CN115304656A - 一种特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡药物构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是一种用于特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡类药物及其制备方法和应用，其中的细胞凋亡诱导剂为体外制备的Z构型DNA，通过脂质体或外泌体包裹后，可以通过细胞内吞将Z‑DNA运输至细胞内，从而诱导细胞发生泛凋亡。本发明可以作为泛凋亡研究的标准化药物，或用于肿瘤治疗。

Description

一种特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡药物构建及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡药物构建及应用。

背景技术

程序性细胞死亡介导了多种病理、生理过程的发生，包括胚胎发育、组织稳态维持和宿主对病原体的免疫防御。程序性细胞死亡由不同的分子信号通路控制，其参与机体中不需要的细胞或异常细胞的清除。目前的观点认为因细胞凋亡(apoptosis)而死亡的细胞是非免疫原性的，而坏死性凋亡(necroptosis)和细胞焦亡(pyroptosis)会驱动免疫反应。

近期研究发现，不同形式程序性细胞死亡具有不同的分子机制和死亡方式，各种形式的程序性细胞死亡途径之间又存在着明显的串扰：细胞凋亡和坏死性凋亡通路通过caspase8的活性紧密相连，caspase8活化后不仅会激活下游的caspase3/7促进凋亡发生，亦可以通过介导MLKL磷酸化可以促进坏死性凋亡的信号传导；坏死性凋亡和细胞焦亡都具有相同的溶解性和潜在的炎症形态，NLRP3炎症小体活化可同时引发Caspase1与MLKL活化，引发坏死性凋亡和细胞焦亡。细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡在感染性疾病中引起的组织损伤中常共同发生介导组织损伤，被称为泛凋亡途径(PANoptosis)。然而，除利用高剂量病毒感染引发泛凋亡外，目前尚缺乏稳定性高、可重复性强的诱导细胞泛凋亡手段。这严重制约了研究泛凋亡发生机制、以及利用泛凋亡途径进行肿瘤等疾病的治疗。

目前认为，泛凋亡是由AIM2(absent in melanoma 2)、Z-DNA结合蛋白(Z-DNAbanding protain1，ZBP1)等蛋白形成泛凋亡蛋白复合体(PANoptosome)诱导发生。ZBP1蛋白含有Zα结构域，可以特异性识别左旋双股螺旋Z型DNA(Z-DNA)，激活细胞泛凋亡发生。Z-DNA是1979年Rich等人在X射线下发现，含有丰富的鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)交替序列，在炎症、缺氧、微生物感染、肿瘤等疾病可引起Z-DNA在细胞内大量聚集，与细胞浆内ZBP1结合，激活细胞发生泛凋亡。虽然Z-DNA可以激活泛凋亡发生，但Z-DNA处于高能状态而不稳定，如何制备稳定的Z-DNA药物是限制其应用的难点。

使用Z-DNA诱导泛凋亡的另一瓶颈是如何实现Z-DNA的胞内递送。脂质体是双亲性脂分子在水相中进行自组装形成的双层膜脂小泡，可以将特定物质(药物或基因片段等)包埋在脂质体内部，形成特定的运输系统。外泌体是细胞分泌产生的一种直径在30-200nm的微小囊泡，其细胞膜通常组成型表达PDGFR、CD81、CD9等膜蛋白。利用这一特性可将靶向细胞的多肽或抗体片段与上述分子组成嵌合分子，使工程化细胞分泌的外泌体具有高度的靶向性，从而实现Z-DNA的靶向运输。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包裹有Z-DNA片段的脂质体或精准靶向外泌体及其制备方法，由此制备的囊泡药物可以特异性激活细胞泛凋亡途径(PANoptosis)。

本发明的第一方面，提供一种稳定的Z-DNA制备方法，包括以下步骤：

a)合成50-200bp的poly(dG-dC)；将poly(dG-dC)溶解于pH＝7.5-8.0的0.5mMEDTA·3.5M NaCl溶液，后将pH调制6.5；

