CN115297929B - 调节卵泡生成以治疗卵巢衰老的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与抗缪勒管激素(AMH)的经修饰蛋白质相关的方法和组合物，用于调节女性的卵泡生成，特别是调节卵泡的活化和成熟以及未成熟(原始)卵泡的耗减。在某些实施方案中，调节或抑制女性的卵泡生成能治疗卵巢老化、暂停或减缓卵巢老化并且/或者延迟绝经的开始和/或与绝经相关的症状、由性腺毒性治疗引起的卵巢早衰、或由调节卵泡生成和卵巢生物学的基因中的遗传突变引起的疾病或病况。

Description

调节卵泡生成以治疗卵巢衰老的组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2019年11月13日提交的美国临时申请号62/935,048的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
在一些情况下，本公开内容涉及用于调节卵泡生成以治疗卵巢衰老、暂停或减缓卵巢老化、延迟绝经或围绝经期、治疗或以其他方式减轻绝经或围绝经期症状或其组合的方法和组合物。
通过引用并入
在本公开全文中已经对其他文件进行了引用和引述，例如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容。出于所有目的，所有此类文件均通过引用整体并入本文。
发明内容
在许多情况下，女性会欢迎和/或受益于治疗(例如延迟、抑制或预防)卵巢衰老和/或控制(例如延迟、抑制或预防)卵巢老化(例如卵巢衰老)的疗法。在许多情况下，卵巢老化可能是由时间、遗传和/或环境因素引起的。此外，在某些情况下，许多接受性腺毒性治疗(例如但不限于化疗和放疗和/或卵巢切除术)的女性会欢迎和/或受益于减少(例如预防、降低、抑制)她们卵巢储备的耗减的疗法。在一些情况下，许多经历卵巢储备过早耗减的女性会欢迎和/或受益于减少(例如预防、降低、抑制并且/或者延迟)她们卵巢储备耗减的疗法。在许多情况下，具有卵巢储备过早损失遗传倾向的女性会欢迎和/或受益于调节(例如预防、减少、抑制并且/或者延迟)卵泡生成和/或减少(例如预防、降低、抑制并且/或者延迟)她们卵巢储备耗减的疗法。在一些情况下，例如，具有对卵泡生成和卵巢生物学至关重要的基因突变的女性(例如AR、BMP15、ESR1、FIGLA、FMR1、FOXE1、FOXL2、FOXO3、FSHR、GALT、GDF9、INHA、NOBOX、NR5A1、SYCP2L、TGFBR3)将受益于控制(例如预防、减少、抑制并且/或者延迟)卵巢储备耗减的疗法。在本文中提供的具体实施方案中是治疗(例如延迟、抑制或预防)女性(例如绝经前和围绝经期女性)卵巢衰老和/或控制(例如延迟、抑制或预防)卵巢老化(例如衰老)的治疗性方法。在一些实施方案(例如，同时还控制绝经的开始)中，本文提供的方法包括治疗(例如，抑制、预防、降低其严重性或以其他方式改善)卵巢储备生理性耗减和/或过早耗减。在具体实施方案中，本文提供的方法包括施用本文更详细描述的治疗剂(例如，以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，这种治疗方法与卵细胞、胚胎或卵巢组织的冷冻保存方法类似，可以保存妇女的生殖潜力，而且它的侵入性较小，并不一定需要女性接受卵巢过度刺激、体外受精(IVF)或组织切除手术。在一些情况下，就像卵母细胞、胚胎和卵巢组织的冷冻保存可以让女性推迟尝试怀孕的时间一样，这种疗法使得女性能够在诸多生活事件中计划怀孕。例如，在一些情况下，本文提供的方法或疗法涉及提高面临过早绝经风险的女性的生育能力的方法(例如，因为使用本文提供的方法的女性能够延迟绝经并给予自己更长的怀孕窗口时间，例如，从而允许自己在以后的生活中怀孕)。在诸如本文所述的各种情况下，许多妇女面临过早绝经的风险，并且最终她们的生育期在其能够满足她们想要孩子和组建家庭的愿望之前结束。因此，在某些情况下，本文提供的疗法在改善女性的精神和/或身体健康方面非常有价值，特别是当女性面临潜在的性腺毒性治疗的身体和精神压力时。
在许多情况下，女性会欢迎和/或受益于控制(例如，延迟、抑制或预防)绝经(和/或绝经过渡期)开始的疗法。此外，在某些情况下，许多女性会欢迎和/或受益于治疗(例如，抑制、预防、降低其严重性或以其他方式改善)与绝经过渡期(和/或绝经)相关的症状的疗法。在本文提供的具体实施方案中是控制(例如，延迟、抑制或预防)女性(例如，围绝经期女性)绝经开始的治疗性方法。在一些实施方案中(例如，同时还控制绝经的开始)，本文提供的方法包括治疗(例如，抑制、预防、降低其严重性或以其他方式改善)与绝经过渡期相关的症状。在具体实施方案中，本文提供的方法包括施用本文更详细描述的治疗剂(例如，以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，这样的疗法与控制怀孕的方法相似，同时也减轻与月经相关的其他症状。在一些情况下，就像节育可以让女性控制和计划自己的生活一样，这种疗法使得女性能够在诸多生活事件中计划绝经。例如，在某些情况下，本文提供的方法或疗法涉及提高40岁以上女性的生育能力的方法(例如，因为使用本文提供的方法的女性能够延迟绝经并给予自己更长的怀孕窗口时间，例如，从而允许自己在以后的生活中怀孕)。在一些情况下，疗法(例如，还)减轻症状(例如，与绝经和/或绝经过渡期相关的症状)，例如热潮红和/或本文所述的其他症状。在一些情况下，这种效果适用于改善女性在经历绝经和/或绝经过渡期时的生活质量。在诸如本文所述的各种情况下，许多女性在她们生活中的情绪和/或身体上的困难时期经历绝经过渡期，并最终经历绝经。因此，在某些情况下，本文提供的疗法特别是在女性生命中的情绪和身体过渡期期间在改善女性的心理和/或身体健康方面非常有价值。
在某些实施方案中，本文描述了与用于改善或保护卵巢功能的经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物。在一些实施方案中，与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物改善或保护卵巢的内分泌功能。在一些实施方案中，卵巢内分泌功能的丧失是卵泡丧失的结果。在一些实施方案中，卵巢功能或卵巢内分泌功能的丧失是性腺毒性治疗(例如，化疗、放疗和手术切除)的结果。在一些实施方案中，卵巢功能或卵巢内分泌功能的丧失结果是与性功能、免疫功能、葡萄糖代谢、心理健康、睡眠、怀孕、心脏功能、骨密度、神经认知功能，或其组合相关的失调或病症。在一些实施方案中，卵巢功能或卵巢内分泌功能的破坏导致病态，例如不育、心血管疾病、骨质疏松症、自身免疫病症、糖尿病、肥胖症、脱发、中风、痴呆或其组合。在某些实施方案中，本文描述了与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物，用于维持或改善性功能、免疫功能、葡萄糖代谢、心理健康、睡眠、怀孕、心脏功能、骨密度、神经认知功能或其组合。在某些实施方案中，本文描述了与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物，用于预防化疗诱导的卵巢功能衰竭(CIOF)、不育和其他绝经相关的病态，例如心血管疾病、骨质疏松症、自身免疫病症、糖尿病、肥胖症、脱发、中风、痴呆、或其组合。在某些实施方案中，本文描述了与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物，用于延迟或预防卵巢衰老。
绝经开始的不可预测性使得计划受孕变得困难且难以管理。此外，绝经症状对女性的身心健康有害。为了解决这些问题，本文描述的本公开的某些实施方案包括用于治疗卵巢衰老和控制绝经的开始和/或与绝经过渡期(和/或绝经)相关的症状的方法和组合物。在一些情况下，卵巢衰老的治疗和绝经开始的控制和/或与绝经过渡期和/或绝经相关的症状的控制通过本文提供的方法来实现，其中所述方法调节卵泡生成(例如，抑制、延迟或减少卵泡生成[例如减慢卵泡生成的速度])。
在某些实施方案中，本文提供了针对或用于调节(例如，抑制、减少)卵泡生成以治疗卵巢衰老的方法和组合物。在一些情况下，原始卵泡的激活或耗减会逐渐降低生殖潜力。在一些情况下，原始卵泡的激活或耗减会逐渐降低卵巢功能或卵巢的内分泌功能。在一些情况下，女性卵泡的加速激活或耗减(例如，通过卵泡成熟的生物学过程，例如未成熟的原始卵泡变成排卵前卵泡)会降低生殖潜力。在一些情况下，女性卵泡的加速激活或耗减(例如，通过卵泡成熟的生物学过程，例如未成熟的原始卵泡变成排卵前卵泡)会降低卵巢功能或卵巢的内分泌功能。在本文的某些实施方案中提供了延迟卵巢衰老和延长生殖潜力和卵巢功能的方法，例如通过抑制女性中的卵泡生成(例如，所述方法包括例如以治疗有效量和/或方式将本文提供的药剂施用给女性(例如，有需要的女性))。在一些实施方案中，本文提供了用于例如通过调节卵泡生成和卵巢衰老(例如，根据本文所述的过程)来治疗绝经和/或绝经过渡期的症状或与绝经和/或绝经过渡期相关的症状的方法。
在一些实施方案中，本文提供了例如通过向女性(例如，有需要的女性)施用治疗有效量的本文所述的药剂来调节(例如，延迟或减少(例如，减慢其速度))卵泡生成和卵巢衰老的方法。在具体实施方案中，本文提供了例如通过向女性(例如，有需要的女性)施用治疗有效量的本文所述的药剂来调节(例如，延迟或减少(例如，减慢其速度))卵泡成熟(和/或死亡)和/或未成熟(例如，原始)卵泡耗减的方法。
在某些实施方案中，本文提供的方法(例如，治疗卵巢衰老、调节卵泡生成、控制绝经、治疗围绝经期的开始等的方法)包括施用适合于其的(例如，治疗性)药剂(例如，以治疗有效量和/或方式，如本文更详细描述的)。在具体实施方案中，所述药剂是蛋白质的转化生长因子β(TGF-β)超家族的多肽，或其变体(在本文中也称为“经修饰蛋白质”)。在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的药剂和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，本文提供的是调节(例如，下调)卵泡生成(例如，卵泡生成速度)，调节(例如，降低、延迟、抑制、预防)卵巢老化，调节(例如，下调)(例如，未成熟的或原始的)卵泡耗减(例如，耗减速度)，和/或调节(例如，下调)卵泡成熟(例如，卵泡成熟速度)的药剂。在具体实施方案中，所述药剂是转化生长因子β(TGF-β)超家族蛋白或其变体。在一些实施方案中，TGF-β超家族蛋白是抗缪勒管激素(“AMH”)或其变体，抗缪勒管激素是由卵巢卵泡发育产生的激素。在一些情况下，增加AMH活性会延迟绝经的开始，缓解绝经症状和/或治疗早发性卵巢功能不全(POI)，例如通过降低卵泡成熟速度和/或(例如，原始)卵泡耗减。
在某些实施方案中，本公开进一步包括确定卵巢储备的下降或原始卵泡募集和成熟速度的增加，以及施用本文所述的本公开的组合物以延迟绝经。在一些情况下，延迟绝经可以增加女性的生育窗口。在一些情况下，延迟绝经会导致绝经加速的合并症和病况发作的一级预防。
在某些实施方案中，本文描述的是具有SEQ ID NO:1的野生型抗缪勒管激素(AMH)蛋白的经修饰蛋白质，其包含至少两个选自以下的修饰：(a)SEQ ID NO:1的氨基酸位置448至452处的切割识别位点内或附近的置换或插入，其中所述切割识别位点包含序列RAQRS；(b)在SEQ ID NO:1的具有序列PRYG的氨基酸位置501和504之间或在SEQ ID NO:1的具有序列GNHV的氨基酸位置504和507之间的糖基化位点的插入；(c)用TGF-β家族蛋白的N末端区域对AMH中的N末端区域的置换；(d)在SEQ ID NO:1的氨基酸位置254-255处的二碱基切割位点内的置换；(e)肽标签在AMH序列内的添加；(f)来自糖蛋白的基序的添加；和(g)在AMH的N末端区域的缺失以及在AMH的C末端处修饰或蛋白质序列的插入。在一些实施方案中，基序RAQRS内的置换包括用属于TGF-β超家族的不同蛋白质的切割识别位点或针对被不同蛋白酶识别而优化的切割位点替换RAQRS。在一些实施方案中，置换或插入选自以下：(a)用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；(b)用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；(c)用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基；(d)用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；(e)用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基；以及(f)在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基；用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基；以及在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包含选自以下的置换：(a)用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；(b)用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；(c)用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；(d)用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；(e)用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。如权利要求1所述的经修饰蛋白质，其中糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；以及用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括在C末端区域中4个氨基酸的置换。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用PNAS、PNSS、LNSS、MNAS或GNHT置换PRYG。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用GNHT置换GNHV。在一些实施方案中，TGF-β家族蛋白选自TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA。在一些实施方案中，TGF-β1的N末端区域包含与SEQ ID NO:146具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，TGF-β1的N末端区域包含根据SEQ ID NO:146的序列。在一些实施方案中，TGF-β2的N末端区域包含与SEQ ID NO:147具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，TGF-β2的N末端区域包含根据SEQ ID NO:147的序列。在一些实施方案中，修饰TGF-β1的N末端区域或TGF-β2的N末端区域以改善分泌、切割、稳定性或其组合。在一些实施方案中，TGF-β1的经修饰N末端区域或TGF-β2的经修饰N末端区域包含与SEQ ID NO:80、81、148或149具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经修饰蛋白质进一步包括用非AMH信号肽置换AMH中的信号肽。在一些实施方案中，非AMH信号肽衍生自天青杀素(Azurodicin)、IL-2、IL-6、CD5、免疫球蛋白重链(Ig-HC)、免疫球蛋白轻链(Ig-LC)、胰蛋白酶原、催乳素、弹性蛋白、HMM、人流感血凝素或IgKappa。在一些实施方案中，肽标签是Strep-标签、Flag标签或多组氨酸标签。在一些实施方案中，基序包括添加至少一个丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，基序包括添加1至6个丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，来自糖蛋白的基序衍生自人绒毛膜促性腺激素蛋白。在一些实施方案中，来自糖蛋白的基序衍生自CGB3蛋白。在一些实施方案中，基序包含与SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ或SSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ具有至少90％序列同一性的序列。在一些实例中，氨基酸位置254处的精氨酸(R)被丝氨酸(S)或谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)置换。在一些实施方案中，AMH的N末端区域的缺失和AMH的C末端的插入包括hCG的CTP或FcIgG1重链恒定区的插入。
