CN115308410A - 一种鸭血管紧张素转换酶2(ace2)双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种鸭血管紧张素转换酶2(ace2)双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒以及对鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)检测方法。本发明具有定量、检测浓度范围大、重复性好、操作简便等优点。

Description

一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及一种抗原检测试剂盒，具体的涉及一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其应用。
背景技术
血管紧张素转换酶2(ACE2)是2000年发现的ACE同系物中的一员，是肾素-血管紧张素系统的一个重要调节因子。属于I型跨膜糖蛋白，一种含锌离子的单羧基肽糖蛋白酶。广泛存在于动物的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸以及肠道等主要器官中。ACE2将血管紧张素II(AngII)降解为具有舒张血管及抗增殖作用血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]，也可将血管紧张素I(AngI)降解为Ang(1-9)。Ang(1-7)通过其受体Mas(MasR)发挥抗氧化、抗纤维化、抗炎等作用，引起了科研工作者的广泛关注。
自从发现血管紧张素转换酶2(ACE2)的基本生物学和生理学知识以来，对它的研究不断深入，并进一步促进着对肾素-血管紧张素系统(RAS)的理解。围绕血管紧张素转化酶(ACE2)研究主要有三个方面：肾素-血管紧张素系统(RAS)的负调节剂，氨基酸转运的促进剂以及SARS-CoV和SARS-CoV-2受体。ACE2广泛表达在肺，心血管系统，肠，肾，中枢神经系统和脂肪组织中。
多年来对ACE2的研究已见于人类、动物猪、羊等，但在鸭上的研究缺少资料和相应的检测方法。本研究首次用自制的鸭ACE2重组蛋白作为免疫抗原，制备了多克隆抗体，在此基础上建立了鸭ACE2含量检测的双抗夹心ELISA方法，建立的方法快速、灵敏、特异性好，可用于鸭血液、组织匀浆液ACE2含量的检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本研究通过重组表达鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)蛋白，制备兔源多克隆抗体、鼠源多克隆抗体，进一步利用双抗体夹心ELISA法研制了一种快速检测鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心Elisa试剂盒，快速检测ACE2。
为达到上述目的，本发明采用一种技术方案：一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。
本发明涉及的抗鸭ACE2蛋白多克隆抗体由蛋白纯化后免疫大鼠、新西兰大白兔获得。
利用所述鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心EL ISA试剂盒检测鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的方法，其步骤如下：
(1)捕获抗体的包被：用包被液将捕获抗体(鼠抗鸭ACE2多克隆抗体)按1∶1600(3.5μg/mL)稀释后加入96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜。
(2)封闭：倒掉包被液，每孔加入100μL5％BSA，4℃下封闭过夜。
(3)加入待检测抗原：标品/样本100ul，37℃下孵育1h。
(4)捕获抗体孵育：抗原稀释液，拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次。每孔加入100L按1∶200(17μg/mL)稀释的兔抗鸭ACE2多克隆抗体(HRP标记)，37℃孵育1.5h。
(5)显色：倒掉二抗，拍打干净残留液体，洗涤缓冲液洗涤三次，每次三分钟，每次尽量拍打干净残留液体。每孔加入100LTMB显色剂，，37℃孵育1.5h。
(6)终止反应：每孔加入100uL的终止液，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
(7)标准方程的建立：使用酶标仪测定已知浓度的鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)得到对应的0D450-ACE2浓度对数值，拟合得出线性标准线性方程；
(8)待测样品的测定：将测得的OD450值作为x值代入方程，计算出的y值，y值为ACE2浓度(ng/ml)的对数值，进而计算出待测样品中ACE2的浓度。
现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：试剂盒中，作为检测标记物ACE2的多克隆抗体，标记条件成熟稳定无毒，试剂盒本身分辨率、灵敏度、稳定较强，可做定量检测。
本发明的ACE2双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒及检测系统，操作简单直接加血清样本、检测时间短，适合于推广使用，克服了现有化学发光法，价格昂贵，检测耗时且需要投入专业操作人员的缺点，能独立处理数据从而定量检测的优点。
为了实现本发明，对一系列实验进行了优化。包括：优化了抗体最佳工作浓度、包被条件、封闭条件、孵育条件和显色时间。