在本发明的一个优选的实施方式中，步骤a中合成100-150bp的poly(dG-dC)。

b)制备饱和溴水：在磨口玻璃塞瓶中加入1L ddH₂O与16mL单质溴，置于摇床以250rpm室温震荡混匀2个小时，静置后吸取上层橙红色溶液，为饱和溴水；

c)饱和溴水以1～2倍体积逐滴加入poly(dG-dC)溶液，混合后室温下轻柔颠倒混匀30分钟，使DNA发生溴化反应；

在本发明的一个优选的实施方式中，步骤c中饱和溴水和poly(dG-dC)溶液以1.3:1.0的比例进行混合。

d)在反应液中加入10％体积的四氯化碳，振荡混匀萃取反应液中剩余的溴单质，吸取上层水相，即获得含有Z-DNA的溶液；

e)Z-DNA溶液通过超滤浓缩，Z-DNA含量使用dot-blot进行鉴定。

本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的制备方法制备得到的稳定的Z-DNA。

本发明的第三方面，提供一种用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(A)配制脂质材料的乙醇溶液(有机相)：称取磷脂酰胆碱10mg～30mg、胆固醇1mg～10mg，DOTAP 5mg～50mg，溶于10mL无水乙醇；

在本发明的一个优选的实施方式中，步骤A中使用磷脂酰胆碱30mg、胆固醇10mg、DOTAP 10mg溶于10mL无水乙醇。

(B)含有Z-DNA的水相：如上所述的超滤浓缩后的Z-DNA溶液使用0.5MPBS稀释至1～5ng/μL；

在本发明的一个优选的实施方式中，步骤B中使用2ng/μL Z-DNA稀释液作为水相。

(C)将装有有机相的1ml注射器置于微流控泵1通道固定，将装有水相的1mL注射器置于微流控泵2通道固定。按照水相:有机相的流速比2～5:1微流控参数进行设置。

在本发明的一个优选的实施方式中，为了获得直径在100～200nm范围的脂质体，步骤C中使用水相:有机相的流速比为3:1。

(D)启动微流控系统，使得有机相和水相在芯片中混合，弃掉初始10％流出液，收集其余流出液，使用NTA法表征脂质体。

本发明的第四方面，提供一种采用如上制备方法制备得到的用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体。

本发明的第五方面，提供一种用于诱导细胞发生泛凋亡途径(PANoptosis)的靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将人工嵌合蛋白的编码基因克隆至pcDNA3.1质粒，转染293T细胞，使用无血清培养基培养48小时，收集培养上清，26000g离心2小时收集外泌体；

步骤二：Z-DNA加载外泌体：将外泌体与如上所述的Z-DNA溶液按照质量比10:1进行混合，使用超声法进行装载，设置超声参数为60Hz超声30s，暂停30s，循环3次；在超声结束后放置在37℃的摇床，50rpm孵育1小时，帮助外泌体恢复膜结构；26000g离心2小时收集外泌体；获得加载有人工Z-DNA的靶向外泌体。

其中，所述的靶向外泌体利用外泌体组成型表达蛋白与多肽或抗体序列嵌合构成，其基本构成为：信号肽—靶向蛋白—跨膜序列；

进一步的，为了实现外泌体对αv integrin阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.1所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对CD19阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.2所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对GPC3阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.3所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对MUC1阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.4所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对MSLN阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.5所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对Claudin18.2阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.6所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对PDL1阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.7所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对NKG2DL阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.8所示的人工嵌合蛋白。

进一步的，为了实现外泌体对GD2阳性细胞的精准靶向，工程化外泌体组装了编码基因序列如SEQ ID NO.9所示的人工嵌合蛋白。

本发明的第六方面，提供一种采用如上制备方法制备得到的用于诱导细胞发生泛凋亡途径(PANoptosis)的靶向外泌体。

本发明的第七方面，提供如上所述的Z-DNA、脂质体或靶向外泌体在制备诱导细胞发生泛凋亡途径(PANoptosis)的药物中的应用。

本发明的第八方面，提供如上所述的Z-DNA、脂质体或靶向外泌体在构建细胞泛凋亡模型中的应用。

本发明的第九方面，提供如上所述的Z-DNA、脂质体或靶向外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述的肿瘤包括但不限于表达特定肿瘤相关抗原的肝癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、胶质瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、胆管癌、淋巴瘤、食管癌、鼻咽癌等。