在某些实施方案中，本文描述的是具有SEQ ID NO:1的野生型抗缪勒管激素(AMH)蛋白的经修饰蛋白质，其包含一个或多个选自以下的修饰：(a)SEQ ID NO:1的氨基酸位置448、449或451处的切割识别位点内或附近的置换或插入，其中所述切割识别位点包含序列RAQRS；(b)在SEQ ID NO:1的具有序列PRYG的氨基酸位置501和504之间或在SEQ ID NO:1的具有序列GNHV的氨基酸位置504和507之间的糖基化位点的插入；(c)用TGF-β家族蛋白的N末端区域对AMH中的N末端区域的置换；(d)在SEQ ID NO:1的氨基酸位置254-255处的二碱基切割位点内的置换；(e)肽标签在AMH序列内的添加；(f)来自糖蛋白的基序的添加；和(g)在AMH的N末端区域的缺失以及在AMH的C末端处修饰或蛋白质序列的插入。在一些实施方案中，置换或插入选自以下：a)用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；b)用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；c)用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；以及d)在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；以及在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包含选自以下的置换：(a)用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；(b)用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；(c)用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；(d)用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；(e)用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；以及用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括在C末端区域中4个氨基酸的置换。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用PNAS、PNSS、LNSS、MNAS或GNHT置换PRYG。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用GNHT置换GNHV。在一些实施方案中，TGF-β家族蛋白选自TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA。在一些实施方案中，TGF-β1的N末端区域包含与SEQ ID NO:146具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，TGF-β1的N末端区域包含根据SEQ IDNO:146的序列。在一些实施方案中，TGF-β2的N末端区域包含与SEQ ID NO:147具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，TGF-β2的N末端区域包含根据SEQ ID NO:147的序列。在一些实施方案中，修饰TGF-β1的N末端区域或TGF-β2的N末端区域以改善分泌、切割、稳定性或其组合。在一些实施方案中，TGF-β1的经修饰N末端区域或TGF-β2的经修饰N末端区域包含与SEQ ID NO:80、81、148或149具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，肽标签是Strep-标签、Flag标签或多组氨酸标签。在一些实施方案中，基序包括添加至少一个丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，基序包括添加1至6个丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，来自糖蛋白的基序衍生自人绒毛膜促性腺激素蛋白。在一些实施方案中，来自糖蛋白的基序衍生自CGB3蛋白。在一些实施方案中，基序包含与SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ或SSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，AMH蛋白的经修饰形式进一步包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置254-255处的二碱基切割位点内的置换。在一些实施方案中，氨基酸位置254处的精氨酸(R)被丝氨酸(S)或谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)置换。
本文描述的是一种调节卵泡生成以治疗卵巢衰老的方法，所述方法包括：施用本文所述的任何经修饰蛋白质。在一些实施方案中，施用步骤包括经修饰蛋白质的真皮内注射、皮下注射、透真皮递送、真皮下递送或输注。在一些实施方案中，施用步骤包括施用真皮下缓释设备。在一些实施方案中，经修饰蛋白质在载体中表达。在一些实施方案中，载体是微生物载体。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：评估基础窦卵泡计数、促卵泡激素水平和/或抗缪勒管激素水平，以及至少部分基于评估步骤，确定有待施用的组合物的剂量。在一些实施方案中，每天施用经修饰蛋白质。在一些实施方案中，施用的剂量为约0.5mg至约1.0mg。在一些实施方案中，施用的经修饰蛋白质的量足以在患者中治疗卵巢衰老、延迟绝经并且/或者减轻绝经症状。在一些实施方案中，施用的经修饰蛋白质的量基于以下来确定：(i)BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮和/或雌二醇中的一种或两种或三种或四种或五种或全部六种是否偏离阈值水平，(ii)FSH、AMH、LH、孕酮和/或雌二醇中的任何一种或多种的经确定水平偏离阈值水平的程度，或其组合。在一些实施方案中，施用的经修饰蛋白质的量通过评估与绝经和/或绝经过渡期相关的一个或多个特征来确定。在一些实施方案中，与绝经和/或绝经过渡期相关的一个或多个特征是情绪变化、体重指数(BMI)变化、体重变化、保水性变化、食欲变化、热潮红变化、月经周期规律变化、性欲变化、睡眠指标变化、能量水平变化，或其一种或多种的任何组合。在一些实施方案中，方法进一步包括评估生物样品中的促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、BAFC、促黄体激素(LH)、孕酮、雌二醇水平、基础体温或其组合。在一些实施方案中，方法进一步包括评估卵泡计数(BAFC)，例如通过个体的超声进行可视化。在一些实施方案中，生物样品是组织、血液、唾液、尿液或月经液。
本文在某些实施方案中描述的是一种组合物，其包含：野生型AMH蛋白的经修饰形式，其中经修饰蛋白质包含一个突变或多于一个突变的组合，所述突变选自切割识别位点内或附近的置换或插入、糖基化位点的插入、用来自TGF-β超家族不同成员的N末端区域替换AMH中的N末端区域、用来自不同蛋白质的信号肽对AMH中的信号肽的替换、肽标签在AMH序列内的添加以及来自糖蛋白家族成员的野生型序列的基序(例如，人绒毛膜促性腺激素蛋白(hCG)的羧基末端肽)的添加。在一些实施方案中，经修饰蛋白质包括在外源微生物载体中表达的重组蛋白质。在一些实施方案中，经修饰蛋白质包括具有SEQ ID NO:1的野生型蛋白质的经修饰形式。在一些实施方案中，突变包括在切割识别位点内和/或附近的置换。在一些实施方案中，突变包括基序RAQRS(SEQ ID NO:120)内的置换，并且其中所述基序在野生型蛋白质的切割识别位点内或在其侧翼。在一些实施方案中，基序RAQRS内的置换包括用属于TGF-β超家族的不同蛋白质的切割识别位点或针对被不同蛋白酶识别而优化的切割位点替换RAQRS(SEQ ID NO:120)。在一些实施方案中，来自属于TGF-β超家族的不同蛋白质的切割识别位点包含TGFB1中、或BMP15中、或GDF9中、或BMP2中、或BMP4中、或BMP6中、或BMP7中、或BMP8B中、或GDF15中或或INHBA中的切割识别位点。在一些实施方案中，针对蛋白酶切割而优化的切割识别位点包括被弗林蛋白酶或肠激酶识别的位点。在一些实施方案中，突变增加了活性蛋白质的产生和/或蛋白质的活性和/或稳定蛋白质。在一些实施方案中，突变进一步包括在野生型AMH序列中氨基酸254-255处的二碱基切割位点内的置换。在一些实施方案中，突变包括用不同的氨基酸置换位置254处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，突变包括用丝氨酸(S)、或谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)置换位置254处的精氨酸(R)。在一些实施方案中，突变降低了由与形成活性蛋白质所需的切割过程不同的切割过程所产生的产物的产量。在一些实施方案中，突变进一步包括糖基化位点的插入。在一些实施方案中，糖基化位点插入包括C末端区域中4个氨基酸的置换。在一些实施方案中，C末端区域中氨基酸的置换包括引入序列PNAS或PNSS、或LNSS、或MNAS、或GNHT。在一些实施方案中，修饰包括添加人绒毛膜促性腺激素蛋白(hCG)的羧基末端肽。在一些实施方案中，修饰包括用TGF-β超家族中不同蛋白质的N末端区域替代野生型AMH的N末端区域。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族中不同蛋白质的N末端区域包括TGFB1中的其中信号肽已被修饰的N末端区域，或TGFB2中的其中信号肽和切割位点已被修饰的N末端区域。在一些实施方案中，修饰包括向AMH的野生型或经修饰形式添加肽标签。在一些实施方案中，肽标签包括Strep-标签、FLAG或多组氨酸标签。在一些实施方案中，修饰包括用来自不同蛋白质的信号肽替代野生型AMH中的信号肽。在一些实施方案中，对野生型AMH中的信号肽进行替代的信号肽是来自天青杀素、或来自IL2、或来自IL6、或来自CD5、或来自Ig重链、或来自Ig轻链、或来自胰蛋白酶原、或来自催乳素，或来自弹性蛋白、或来自HMM信号肽或来自人流感血凝素或来自IgKappa的信号肽。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物悬浮在盐水溶液中并包含在静脉内(IV)袋中。
在某些实施方案中，本文描述的是用于调节或促进调节个体中的卵泡生成、绝经、绝经过渡期或与之相关的症状的系统，所述系统包括：第一数据库，其包括个体的一个或多个生物学水平或得分，所述一个或多个生物学得分包括促卵泡激素(FSH)的生物学水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的生物学水平或得分、基础窦卵泡计数(BAFC)的生物学水平或得分、促黄体激素(LH)、孕酮的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合；第二数据库，其包括一个或多个参考水平或得分，所述一个或多个参考水平或得分包括促卵泡激素(FSH)的水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的水平或得分、基础窦卵泡计数(BAFC)的生物学水平或得分、促黄体激素(LH)、孕酮的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合；和一个或多个计算机处理器，其被单独或共同编程以对照第二数据库的一个或多个参考水平或得分处理来自第一数据库的生物学水平或得分，从而确定个体需要(例如，特别)治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案是多种可能的治疗方案之一。在一些实施方案中，治疗方案要求施用第一量的治疗剂(例如，前述权利要求中任一项的治疗剂)，并且多个可能的治疗方案要求以不同于第一量的量施用所述治疗剂。在一些实施方案中，所述系统进一步包括第三数据库，所述第三数据库包括个体的一个或多个特征水平或得分；和第四数据库，所述第四数据库包括一个或多个参考特征水平或得分；并且一个或多个计算机处理器进一步被单独或共同编程以对照第二数据库的一个或多个参考特征水平或得分处理来自第一数据库的特征水平或得分，从而连同来自第一数据库的生物学水平或得分与第二数据库的一个或多个参考水平或得分的比较，确定个体需要治疗方案。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个生物传感器，所述一个或多个生物传感器被配置为从个体获得或接收与个体的促卵泡激素(FSH)的生物学水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的生物学水平或得分、基础窦卵泡计数(BAFC)的生物学水平或得分、促黄体激素(LH)、孕酮的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合有关的生物数据。在一些实施方案中，生物传感器是配置用于植入或粘附到个体的传感器。在一些实施方案中，生物传感器是基于唾液的传感器、基于皮肤的传感器(例如，皮肤贴片)、皮下传感器、子宫内传感器或阴道传感器。在一些实施方案中，生物传感器是被配置为分析体液的传感器。在一些实施方案中，体液是唾液、血液、尿液或月经液。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个计算机处理器，其被配置为将生物数据转换成个体的一种或多种生物学水平或得分。在一些实施方案中，系统进一步包括被配置为显示治疗方案的显示器。在一些实施方案中，系统进一步包括配置为根据治疗方案施用治疗剂的设备。在一些实施方案中，系统进一步包括配置为根据治疗方案自动施用治疗剂的设备。
附图说明
图1显示了野生型AMH、野生型BMP2、野生型BMP4、野生型BMP6、野生型BMP7、野生型BMP8B和其中插入了糖基化位点的经修的AMH构建体的蛋白质序列比对。AMH野生型序列中被替代的氨基酸被突出显示并被矩形圈出。BMP2和BMP4中的糖基化位点被突出显示并被圆圈圈出(糖基化在N残基上)。BMP6、BMP7和BMP8B中的糖基化位点被突出显示，并且没有被圆圈或矩形圈出(糖基化在N残基上)。α螺旋的位置(根据计算机预测模型)由下划线字符的存在标记。
图2是AMH蛋白修饰的组别(即类型)的示意图。
图3是卵巢中AMH作用的说明性模型。AMH由生长中的小卵泡的颗粒细胞产生，抑制初始卵泡募集和FSH依赖性生长以及前窦卵泡和小窦卵泡的选择。
图4是在生殖内分泌诊所接受评估的一组女性中，在卵泡周期早期，AMH循环水平与基础窦卵泡(BAFC)数量之间关系的图形描述。线的粗细表示每个BAFC计数的95％置信区间。
图5是图解，说明了AMH的循环水平与在IVF情况下取回并受精的卵母细胞发育的存活胚胎数量之间的关系。
图6是典型TGF-β蛋白的加工和激活所涉及的步骤的说明性表示。在分泌之前，TGF-β家族成员缔合成二硫键键合的二聚体。这些二聚体可以是同二聚体或异二聚体，具体取决于家族成员。然后蛋白质折叠导致在二聚体的每个单体内形成非共价键。在从蛋白质的N末端部分蛋白水解切割C末端配体结构域后，二硫键和非共价键起到使分子保持完全折叠的潜伏形式的作用。蛋白质以这种形式分泌，但它不能与受体结合，直到N末端区域与配体区域解离。
图7是本文某些实施方案中提供的递送系统和过程的示意图的图示。
图8是在本文的某些系统或过程中提供和/或使用的处理或计算机系统的示例性元件和连接方式的示意图示。
图9是AMH及其修饰的氨基酸序列表。序列被对齐以显示各个修饰(修饰带有下划线，框包括修饰的组)。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本公开的各种实施方案，但是对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员可以想到许多变型、改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。
定义
在整个本申请中，本公开的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体披露了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
术语“约(about)”和“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于该值是怎样测定或确定的，即，受到测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或超过1个标准差内。可替代地，这些术语可以表示给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。或者，这些术语可以表示在值的数量级内，优选在5倍内，更优选在2倍内。
术语“相邻”和“侧翼”(flanking)是指蛋白质的氨基酸残基或区或区域之间的紧密线性和/或紧密空间接近。
术语“切割识别位点”和“切割位点”是指被酶识别的蛋白质或多肽位点。在特定情况下，这些术语是指位点特异性蛋白酶切割或切开蛋白质处的肽序列和/或基序。
术语“卵泡”和“卵巢卵泡”是指在卵巢中发现的含有卵母细胞或在卵泡内发育的未成熟卵母细胞的细胞聚集体(例如，包括含有未成熟卵母细胞的致密体细胞壳)。
术语“卵泡生成”是指包含(未成熟)卵母细胞的卵巢卵泡成熟的过程或其任何阶段，包括从原始卵泡到排卵前卵泡和/或从未成熟卵母细胞到卵子的任何进展阶段。
术语“卵母细胞”是指能够通过减数分裂成熟为雌性单倍体卵细胞(卵子)的细胞。
术语“糖蛋白激素家族”包括但不限于人绒毛膜促性腺激素(hCG)、脊椎动物促黄体激素(LH)、脊椎动物促卵泡激素(FSH)和脊椎动物促甲状腺激素(TSH)。
术语“糖基化位点”是指多肽或蛋白质中可以连接碳水化合物或碳水化合物部分的分子或氨基位置。
术语“人绒毛膜促性腺激素”是指任何人绒毛膜促性腺激素，包括类似物、衍生物和变体。
术语“插入”是指将一个或多个氨基酸残基或分子添加到多肽或蛋白质中。
术语“绝经症状”和“绝经期症状”是指至少部分由卵巢老化、荷尔蒙变化和/或其他与绝经相关的生物学过程引起的妇女绝经前、绝经期间和绝经后出现的症状和疾病。
术语“经修饰的”和“突变的”和“变体”是指相对于蛋白质或多肽的野生型版本已经改变的蛋白质或多肽，并且优选地是其中至少一个氨基酸残基相对于野生型版本已被置换、缺失或添加的蛋白质或多肽。
术语“基序”或“氨基酸基序”是指多肽链或三级结构内的一组连续氨基酸，并且优选重复出现和/或被认为具有生物学意义的一组连续氨基酸。
