CN115298547A - 用于霉菌毒素分析的高通量亲和样品制备 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种分离包含霉菌毒素的样品的方法。该方法包括使该样品流动通过柱以将该样品装载在柱上，洗涤该柱以减少杂质，从该柱洗脱该霉菌毒素，将带有该霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中，将该经洗脱样品密封在该样品板中，转移该密封的样品板，从该转移的样品板移除该经洗脱样品；以及分析该移除的经洗脱样品。该柱可包括亲和树脂，例如免疫亲和树脂。该样品板可以是96孔板。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月18日提交并且名称为“用于霉菌毒素分析的高通量亲和样品制备(High Throughput Affinity Sample Preparation for Mycotoxin Analysis)”的美国临时专利申请第62/991,141号的权益和优先权。该专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及分离霉菌毒素。更具体地，本公开涉及用于霉菌毒素分析的高通量免疫亲和样品制备。
背景技术
色谱法是将混合物分离成其组分的一组技术。免疫亲和色谱(IAC)将液相色谱(LC)的使用与抗体或相关药剂的特异性结合相组合。
发明内容
IAC可用于针对特定靶标的测定中或针对纯化和/或浓缩分析物的测定中。在一些示例中，纯化和/或浓缩在通过另一种技术进行检查之前发生。本公开涉及用于霉菌毒素分析的样品制备中的IAC(和其它基于亲和力的色谱)。霉菌毒素诊断范围是从快速测试到复杂的仪器测试。快速测试包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、侧向流动条和荧光计测试，该快速测试用作本领域的筛选测试。高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC/MS)方法在成熟的实验室中采用，并且可产生比ELISA和其它快速测试更准确和更确认的结果。ELISA是目前唯一一种可以在数小时内处理数百份样品的高通量方法。
用于霉菌毒素分析的高通量亲和样品制备的本公开提供了仪器分析诸如超高效液相色谱(UHPLC)/MS、HPLC/MS或LC/MS的性能以及方法诸如ELISA的高通量特征。IAC高通量解决方案的一些益处包括能够与ELISA可以在给定时间内、更短的周转时间(与荧光计相比)或实际操作时间(与UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS相比)内处理的样品数量竞争，以及过程中使用的耗材廉价。通常，ELISA过程花费数小时(1、2或更多小时)来运行样品，而本技术可以在30分钟或更短时间内处理多达96个样品。IAC高通量解决方案还提供优异的结果，该优异的结果包括更好的变异系数(CV)、确认结果而非缺乏详细信息和足够准确度的筛选结果，多路复用-同时处理多个样品的能力，以及关于亚型的信息，该信息包括霉菌毒素的分布)。例如，通过用于霉菌毒素分析的高通量免疫亲和样品制备，可检测霉菌毒素的分布，例如黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的分布。
一方面，本公开提供了一种分析包含霉菌毒素的样品的方法。该方法可以包括将样品装载在柱中，其中该柱包括亲和树脂(例如，免疫亲和树脂)；洗涤柱以减少杂质(任选的)；从柱洗脱霉菌毒素；将包含霉菌毒素的经洗脱样品收集在多孔样品板(例如，48孔样品板、96孔样品板等)；将经洗脱样品密封在多孔样品板中；转移密封的多孔样品板；从转移的多孔样品板中移除经洗脱样品；以及分析(例如，用UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器分析)移除的经洗脱样品。
在另一方面，本公开提供了一种分离包含霉菌毒素的样品的方法。该方法包括将样品装载在柱上，其中该柱包括亲和树脂(例如，免疫亲和树脂)；从柱洗脱霉菌毒素；将包含霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中，其中样品板是96孔板；将经洗脱样品密封在样品板中；转移在密封的样品板中的经洗脱样品；以及使用UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器来分析96孔板格式中的经洗脱样品。
在另一方面，一种分离包含霉菌毒素的样品的方法。该方法包括将包含霉菌毒素的样品引入包括亲和力或免疫亲和树脂的色谱柱中；从该柱洗脱样品，其中霉菌毒素与亲和或免疫亲和树脂结合；以及将包含霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中。