本发明优点在于：

1、本发明提供一种用于特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡类药物，细胞凋亡诱导剂为体外制备的Z构型DNA，通过脂质体或外泌体包裹后，可以通过细胞内吞将Z-DNA运输至细胞内，从而诱导细胞发生泛凋亡。

2、本发明提供的用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体或外泌体的制备方法，可以在体内及体外稳定激活细胞泛凋亡通路，是一种新型构建细胞泛凋亡模型的药物，可以作为泛凋亡研究的标准化药物，用于细胞泛凋亡相关研究。

3、本发明提供的用于特异性激活细胞泛凋亡的靶向性工程外泌体的制备方法，可以在体内诱导特定细胞群体的发生泛凋亡，可用于肿瘤的治疗。

附图说明

图1是利用微流控芯片制备脂质体的示意图

图2是本发明实施例的Z-DNA脂质体的制备流程示意图。

图3是本发明实施例中应用NTA与电镜对Z-DNA脂质体进行表征。

图4是Z-DNA脂质体置于4℃避光保存，每5日取样进行dot-blot检测DNA含量。

图5是Western-blot检测Z-DNA脂质体对Caspase1、Caspase8与MLKL活化。

图6是使用GPC3靶向外泌体负载Z-DNA后杀伤GPC3阳性的HepG2细胞后，测定上清乳酸脱氢酶含量

图7是使用MSLN靶向外泌体负载Z-DNA后杀伤MSLN阳性的BXPC3细胞后，测定上清乳酸脱氢酶含量

图8是使用Z-DNA脂质体滴鼻小鼠后建立的肺损伤模型。A图为肺的HE病理检测，B图为小鼠给药后生存期。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：人工Z-DNA溶液的制备

实验方法：①合成100-150bp的poly(dG-dC)；将poly(dG-dC)溶解于pH＝7.5-8.0的0.5mM EDTA·3.5M NaCl溶液，后将pH调制6.5。②制备饱和溴水：在磨口玻璃塞瓶中加入1L ddH₂O与16mL单质溴，置于摇床以250rpm室温震荡混匀2个小时，静置后吸取上层橙红色溶液，为饱和溴水。③饱和溴水以1.3:1.0倍体积逐滴加入poly(dG-dC)溶液进行混合；混合后室温下轻柔颠倒混匀30分钟，使DNA发生溴化反应。④在反应液中加入10％体积的四氯化碳，振荡混匀萃取反应液中剩余的溴单质，吸取上层水相，即获得含有Z-DNA的溶液。⑤Z-DNA溶液通过超滤浓缩，Z-DNA含量使用dot-blot进行鉴定。

实施例2：合成含有人工Z-DNA脂质体的制备

实验方法：①配制脂质材料的乙醇溶液(有机相)：称取磷脂酰胆碱30mg、胆固醇10mg、DOTAP 10mg，溶于10mL无水乙醇。②含有Z-DNA的溶液(水相)：实施例1中超滤浓缩后的Z-DNA溶液使用0.5M PBS稀释至2ng/μL。③将装有有机相的1ml注射器置于微流控泵1通道固定，将装有水相的1mL注射器置于微流控泵2通道固定。按照水相:有机相的流速比3:1微流控参数进行设置(图1)。④启动微流控系统，使得有机相和水相在芯片中混合，弃掉初始10％流出液，收集其余流出液，使用NTA法表征脂质体。

图2是本发明实施例的人工脂质体的制备流程示意图。

实施例3：基于人工合成的包含Z-DNA的脂质体的表征和稳定性检测实验方法：将实施例2制备好的Z-DNA脂质体置于4℃避光保存，每5日取样进行dot-blot检测，检测DNA含量。