术语“卵巢储备”是指卵巢提供卵细胞和卵巢卵泡细胞的能力，这些卵细胞能够受精，从而导致健康和成功的妊娠，这些卵巢卵泡细胞能够产生卵巢激素和信号传导分子，这些卵巢激素和信号传导分子是卵巢内分泌功能的基础。
术语“置换”是指用不同的“替代”氨基酸残基或分子替代一个或多个氨基酸残基或分子。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指代人。对象可以是任何年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年对象。还包括在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。指定为“对象”、“个体”或“患者”并不一定需要医疗专业人员的监督。
术语“转化生长因子β超家族蛋白”、“TGF-β超家族蛋白”、“TGF-β蛋白”、“TGF-β超家族的蛋白”或其他变体是指与TGF-β受体相互作用的细胞调节蛋白，包括但不限于AMH。
术语“野生型”是指由天然存在的微生物表达的多肽或蛋白质，或具有从天然存在的微生物中分离的多肽或蛋白质的特征的多肽或蛋白质。
本文中所用术语仅用于描述具体情况的目的，而不意图具有限制性。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“具有”、“带有”或其变体的程度而言，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包括性的。
与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物
在某些实施方案中，本文描述的是与经修饰AMH蛋白相关的组合物和方法。在一些情况下，如本文所述的经修饰AMH蛋白包含改善的生物活性。在一些情况下，对蛋白质的修饰改善了蛋白质的功能，因为它们有助于保持蛋白质的生物活性形式。例如，在一些情况下，只有蛋白质的经切割形式具有生物活性，而修饰使切割更有效，从而增强了蛋白质的生物活性。在一些情况下，修饰增加了蛋白质的分泌。在一些情况下，修饰导致蛋白质稳定性改善。
在一些实施方案中，本文提供了调节卵泡生成和卵巢衰老的方法，例如延迟生育潜力峰(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些实施方案中，施用本文提供的药剂和/或组合物降低了卵泡活化和成熟的速度。在某些实施方案中，本文提供的例如延迟生育潜力峰的疗法进一步包括在初始施用之后的某个时间点停止药剂或组合物的施用，例如当个体准备好生殖时。在一些实施方案中，本文提供了用于延长女性生殖寿命的方法(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物延长了女性的生殖寿命。
在某些实施方案中，本文描述了与用于改善或保护卵巢功能的经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物。在一些情况下，施用本文提供的组合物的药剂延长卵巢的内分泌功能并延迟或预防卵巢衰老和功能衰竭。在一些实施方案中，与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物改善或保护卵巢的内分泌功能。在一些实施方案中，与本文所述的经修饰AMH蛋白相关的方法和组合物改善或维持性功能、免疫功能、葡萄糖代谢、心理健康、睡眠、怀孕、心脏功能、骨密度、神经认知功能或其组合。在一些实施方案中，与本文所述的经修饰AMH蛋白相关的方法和组合物延迟或减轻绝经加速的合并症和病况的症状。
在一些实施方案中，本文提供了调节卵泡生成和卵巢衰老的方法，例如以维持接受性腺毒性疗法(例如对卵巢(包括卵巢内分泌功能)造成损伤并损害生育潜力的治疗，包括化疗、放疗和手术切除)的女性的卵巢储备(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些实施方案中，施用本文提供的药剂和/或组合物减少由性腺毒性治疗引起的对原始卵泡的活化或损伤。在某些实施方案中，本文提供的例如用于在性腺毒性治疗期间维持卵巢储备的疗法进一步包括在性腺毒性治疗之后的某个时间点停止施用药剂或组合物。在一些实施方案中，本文提供了用于延长女性生殖寿命的方法(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物延长了女性的生殖寿命。在一些情况下，施用本文提供的组合物的药剂延长卵巢的内分泌功能并延迟或预防卵巢衰老和功能衰竭。在一些实施方案中，与经修饰AMH蛋白有关的方法和组合物改善或维持卵巢的内分泌功能。
一般来说，前AMH(切割前)和经加工的AMH(切割后，当N和C末端仍然非共价键合时)都存在于绝经前女性的循环血清中。这两种形式之间的比率随着年龄变化并且在同一卵巢周期内变化。本文的各种实施方案中提供的某些方法用于和/或涉及(例如，在控制卵泡生成的方法或本文的其他方法中)通过施用包含经修饰的TGF-β蛋白的组合物来改变这两种形式的AMH(例如，包括其变体)的相对水平。
在某些实施方案中，本公开的组合物包含经修饰的TGF-β超家族蛋白质，例如参与卵巢周期的经修饰的TGF-β超家族蛋白质。在具体实施方案中，TGF-β超家族蛋白是在卵巢卵泡(或其中的卵母细胞)中产生的蛋白(例如，AMH)。
在具体实施方案中，本文提供的是经修饰的TGF-β蛋白(本文也称为TGF-β蛋白变体)。在更具体的实施方案中，蛋白变体相对于野生型被修饰，例如以修饰(例如，增加)其生物活性和/或改善其稳定性(例如，相对于野生型)。在某些情况下，经修饰的生物活性包括对蛋白质结合至受体的能力和/或信号蛋白或激素(例如，AMH)水平的修饰。在一些情况下，在分泌之前，TGF-β家族成员，如AMH，缔合成二硫键键合的二聚体(例如，如图6所示)。这些二聚体可以是同二聚体或异二聚体，具体取决于家族成员。然后蛋白质折叠导致在二聚体的每个单体内形成非共价键。在从蛋白质的N末端部分蛋白水解切割C末端配体结构域后，二硫键和非共价键起到使分子保持完全折叠的潜伏形式的作用。蛋白质以这种形式分泌，但它不能与受体结合，直到N末端区域与配体区域解离。经切割的AMH的c末端结构域引发强烈的下游反应。
因此，在一些情况下，对AMH和其他TGF-β蛋白的翻译后修饰调节它们的生物活性。在某些情况下，只有TGF-β家族成员(包括AMH)的经切割形式具有生物活性。在一些情况下，本文提供的蛋白质变体中存在的修饰包括在相对于野生型AMH的切割识别位点内或附近的置换或插入。在某些情况下，被修饰(例如，以改善切割效率)的切割位点是蛋白质活化所需的切割位点。在一些情况下，被修饰(例如，以降低切割效率)的切割位点是蛋白质活化不需要的切割位点。在某些实施方案中，修饰是糖基化位点中的插入或置换，这在一些情况下导致相对于野生型TGF-β蛋白更稳定的经切割或未切割重组蛋白。在一些情况下，修饰是用TGF-β超家族的另一个成员的N末端区域替代AMH的N末端区域。在一些实施方案中，用TGF-β超家族的另一成员的N末端区域替代AMH的N末端区域，其中TGF-β家族蛋白选自TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA。在一些实施方案中，修饰是去除AMH的N末端肽并向C末端肽添加可以稳定肽的元件。在一些实施方案中，稳定元件可以是添加hCG的CTP或添加Fc IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，使用聚合物稳定C末端肽。在一些实施方案中，聚合物是直链或支链聚合物。合适的直链或支链聚合物的示例包括直链或支链聚乙二醇(PEG)、直链或支链聚丙二醇、直链或支链聚乙烯醇、直链或支链聚乳酸、直链或支链聚乙醇酸、直链或支链聚甘氨酸、直链或支链聚乙酸乙烯酯、葡聚糖或其他此类聚合物，或掺入任何两种或多种前述聚合物或掺入本领域已知的其他聚合物的共聚物。在一些实施方案中，聚合物是PEG。在一些实施方案中，聚合物包含PEG支链。在某些情况下，修饰是将野生型AMH中的信号肽替换为不同蛋白质中的以更高效率分泌的信号肽。在一些情况下，修饰是插入肽标签以促进蛋白质纯化。
在一些情况下，AMH的野生型包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在特定情况下，AMH的野生型氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:1)(参见UnitProt登录号P03971)。
在一些实施方案中，本文的组合物是包含SEQ ID NO:1的野生型抗缪勒管激素(AMH)蛋白的经修饰形式，其包含至少两个选自下组的修饰：a)SEQ ID NO:1的氨基酸位置448至452处的切割识别位点内或附近的置换或插入，其中所述切割识别位点包含序列RAQRS(SEQ ID NO:120)；b)在SEQ ID NO:1的具有序列PRYG的氨基酸位置501和504之间或在SEQ ID NO:1的具有序列GNHV的氨基酸位置504和507之间的糖基化位点的插入；c)用TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA的N末端区域对AMH中的N末端区域的置换；d)用非AMH信号肽对AMH中的信号肽的置换；e)肽标签在AMH序列内的添加；以及f)来自糖蛋白的基序的添加。
在某些实施方案中，AMH在氨基酸448-451处含有切割识别位点，其中初级切割(在序列中用“/”标记)发生在氨基酸451和452之间。在某些实施方案中，初级切割位点包含氨基酸448、449、450、451和452。在某些实施方案中，次级切割位点(在序列中用“//”标记)在SEQ ID NO:1的氨基酸254和255之间。
在某些实施方案中，野生型AMH中初级切割位点的序列包含以下基序：
RAQRS 5
(SEQ ID NO:120)
在一些情况下，切割识别位点是靶向的，因为只有TGF-β家族成员的经切割形式具有生物活性(例如，能够与受体结合)。在某些情况下，使切割更有效的修饰可以增强蛋白质的生物活性。在某些情况下，提高生物活性形式的水平会降低卵泡生成。在本文的具体实施方案中是一种方法，所述方法包括施用(例如，对女性，例如有需要的女性)转化生长因子β(TGF-β)超家族的经修饰蛋白质，所述经修饰蛋白质包括在切割识别位点内和/或附近的置换和/或插入，例如以延迟绝经的开始、降低卵泡活化、卵泡成熟的速度并且/或者降低原始卵泡耗减的速度。在一些实施方案中，经修饰蛋白质在切割识别位点侧翼或内部的氨基酸基序内具有置换。在某些实施方案中，在经修饰蛋白质中，野生型AMH的切割位点侧翼和/或内部的氨基酸被TGF-β超家族的其他成员中的切割位点的侧翼和/或内部的氨基酸替换。在某些实施方案中，已知基序衍生自的TGF-β超家族成员在卵巢中表达和/或发挥作用。在一些实施方案中，基序衍生自的TGF-β超家族成员通过与活化AMH的蛋白酶相同或相似的蛋白酶的蛋白水解切割而被活化。例如，在某些实施方案中，切割位点侧翼或内部的基序的突变包括用在不同TGF-β超家族成员的氨基酸序列中发现的切割位点替换野生型AMH的切割位点。在某些实施方案中，切割位点侧翼或内部的基序的突变包括用针对蛋白水解酶切割而优化的切割位点替换野生型AMH的切割位点。在一些实施方案中，野生型AMH中的切割位点被修饰以被弗林蛋白酶或肠激酶切割。在一些实施方案中，野生型AMH中的切割位点被修饰以包含来自弗林蛋白酶或肠激酶的切割位点。在一些实施方案中，野生型AMH中的切割位点被修饰以包含来自TGFB1、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BNMP8B、GDF15、INHBA或其组合的切割位点。例如，在一些实施方案中，切割位点侧翼或内部的基序的修饰包括表1中列出的置换之一：
表1：AMH切割位点置换
/>
在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含相对于包含SEQ ID NO:1的野生型AMH蛋白的置换或插入，所述置换或插入选自以下：(a)用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；(b)用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；(c)用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基；(d)用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；(e)用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基；以及(f)在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，置换或插入是用天冬氨酸(D)或甘氨酸(G)置换位置448处的精氨酸(R)残基；用组氨酸(H)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)置换位置449处的丙氨酸(A)残基；用精氨酸(R)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)置换位置450处的谷氨酰胺(Q)残基；用赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)置换位置451处的精氨酸(R)残基；用丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或赖氨酸(K)置换位置452处的丝氨酸(S)残基；在位置452后插入精氨酸(R)或丝氨酸(S)残基。
在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:2-14中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:2-14中的任何一个具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰包括对野生型AMH蛋白的氨基酸448-452的任何以下修饰：(1)1R>X、2A>X、3Q>X、4R>X和/或5S>X；(2)1R>R、2A>H、3Q>R、4R>R和/或5S>A；(3)1R>R、2A>R、3Q>T、4R>R和/或5S>Q；(4)1R>R、2A>H、3Q>R、4R>R和/或5S>G；(5)1R>R、2A>E、3Q>K、4R>R和/或5S>Q；(6)1R>R、2A>A、3Q>K、4R>R和/或5S>S；(7)1R>R、2A>T、3Q>T、4R>R和/或5S>S；(8)1R>R、2A>S、3Q>I、4R>R和/或5S>S；(9)1R>R、2A>T、3Q>P、4R>R和/或5S>A；(10)1R>R、2A>R、3Q>A、4R>R和/或5S>A；(11)1R>R、2A>R、3Q>R、4R>R和/或5S>G；(12)1R>R、2A>A、3Q>R、4R>K、5S>R和/或6->R；or(13)1R>D、2A>D、3Q>D、4R>D、5S>K和/或6->S；(14)1R>G、2A>R、3Q>R、4R>R和/或5S>A；(15)1->R、2->A、3R>R、4A>K、5Q>R和/或6R>R；(16)1->D、2R>D、3A>D、4Q>D、5R>K和/或6S>S。
在某些实施方案中，突变蛋白包含任何以下序列：
/>
/>
(SEQ1为野生型AMH蛋白的氨基酸序列；SEQ 3-14和166是经修饰AMH蛋白的氨基酸序列；野生型蛋白RAQRS(SEQ ID NO:120)中的靶向基序以粗体标记；突变蛋白中的经修饰的基序加下划线)。
在某些实施方案中，本文提供的或在本文提供的组合物或方法中提供的(例如治疗性)药剂是经修饰蛋白质。在具体实施方案中，相对于蛋白质的野生型版本，经修饰蛋白质包含糖基化位点的插入或置换。在一些情况下，具有这种序列的经修饰蛋白质(例如，AMH)提供了更稳定的切割和/或未切割的蛋白质(例如，AMH，例如重组AMH)。在某些实施方案中，突变包括糖基化位点的一个或多个3-4个氨基酸插入。在一些实施方案中，糖基化位点的添加包含选自以下的置换(相对于野生型蛋白质)：a)用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；b)用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；c)用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；d)用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；以及e)用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括用亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)置换位置501处的脯氨酸(P)残基；用天冬酰胺(N)置换位置502处的精氨酸(R)残基；用丝氨酸(S)或丙氨酸(A)置换位置503处的酪氨酸(Y)；用丝氨酸(S)置换位置504处的甘氨酸(G)；以及用天冬酰胺(N)置换位置507处的缬氨酸(V)。在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括在C末端区域中4个氨基酸的置换。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用PNAS、PNSS、LNSS、MNAS或GNHT置换PRYG。在一些实施方案中，C末端区域中4个氨基酸的置换包括用GNHT置换GNHV。