在上述方面中任一方面的一些实施方案中，亲和树脂是包含霉菌毒素特异性抗体的免疫亲和树脂。在其它实施方案中，亲和树脂包含霉菌毒素特异性适体或分子印迹聚合物(MIP)。在一些实施方案中，样品含有单一霉菌毒素或多种霉菌毒素。在一些实施方案中，免疫亲和树脂含有多种抗体以一次纯化多种霉菌毒素。在某些实施方案中，亲和树脂含有多种适体和/或MIP以一次纯化多种霉菌毒素。在一些实施方案中，流动包括在施加在柱顶部处的正压下流动。在一些实施方案中，流动包括通过使用负压流动。使用负压可以包括使用真空歧管。在一些实施方案中，当样品大于约1mL时，装载样品包括装载样品两次或更多次。
在一些实施方案中，样品板是96孔板。在一些实施方案中，96孔板是96个孔或96个无凸缘/无边缘管堆积在96孔架上的一体式板。在一些实施方案中，孔或管体积的范围是从约0.5mL到约1.5mL。在一些实施方案中，样品板是部分板。
样品板不必限于96孔板格式。例如，一些实施方案以24孔格式、48孔格式或384孔格式为特征。另外的格式在本公开的范围内。
在一些实施方案中，该方法包括借助于多通道移液管和正压处理器或真空歧管同时处理多个样品。在一些实施方案中，在收集经洗脱样品之后，干燥或重构经洗脱样品以改变方法的溶剂或浓缩经洗脱样品。在一些实施方案中，在收集经洗脱样品之后，将经洗脱样品密封在样品板中；以及转移在密封的样品板中的经洗脱样品。
在一些实施方案中，该方法包括分析经洗脱样品。在一些实施方案中，分析经洗脱样品包括使用UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机来分析样品。在一些实施方案中，分析样品包括使用荧光读板机来分析样品。在一些实施方案中，该方法包括将经洗脱样品分成第一经洗脱部分和第二经洗脱部分；将第一经洗脱部分转移到UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机以分析这些样品；以及将第二经洗脱部分转移到荧光读板机以分析这些样品。在一些实施方案中，用荧光读板机分析样品包括检测霉菌毒素，该霉菌毒素包括选自包括以下的组中的至少一者：黄曲霉毒素、赭曲毒素、脱氧瓜萎镰菌醇、瓜萎镰菌醇、T2/HT2毒素、棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、橘霉素、伏马毒素或它们的类似物。
在一些实施方案中，该方法是高通量的，还包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素、赭曲毒素、伏马毒素或玉米赤霉烯酮。在一些实施方案中，检测黄曲霉毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1或黄曲霉毒素M2。在一些实施方案中，检测赭曲毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：赭曲毒素A、赭曲毒素B、赭曲毒素C或赭曲毒素TA。在一些实施方案中，检测伏马毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3或伏马毒素B4。在一些实施方案中，检测玉米赤霉烯酮的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1示出了根据本公开的用于样品制备的样品板格式。
图2为说明根据本公开的方法的流程图。
具体实施方式
IAC柱可以用于霉菌毒素诊断的样品制备。可以通过荧光计、HPLC或LC/MS分析所得纯化样品。虽然IAC提供优异的特异性和富集性，但是IAC样品制备的程序通常手动进行以及耗时。并且对于每天测试大量样品的实验室，ELISA可作为高通量方法采用。然而，ELISA是筛选工具，不能提供足够的准确度和关于分析物的详细信息。例如，ELISA仅可以确定组合的所有黄曲霉素的浓度，而不是黄曲霉素B1、B2、G1、G2、M1和M2的分布。此外，ELISA不能一次确定多种霉菌毒素。本公开的高通量霉菌毒素分析提供了作为UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的仪器分析的性能，并且还提供了作为ELISA的高通量特征。
IAC柱可以在高通量解决方案中用作样品制备工具，以使用荧光计、UHPLC/MS、HPLC/MS和LC/MS方法等等支持分析。在一个示例中，在提取样品以及过滤后，将样品装载到板(诸如96孔板)上的IAC柱。洗涤和洗脱可以与样品装载相同的方式进行。样品在施加在顶部上的正压下或通过使用真空歧管流动通过柱。如果需要装载超过1mL的样品，则可以将样品装载多次，即两次或更多次。收集所得经洗脱样品，诸如用96孔微板。可以通过用期望的溶剂干燥和重构来完成缓冲液交换，如果需要的话该溶剂可以有助于浓缩洗脱液。可立即分析所收集的样品(带有分离的霉菌毒素的洗脱液)或将所收集的样品转移到另一装置进行分析。例如，所得方法可以用于针对特定靶标的测定中或针对在通过另一种技术诸如荧光计、UHPLC/MS、HPLC/MS和/或LC/MS方法进一步检查之前进行分析物的纯化和浓缩的测定中。