实验结果：应用NTA与电镜对制备的Z-DNA脂质体表征进行检测。图3是本发明实施例中应用NTA与电镜对Z-DNA脂质体进行表征，结果表明Z-DNA脂质体直径大小为80-200nm之间，大部分颗粒直径为150nm。Z-DNA脂质体置于4℃避光保存，每5日取样进行dot-blot检测DNA含量，结果表明Z-DNA脂质体在该条件下可稳定保存30天以上，观察期内Z-DNA含量未发生显著改变(图4)。

实施例4：基于人工合成的包含Z-DNA的脂质体对肺泡细胞泛凋亡途径的活化作用

实验方法：Z-DNA脂质体诱导Lenti-X-293T细胞。Western-blot检测Z-DNA脂质体对Caspase1、Caspase8与MLKL活化。

实验结果：图5是Western-blot检测Z-DNA脂质体对泛凋亡三条通路Caspase1、Caspase8与MLKL活化。图5结果显示，本发明制备的Z-DNA脂质体可诱导细胞焦亡(Caspase1通路)、细胞凋亡(Caspase8通路)和坏死性凋亡(MLKL通路)的信号活化。

实施例5：包覆有人工Z-DNA的靶向GPC3外泌体的制备及其对HepG2肿瘤细胞的杀伤活性

实验方法：

第一步，包覆有人工Z-DNA的靶向GPC3外泌体的制备

①将SEQ ID NO.3所示的基因序列克隆至pcDNA3.1质粒，转染293T细胞，使用无血清培养基培养48小时，收集培养上清，26000g离心2小时收集外泌体。

②Z-DNA加载外泌体：将外泌体与实施例1中Z-DNA溶液按照质量比10:1进行混合，使用超声法进行装载，设置超声参数为60Hz超声30s，暂停30s，循环3次。在超声结束后放置在37℃的摇床，50rpm孵育1小时，帮助外泌体恢复膜结构。26000g离心2小时收集外泌体。获得包覆有人工Z-DNA的靶向GPC3的外泌体。

第二步，包覆Z-DNA的GPC3靶向外泌体对GPC3阳性的HepG2肿瘤细胞的体外杀伤效率研究。将包覆有Z-DNA外泌体按颗粒比5:1与HepG2肿瘤细胞共培养，在共培养4小时、8小时、12小时后使用LDH试剂盒检测培养上清中LDH含量。

实验结果：如图6所示，包覆Z-DNA的GPC3靶向外泌体可以有效诱导GPC3阳性的肝癌细胞凋亡。

实施例6：包覆有人工Z-DNA的靶向MSLN外泌体的制备及其对BXPC3肿瘤细胞的杀伤活性

实验方法：

第一步，包覆有人工Z-DNA的靶向MSLN外泌体的制备

①将SEQ ID NO.5所示的基因序列克隆至pcDNA3.1质粒，转染293T细胞，使用无血清培养基培养48小时，收集培养上清，26000g离心2小时收集外泌体。

②Z-DNA加载外泌体：将外泌体与实施例1中Z-DNA溶液按照质量比10:1进行混合，使用超声法进行装载，设置超声参数为60Hz超声30s，暂停30s，循环3次。在超声结束后放置在37℃的摇床，50rpm孵育1小时，帮助外泌体恢复膜结构。26000g离心2小时收集外泌体。获得包覆有人工Z-DNA的靶向MSLN的外泌体。

第二步，包覆Z-DNA的MSLN靶向外泌体对MSLN阳性的BXPC3肿瘤细胞的体外杀伤效率研究。将包覆有Z-DNA外泌体按颗粒比5:1与BXPC3肿瘤细胞共培养，在共培养4小时、8小时、12小时后使用LDH试剂盒检测培养上清中LDH含量。

实验结果：如图7所示，包覆Z-DNA的MSLN靶向外泌体可以有效诱导MSLN阳性的胰腺癌细胞凋亡。

实施例7：Z-DNA脂质体诱导小鼠肺损伤模型

实验方法：

将Z-DNA脂质体母液稀释至1×10⁹个/mL，取100μL滴鼻吸入，对照组吸入等量的空载脂质体。HE染色检测肺部损伤水平，同时观察小鼠生存期。

实验结果：

Z-DNA脂质体吸入后，诱发肺泡细胞损伤并继发炎症反应，出现典型的肺实质变；肺泡内充满纤维素样渗出及红细胞、淋巴细胞浸润，肺泡间隔增宽(图8A)。吸入Z-DNA的小鼠在3天内完全死亡(图8B)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院