在一些情况下，糖基化位点插入到C末端结构域中的α-螺旋基序的上游，类似于某些骨形态发生蛋白(BMP)被糖基化的位置。在某些情况下，突变包括用包含糖基化共有序列的不同基序替换AMH野生型序列中具有序列PRYG(SEQ ID NO.133)的氨基酸501-504。在某些情况下，替换野生型序列的基序包含糖基化共有序列，其包含序列PNAS(SEQ ID NO138)，或PNSS(SEQ ID NO 139)。在一些情况下，替换野生型序列的基序是在BMP蛋白的C末端发现的糖基化位点。在一些情况下，基序是在BMP2和BMP4的C末端肽中发现的糖基化位点的修饰。在某些情况下，替换野生型序列的基序包含糖基化共有序列，其包含序列LNSS(SEQID NO 136)。在某些情况下，基序是在BMP6、BMP7和BMP8B的C末端肽中发现的糖基化位点的修饰。在某些情况下，替换野生型序列的基序包含糖基化共有序列，其包含序列MNAS(SEQID NO:137)。在其他情况下，突变包括用包含糖基化共有序列的不同基序替换AMH野生型序列中具有序列GNHV的氨基酸504-507。在某些情况下，替代野生型序列的基序包含糖基化共有序列，即GNHT(SEQ ID NO 140)。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:2、15-19、69-73、111、112、113、115、116、118或170中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:2、15-19、69-73、111、112、113、115、116、118或170中任一个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:138、139、136、137或140中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:138、139、136、137或140中任一个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，糖基化位点的插入包括图1和表2中列出的置换之一：
表2：示例性AMH糖基化位点添加
在某些实施方案中，突变蛋白包含这些修饰之一：
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(野生型蛋白质中的靶向基序以粗体标记，突变蛋白质中的经修饰的基序带下划线)
在某些实施方案中，突变包括将来自糖蛋白激素家族成员(例如，人绒毛膜促性腺激素蛋白[hCG]的羧基末端肽)的野生型序列的基序添加到蛋白质中。在具体实施方案中，经修饰蛋白质是由人绒毛膜促性腺激素蛋白(hCG)的羧基末端肽与蛋白质融合产生的野生型蛋白质的嵌合形式。在具体实施方案中，基序包含hCG蛋白的羧基末端肽(CTP)的全部或部分。在一些实施方案中，使用聚合物稳定C末端肽。在一些实施方案中，聚合物是直链或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物是PEG。在一些实施方案中，聚合物包含PEG支链。在一些实施方案中，经修饰的TGF-β家族成员是AMH并且插入的基序是氨基酸序列SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO.20)。在一些实施方案中，插入的基序是hCG蛋白的羧基末端肽(CTP)的全部或部分，其中在AMH蛋白序列与hCG蛋白的(CTP)之间添加了接头序列。在一些实施方案中，接头是具有3或4个残基的序列。例如，在一些实施方案中，接头序列是SSS，并且插入的基序是氨基酸序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO.21)。此外，在一些实施方案中，接头序列是SSSS，并且插入的基序是氨基酸序列SSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO.22)。
在某些实施方案中，突变蛋白包含这些修饰之一：
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(野生型蛋白质中的靶向基序以粗体标记，突变蛋白质中的经修饰的基序带下划线)
在某些实施方案中，突变包括AMH野生型序列中次级切割位点内或侧翼的一个或多个氨基酸残基的修饰。在具体实施方案中，次级切割位点是例如二碱基基序。在一些实施方案中，次级切割位点在AMH野生型序列的氨基酸254和255之间。在一些实施方案中，含有次级切割位点的基序包含氨基酸序列PRSE。在一些实施方案中，修饰包括用任何以下氨基酸序列替换PRSE基序：PSSE、PQSE或PASE。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ IDNO:2、167、23-25或77-79的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ IDNO:2、167、23-25或77-79具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以通过修饰切割位点侧翼的一个或多个氨基酸来突变次级切割位点基序。在一些实施方案中，修饰包括对含有野生型AMH蛋白的次级切割位点的基序的任何以下修饰：(1)1P>P、2R>S、3S>S和/或4E>E；(2)1P>P、2R>Q、3S>S和/或4E>E；或(3)1P>P、2R>A、2S>S和/或4E>E。例如，在一些实施方案中，切割位点侧翼或内部的基序的突变包括表3中列出的置换之一：
表3：示例性AMH次级切割位点突变
在某些实施方案中，突变蛋白包含这些序列之一：
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(野生型蛋白质(SEQ ID NO:1)中的靶向基序以粗体标记，突变蛋白质中的经修饰的基序带下划线)
在某些实施方案中，突变包括用来自TGF-β超家族的另一个成员的N末端区域(即TGF-β超家族的另一个成员的前蛋白序列的野生型形式内的区域，该区域被蛋白水解切割以产生C末端成熟区域)替换野生型AMH序列的N末端区域(即野生型AMH前蛋白序列内的肽，该区域被蛋白水解切割以产生C末端成熟区域，例如与SEQ ID NO:145具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:145的区域)。在某些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自在卵巢中表达和/或有活性的TGF-β超家族的另一成员(例如，GDF9、BMP15、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8B、TGFB、INHA、INHBA)的N末端区域。在某些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的另一成员(例如，TGFB1、TGFB2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA)的N末端区域。在某些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP8B、GDF15、INHA或INHBA的N末端区域。在具体实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的另一成员的N末端区域，其已显示当嵌合体(即与两个不同TGF-β家族成员的成熟区域相关的前肽)产生时增强分泌。在具体实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGFB1的N末端区域，例如与SEQ ID NO:146具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:146的N末端区域。在其他实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的已显示增强稳定性的另一成员的N末端区域。在具体实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域来自GDF15。在某些实施方案中，被替换的AMH区域包括来自另一个TGF-β家族成员的N末端肽和切割酶识别的氨基酸基序(切割位点)。在一些实施方案中，基序包括从中获得N末端肽的TGF-β成员的C末端肽的第一个氨基酸。在某些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的另一成员的N末端区域，其中野生型信号肽已被来自不同蛋白质的信号肽替换。在某些实施方案中，信号肽是IgK中与SEQ ID NO:164具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:164的信号肽。在其他实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的已显示增强稳定性的另一成员的N末端区域。在具体实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGFB2的与SEQ ID NO:147具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:147的N末端区域。在某些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域是来自TGF-β超家族的另一成员的N末端区域，其中野生型信号肽已被来自不同蛋白质(例如IgK)的信号肽替换，并且切割位点已被替换为优化用于弗林蛋白酶切割的切割位点(例如RKKRRS)(SEQ ID NO 13)。在一些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域包含SEQ ID NO:147、148、149、174、176、178、180、182或184的氨基酸序列。在一些实施方案中，替换野生型AMH中的N末端区域的N末端区域包含与SEQ ID NO:147、148、149、174、176、178、180、182或184具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、165、26、27、81或82的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、165、26、27、81或82具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。例如，在某些实施方案中，AMH的野生型形式的N末端区域的突变包括表4中列出的置换之一：
表4：AMH N末端肽的示例性替换
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在某些实施方案中，经修饰蛋白质包含以下任何氨基酸序列，或与以下任何氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列：
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(野生型蛋白质(SEQ ID NO:1)中的靶向基序以粗体标记，经修饰蛋白质中的经修饰的基序带下划线)。
在某些实施方案中，突变包括添加多肽蛋白标签，一旦重组蛋白产生，其可用于纯化重组蛋白。在一些实施方案中，标签是表位标签。在一些实施方案中，标签是亲和标签(即可以使用亲和技术容易地纯化的基序)。在一些实施方案中，将Strep-标签插入到AMH序列中。在一些实施方案中，将FLAG-标签插入到AMH序列中。在一些实施方案中，将多组氨酸标签插入到AMH序列中。例如，在某些实施方案中，插入到AMH序列中的标签是以下标签之一(表5)：与SEQ ID NO:150具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:150的Strep-标签、与SEQ ID NO:151具有至少90％序列同一性或根据SEQ ID NO:151的FLAG-标签、与SEQ IDNO:194具有至少90％序列同一性的多组氨酸标签。在一些实施方案中，插入的标签包含与SEQ ID NO:150、151或194具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:169、28、29或195。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:169、28、29或195具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，标签以AMH的野生型形式插入。在某些实施方案中，标签以AMH的突变形式插入并与一种或多种其他修饰组合使用。在某些实施方案中，将标签插入在初级切割位点之后(即，在其C末端侧)，从而可以在切割后纯化AMH或经修饰的AMH的C末端区域。
表5：示例性多肽蛋白标签
在某些实施方案中，突变蛋白包含这些修饰之一：
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(野生型蛋白质(SEQ ID NO:1)中的靶向基序以粗体标记，突变蛋白质中的经修饰的基序带下划线)
在某些实施方案中，突变包括用来自不同蛋白质的信号肽替换野生型AMH形式的信号肽。在具体实施方案中，来自高效天然分泌的蛋白质的信号肽改善了添加了该肽的突变蛋白质的分泌。在一些实施方案中，被替换的野生型AMH的肽包含野生型蛋白质的残基1-24并且包含氨基酸序列：MRDLPLTSLALVLSALGALLGTEA。在其他实施方案中，被替换的野生型AMH的肽包含野生型蛋白质的残基1-25并且包含氨基酸序列：MRDLPLTSLALVLSALGALLGTEAL。例如，在某些实施方案中，野生型AMH的信号肽被来自以下蛋白质之一的信号肽替换(表6)：天青杀素、IL2、IL6、CD5、免疫球蛋白重链(Ig-HC)、免疫球蛋白轻链(Ig-LC)(胰蛋白酶原、催乳素、弹性蛋白、人流感血凝素、IgKappa。在一些实施方案中，野生型AMH的信号肽被由隐马尔可夫模型(HMM)产生的信号肽替换。在一些实施方案中，野生型AMH的信号肽被替换为包含与SEQ ID NO:153-164中的任何一个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％，或至少99％同一性的氨基酸的信号肽。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:30-53或82-119中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含与SEQ ID NO:30-53或82-119中任一个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
表6：示例性AMH信号肽
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在某些实施方案中，突变蛋白包含这些修饰之一：
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(野生型蛋白质中的靶向基序以粗体标记，突变蛋白质中的经修饰的基序带下划线)
在一些实施方案中，突变蛋白是包含野生型AMH的C末端肽的多肽(表7)。在一些实施方案中，包含AMH的C末端肽的蛋白质缺少AMH的N末端部分。在一些实施方案中，AMH的C末端肽与允许和/或促进经修饰蛋白质分泌的信号肽(例如IL2信号肽或HMM信号肽)连接。在一些情况下，AMH的与信号肽连接的C末端肽与可结晶片段(Fc)IgG1重链恒定区的序列连接以促进蛋白质的纯化。在一些实施方案中，AMH的C末端区域与hCG蛋白的C末端肽(CTP)连接。在一些实施方案中，CTP通过接头(例如SSS或SSSS)与AMH的C末端肽连接。在一些实施方案中，使用聚合物稳定C末端肽。在一些实施方案中，聚合物是直链或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物是PEG。在一些实施方案中，聚合物包含PEG支链。
表7：野生型AMH的C末端肽
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在某些实施方案中，本文所述的突变可以组合使用。在具体实施方案中，突变可以基于它们影响的蛋白质(例如，AMH)区域和它们引入的变化类型来分组：组A包含对蛋白质初级切割位点的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14；组B包含其中糖基化位点被引入蛋白质序列中的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19；组C包含其中将C末端肽添加到蛋白质序列中的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；组D包含对蛋白质序列中次级(即不是蛋白质活化所需的切割)切割位点的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25；组E包含对蛋白质N末端结构域的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193；组F包含其中标签表位插入到蛋白质序列中初级切割位点(即蛋白质活化所需的切割)的下游的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:195；组G包含对蛋白质信号肽的修饰，其与以下项中的任一个具有至少90％序列同一性或是根据以下项中的任一个：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53；组H包含经修饰的AMH序列(其中不存在N末端肽)，其与以下项具有至少90％序列同一性或是根据以下项：SEQ ID NO:54(图2)。在某些实施方案中，来自不同组的修饰被组合并引入相同的经修饰蛋白质中：例如来自组A的零个或一个修饰，以及，来自组B的零个或一个修饰，以及，来自组C的零个或一个修饰，以及，来自组D的零个或一个修饰，以及，来自组E的零个或一个修饰，以及，来自组F的零个或一个修饰，以及，来自组G的零个或一个修饰，以及，来自组H的零个或一个修饰。在某些实施方案中，来自一、二、三、四、五、六、七和/或八个组的任何组合的修饰可以被引入相同的经修饰蛋白质中。