IAC(和其它亲和柱，诸如基于适体或MIP的那些)可以选择性地从复杂样品分离给定化合物。IAC的基础依赖于抗体的选择性结合。IAC中的抗体(诸如例如抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗赭曲霉素单克隆抗体等)可针对它们的选择性和抗体对给定分析物诸如霉菌毒素的强结合性来选择。IAC的一些用途包括制备性应用或选择性分析。
在一些示例中，霉菌毒素是靶向分析物。霉菌毒素是由真菌产生的毒性化合物。霉菌毒素的一些示例包括黄曲霉毒素、赭曲毒素、单端孢霉烯诸如脱氧瓜萎镰菌醇(DON)、瓜萎镰菌醇、T2/HT2毒素、棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、橘霉素、伏马毒素或它们的类似物。样品可以含有单一霉菌毒素或多种霉菌毒素。
已经示出几种化合物属于黄曲霉毒素组。黄曲霉毒素组的成员包括B1、B2、G1、G2、M1和M2。黄曲霉毒素具有类似的结构并且形成一组高度氧化的天然存在的杂环化合物，该杂环化合物在暴露于紫外光时发荧光。赭曲毒素组的成员包括赭曲毒素A、赭曲毒素B、赭曲毒素C和赭曲毒素TA，并且是在7-羧基处通过酰胺键联结到L-β苯丙氨酸的3,4二氢-3-甲基异香豆素的结构相关衍生物。单端孢霉烯诸如脱氧脱氧瓜萎镰菌醇(DON)和相关的倍半萜烯形成另一类霉菌毒素。单端孢霉烯是由各种真菌产生的一组约50种生物活性倍半萜烯。单端孢霉烯通过12,13-环氧-单端孢菌-9-烯环系统来化学表征。玉米赤霉烯酮，也被称为RAL和F-2霉菌毒素，是一些镰刀菌和赤霉菌种产生的强效雌激素代谢产物。玉米赤霉烯酮组的成员包括玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。伏马毒素是一组来源于镰刀菌以及它们的李瑟组菌纲的霉菌毒素。伏马毒素组的成员包括伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3或伏马毒素B4。
制备性应用可以使用IAC。例如，含有分析物的样品可以应用于免疫亲和柱，并且允许未保留的样品组分通过。然后通过破坏抗体与带有洗脱缓冲液的分析物之间的交互作用来洗脱分析物。IAC可用于分析物的直接检测和/或纯化。
生物化学以及其它领域可以使用IAC从复杂样品中选择性地纯化目标化合物。已经通过此方法分离的一些化合物包括蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、细菌、病毒颗粒、药物和环境剂。IAC也可以用于通过在IAC柱之后放置合适的检测器来直接检测分析物。对于这种类型的应用，分析物可能需要以相对高的浓度存在，并且在允许良好检测极限的尖锐、明确界定峰中洗脱。根据期望的检测水平，UV/可见吸光度、荧光和MS可用于检测分析物。已经通过这种方法测量的分析物的一些示例包括人血清白蛋白、重组组织型纤溶酶原激活剂、重组抗凝血酶III、IgG、大肠杆菌、异丙隆、苯基脲除草剂、联苯胺、二氯联苯胺、氨基叠氮苯、偶氮染料、三嗪、己烯雌酚、乙酰胆碱酯酶、转铁蛋白和胰岛素。
可以使用IAC在通过第二方法分析之前从样品移除特定分析物或分析物组。在一些示例中，抗体固定到载体上并填充到小的一次性注射器或微型柱中。然后通过亲和载体施加样品，该亲和载体结合感兴趣的分析物，而其它样品组分被洗掉。然后使洗脱缓冲液通过亲和载体以洗脱提取的分析物。
除了移除不期望的样品组分之外，IAC还可以浓缩分析物。可以收集经洗脱级分，将其干燥，并且溶解在更适合分析的溶剂中。该样品也可以在分析之前进行衍生。IAC也与其它方法耦合以分析尿液、食品、水和土壤提取物。已经通过这种方法检查的分析物的示例包括α1-抗胰蛋白酶、阿特拉津、苄基青霉素酰基-肽、牛血清白蛋白、多菌灵、氯霉素、皮质醇、克仑特罗和苯妥英等等。IAC可以直接耦合到第二分析技术以进行分析。例如，通过将IAC与MS(IAC–MS)组合，该方法使用抗原-抗体交互作用的选择性和MS的敏感性。
IAC通常在实验室中以最小的通量进行或者用MS花费很长时间。当前的IAC方法还需要来自用户大量的实际操作时间，这增加了通量时间以及增加了系统和方法中的误差量。
通常，本技术涉及用于霉菌毒素分析的方法、装置和试剂盒。特别地，该技术利用用于IAC的多路复用解决方案。IAC柱可以含有针对单一霉菌毒素或多种霉菌毒素的抗体。使用样品和允许同时运行多个样品的收集板(例如，96孔微板)有助于形成高通量方法。在一次用IAC柱处理多个样品使得样品能够准备好用一种或多种分析技术(例如，UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器)进行霉菌毒素分析，包括同时用多于一种技术处理样品。