<120> 一种特异性激活细胞泛凋亡途径的囊泡药物构建及应用

<130> /

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgagattgc ctggcgcaat gcccgctttg gccttgaaag gagaactgct ccttctgtcc 60

cttctgctct tgcttgagcc tcagatcagc cagggatgca gaggggacaa gggcccagac 120

tgcgttgtga tcagcgcaat tctcgcactg gtcgtgctga caatcatctc cctgattatt 180

ctgattatgc tgtggcagaa gaaacct 207

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

atgagattgc caggagctat gcctgccctt gcactgaagg gagaacttct gctgttgagc 60

ctgttgttgc tcctggagcc ccagatttcc cagggcgaca tccagatgac ccagtcccca 120

tcatcactct ctgcctctgt gggcgaccga gtgacaatca cttgtcgggc cagcgacatt 180

tcaaaatacc tgaattggta tcagcagaag cccggcaagg ccccaaaact tctgatctat 240

cacacttctc ggctgcactc cggagttcct tcaaggttct caggaagcgg ttctgggacg 300

gatttcaccc tcaccatcag cagcttgccc gaggactttg cgacatacta ttgccagggc 360

aatactctgc cctatacttt tggtgggggg acaaaagttg aaattaaagg aggtggaggt 420

tctggaggag ggggcagtgg tggaggagga agtgaggtgc agctcgtgga aagtggaggc 480

ggtttggtgc aacctggagg atctctgcga ctttcctgcg ctgcttcagg tgtaagtctg 540

ccagattatg gcgtatcctg ggtgaggcaa gcccctggaa aaggattgga gtgggtttct 600

gttatctggg gctcagagac cacttactac aattccgccc tgaagagccg ctttaccata 660

tcacgcgaca acagcaaaaa taccctttac ctgatgaatt ctttgagggc tgaagatacc 720

gcggtgtatt attgcgctaa gcactactat tacgggggaa gctacgccat ggattactgg 780

ggagggactc tggttactgt gtccagcgtc gttatctctg ccatcctggc actcgtagtc 840

ctcaccatca tctccctgat cattttgatt atgctgtggc aaaaaaagcc a 891

<210> 3

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atgagattgc ctggagccat gccagctctt gctctgaaag gagaactgct gcttctgagc 60

ctgctgcttc tgctggagcc tcagatctct cagggtgacg tcgtgatgac tcagtccccc 120

ctctctcttc ctgtgacccc aggggagcca gcaagcatca gttgccgctc ttcccaatcc 180

ctggtccact ccaacgccaa cacttacctt cactggtacc tccagaagcc cggacagtct 240

ccacagctgc tgatctataa ggtgtctaat cggttcagcg gagtgcccga cagattctca 300

gggtcagggt ctggtacgga ttttaccctg aaaatctcac gagttgaagc cgaagatgtg 360

ggggtttatt actgtagcca gaacacccac gtacccccca ctttcggcca gggaacaaag 420

ctcgagataa agggtggtgg aggatccggt ggtggaggtt ctggcggagg aggttctcaa 480

gtgcaacttg ttcagagtgg ggctgaagtg aaaaagcccg gggccagcgt gaaggtgagt 540

tgcaaagcct cagggtacac cttcactgac tacgagatgc attgggtcag acaagcacct 600

ggccagggac ttgaatggat gggcgctctc gaccctaaaa cgggcgacac cgcatattca 660

cagaaattca aaggcagggt gactcttacc gctgacgaaa gtacctcaac cgcctacatg 720

gagctgtcaa gcctccggtc tgaagacacc gcggtctact attgtacccg cttctatagc 780

tacacatact ggggccaggg aactctcgtg acggtgagca gcgtggtcat ctccgcaatc 840

ctcgctttgg tggtcctgac aattatttct ttgatcattc tgatcatgct ctggcagaaa 900

aagccg 906

<210> 4

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atgagattgc ctggcgctat gcctgctttg gcccttaagg gagaactgct cctcctgagt 60