在某些实施方案中，不同类型修饰的组合包括以下任何一种或其任何组合：1)向野生型AMH序列添加strep标签；2)向野生型AMH序列的野生型序列添加FLAG标签；3)野生型AMH序列，其中天然切割位点被TGFB1中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；4)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP15中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；5)野生型AMH序列，其中天然切割位点被GDF9中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；6)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP2中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；7)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP4中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；8)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP6中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；9)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP7中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；10)野生型AMH序列，其中天然切割位点被BMP8B中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；11)野生型AMH序列，其中天然切割位点被GDF15中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；12)野生型AMH序列，其中天然切割位点被INHBA中的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；13)野生型AMH序列，其中天然切割位点被针对弗林蛋白酶切割而优化的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；14)野生型AMH序列，其中天然切割位点被针对肠激酶切割而优化的切割位点替换。可以在切割位点后添加strep标签；15)野生型AMH序列，其中PRYG位点(残基501-504)被LNSS替换。可以在切割位点后添加strep标签；16)野生型AMH序列，其中PRYG位点(残基501-504)被MNAS替换。可以在切割位点后添加strep标签；17)野生型AMH序列，其中PRYG位点(残基501-504)被PNAS替换。可以在切割位点后添加strep标签；18)野生型AMH序列，其中PRYG位点(残基501-504)被PNSS替换。可以在切割位点后添加strep标签；19)野生型AMH序列，其中GNHV位点(残基504-507)被GNHT替换。可以在切割位点后添加strep标签；20)野生型AMH序列，其中添加了来自hCG的CTP序列(SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)。可以在切割位点后添加strep标签；21)野生型AMH序列，其中添加了来自hCG的CTP序列+接头(SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)。可以在切割位点后添加strep标签；22)野生型AMH序列，其中添加了来自hCG的CTP序列+接头(SSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)。可以在切割位点后添加strep标签；23)野生型AMH序列，其中次级二碱基切割位点RS(残基254-255)突变为SS并且在初级切割位点之后添加strep标签；24)野生型AMH序列，其中次级二碱基切割位点RS(残基254-255)突变为QS。可以在切割位点后添加strep标签；25)野生型AMH序列，其中次级二碱基切割位点RS(残基254-255)突变为AS。可以在切割位点后添加strep标签；26)野生型AMH序列，其中N末端肽被TGFB2的N末端肽替换，信号肽被IgK的信号肽替换，并且切割位点针对弗林蛋白酶切割进行了优化。可以在切割位点后添加strep标签；27)野生型AMH序列，其中N末端肽被TGFB1的N末端肽替换并且信号肽被IgK的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；28)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被天青杀素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；29)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被IL2的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；30)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被IL6的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；31)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被CD5的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；32)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被免疫球蛋白重链的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；33)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被免疫球蛋白轻链的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；34)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被胰蛋白酶原的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；35)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被催乳素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；36)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被弹性蛋白的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；37)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被HMM信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；38)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被人流感血凝素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；39)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-24)被IgKappa的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；40)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被天青杀素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；41)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被IL2的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；42)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被IL6的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；43)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被CD5的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；44)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被免疫球蛋白重链的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；45)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被免疫球蛋白轻链的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；46)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被胰蛋白酶原的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；47)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被催乳素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；48)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被弹性蛋白的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；49)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被HMM信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；50)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被人流感血凝素的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；51)野生型AMH序列，其中信号肽(残基1-25)被IgKappa的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；52)野生型AMH的C末端肽，其中信号肽被IL2的信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；53)野生型AMH的C末端肽，其中信号肽被HMM信号肽替换。可以在切割位点后添加strep标签；54)野生型AMH的C末端肽，其中信号肽被IL2的信号肽替换并且hCG的CTP添加到肽的C末端。可以在切割位点后添加strep标签；55)野生型AMH的C末端肽，其中信号肽被HMM信号肽替换并且hCG的CTP添加到肽的C末端。可以在切割位点后添加strep标签；56)野生型AMH的C末端肽，其中信号肽被IL2的信号肽替换并且在信号肽和AMH C-末端肽之间添加Fc IgG1重链恒定区和烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)切割位点；57)野生型AMH，其中信号肽(残基1-24)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被GDF9中的切割位点替换，PRYG位点(残基501-504)被PNAS替换；58)野生型AMH，其中信号肽(残基1-24)被HMM信号肽替换，AMH切割位点被GDF9中的切割位点替换，hCG的CTP(带或不带接头)添加在蛋白质的C末端；59)野生型AMH，其中信号肽(残基1-24)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被针对弗林蛋白酶切割而优化的切割位点替换，PRYG位点(残基501-504)被PNAS替换；60)野生型AMH，其中信号肽(残基1-24)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被针对弗林蛋白酶切割而优化的切割位点替换，并且hCG的CTP(带或不带接头)添加在蛋白质的C末端；61)AMH的与IL2的信号肽连接的野生型C-末端肽，其中PRYG位点(完整野生型AMH序列中的残基501-504)被PNAS替换；62)野生型AMH，其中信号肽(残基1-25)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被GDF9中的切割位点替换，PRYG位点(残基501-504)被PNAS替换；63)野生型AMH，其中信号肽(残基1-25)被HMM信号肽替换，AMH切割位点被GDF9中的切割位点替换，hCG的CTP(带或不带接头)添加在蛋白质的C末端；64)野生型AMH，其中信号肽(残基1-25)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被针对弗林蛋白酶切割而优化的切割位点替换，PRYG位点(残基501-504)被PNAS替换；65)野生型AMH，其中信号肽(残基1-25)被IL2的信号肽替换，AMH切割位点被针对弗林蛋白酶切割而优化的切割位点替换，并且hCG的CTP(带或不带接头)添加在蛋白质的C末端。
在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白包含SEQ ID NO:55-119中任一个。在一些实施方案中，经修饰AMH蛋白与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在一些实施方案中，来自不同组的修饰被组合并引入相同的经修饰蛋白质中：例如来自组A的零个或一个修饰，以及，来自组B的零个或一个修饰，以及，来自组C的零个或一个修饰，以及，来自组D的零个或一个修饰，以及，来自组E的零个或一个修饰，以及，来自组F的零个或一个修饰，以及，来自组G的零个或一个修饰，以及，来自组H的零个或一个修饰，或其任何组合。在一些实施方案中，来自一、二、三、四、五、六、七和/或八个组的任何组合的修饰可以被引入相同的经修饰蛋白质中。
在某些实施方案中，经修饰的肽的序列是以下表8中提供的以下序列之一。在一些情况下，经修饰的肽与表8中列出的序列或与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性。在一些情况下，经修饰的肽与表8中列出的序列或与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少或约95％同源性。在一些情况下，经修饰的肽与表8中列出的序列或与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，经修饰的肽与表8中列出的序列或与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，经修饰的肽与表8中列出的序列或与SEQ ID NO:55-119中任一个具有至少或约100％同源性。在一些情况下，经修饰的肽至少包含具有表8中列出的序列或SEQ ID NO:55-119中任一个的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400或超过400个氨基酸的部分。
表8：经修饰的肽序列
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*以上任何序列中的粗体和下划线文本表示粗体和下划线文本包含添加的strep标签的序列。
**以上任何序列中突出显示的文本表示突出显示的文本包含添加的FLAG标签的序列。
在某些实施方案中，本文所述的突变修饰(例如，增加)蛋白质的活性和/或稳定(例如，帮助保持生物活性和/或生物活性形式)蛋白质，和/或增加蛋白质的分泌，和/或减少在次级位点切割产生的蛋白质副产物的产生。在具体实施方案中，蛋白质是AMH或其变体，并且增加AMH或其变体的水平可以例如通过降低卵泡活化、卵泡成熟和/或(例如，原始)卵泡耗减的速度来控制(例如，延迟)卵巢衰老和/或绝经(或绝经过渡期)的开始，减轻绝经(或绝经过渡期)症状和/或治疗早发性卵巢功能不全(POI)，在性腺毒性治疗期间保护卵巢储备和功能。
在本文的具体实施方案中提供了一种例如在有需要的女性中减少卵巢衰老和卵泡损失速度的方法。在具体实施方案中，所述方法包括将本文所述的药剂施用于个体(例如，有需要的女性)。在某些实施方案中，卵泡损失通过卵泡生成和/或(例如，原始)卵泡耗减(例如卵巢储备的耗减)而发生。在一些情况下，显著的卵泡损失(例如，通过成熟和耗减的组合)与绝经的开始相关。在某些情况下，显著的卵泡损失(例如，通过成熟和耗减的组合)与绝经过渡期的开始(例如，在达到卵泡群体的临界阈值后)相关。