图1公开了带有柱102和样品板104的系统100。系统100可以用于分离带有至少一种霉菌毒素的样品的方法中。柱102可以包括可以一次纯化一种或多种霉菌毒素的免疫亲和树脂。将样品装载到柱102。基于柱102的大小和样品/试剂的大小，可以执行多于一次装载(并且在一些情况下需要多于一次装载)。例如，当96孔IAC板的孔/管具有足够的空间以适应高达1mL的样品/试剂并且需要装载多于1mL的样品/试剂时，执行多次装载。大型样品装载体积的范围可以从约5mL到约10mL或大于10mL。
可使用多通道移液管一次填充多个微板，例如96孔微板和384孔微板。为了减少该方法的时间，可以借助于多通道移液管或其它自动多通道样品装载装置同时处理大量样品。此外，多通道移液管可用于帮助维持或提供期望的样品顺序。也就是说，移液管可以自动化以减少操作员错误。
在一些示例中，可以将正压处理器或真空歧管添加到系统100中。正压处理器的一个示例是沃特世正压-96处理器(Waters Positive Pressure-96Processor)(购自马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corp.,Milford,MA))。正压可用于在柱102的顶部处施加正压，该正压可以减少流体流动通过柱102的时间量。还可以将真空歧管添加到系统100。真空歧管可以在柱102的底部处施加负压，该负压将会将流体抽吸通过柱。在一些示例中，使用负压包括使用真空歧管。类似于正压处理器，真空歧管将减少流体流动通过柱102的时间量。
在装载样品之后，该方法包括洗涤柱102。洗涤会移除柱102中的任何不需要的材料，同时保留与树脂结合的材料，即靶向分析物诸如霉菌毒素。免疫亲和树脂在洗涤期间维持与分析物的交互作用，并在洗脱期间释放分析物。分析物(例如，霉菌毒素)将由免疫亲和树脂保留，而未保留的化合物从柱102中洗出。在一些示例中，从柱102洗出的未保留化合物不被保存用于进一步分析。未保留的化合物可以由用户处理掉。可以基于柱102的免疫亲和树脂、分析物和/或将被洗掉的不需要的材料来选择洗涤溶液。柱102通常可用水或缓冲液(例如，盐水和/或基于磷酸盐的缓冲液)洗涤。
在从柱102洗涤不需要的材料之后，该方法包括通过柱102洗脱霉菌毒素。例如，可以将洗脱缓冲液添加到柱102中，这破坏抗体-分析物交互作用。洗脱缓冲液包含有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、乙腈等)。在实施方案中，有机溶剂可以被稀释或浓缩到各种程度。缓冲液可以是高度酸性的或碱性的。在一些实施方案中，缓冲液可以具有各种盐含量(即，缓冲液的离子强度可以设置为期望的水平或可以在洗脱过程中变化)。在一些实施方案中，缓冲剂可以包括变性剂，诸如盐酸胍或尿素等。通过使洗脱缓冲液流动通过柱102，可以从免疫亲和树脂中释放分析物。可以基于免疫亲和树脂和分析物的特性来选择洗脱缓冲液。可以使用不同强度的洗脱缓冲液。例如，对于免疫亲和树脂与分析物之间的强交互作用，可能需要使用强缓冲液以克服免疫亲和树脂与分析物之间的交互作用，并且从免疫亲和树脂释放分析物。
可以收集经洗脱霉菌毒素以进行进一步的分析。例如，可以将含有霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板104中。样品板104可以是96孔板或任何其它数量的孔，例如24孔板。样品板104可以是一体式板或者可以具有堆积在孔架上的无凸缘/无边缘管。例如，样品板104可以是96孔板，该96孔板带有96个孔或96个无凸缘/无边缘管堆积在96孔架上的一体式板。在一些示例中，样品板104的孔或管体积的范围是从约0.1mL到约3mL、从约0.5mL到约1.5mL或从约0.05mL到5mL。在一些示例中，可以一次加载0.7mL。样品板104的所有孔不必一次使用。样品板104可以是部分板。例如，在不需要所有孔的96孔板中，样品板104可以用胶带粘住以保存未使用的孔。如果用户没有足够的样品使用所有的柱(例如，所有96个柱)，则可以使用部分板。然后可以在另一次使用已保存的未使用的孔。
可以选择免疫亲和树脂以保留一种特定分析物或多种分析物。免疫亲和树脂可以包括霉菌毒素特异性抗体、适体或分子印迹聚合物(MIP)。免疫亲和树脂的一个示例包括珠粒直径的范围是从约40μm到约200μm的
珠粒，(购自伊利诺伊州芝加哥GE医疗(GE Healthcare,Chicago,Illinois))。也可以使用其它珠粒直径，包括100微米。柱102可以是IAC微型柱，并且可以含有针对单一霉菌毒素或多种毒素的抗体。在一些示例中，柱102可以类似于购自VICAM的试剂盒，诸如例如AflaOchra HPLCTM、AOZ HPLCTM、
LC/MS/MS、