ctgcttctcc tgttggaacc tcagataagc caaggggaag tgcttcagca gtcaggcgca 120

gaactggtca agccaggtgc ctcagtgaag ttgtcctgca ctgccagtgg cgaaaacatc 180

aaggactatt acatgcactg ggtcaagcag cgcacagagc agggccttga atggatcgga 240

cggattgacc cagaggacgg tgagacaaaa tatgccccca aatttggcaa ggctatcatt 300

accgcggata ctagttctaa caccgcctat ctgctgtcat ctcttactag cgaagacact 360

gcagtctact actgcgttca cttctactat ggctacgacg tcggacgagg ctattggggt 420

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ggaggaggat cagacatcgt tatgtcacag agtcctagtt ctctggcagt ctcagtgggg 540

gagaaggtca ctatgtcttg taaaagttct cagtctctgc tgtacagcag taaccagaaa 600

aactacctgg catggtacca gcaaaagcct ggccaaagcc caaagctgct catttattgg 660

gcgtctacca gggagtctgg cgtgcctgat cgctttaccg gctcagggag tgggaccgat 720

ttcacactca caataagttc agtgaaggca gaggacctcg ccgtttacta ctgccagcag 780

tactactcat acaccttcgg cggtggaaca aaactggaga taaaggttgt gatctccgcc 840

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<210> 5

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

atgaggctgc caggagctat gcctgcattg gcactgaaag gagaactcct gcttctgtca 60

cttcttttgc tccttgagcc acagatttct cagggcgacg tggtgatgac gcagactcct 120

gcctcagttt ctgagccagt tggggggacg gtgaccatca agtgtcaggc gtcccagaga 180

attagtagct atctgtcatg gtatcagcag aagccaggac agcggcccaa acttctgatc 240

ttcggggcta gtacccttgc atctggggtt cccagcaggt tcaaaggctc aggctccggt 300

accgagtaca cattgactat ttccgacctg gaatgtgccg atgccgctac ctattactgc 360

cagtcctatg cctactttga ttccaacaat tggcacgctt tcggaggcgg aacagaagtg 420

gttgtgggag gaggtggatc aggaggagga ggatctggcg gtggtggctc acagcagcaa 480

ctggaagagt ccggtggagg cctggtgaag ccagaaggct ccctcaccct cacttgcaaa 540

gcctccgggt ttgatttggg attctacttt tacgcttgtt gggtgcgaca ggcccctgga 600

aaggggttgg aatggatcgc gtgtatctat acggctggca gcggcagcac ctattatgcg 660

tcatgggcca agggacggtt cactatcagc aaagctagct ccaccacggt gacactgcag 720

atgacgagtc tggctgcagc agacacggcc acttatttct gcgcgcgcag tactgcaaat 780

acacggtcta cttattacct gaacctgtgg gggcccggca cattggtgac agtgtcctct 840

gttgtaatta gcgccattct cgcccttgtc gtgctgacta ttatttccct gatcatcctg 900

attatgctgt ggcaaaaaaa gccc 924

<210> 6

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

atgaggttgc ccggcgcaat gccagctctt gctttgaaag gagaactgct gttgctgtca 60

ctgctgctgt tgctggagcc ccagatcagc cagggtcagg tacagttgca gcagccaggt 120

gctgaactcg tacgacccgg agcctcagtg aaattgtctt gcaaggccag cggatacaca 180

ttcacgtcat actggatcaa ctgggtgaag cagagaccag gacaggggct cgagtggatt 240

gggaacatct accctagcga ttcctacacc aattacaacc aaaagttcaa ggataaggct 300