将多抗血清分别做倍比稀释进行方阵ELISA滴定，以其中OD450nm最接近1的孔为最佳抗体稀释浓度，确定捕获抗体(鼠抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶1600(3.5μg/mL)，检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。
分别用脱脂乳和BSA为封闭液进行封闭，结果表明5％BSA 4℃封闭过夜时P/N值最大，故选用此条件为最佳封闭条件。采用单因素变量法，分别对待检样品、检测样品孵育时间、显色时间等进行比较，以P/N值最大为判定标准，最终确定待检样品作用时间1h、检测样品作用时间1.5h，37℃显色15min为最佳反应条件。
用制备的鸭ACE2纯化重组蛋白抗原作标准品，设置标准品浓度依次为至1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL，建立了标准曲线，可以定性检测样本中抗原含量。最低检测浓度为25ng/mL。
本发明与现有技术相比，具有以下优势；
1.本发明试剂盒具有良好的重复性。批内实验变异系数为1.65％～5.62％，批间实验变异系数为3.66％～6.81％，变异系数均在10％以内，显示重复性好；
2.本发明试剂盒有较宽的检测浓度区间。从25ng/mL-1600ng/mL均可准确检测ACE2浓度；
3.本发明试剂盒为特有检测鸭物种ACE2浓度，填补了缺少定量检测鸭物种ACE2浓度的空白；
4.本发明可以定量检测样品中ACE2蛋白含量，最低检测值为25ng/mL；
5.本发明试剂盒与目前常用的Western Blot、免疫荧光及荧光定量PCR等方法相比，检测周期短、操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单、可以快速实现大批量样品的检测分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实例中4种包被液包被效果的P/N比值；
图2在不同封闭液、不同封闭时间和温度下P/N比值；
图3为不同显示时间下P/N比值；
图4为本发明ELISA试剂盒ACE2重组蛋白含量测定标准曲线结果图；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
实施例1 ACE2蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立
1.捕获抗体浓度和检测抗体最佳工作浓度的确定
捕获抗体的包被：用抗原包被液将捕获抗体(鼠抗鸭ACE2多克隆抗体)按1∶200(28μg/mL)、1∶400(14μg/mL)、1∶800(7ug/mL)、1∶1600(3.5μg/mL)、1∶3200(1.75μg/mL)、1∶6400(3.75μg/mL)、1∶12800(0.875μg/mL)、25600(0.435μg/mL)倍比稀释后加入96孔板中，每孔100μL，4℃包被10h。每种条件设三个重复。检测抗体孵育：拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次。每孔加入100L按1∶100(34μg/mL)、1∶200(17μg/mL)、1∶400(8.5μg/mL)、1∶800(4.25ug/mL)、1∶1600(2.125μg/mL)稀释的兔抗鸭ACE2多克隆抗体(HRP标记)，37℃孵育。每种条件设三个重复。按常规ELISA方法操作，测定OD450值，计算P/N值。结果如表1，判定标准为：且P/N值越大，抗体效价越高。可以看出，捕获抗体(鼠抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶1600(3.5μg/mL)，检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。
表1抗体不同稀释倍数下P/N值
Figure BSA0000241214180000051
2.捕获抗体最佳包被条件的确定
捕获抗体包被条件的选择：(1)包被液的选择：分别以0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(CBS，pH 9.6)、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH6.6)和0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)为包被抗体稀释液，将捕获抗体(鼠抗鸭ACE2多克隆抗体)按1∶1600(3.5μg/mL)稀释后加入96孔板中，每孔100L，进行酶标板包被，以P/N比值最大值所对应的该种包被稀释液为最适包被液。(2)包被温度和时间的选择：以最适包被液包被酶标板，分别置于4℃过夜，采用37℃、1h，37℃、2h和37℃、3h条件进行包被，其他步骤均相同，检测OD450nm值，综合OD值和P/N比值，选择最适的包被条件。其余步骤按常规ELISA方法操作，测定OD450值，计算P/N值。从附图1中可以看出，碳酸盐缓冲液(CBS，pH9.6)的比值在各个浓度均大于其它缓冲液，因此选定碳酸盐缓冲液(CBS，pH 9.6)为最适抗体包被液。以最适包被液包被酶标板，分别置4℃过夜(18h)，采用37℃、1h，37℃、2h和37℃、3h条件进行包被，其他步骤均相同，检测OD450nm处A值，结果如表2，综合A值和P/N比值，选择2个数据均较大的包被条件为最适包被条件，因此，最适包被温度为4℃过夜(18h)。
表2包被温度和时间的OD450nm值及P/N比值
Figure BSA0000241214180000061
3.双抗体夹心ELISA最佳封闭条件的确立
封闭：选择1.5％BSA、3％BSA、5％BSA和1.5％的脱脂乳、3％的脱脂乳、5％脱脂乳作为封闭液，分别37℃封闭1h、37℃封闭2h、4℃条件下封闭过夜和37℃封闭1h后4℃封闭过夜。其余步骤按常规ELISA方法操作，测定OD450值，计算P/N值。各个封闭条件下的P/N值见表1。根据P/N值作柱状图，如图3，可以看出，5％BSA 4℃封闭过夜时P/N值最大，故选用此条件为最佳封闭条件。