AflaBTM、Afla M1TM、AflaTest WBTM、AflaTest WB SRTM、OchraTestTM、OchraTest WBTM、FumoniTestTM、FumoniTest WBTM、ZearalaTestTM、ZearalaTest WBTM、DONtest HPLCTM、DONtest WBTM、DON-NIVTMWB、T-2testTM、T-2/HT-2TMHPLC、Afla M1
和
(购自马萨诸塞州米尔福德市的VICAM(VICAM,Milford,MA))。
系统100可以提供柱102以使得能够分析含有一种或多种霉菌毒素的单个样品。免疫亲和树脂可以具有与其结合的抗体。免疫亲和树脂可以含有多种抗体以一次纯化多种霉菌毒素。因此，系统100可以使用单独的柱102来制备带有多种霉菌毒素的样品。
免疫亲和树脂可以包括多种抗体，并且每种抗体可以对霉菌毒素具有特异性。例如，免疫亲和树脂可以包括对黄曲霉毒素具有特异性的第一抗体和对赭曲毒素具有特异性的第二抗体。免疫亲和树脂的抗体的数量可以对应于靶向的霉菌毒素的数量。例如，在抗体的数量与霉菌毒素的数量之间可以存在1:1的关系。该关系可以更多或更少，包括例如0.5:1或2:1。在一些实施方案中，该关系可以落在这些范围之外，这取决于抗体的活性、耦合效率和柱容量要求。
柱102中树脂的总量可根据样品中的霉菌毒素的期望的百分比回收率(例如，75％、80％、81％、82％、85％、87％、89％、90％、93％或更多)以及期望的柱流速而变化。(例如，小于或约为3mL/min，小于或约1滴/秒)。
与霉菌毒素特异性抗体耦合的免疫亲和树脂可以堆积在96孔微板格式中。在一些示例中，由于与分析物的化学相容性良好，可以在各种应用中使用聚丙烯。随着多通道移液管和机器人的出现，聚丙烯96孔板在高通量应用中特别受欢迎。它们经常与蛋白质或肽样品一起使用的另一个原因是，与玻璃容器相比，它们不太可能因离子吸引力而导致分析物损失。聚丙烯容器上的任何分析物损失(当其发生时)都可能是疏水交互作用的结果。
在收集霉菌毒素之后，可以将收集的样品密封在样品板104中。也可以密封微型柱的顶部和底部以防止蒸发。96孔板或单独的微型柱可以在顶部和底部上封盖。可以将整个板密封在包装中以防止蒸发。盖或密封垫是用于样品容器的互补元件，以防止污染、蒸发和意外飞溅。正如小瓶有各种盖一样，用于样品板104的密封选项也可以与LC/MS注射器兼容。通常，一些密封盖具有与孔的形状和尺寸匹配的压花结构，使得盖通过摩擦保持在板的顶部上。其它盖是带有粘合剂侧以将膜附接到板的膜。无论形状和密封机制如何，建议盖不应与样品溶液直接接触，以防止潜在污染和样品损失。
如有必要，可以进行干燥和重构以改变溶剂或浓缩样品。例如，在收集经洗脱样品之后，可以将经洗脱样品干燥或重构以改变方法的溶剂或浓缩经洗脱样品。在一些示例中，可以通过干燥和用期望的溶剂重构来进行缓冲液交换。
收集之后和分析经洗脱样品之前，可以转移经洗脱样品。可转移在密封的样品板104中的经洗脱样品。例如，可以密封样品板104并且将其送到UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS以进行测定。在一些示例中，可以密封含有经洗脱样品的样品板104(诸如微板)并且将其转移到UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机以进行分析。
也可使用荧光读板机来分析样品(在添加显影剂/衍生剂后)。可以添加到板中的一些常见衍生剂/显影剂的示例包括溴、碘、三氟乙酸(TFA)。可以将经洗脱样品分成多个部分以送去分析。部分的数量可以通过需要用于分析样品的不同方法的数量来确定。例如，可将经洗脱样品分成第一经洗脱部分和第二经洗脱部分。可将第一经洗脱部分转移到UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机以分析样品，并且可将第二经洗脱部分可以转移到荧光读板机以分析样品。
在一些示例中，用荧光读板机分析经洗脱样品包括检测霉菌毒素，这些霉菌毒素包括选自包括以下的组中的至少一者：黄曲霉毒素、赭曲毒素、脱氧瓜萎镰菌醇、瓜萎镰菌醇、T2/HT2毒素、棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、橘霉素、伏马毒素或它们的类似物。
分析样品包括使用UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器来分析96孔板格式中的经洗脱样品。在一些示例中，可将经洗脱样品用水稀释并且注射到与荧光检测器(FLD)/UV/质量检测器连接的HPLC或UHPLC中。