在各种实施方案中，根据本文方法施用的药剂是利用任何合适的施用技术或配制品施用的。此外，在一些实施方案中，本文提供的药剂被配制为任何合适的形式，例如本文所述。在某些实施方案中，本公开的方法包括递送或施用本文所述的任何药剂或组合物。在一些实施方案中，施用本文所述的药剂或组合物包括通过真皮内注射、皮下注射、透真皮递送、真皮下递送或输注来施用所述药剂或组合物。在一些实施方案中，药剂或组合物的施用通过真皮下缓释设备实现。
在某些实施方案中，本文提供的方法进一步包括评估年龄、基础窦卵泡计数、促卵泡激素水平、雌二醇、促黄体激素(LH)、孕酮、基础体温和/或抗缪勒管激素水平。在一些实施方案中，至少部分地基于年龄、基础窦卵泡计数、促卵泡激素水平、雌二醇、促黄体激素(LH)、孕酮、基础体温和/或抗缪勒管激素(AMH)水平确定施用的时间和/或剂量。在一些实施方案中，药剂(或包含所述药剂的组合物)的施用每天发生。在某些实施方案中，施用任何合适量的药剂，例如约0.5mg至约1mg的药剂。在某些实施方案中，所施用的药剂和/或组合物的量是足以在女性(例如，有需要女性)中调节(例如，减少)卵泡生成、调节(例如，延迟)绝经(例如，在正在进行的给药方案中)、减轻绝经或绝经过渡期症状和/或本文所述的其他有益效果的量。
在某些实施方案中，本文提供的方法进一步包括评估女性表现出卵巢储备过早耗减的遗传风险，以鉴定可以受益于该药剂的治疗的女性。在具体实施方案中，具有对卵泡生成和/或卵巢生物学至关重要的基因(例如，AR、BMP15、ESR1、FIGLA、FMR1、FOXE1、FOXL2、FOXO3、FSHR、GALT、GDF9、INHA、NOBOX、NR5A1、SYCP2L、TGFBR3)中的突变的女性有资格接受药剂治疗。
在某些实施方案中，本文提供的是TGF-β超家族的经修饰蛋白质或包含TGF-β超家族的经修饰蛋白质(例如，和药学上可接受的赋形剂)的组合物。在某些实施方案中，TGF-β超家族蛋白是抗缪勒管激素(AMH)(例如，野生型版本AMH，SEQ ID NO:1，或其变体)。
在某些实施方案中，经修饰蛋白质(例如，AMH的变体)包含以下突变中的一种或多种：插入或缺失(indel)，相对于蛋白质野生型版本的置换，以及来自TGF-β超家族或糖蛋白激素家族的成员的野生型序列的基序的添加。在某些实施方案中，插入或缺失包括在切割识别位点内或附近的置换。在某些实施方案中，置换包括氨基酸基序内的置换，在一些情况下，包括在野生型蛋白质的切割识别位点内或侧翼的置换。在一些情况下，突变包括糖基化位点中的插入或置换。在一些实施方案中，突变包括用TGF-β超家族的不同成员的N末端肽替换AMH的N末端肽。在某些实施方案中，突变包括用来自不同蛋白质的信号肽替换AMH的信号肽。在一些实施方案中，突变包括插入肽标签，例如，有利于重组蛋白的纯化的肽标签。在一些实施方案中，本文描述的修饰的组合被引入相同的蛋白质中。
在某些实施方案中，相对于天然存在的蛋白质，经修饰的(例如，TGF-β超家族)蛋白质在对象中具有增加的活性。在某些实施方案中，相对于天然存在的蛋白质，经修饰的(例如，TGF-β超家族)蛋白质具有增加的稳定性和半衰期。在某些实施方案中，经修饰蛋白质以更高的效率纯化并且/或者在其产生过程中的副产物量减少(例如，通过在蛋白质序列内的次级位点处切割而产生的肽)。
在某些实施方案中，通过聚乙二醇(PEG)聚合物链的共价或非共价连接或融合进一步对经修饰蛋白质进行翻译后修饰。在一些实施方案中，分子的聚乙二醇化降低了它们的免疫原性或抗原性。在其他实施方案中，分子的聚乙二醇化通过增加水溶性并降低肾清除率而延长它们的循环时间。
在某些实施方案中，本文提供了编码经修饰蛋白质的重组基因，例如本文所述的经修饰蛋白质(例如，转化生长因子β(TGF-β)超家族的重组蛋白，其含有相对于蛋白质野生型版本的突变)。在一些情况下，基因作为微生物(例如，细菌、病毒)载体(例如，质粒或腺相关病毒(AAV))的一部分提供。在一些情况下，蛋白质在培养物中表达，例如在大肠杆菌、乳杆菌、酵母或其他合适的生物体中表达。在一些情况下，将重组基因递送至个体(例如，有需要的女性)(例如，作为脂质体或其他纳米颗粒中的质粒)(例如，以提供经修饰蛋白质在个体中的表达，例如在其细胞中的表达)。
在一些实施方案中，本文提供的任何组合物(例如，包含蛋白质或基因)包含药学上可接受的赋形剂或载体。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含经修饰蛋白质(或核酸)，悬浮在盐水溶液中，并且例如包含在静脉内(IV)袋中。
在具体实施方案中，本文提供的方法包括向对象(例如，有需要的女性)施用重组蛋白，所述重组蛋白包含足以调节卵泡生成、减少卵巢衰老、延迟绝经和/或减轻患者的绝经症状的量的经修饰TGF-β超家族蛋白。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用治疗有效量的药剂，例如本文提供的药剂(例如，本文提供的经修饰蛋白质)。在一些实施方案中，将药剂施用于具有偏离(例如，低于或高于)阈值水平的基础窦卵泡计数(BAFC)、促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、促黄体激素(LH)、孕酮、基础体温和/或雌二醇水平的女性。在一些实施方案中，BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温和/或雌二醇水平以任何合适的方式并从任何合适的生物样品(例如组织、血液或唾液)中或通过例如温度计或超声波等设备确定。在一些实施方案中，所施用的药剂的治疗有效量至少部分地基于(1)BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇中的一种或两种或三种或四种或五种或六种或全部七种是否偏离(例如，低于)阈值水平，和/或(2)BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇中任何一种或多种的经确定水平偏离(例如，低于)阈值水平的程度。在一些实施方案中，药剂的治疗有效量至少部分地基于一个或多个特征(例如，与绝经和/或绝经过渡期相关的症状或症状评估(例如，得分))，例如基于情绪、体重指数(BMI)、体重变化、热潮红、保水性、食欲、月经周期规律、性欲、睡眠指标、能量水平等，或其一种或多种的任何组合。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括评估此类水平(或与其相关的得分)的步骤，例如以确定施用给个体的药剂的适当治疗有效量(例如，如本文更详细描述的)。
此外，在本文的某些实施方案中提供了用于监测和/或提供本文提供的疗法的系统。在一些实施方案中，本文提供了用于调节或促进调节个体中的卵泡生成、卵巢衰老、绝经、绝经过渡期或与之相关的症状的系统。在一些实施方案中，本文提供了用于例如根据本文提供的方法扩展个体(女性)的生育窗口的系统。此外，本文提供的系统可用于促进本文设想的其他疗法。
在一些实施方案中，本文提供的系统包括：第一数据库，其包括个体的一个或多个生物学水平或得分，所述一个或多个生物学得分包括促卵泡激素(FSH)的生物学水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的生物学水平或得分、基础窦卵泡计数(BAFC)的生物学水平或得分、孕酮的生物学水平或得分、LH的生物学水平或得分、和/或雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合；第二数据库，其包括一个或多个参考水平或得分，所述一个或多个参考水平或得分包括促卵泡激素(FSH)的水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的水平或得分、基础窦卵泡计数(BAFC)的水平或得分、孕酮的生物学水平或得分、LH的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合；和一个或多个计算机处理器，其被单独或共同编程以对照第二数据库的一个或多个参考水平或得分处理来自第一数据库的生物学水平或得分，从而确定个体(例如，特别)需要治疗方案。
在一些实施方案中，治疗方案(例如，提供或指示要提供的治疗方案)是多种可能的治疗方案之一。在一些实施方案中，不同的治疗方案基于BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇中一种或多种的生物学水平或得分(例如与这些的水平相关的得分)进行选择。在一些实施方案中，各种治疗方案包括待施用的治疗有效量的药剂、待施用的治疗有效量的药剂的频率、施用途径等，或其一种或多种的任何组合。在一些实施方案中，多种可能的治疗方案中的一些或全部需要施用不同的量(例如，彼此不同和/或不同于所指示的治疗方案的量)。
在一些实施方案中，系统进一步包括第三数据库，所述第三数据库包括个体的一个或多个特征水平或得分；和第四数据库，所述第四数据库包括一个或多个参考特征水平或得分。在一些实施方案中，一个或多个计算机处理器进一步被单独或共同编程以对照第二数据库的一个或多个参考特征水平或得分处理来自第一数据库的特征水平或得分，从而连同来自第一数据库的生物学水平或得分与第二数据库的一个或多个参考水平或得分的比较，确定个体需要治疗方案。
在一些实施方案中，系统包括一个或多个生物传感器。例如，在一些实施方案中，一个或多个生物传感器被配置为从个体获得或接收生物数据，例如与个体的促卵泡激素(FSH)的生物学水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的生物学水平或得分、BAFC的生物学水平或得分、孕酮的生物学水平或得分、LH的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合相关的生物数据。任选地使用任何合适的生物传感器，例如任何适于获得适于评估以下项的生物数据的传感器：个体的促卵泡激素(FSH)的生物学水平或得分、抗缪勒管激素(AMH)的生物学水平或得分、BAFC的生物学水平或得分、孕酮的生物学水平或得分、LH的生物学水平或得分、雌二醇的生物学水平或得分、基础体温水平或其组合。在一些实施方案中，生物传感器是配置用于植入或粘附到个体的传感器。在一些实施方案中，生物传感器是被配置为分析体温的传感器。在一些实施方案中，生物传感器是温度传感器(例如，温度计)。在一些实施方案中，生物传感器是基于唾液的传感器、基于皮肤的传感器(例如，皮肤贴片)、皮下传感器、子宫内传感器或阴道传感器。在一些实施方案中，生物传感器是被配置为分析体液的传感器。在一些实施方案中，体液是唾液、血液、尿液或月经液。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个计算机处理器(例如，与系统的其他计算机处理器相同或不同)，其被配置为将生物数据转换成个体的一种或多种生物学水平或得分。
在某些实施方案中，显示由本文提供的系统鉴定的治疗方案，例如显示给个体或医疗提供者。在一些情况下，个体或医疗提供者随后遵守治疗方案(例如，通过向个体施用本文提供的经修饰蛋白质或根据治疗方案的其他药剂)。在特定实施方案中，系统包括被配置为显示治疗方案的显示器。
在一些实施方案中，系统包括配置为根据治疗方案(例如，自动地)施用治疗剂的设备。在一些实施方案中，设备是植入设备。在一些实施方案中，即使系统包括被配置为根据治疗方案(例如，自动地)施用治疗剂的设备，也存在显示器，例如以允许个体和/或医疗提供者监测治疗方案(例如，当前和或以前使用的)。
在一些实施方案中，本文提供了调节卵泡生成和卵巢衰老的方法，例如以延迟生育潜力和卵巢功能峰或维持生育潜力和卵巢功能(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些实施方案中，施用本文提供的药剂和/或组合物降低了卵泡活化的速度。在一些实施方案中，施用本文提供的药剂和/或组合物降低了卵泡成熟的速度。在某些实施方案中，本文提供的例如延迟生育潜力峰的疗法进一步包括在初始施用之后的某个时间点停止药剂或组合物的施用，例如当个体准备好生殖时。在一些实施方案中，本文提供了用于延长女性生殖寿命的方法(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物延长了女性的生殖寿命。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物保护卵巢功能和卵巢的内分泌功能。
在一些实施方案中，本文提供了调节卵泡生成和卵巢衰老的方法，例如以维持接受性腺毒性疗法(例如对卵巢造成损伤并损害生育潜力的治疗，包括化疗、放疗和手术切除)的女性的卵巢储备(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些实施方案中，施用本文提供的药剂和/或组合物减少由性腺毒性治疗引起的对原始卵泡的募集。在某些实施方案中，本文提供的例如在性腺毒性治疗期间维持卵巢储备的疗法进一步包括在性腺毒性治疗之后的某个时间点停止施用药剂或组合物。在一些实施方案中，本文提供了用于延长女性生殖寿命的方法(例如，通过向有需要的女性施用本文提供的药剂，例如以治疗有效量和/或方式)。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物延长了女性的生殖寿命。在一些情况下，施用所提供的药剂或组合物保护卵巢功能和卵巢的内分泌功能。
一般来说，前AMH(切割前)和经加工的AMH(切割后，当N和C末端仍然非共价键合时)都存在于绝经前女性的循环血清中。这两种形式之间的比率随着年龄变化并且在同一卵巢周期内变化。本文的各种实施方案中提供的某些方法用于和/或涉及(例如，在控制卵泡生成的方法或本文的其他方法中)通过施用包含经修饰的TGF-β蛋白的组合物来改变这两种形式的AMH(例如，包括其变体)的相对水平。
在某些实施方案中，本公开的组合物包含经修饰的TGF-β超家族蛋白质，例如参与卵巢周期的经修饰的TGF-β超家族蛋白质。在具体实施方案中，TGF-β超家族蛋白是在卵巢卵泡(或其中的卵母细胞)中产生的蛋白(例如，AMH)。
在具体实施方案中，本文提供的是经修饰的TGF-β蛋白(本文也称为TGF-β蛋白变体)。在更具体的实施方案中，蛋白变体相对于野生型被修饰，例如以修饰(例如，增加)其生物活性和/或改善其稳定性(例如，相对于野生型)。在某些情况下，经修饰的生物活性包括对蛋白质结合至受体的能力和/或信号蛋白或激素(例如，AMH)水平的修饰。在一些情况下，在分泌之前，TGF-β家族成员，如AMH，缔合成二硫键键合的二聚体(例如，如图6所示)。这些二聚体可以是同二聚体或异二聚体，具体取决于家族成员。然后蛋白质折叠导致在二聚体的每个单体内形成非共价键。在从蛋白质的N末端部分蛋白水解切割C末端配体结构域后，二硫键和非共价键起到使分子保持完全折叠的潜伏形式的作用。蛋白质以这种形式分泌，但它不能与受体结合，直到N末端区域与配体区域解离。经切割的AMH的C末端结构域引发强烈的下游反应。
因此，在一些情况下，对AMH和其他TGF-β蛋白的翻译后修饰调节它们的生物活性。在某些情况下，只有TGF-β家族成员(包括AMH)的经切割形式具有生物活性。在一些情况下，本文提供的蛋白质变体中存在的修饰包括在相对于野生型AMH的切割识别位点内或附近的置换或插入。在某些情况下，被修饰(例如，以改善切割效率)的切割位点是蛋白质活化所需的切割位点。在一些情况下，被修饰(例如，以降低切割效率)的切割位点是蛋白质活化不需要的切割位点。在某些实施方案中，修饰是糖基化位点中的插入或置换，这在一些情况下导致相对于野生型TGF-β蛋白更稳定的经切割或未切割重组蛋白。在一些情况下，修饰是用TGF-β超家族的另一个成员的N末端区域替代AMH的N末端区域。在某些情况下，修饰是将野生型AMH中的信号肽替换为不同蛋白质中的以更高效率分泌的信号肽。在一些情况下，修饰是插入肽标签以促进蛋白质纯化。
在一些情况下，AMH的野生型包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在特定情况下，AMH的野生型氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:1)(参见UnitProt登录号P03971)。
在一些实施方案中，本文的组合物是包含SEQ ID NO:1的野生型抗缪勒管激素(AMH)蛋白的经修饰形式，其包含至少两个选自下组的修饰：a)SEQ ID NO:1的氨基酸位置448至452处的切割识别位点内或附近的置换或插入，其中所述切割识别位点包含序列RAQRS(SEQ ID NO:120)；b)在SEQ ID NO:1的具有序列PRYG的氨基酸位置501和504之间或在SEQ ID NO:1的具有序列GNHV的氨基酸位置504和507之间的糖基化位点的插入；c)用TGFβ家族的不同成员(例如，TGF-β1、TGF-β2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8B、GDF15、INHA、INHBA)的N末端区域对AMH中的N末端区域的置换；d)用非AMH信号肽对AMH中的信号肽的置换；e)肽标签在AMH序列内的添加；f)来自糖蛋白的基序的添加；以及g)N末端肽从野生型AMH中的去除和稳定化修饰的添加。
在某些实施方案中，AMH在氨基酸448-451处含有切割识别位点，其中初级切割(在序列中用“/”标记)发生在氨基酸451和452之间。在某些实施方案中，初级切割位点包含氨基酸448、449、450、451和452。在某些实施方案中，次级切割位点(在序列中用“//”标记)在SEQ ID NO:1的氨基酸254和255之间。
在某些实施方案中，野生型AMH中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RAQRS 5
(SEQ ID NO:120)
在某些实施方案中，野生型TGFB1中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RHRRA 5
(SEQ ID NO:121)
在某些实施方案中，野生型BMP15中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RRTRQ 5
(SEQ ID NO:122)