accctgaccg ttgacaaatc aagtagcaca gcttacatgc agctgagcag ccctactagt 360

gaggactcag ccgtgtacta ctgtacacgc agttggcgcg gcaacagctt cgattactgg 420

ggacagggta caactttgac cgtgtcaagc ggaggaggtg gatctggcgg tggaggatca 480

ggaggaggag gaagtgacat tgtgatgact cagtctccat ctagcctcac agtgactgcc 540

ggggagaaag tgaccatgtc atgcaaaagc tctcaatcac tcttgaattc tgggaatcag 600

aagaactatt tgacctggta ccagcagaaa ccaggacagc ctcccaagct gttgatatac 660

tgggcttcaa ctcgggaaag cggcgtgccc gatcgcttca caggtagtgg ttcaggaact 720

gatttcacac tgaccatcag ctccgttcag gctgaggatt tggccgtcta ttattgccag 780

aacgactact cttatccttt cacctttggc agcgggacaa agctcgagat caaggtggtg 840

attagcgcta ttctggcttt ggtggtcctg acaattatat cattgatcat tttgatcatg 900

ctgtggcaaa agaagcca 918

<210> 7

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

atgagactgc caggtgcaat gccagccttg gccttgaaag gagaactcct cttgttgtcc 60

ctgctgcttc tcctcgagcc acagatttcc caggggccag gttggttttt ggattccccg 120

gacagaccat ggaatccacc gacctttagt ccagcgctgc tggtggtcac tgagggagat 180

aacgccacct tcacatgtag cttctccaat acgtctgaat cctttgtact gaactggtac 240

aggatgtcac cctccaacca gaccgataag ctcgctgcgt ttccagagga tagatcacag 300

ccggggcagg actgcagatt tcgcgtcacc cagcttccta atggacggga ttttcacatg 360

tccgttgtgc gggcaaggag gaatgacagt gggacatact tgtgcggagc catcagcctt 420

gctccaaagg cccagatcaa ggagtccctc agggccgagc tgagagtgac agaacgaaga 480

gccgaggtac ctaccgccca tccttctcct agcccacgac ccgcaggaca attccagacc 540

ctggtggttg ttatttctgc catcttggct ctcgtcgtgc tgacgattat atctctcatc 600

atcctgatta tgctgtggca gaaaaagccg 630

<210> 8

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

atgagactcc ctggagctat gccggctctt gctcttaaag gagagctgct gctgctcagt 60

ctgctgctgc tgctggaacc ccagatctca cagggaattt ggtccgccgt ctttctcaac 120

agtctgttta accaagaggt gcaaattccc cttaccgaga gctactgtgg tccgtgcccc 180

aagaactgga tctgctacaa gaacaattgc taccagttct tcgatgagtc caagaattgg 240

tacgaatccc aggcttcctg tatgagccaa aatgccagcc tcttgaaagt gtactcaaag 300

gaggatcaag atctcctgaa gctcgtgaag agttaccact ggatgggctt ggtgcacatc 360

cccactaacg gcagctggca atgggaagac ggatccatat tgtcaccaaa cctgctcacc 420

atcatcgaaa tgcagaaggg tgattgcgca ctctatgcca gtagcttcaa aggctatatc 480

gagaactgtt caacacccaa cacgtatatt tgcatgcaga ggaccgtagt ggtgatctca 540

gccatcttgg cactcgtggt gttgacaatc atcagcctca tcatccttat tatgctgtgg 600

cagaagaaac ca 612

<210> 9

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

atgagacttc ccggagcaat gccagcattg gctcttaaag gggagctcct gttgctgtca 60