本公开的方法是高通量的并且包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素、赭曲毒素、伏马毒素或玉米赤霉烯酮。检测黄曲霉毒素的分布可以包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1或黄曲霉毒素M2。检测毒素的分布可以包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：赭曲毒素A、赭曲毒素B、赭曲毒素C或赭曲毒素TA。检测伏马毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3或伏马毒素B4。检测玉米赤霉烯酮的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。
图2为说明根据本公开的方法200的流程图。方法200描述了高通量亲和柱分离带有霉菌毒素的样品的过程。方法200可以使用如图1中所述的系统100。方法200包括任选的步骤。一些步骤(例如，步骤204或步骤210)的虚线轮廓指示步骤可以是任选的。方法200可以通过在柱(202)中装载带有霉菌毒素的样品来开始。可以通过柱洗涤样品中不需要的材料(204)。洗涤柱后，可以从柱洗脱霉菌毒素(208)。可以收集经洗脱样品(210)。可使用样品板(诸如微板)可来收集样品。可以通过正压或负压(真空)辅助洗涤和洗脱样品。在一些示例中，可以密封经洗脱样品(210)。密封经洗脱样品可以防止污染和蒸发。密封经洗脱样品也可以在转移经洗脱样品时防止样品损失。在一些示例中，转移经洗脱样品(212)。可以转移经洗脱样品以用于分析目的。可以通过几种不同的方法分析经洗脱样品(214)。例如，可以通过UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS和/或荧光读板机来分析经洗脱样品。
在一些示例中，本公开包括一种分离带有霉菌毒素的样品的方法。该方法包括将带有霉菌毒素的样品引入到色谱系统中。色谱系统可以包括由色谱系统的内部和色谱系统的内部的带有亲和树脂(诸如免疫亲和树脂)的至少一部分限定的流动路径。该方法还包括通过流动路径洗脱霉菌毒素，并将包含霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中。该方法可以任选地包括在引入样品之后但在从柱中的树脂洗脱霉菌毒素之前洗涤柱。
在一些示例中，本公开包括分离带有霉菌毒素的样品的方法。该方法包括将带有霉菌毒素的样品引入到包括由流体系统的内部限定的流动路径的流体系统。流体系统的内部的至少一部分可以包括亲和树脂(例如，免疫亲和树脂)。该方法还可包括通过流体系统洗脱样品并将包含霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板。霉菌毒素可以与亲和树脂结合。
在一些示例中，该方法还包括通过使用UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器分析96孔板格式中的经洗脱样品来分析经洗脱样品。
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。例如，可以使用其它色谱系统或检测系统。
Claims (28)
1.一种分析包含霉菌毒素的样品的方法，所述方法包括：
将所述样品装载在柱中，其中所述柱包括亲和树脂；
从所述柱洗脱所述霉菌毒素；
将包含所述霉菌毒素的经洗脱样品收集在多孔样品板中；
将所述经洗脱样品密封在所述多孔样品板中；
转移所密封的多孔样品板；
从所转移的多孔样品板中移除所述经洗脱样品；以及
分析所移除的经洗脱样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中分析所移除的经洗脱样品包括使用UHPLC/MS、HPLC/MS、LC/MS或荧光微板读数器分析所移除的经洗脱样品。
3.一种分离包含霉菌毒素的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述霉菌毒素的所述样品引入到包括亲和树脂的色谱柱中；
从所述柱洗脱所述霉菌毒素；以及
将包含所述霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中。
4.一种分离包含霉菌毒素的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述霉菌毒素的所述样品装载在包括亲和树脂的柱上；
从所述柱洗脱所述样品，其中所述霉菌毒素与所述亲和树脂结合；以及