在某些实施方案中，野生型GDF9中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RHRRG 5
(SEQ ID NO:123)
在某些实施方案中，野生型BMP2中的初级切割位点的序列包含以下基序：
REKRQ 5
(SEQ ID NO:124)
[1]在某些实施方案中，野生型BMP4中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RAKRS 5
(SEQ ID NO:125)
在某些实施方案中，野生型BMP6中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RTTRS 5
(SEQ ID NO:126)
在某些实施方案中，野生型BMP7中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RSIRS 5
(SEQ ID NO:127)
在某些实施方案中，野生型BMP8B中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RTPRA 5
(SEQ ID NO:128)
在某些实施方案中，野生型GDF15中的初级切割位点的序列包含以下基序：
GRRRA 5
(SEQ ID NO:129)
在某些实施方案中，野生型INHBA中的初级切割位点的序列包含以下基序：
RRRRG 5
(SEQ ID NO:130)
在某些实施方案中，针对弗林蛋白酶切割而优化的初级切割位点的序列包含以下基序：
RARKRR 6
(SEQ ID NO:131A)
RARKRRS 7
(SEQ ID NO:131B)
RKKRRS 6
(SEQ ID NO:131C)
KKRRS 5
(SEQ ID NO:131D)
RKKRR 5
(SEQ ID NO:131E)
KKRR 4
(SEQ ID NO:131F)
在某些实施方案中，针对肠激酶切割而优化的初级切割位点的序列包含以下基序：
DDDDKS 6
(SEQ ID NO:132)
DDDDK 5
(SEQ ID NO:132B)
在某些实施方案中，经修饰蛋白质包含以下突变之一：插入或缺失(indel)，相对于蛋白质野生型版本的置换，以及基序(例如，来自糖蛋白激素家族成员的野生型序列的基序)的添加。在某些实施方案中，插入或缺失包括在切割识别位点内或附近的置换。在某些实施方案中，置换包括氨基酸基序内的置换，在一些情况下，包括在野生型蛋白质的切割识别位点内或侧翼的置换。在某些实施方案中，突变包括糖基化位点中的插入或置换。在一些实施方案中，突变包括用TGF-β超家族的不同成员的N末端肽替换AMH的N末端肽。在某些实施方案中，突变包括用来自不同蛋白质的信号肽替换AMH的信号肽。在一些实施方案中，突变包括插入肽，例如，促进重组蛋白的纯化的肽。
在一些情况下，负责对前TGF-β蛋白进行切割的酶是枯草杆菌蛋白酶/kexin样前蛋白转化酶(SPC)的成员，例如PC5(由PCSK5编码)、弗林蛋白酶(由PCSK3编码)和PACE4(PCSK6)。通常，这些酶的识别位点由对应于RXXR共有基序(其中X＝任何氨基酸残基)的4个氨基酸构成(例如，其在TGF-β家族的所有成员中通常是保守的)。例如，在AMH中，这个序列是RAQR。通常，切割识别位点侧翼的氨基酸序列调节前蛋白切割的效率。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括为本文所述的目的施用本文所述的经修饰蛋白质，例如其中施用(和/或施用后体内经修饰蛋白质的存在)增强了相应TGF-β前蛋白的切割和/或增加了生物活性形式的水平。在一些实施方案中，本文提供了增强相应TGF-β前蛋白的切割和/或增加生物活性形式的水平的方法(例如，通过施用本文提供的药剂或组合物)。在某些实施方案中，施用药剂或组合物以调节(例如，减少)卵泡生成以治疗卵巢衰老。
在某些实施方案中，经修饰蛋白质包含野生型蛋白质基序的突变，例如在切割位点侧翼或内，例如表1中列出的置换之一。
在某些具体实施方案中，蛋白质的突变或修饰包括糖基化位点的插入，例如3-4个氨基酸插入替换野生型AMH序列中的残基。天然存在的AMH氨基酸序列在C末端区域中的α-螺旋上游不包括n-糖基化位点。BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和BMP8B在C末端区域中的α-螺旋上游具有n-糖基化(图1)。在一些情况下，将与在BMP2、BMP4、BMP6、BMP7或BMP8B中发现的位点相似的n-糖基化位点添加到α-螺旋的上游，并且/或者改善成熟蛋白质的稳定性(例如，从而改善丰度)。在一些情况下，具有这种序列的经修饰AMH蛋白产生更稳定的经切割或未切割的重组AMH。在具体实施方案中，糖基化位点的插入发生在AMH野生型序列(PRYGNHV，SEQID NO:133)中的氨基酸501和504之间。在一些实施方案中，插入是LNSS(SEQ ID NO 136)，或MNAS(SEQ ID NO 137)，或PNAS(SEQ ID NO 138)，或PNSS(SEQ ID NO 139)。在具体实施方案中，糖基化位点的插入发生在野生型序列(PRYGNHV，SEQ ID NO:133)的氨基酸504和507之间并且插入是GNHT(SEQ ID NO:140)。在某些实施方案中，野生型BMP2和BMP4的C末端区域中的糖基化位点的序列包含以下基序：
LNST
(SEQ ID NO:134)
在某些实施方案中，野生型BMP6和BMP7的C末端区域中的糖基化位点的序列包含以下基序：
MNAT
(SEQ ID NO:135)
在某些实施方案中，野生型BMP6、BMP7、BMP2或BMP4的C末端区域中的糖基化位点的序列被修饰以减少对AMH序列结构和/或稳定性的干扰，并且插入的经修饰序列是：
LNSS
(SEQ ID NO:136)
在某些实施方案中，野生型BMP6、BMP7、BMP2或BMP4的C末端区域中的糖基化位点的序列被修饰以减少对AMH序列结构和/或稳定性的干扰，并且插入的经修饰序列是：
MNAS
(SEQ ID NO:137)
在某些实施方案中，野生型BMP6、BMP7、BMP2或BMP4的C末端区域中的糖基化位点的序列被修饰以减少对AMH序列结构和/或稳定性的干扰，并且插入的经修饰序列是：
PNAS
(SEQ ID NO 138)
在某些实施方案中，野生型BMP6、BMP7、BMP2或BMP4的C末端区域中的糖基化位点的序列被修饰以减少对AMH序列结构和/或稳定性的干扰，并且插入的经修饰序列是：
PNSS
(SEQ ID NO:139)
在某些实施方案中，野生型AMH中的序列GNHV被修饰以产生具有以下序列的糖基化位点：
GNHT
(SEQ ID NO:140)
在某些情况下，人绒毛膜促性腺激素蛋白(由CGB3基因编码)的P亚基(野生型蛋白中带有四个被O连接的寡糖修饰的丝氨酸残基的羧基末端延伸)有助于较长的蛋白质半衰期。
在某些情况下，编码人绒毛膜促性腺激素的CGB3的野生型序列是：
(SEQ ID NO:141)(参见UnitProt登录号P0DN86)
CGB3在SEQ ID NO:141的野生型蛋白质中的氨基酸140-164处具有C末端延伸，其包括4个O-连接的寡糖修饰的丝氨酸残基(氨基酸140、146、151和157)。
在一些实施方案中，经修饰蛋白质包括基序的添加，例如来自糖蛋白激素家族成员的野生型序列的基序的添加。在某些实施方案中，基序包含人绒毛膜促性腺激素蛋白的羧基末端肽的全部或部分，例如氨基酸序列SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:142)。
在一些实施方案中，经修饰蛋白质包括基序的添加，例如来自糖蛋白激素家族成员的野生型序列的基序的添加。在某些实施方案中，基序包含其中添加有接头的人绒毛膜促性腺激素蛋白的羧基末端肽的全部或部分，例如氨基酸序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:143)或序列SSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:144)。
在某些实施方案中，突变包括在AMH野生型序列中的次级切割位点内或侧翼的一个或多个氨基酸残基的修饰。在具体实施方案中，次级切割位点例如在AMH野生型序列的氨基酸254(R)和255(S)之间。在某些实施方案中，修饰包括用不同的氨基酸替换切割位点之前的氨基酸。在具体实施方案中，修饰包括用丝氨酸(S)或用谷氨酰胺(Q)或用丙氨酸(A)替换切割前的精氨酸(R)。
在某些实施方案中，突变包括用来自TGF-β超家族的另一个成员的N末端区域(即TGF-β超家族的另一个成员的前蛋白序列的野生型形式内的肽，该肽会被蛋白水解切割以产生C末端成熟区域)替换野生型AMH序列的N末端区域(即野生型AMH前蛋白序列内的肽，该肽会被蛋白水解切割以产生C末端成熟区域)(例如SEQ ID NO:145)。例如，修饰包括用TGFB1或TGFB2的N末端区域的至少一部分替换野生型AMH中的N末端区域。在一些实施方案中，TGFB1或TGFB2的N末端区域中的信号肽和/或切割位点被修饰以改善经修饰的肽的分泌和/或切割。在一些实施方案中，修饰包括用TGFB1、TGFB2、BMP15、GDF9、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7或BMP8B、GDF15、INHA或INHBA的N末端区域的至少一部分替换野生型AMH中的N末端区域。
在某些实施方案中，野生型AMH的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:145)
在某些实施方案中，野生型TGFB1的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:146)
在某些实施方案中，野生型TGFB2的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:147)
在某些实施方案中，通过用IgK的信号肽替换野生型信号肽来修饰野生型TGFB1的N末端区域以产生以下序列：
(SEQ ID NO:148)
在某些实施方案中，通过用IgK的信号肽替换野生型信号肽并通过用针对弗林蛋白酶切割而优化的位点替换野生型切割位点来修饰野生型TGFB2的N末端区域以产生以下序列
(SEQ ID NO:149)
在某些实施方案中，野生型BMP15的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:174)
在某些实施方案中，野生型GDF9的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:176)
在某些实施方案中，野生型BMP2的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:178)
在某些实施方案中，野生型BMP4的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:180)
在某些实施方案中，野生型BMP6的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:182)
在某些实施方案中，野生型BMP7的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:184)
在某些实施方案中，野生型BMP8B的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:186)
在某些实施方案中，野生型GDF15的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:188)
在某些实施方案中，野生型INHA的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:190)
在某些实施方案中，野生型INHBA的N末端区域包含以下序列：
(SEQ ID NO:192)
在某些实施方案中，突变包括向AMH野生型序列或向AMH经修饰序列添加多肽蛋白标签。在某些情况下，一旦产生重组蛋白，标签可用于纯化重组蛋白。在某些实施方案中，在初级切割位点之后添加标签。在具体实施方案中，标签插入例如氨基酸452(丝氨酸，S)和453(丙氨酸，A)之间。在某些实施方案中，标签是以下中之一：Strep-标签、FLAG标签或多组氨酸标签。
在某些实施方案中，Strep-标签的序列是：
WSHPQFEK 8
(SEQ ID NO:150)
在某些实施方案中，FLAG-标签的序列是：
DYKDDDDK 8
(SEQ ID NO:151)
在某些实施方案中，多组氨酸标签的序列是：HHHHHH 6
(SEQ ID NO:194)
在某些实施方案中，突变包括用来自不同蛋白质的信号肽替换野生型AMH形式的信号肽。在具体实施方案中，来自高效天然分泌的蛋白质的信号肽改善了被添加该肽的突变蛋白质的分泌。例如，替换AMH中的信号肽的信号肽可以是以下之一：天青杀素、IL2、IL6、CD5、免疫球蛋白重链(Ig-HC)、免疫球蛋白轻链(Ig-LC)、胰蛋白酶原、催乳素、弹性蛋白、HMM、人流感血凝素、IgK。
在某些实施方案中，天青杀素中信号肽的序列是：MTRLTVLALL AGLLASSRA 19
(SEQ ID NO:153)
在某些实施方案中，IL2中信号肽的序列是：MYRMQLLSCI ALSLALVTNS 20
(SEQ ID NO:154)
在某些实施方案中，IL6中信号肽的序列是：MNSFSTSAFG PVAFSLGLLL VLPAAFPAP29
(SEQ ID NO:155)
在某些实施方案中，CD5中信号肽的序列是：MPMGSLQPLA TLYLLGMLVA SCLG 24
(SEQ ID NO:156)
在某些实施方案中，Ig重链中信号肽的序列是：MDWTWRVFCL LAVTPGAHP 19
(SEQ ID NO:157)
在某些实施方案中，Ig轻链中信号肽的序列为：MAWSPLFLTL ITHCAGSWA 19
(SEQ ID NO:158)
在某些实施方案中，胰蛋白酶原中信号肽的序列是：MNLLLILTFV AAAVA 15
(SEQ ID NO:159)
在某些实施方案中，催乳素中信号肽的序列是：MNIKGSPWKG SLLLLLVSNLLLCQSVAP 28
(SEQ ID NO:160)
在某些实施方案中，弹性蛋白中信号肽的序列是：MAGLTAAAPR PGVLLLLLSILHPSRP 26
(SEQ ID NO:161)
在某些实施方案中，产生的HMM信号肽的序列是：MWWRLWWLLL LLLLLWPMVW A 21
(SEQ ID NO:162)
在某些实施方案中，人流感血凝素中信号肽的序列是：MKTIIALSYI FCLVFA 16
(SEQ ID NO:163)
在某些实施方案中，IgKappa中信号肽的序列是：METDTLLLWV LLLWVPGSTG 20
(SEQ ID NO:164)
在某些实施方案中，经修饰蛋白质包含一个或多个突变或添加，例如本文所述和/或其他进一步的变异。其他变异也在本公开的范围内。例如，作为非限制性示例，本公开的经修饰蛋白质包括包含以下中任何氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54。
在一些情况下，经修饰蛋白质包括图9中列出的一个或多个经修饰序列。图9包括本文所述的组合物的序列。图9说明了存在于本文提供的各种经修饰蛋白质中的示例性修饰(例如，序列)。
在一些实施方案中，本文提供的是包含例如本文所述的氨基酸序列的多肽，例如本文所述的任何SEQ ID。在具体实施方案中，多肽是重组多肽或蛋白质。在某些实施方案中，(例如，重组的)多肽与本文所述的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。在具体实施方案中，(例如，重组的)多肽是经修饰蛋白质或野生型蛋白质的蛋白质变体，例如本文所述的(换言之，在一些实施方案中，本文提供的多肽具有本文所述的序列同一性，条件是所述多肽不包含野生型氨基酸序列)。在某些实施方案中，多肽或经修饰蛋白质是例如本文所述的野生型蛋白质的功能性蛋白质变体。在具体实施方案中，功能性蛋白质变体具有适合实现本文所述结果的活性。在某些实施方案中，功能性蛋白质变体具有至少与野生型蛋白质的活性相当的活性(例如，其活性的至少80％、其活性的至少90％或其活性的至少100％)。在一些实施方案中，(例如，功能性)蛋白质变体(或其活性形式)具有至少与野生型蛋白质(或其活性形式)的活性相当的稳定性(例如，其活性的至少80％、其活性的至少90％，或其稳定性的至少100％)。在具体实施方案中，(例如，功能性)蛋白质变体比野生型蛋白质更具有活性且更稳定(例如，降解更慢和/或清除率更低)(例如，在实现本文所述的结果时，例如在本文的方法中)。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括单独或与一种或多种其他药剂和/或疗法组合施用本文所述的药剂(例如蛋白质变体)。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括鉴定需要本文提供的疗法的女性，例如使用任何合适的技术。在一些实施方案中，在本文所述的治疗方法(例如，增加或减少施用频率)期间，例如基于对基础窦卵泡计数、促卵泡激素、雌二醇、基础体温和/或AMH水平(例如，经确定的水平)的分析，例如与早期评估或与其他水平的比较，对剂量和/或治疗方案或计划进行修改(例如，增加或减少剂量)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括评估基础窦卵泡计数、促卵泡激素、雌二醇、基础体温、和/或AMH的水平，例如在施用本文所述的治疗性蛋白质之前和/或之后(例如，在治疗前确定基线水平和治疗后，或在治疗方案期间，例如评估治疗结果)。在某些实施方案中，本文提供的是(例如，药物)组合物，其包含本文提供的药剂(例如本文所述的经修饰蛋白质(蛋白质变体))，其还包含生理学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，组合物是无菌的。在某些实施方案中，药物组合物被配制用于特定的施用模式。