表3封闭条件的ELISA结果
Table 1 The ELISA result of blocking condition
Figure BSA0000241214180000062
4.双抗体夹心ELISA孵育时间的确定
加入待检测抗原：倒掉封闭液，拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次每孔加入稀释至1.6μg/mL的ACE2重组蛋白100L，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h。捕获抗体孵育：抗原稀释液，拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次。每孔加入100L按1∶200(17μg/mL)稀释的兔抗鸭ACE2多克隆抗体(HRP标记)，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h。其余步骤按常规ELISA方法操作，测定OD450值，计算P/N值。测得各孵育条件下P/N如表4，由结果可知，在样本孵育时间为1h，检测抗体孵育时间为1.5h时，P/N值最大，故最佳样本孵育时间为1h，检测抗体孵育时间为1.5h。
表4孵育时间的确定
Figure BSA0000241214180000071
5.双抗体夹心ELISA最适显色时间的确立
显色：倒掉二抗，拍打干净残留液体，洗涤缓冲液洗涤三次，每次三分钟，每次尽量拍打干净残留液体。每孔加入100LTMB显色剂，37℃分别孵育5min、10min、15min、20min、25min、30min。其余步骤按常规ELISA方法操作，测定OD450值，计算P/N值。结果如附图3，可以看出随着底物显色液作用时间的延长，在5-15min内，P/N值逐渐增大，在15-30min内，P/N值逐渐减小，因此，选定15min为最适TMB底物作用时间。
实施例2 ACE2蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的评价
1.ACE2重组蛋白含量测定标准曲线
加入待检测抗原：倒掉封闭液，拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次每孔加入稀释至1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL的ACE2重组蛋白100L，37℃孵育1h。根据建立的双抗体夹心ELISA方法测OD450值，以内标品含量为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制标准曲线。可见ACE2重组蛋白含量在测定范围内可形成一条直线，且线性关系较好。标准曲线的回归方程为：y＝0.0016x+0.104，R2＝0.9962。
2.重复性实验
加入待检测抗原：(1)批内重复性试验：抽取5批纯化的蛋白样品，按优化后的双抗体夹心ELISA方法进行操作，测定OD450m值，计算X(平均值)、SD(标准差)和变异系数，每份蛋白做5个重复，以评价批内检测样品的重复性。(2)批间重复性试验：取不同批次制备的蛋白包被酶标板进行试验，其余反应条件同批内重复性试验。结果可以看出批内实验变异系数为1.65％～5.62％，批间实验变异系数为3.66％～6.81％，变异系数均在10％以内，显示重复性好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种鸭ACE2双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：包被有抗鸭ACE2蛋白多克隆抗体的酶标板、封闭液、HRP酶标ACE2多抗、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包被稀释液为碳酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：抗体的最佳包被温度为37℃孵育1h后4℃过夜。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述所述封闭液为含5％BSA，37℃封闭1h。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：捕获抗体(鼠抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶1600(3.5μg/mL)。检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。
7.权利要求1所述的试剂盒在鸭ACE2含量检测的应用。
8.一种鸭ACE2双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包被液包被稀释后的多抗，100uL/孔包被酶标板，4℃作用过夜；
(2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，％BSA 4℃封闭过夜；
(3)洗板5次，加入一定稀释度的待检抗原样品及对照样品，100uL/孔，置37℃孵育，同时设不加抗原对照(用脱脂乳代替)；
(4)洗板5次，加入稀释倍数为1∶200(17μg/mL)的检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)置37℃孵育1.5h；
(5)洗板5次，加入底物显色液，100uL/孔，37℃避光显色15min；
(6)加终止液，50uL/孔，混匀后10min内测定OD450nm值；
(7)结果判定：P/N＝待检样品孔OD值/阴性对照孔OD值，当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)＜0.2时，试验成立，待检样品孔P/N≥2时为阳性。
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