将包含所述霉菌毒素的经洗脱样品收集在样品板中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述亲和树脂包括免疫亲和树脂，所述免疫亲和树脂包含霉菌毒素特异性抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品含有单一霉菌毒素或多种霉菌毒素。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫亲和树脂含有多种抗体以一次纯化多种霉菌毒素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中流动包括在施加在所述柱顶部处的正压下流动。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中流动包括使用负压流动。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用负压包括使用真空歧管。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中当所述样品大于约1mL时，装载所述样品包括装载所述样品两次或更多次。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中所述样品板是96孔板。
13.根据权利要求1、2或12中任一项所述的方法，其中所述96孔板是96个孔或96个无凸缘/无边缘管堆积在96孔架上的一体式板。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述孔或所述管体积的范围是从约0.5mL到约1.5mL。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述样品板是部分板。
16.根据权利要求1至7或11至15中任一项所述的方法，所述方法还包括：
借助于多通道移液管和正压处理器或真空歧管同时处理多个样品。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在收集所述经洗脱样品后，干燥或重构所述经洗脱样品以改变所述方法的溶剂或浓缩所述经洗脱样品。
18.根据权利要求3至17中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在收集所述经洗脱样品后，将所述经洗脱样品密封在所述样品板中；以及
转移在所密封的样品板中的所述经洗脱样品。
19.根据权利要求3至17中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述经洗脱样品。
20.根据权利要求1、2或19中任一项所述的方法，其中分析所述经洗脱样品包括使用UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机来分析所述样品。
21.根据权利要求1、19或20中任一项所述的方法，其中分析所述样品包括使用荧光读板机来分析所述样品。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述经洗脱样品分成第一经洗脱部分和第二经洗脱部分；
将所述第一经洗脱部分转移到UHPLC/MS、HPLC/MS或LC/MS的自动取样机以进行分析；以及
将所述第二经洗脱部分转移到荧光读板机以进行分析。
23.根据权利要求22所述的方法，其中用所述荧光读板机分析所述样品包括检测霉菌毒素，所述霉菌毒素包括选自包括以下的组中的至少一种霉菌毒素：黄曲霉毒素、赭曲毒素、脱氧瓜萎镰菌醇、瓜萎镰菌醇、T2/HT2毒素、棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、橘霉素、伏马毒素或它们的类似物。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的，所述方法还包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素、赭曲毒素、脱氧瓜萎镰菌醇、瓜萎镰菌醇、T2/HT2毒素、棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、橘霉素、伏马毒素或它们的类似物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中检测黄曲霉毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1或黄曲霉毒素M2。
26.根据权利要求24所述的方法，其中检测赭曲毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：赭曲毒素A、赭曲毒素B、赭曲毒素C或赭曲毒素TA。
27.根据权利要求24所述的方法，其中检测伏马毒素的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3或伏马毒素B4。
28.根据权利要求24所述的方法，其中检测玉米赤霉烯酮的分布包括检测选自包括以下的组中的至少一者的分布：玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。
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