ctgctgctcc tcctggagcc ccagatcagc caagggcagg tgaagcttca ggaaagcggg 120

ggaggtcttg ttcagccagg tggctccatg aagctctctt gcgtggtcag cgggttcact 180

ttttctaatt actggatgaa ttgggttcgg caaagcccgg agaaggggct ggaatggatc 240

gccgaaattc gactcaagtc aaacaatttt gccaggtact atgcagagtc cgtgaaggga 300

cggttcacta tctccagaga tgattccaag gggtccgtct accttcagat gatcaacctg 360

cgcgccgagg ataccggaat ctattactgc acctcctacg gcaactacgt gggacactac 420

tttgaccact ggggacaagg aacaacggta accgttagtt caggcggagg tggttcagga 480

ggaggaggat ctggaggagg cggatccgat atcgagctca cgcagtctcc taagtttatg 540

agcacaagtg ttggggatag ggtttccgtc acctgtaaag ccagccagaa cgtggacaca 600

aatgtggctt ggtaccagca gaaaccggga caatctccag agccccttct gttcagcgct 660

agttataggt acactggcgt gccagatcgg ttcactggat caggcagcgg aacagatttc 720

acattgacta tttcaaacgt ccagagcgag gatctggctg agtacttctg ccagcaatac 780

aattcctacc cactgacttt tgggggcgga accaagctcg agatcaaacg cgtcgttatt 840

agcgccattc tggctctcgt tgtgctgacc atcatatccc tcattatact gatcatgctc 900

tggcaaaaga agccc 915

Claims (10)

1.一种稳定的Z-DNA制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)合成50-200bp的poly(dG-dC)；将poly(dG-dC)溶解于pH＝7.5-8.0的0.5mM EDTA·3.5M NaCl溶液，后将pH调制6.5；

b)制备饱和溴水；

c)饱和溴水以1～2倍体积逐滴加入poly(dG-dC)溶液，混合后室温下轻柔颠倒混匀30分钟，使DNA发生溴化反应；

d)在反应液中加入10％体积的四氯化碳，振荡混匀萃取反应液中剩余的溴单质，吸取上层水相，即获得含有Z-DNA的溶液；

e)Z-DNA溶液通过超滤浓缩，Z-DNA含量使用dot-blot进行鉴定。

2.一种采用如权利要求1所述的制备方法制备得到的稳定的Z-DNA。

3.一种用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)配制脂质材料的乙醇溶液(有机相)：称取磷脂酰胆碱10mg～30mg、胆固醇1mg～10mg，DOTAP 5mg～50mg，溶于10mL无水乙醇；

(B)含有Z-DNA的水相：如上所述的超滤浓缩后的Z-DNA溶液使用0.5M PBS稀释至1～5ng/μL；

(C)将装有有机相的1ml注射器置于微流控泵1通道固定，将装有水相的1mL注射器置于微流控泵2通道固定；按照水相:有机相的流速比2～5:1微流控参数进行设置；

(D)启动微流控系统，使得有机相和水相在芯片中混合，弃掉初始10％流出液，收集其余流出液，使用NTA法表征脂质体。

4.一种采用如权利要求3的制备方法制备得到的用于特异性激活细胞泛凋亡的脂质体。

5.一种用于诱导细胞发生泛凋亡途径的靶向外泌体的制备方法，其特征在在于，包括以下步骤：

步骤一：将人工嵌合蛋白的编码基因克隆至pcDNA3.1质粒，转染293T细胞，使用无血清培养基培养48小时，收集培养上清，26000g离心2小时收集外泌体；

步骤二：Z-DNA加载外泌体：将外泌体与如上所述的Z-DNA溶液按照质量比10:1进行混合，使用超声法进行装载，设置超声参数为60Hz超声30s，暂停30s，循环3次；在超声结束后放置在37℃的摇床，50rpm孵育1小时，帮助外泌体恢复膜结构；26000g离心2小时收集外泌体；获得加载有人工Z-DNA的靶向外泌体。

6.根据权利要求5所述的用于诱导细胞发生泛凋亡途径的靶向外泌体的制备方法，其特征在在于，所述的人工嵌合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9任一所示。

7.一种采用如权利要求5或6所述的制备方法制备得到的用于诱导细胞发生泛凋亡途径的靶向外泌体。

8.如权利要求2所述的Z-DNA、如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向外泌体在制备诱导细胞发生泛凋亡途径的药物中的应用。

9.如权利要求2所述的Z-DNA、如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向外泌体在构建细胞泛凋亡模型中的应用。

10.如权利要求2所述的Z-DNA、如权利要求4所述的脂质体或如权利要求7所述的靶向外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。

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