在某些实施方案中，本文提供了用于在女性中，例如在有需要的女性中调节卵泡生成、延迟绝经和/或绝经过渡期、延长生育窗口、治疗或调节与BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温和/或雌二醇等的异常(或绝经，或绝经过渡期)水平相关的病况或病症或与之相关的任何症状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文提供的药剂(例如，本文提供的经修饰蛋白质)。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的女性施用治疗有效量的药剂。在一些实施方案中，有需要的女性是其BAFC、促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、LH、孕酮、基础体温和/或雌二醇的水平低于(或高于)阈值水平的女性。在一些实施方案中，BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇水平从任何合适的生物样品例如组织、血液或唾液或通过温度传感或超声方法来确定。在一些实施方案中，药剂的治疗有效量至少部分地基于(1)BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇中的一种或两种或三种、四种、五种、六种或全部七种是否偏离(例如，低于)阈值水平，和/或(2)BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇中任何一种或多种的经确定水平偏离(例如，低于或高于)阈值水平的程度。在一些实施方案中，药剂的治疗有效量至少部分地基于一个或多个特征(例如，与绝经和/或绝经过渡期相关的症状或症状评估(例如，得分))，例如基于情绪、体重指数(BMI)、体重变化、热潮红、保水性、食欲、月经周期规律、性欲、睡眠指标、能量水平等，或其一种或多种的任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括：(a)评估(例如，确定和/或评分)个体的生物样品中促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、BAFC、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇的生物学水平(例如，在组织、血液或唾液中或通过超声波)；以及(b)向个体施用治疗有效量的药剂(例如，如本文所提供的药剂)(例如，至少部分基于(a)的评估)，例如当BAFC、FSH、AMH、LH、孕酮、基础体温、和/或雌二醇的水平偏离(例如，低于或高于)阈值水平时。在一些实施方案中，所述方法进一步包括评估(例如，鉴定是否存在和/或评分)个体的(例如，表型)状况(例如，绝经或绝经过渡期症状)，例如其中施用的药剂的治疗有效量(1)至少部分基于对个体的FSH、AMH、BAFC、LH、孕酮、基础体温和/或雌二醇的生物学水平的评估；以及(2)至少部分基于对个体状况的评估。
在一些实施方案中，与确定本文提供的药剂的治疗有效量相关的病症(例如，绝经或绝经过渡期症状)是或基于(例如，评分、改变、增加或减少)情绪、(例如，评分、改变、增加或减少)BMI、(例如，评分、改变、增加或减少)体重、(例如，评分、改变、增加或减少)热潮红、(例如，评分、改变、增加或减少)保水性、(例如，评分、改变、增加或减少)食欲、(例如，评分、改变、增加或减少)月经周期规律、(例如，评分、改变、增加或减少)性欲、(例如，评分、改变、增加或减少)睡眠指标、(例如，评分、改变、增加或减少)能量水平等，或其任何组合。
图7图示了涉及评估各种输入的方法示意图，例如与促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、BAFC、LH、孕酮和/或雌二醇和/或绝经和/或绝经过渡期症状的特征的生物学水平(例如，在组织、血液或唾液中或通过超声波可视化)有关的各种输入。如示意图中所示并且在本文中更详细地描述，与这种方法相关联的系统也在本文中被考虑。
在本文提供的药物组合物中，任何合适的赋形剂和/或载体任选地与(例如，治疗有效量的)药剂(例如，本文所述的经修饰蛋白质或蛋白质变体)组合。在一些实施方案中，合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐水溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇类、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(例如甘露醇、蔗糖或其他)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白等，以及其组合。在一些实施方案中，药物制剂包含一种或多种助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)，它们不与活性化合物发生有害反应且不干扰其活性。在一些实施方案中，使用适合静脉内施用的水溶性载体。在一些实施方案中，药物组合物或药物包含一定量(通常为少量)的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。在一些实施方案中，药物组合物可以配制成栓剂，其中具有传统的粘合剂和载体，例如甘油三酯。在一些实施方案中，口服制剂可以包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。例如，在某些实施方案中，通常用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。
在某些实施方案中，当需要或必要时，组合物进一步包括增溶剂和/或局部麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。在一些实施方案中，它们单独提供或以单位剂型混合在一起提供。在一些实施方案中，在通过注射施用组合物的情况下，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，从而可以在施用之前混合成分。
根据本公开使用的组合物或药剂通过任何合适的途径施用。在某些实施方案中，施用本公开的组合物包括组合物的真皮内注射、皮下注射、透真皮递送、真皮下递送或输注。在某些实施方案中，可以通过真皮下缓释设备施用化合物。在某些实施方案中，静脉内施用组合物。在某些实施方案中，皮下施用组合物。在某些实施方案中，药物组合物通过肠胃外、透真皮或透粘膜(例如，经口、经鼻)施用。如果需要，可以同时使用多于一个途径。
在某些实施方案中，组合物被包装用于递送至人患者，例如，在真皮下或静脉内递送系统中或与真皮下或静脉内递送系统一起递送至人患者。组合物可以装在静脉内袋中。真皮下系统可以是缓释系统。
在某些实施方案中，本公开的此类经修饰蛋白质通过本领域普通技术人员已知的任何方法产生，包括但不限于经修饰蛋白质的重组表达。在某些实施方案中，表达载体系统用于制造本文所述的重组蛋白，因为该系统已充分建立并且合适的生产/纯化方案已得到充分描述和验证。通过标准技术将编码蛋白质的表达载体转染到宿主细胞中。载体可以包括使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、质粒、纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、微泡、细胞穿透肽或脂质球。术语“转染”的各种形式旨在涵盖广泛的通常用于将外源(例如，非天然存在于宿主细胞中)外部DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、钙-磷酸沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。在一些情况下，重组蛋白生产包括细菌繁殖和发酵生产，其中将编码目的基因的质粒转化到细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)中，繁殖以制作主细胞库和工作细胞库，并在生物反应器(例如发酵罐)中进一步生长以制造含有高产量质粒的生产细胞，然后进行纯化和制剂稳定性，其中裂解生产细胞并通过多种纯化方法纯化携带目的基因的质粒DNA并配制用于递送。通过离心、去污剂介导的蛋白质溶解，然后进行涉及柱的纯化等来收获受感染的细胞。
在某些实施方案中，组合物的治疗有效量为例如超过约0.01mg/kg、超过约0.05mg/kg、超过约0.1mg/kg、超过约0.5mg/kg、超过约1.0mg/kg、超过约1.5mg/kg、超过约2.0mg/kg、超过约2.5mg/kg、超过约5.0mg/kg、超过约7.5mg/kg、超过约10mg/kg、超过约12.5mg/kg、超过约15mg/kg。
在一些实施方案中，治疗有效量的组合物作为一次性剂量施用或间隔施用。在一些实施方案中，每两个月一次、每月一次、每月两次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次或每天施用组合物。
计算系统
参考图8，示出了描述示例性机器的框图，该示例性机器包括计算机系统100(例如，处理或计算系统)，其中可以执行一组指令以使设备进行或执行本公开的静态代码时序安排的任何一个或多个方面和/或方法。图8中的组件仅是示例并且不限制任何硬件、软件、嵌入式逻辑组件或实现特定实施方案的两个或更多个此类组件的组合的使用范围或功能。
计算机系统100可以包括一个或多个相互通信以及通过总线140与其他组件通信的处理器101、内存103和存储器108。总线140还可以链接显示器132、一个或多个输入设备133(例如，可以包括小键盘、键盘、鼠标、触控笔等)、一个或多个输出设备134、一个或多个存储设备135以及各种有形存储介质136。所有这些元件可以直接或通过一个或多个接口或适配器与总线140连接。例如，各种有形存储介质136可以通过存储介质接口126与总线140连接。计算机系统100可以具有任何合适的物理形式，包括但不限于一个或多个集成电路(IC)、印刷电路板(PCB)、移动手持设备(例如移动电话或PDA)、膝上型电脑或笔记本电脑、分布式计算机系统、计算网格或服务器。
计算机系统100包括一个或多个执行功能的处理器101(例如，中央处理单元(CPU)或通用图形处理单元(GPGPU))。一个或多个处理器101任选地包含高速缓存存储器单元102，用于指令、数据或计算机地址的临时本地存储。一个或多个处理器101被配置为协助执行计算机可读指令。计算机系统100可以为图8中描述的组件提供功能，作为一个或多个处理器101执行包含在一个或多个有形计算机可读存储介质(例如内存103、存储器108、存储设备135和/或存储介质136)中的非暂时性的处理器可执行的指令的结果。计算机可读介质可以存储实现特定实施方案的软件，并且一个或多个处理器101可以执行该软件。内存103可以从一个或多个其他计算机可读介质(例如内存大容量存储设备135、136)或通过合适的接口例如网络接口120从一个或多个其他来源读取软件。该软件可以使一个或多个处理器101执行在此描述或说明的一个或多个过程或一个或多个过程的一个或多个步骤。执行这样的过程或步骤可以包括定义存储在内存103中的数据结构，并按照软件的指示修改数据结构。
内存103可以包括各种组件(例如，机器可读介质)，包括但不限于随机存取存储器组件(例如，RAM 104)(例如，静态RAM(SRAM)、动态RAM(DRAM)、铁电随机存取存储器(FRAM)、相变随机存取存储器(PRAM)等)、只读存储器组件(例如，ROM105)，及其任何组合。ROM 105可用于与一个或多个处理器101单向通信数据和指令，并且RAM 104可用于与一个或多个处理器101双向通信数据和指令。ROM 105和RAM 104可以包括下面描述的任何合适的有形计算机可读介质。在一个示例中，基本输入/输出系统106(BIOS)，包括例如在启动期间帮助在计算机系统100内的元件之间传输信息的基本例程，可以存储在内存103中。
固定存储器108双向连接到一个或多个处理器101，任选地通过存储控制单元107。固定存储器108提供额外的数据存储容量并且还可以包括本文所述的任何合适的有形计算机可读介质。存储器108可用于存储操作系统109、一个或多个可执行文件110、数据111、应用112(应用程序)等。存储器108还可以包括光盘驱动器、固态存储设备(例如，基于闪存的系统)，或上述任何的组合。在适当的情况下，存储器108中的信息可以作为虚拟内存并入内存103中。
在一个示例中，一个或多个存储设备135可以通过存储设备接口125与计算机系统100可移除地连接(例如，通过外部端口连接器(未示出))。特别地，一个或多个存储设备135和相关联的机器可读介质可以为机器可读指令、数据结构、程序模块和/或用于计算机系统100其他数据提供非易失性和/或易失性存储。在一个示例中，软件可以完全或部分地驻留在一个或多个存储设备135上的机器可读介质中。在另一个示例中，软件可以完全地或部分地驻留在一个或多个处理器101内。
总线140连接各种子系统。在此，在适当的情况下，对总线的引用可以包括一条或多条用于共同功能的数字信号线。总线140可以是多种类型的总线结构中的任何一种，包括但不限于，内存总线、内存控制器、外围总线、本地总线以及其任何组合，使用任何种类总线架构。作为示例而非限制，此类架构包括工业标准架构(ISA)总线、增强型ISA(EISA)总线、微通道架构(MCA)总线、视频电子标准协会本地总线(VLB)、外围组件互连(PCI)总线、PCI-Express(PCI-X)总线、加速图形端口(AGP)总线、HyperTransport(HTX)总线、串行高级技术附件(SATA)总线及其任何组合。
计算机系统100还可以包括输入设备133。在一个示例中，计算机系统100的用户可以通过一个或多个输入设备133将命令和/或其他信息输入计算机系统100。一个或多个输入设备133的示例包括但不限于字母数字输入设备(例如，键盘)、定点设备(例如，鼠标或触摸板)、触摸板、触摸屏、多点触摸屏、操纵杆、触控笔、游戏手柄、音频输入设备(例如麦克风、语音响应系统等)、光学扫描仪、视频或静止图像捕获设备(例如，照相机)及其任何组合。在一些实施方案中，输入设备是Kinect、Leap Motion等。一个或多个输入设备133可以通过各种输入接口123中的任何一个(例如，输入接口123)连接到总线140，包括但不限于串行、并行、游戏端口、USB、FIREWIRE、THUNDERBOLT或上述任何组合。
在特定实施方案中，当计算机系统100连接到网络130时，计算机系统100可以与其他设备通信，特别是移动设备和企业系统、分布式计算系统、云存储系统、云计算系统等，连接到网络130。往来于计算机系统100的通信可以通过网络接口120发送。例如，网络接口120可以接收来自网络130的一个或多个数据包(例如互联网协议(IP)数据包)形式的传入通信(例如来自其他设备的请求或响应)，并且计算机系统100可以将传入的通信存储在内存103中以供处理。计算机系统100可以类似地将传出通信(例如对其他设备的请求或响应)以一个或多个数据包的形式存储在内存103中并从网络接口120传送到网络130。一个或多个处理器101可以访问存储在内存103中的这些通信数据包以进行处理。
网络接口120的示例包括但不限于网络接口卡、调制解调器及其任何组合。网络130或网段130的示例包括但不限于分布式计算系统、云计算系统、广域网(WAN)(例如，因特网、企业网络)、局域网(LAN)(例如，与办公室、建筑物、校园或其他相对较小的地理空间相关的网络)、电话网络、两个计算设备之间的直接连接、对等网络及其任何组合。诸如网络130之类的网络可以采用有线和/或无线通信模式。通常，可以使用任何网络拓扑。
可以通过显示器132显示信息和数据。显示器132的示例包括但不限于阴极射线管(CRT)、液晶显示器(LCD)、薄膜晶体管液晶显示器(TFT-LCD)、有机液晶显示器(OLED)(例如无源矩阵OLED(PMOLED)或有源矩阵OLED(AMOLED)显示器)、等离子显示器及其任何组合。显示器132可以通过总线140连接到一个或多个处理器101、内存103和固定存储器108以及其他设备，例如一个或多个输入设备133。显示器132通过视频接口122连接到总线140，并在显示器132和总线140之间数据的传输可以通过图形控件121进行控制。在一些实施方案中，显示器是视频投影仪。在一些实施方案中，显示器是头戴式显示器(HMD)，例如VR头盔。在进一步的实施方案中，作为非限制性示例，合适的VR头盔包括HTC Vive、Oculus Rift、SamsungGear VR、Microsoft HoloLens、Razer OSVR、FOVE VR、Zeiss VR One、Avegant Glyph、Freefly VR头盔等。在更进一步的实施方案中，显示器是诸如本文所公开的那些设备的组合。
除了显示器132之外，计算机系统100可以包括一个或多个其他外围输出设备134，包括但不限于音频扬声器、打印机、存储设备及其任何组合。这样的外围输出设备可以通过输出接口124连接到总线140。输出接口124的示例包括但不限于串行端口、并行连接、USB端口、FIREWIRE端口、THUNDERBOLT端口及其任何组合。
另外地或可替代地，计算机系统100可以提供作为硬接线或以其他方式体现在电路中的逻辑的结果的功能，其可以代替软件或与软件一起操作以执行本文描述或说明的一个或多个过程或一个或多个过程的一个或多个步骤。本公开中对软件的引用可以涵盖逻辑，并且对逻辑的引用可以涵盖软件。此外，对计算机可读介质的引用可以在适当的情况下涵盖存储用于执行的软件的电路(例如IC)、包含用于执行的逻辑的电路、或两者。本公开包括硬件、软件或两者的任何适当组合。
本领域技术人员将理解，结合本文公开的实施方案描述的各种说明性逻辑块、模块、电路和算法步骤可以作为电子硬件、计算机软件或两者的组合实现。为了清楚地说明硬件和软件的这种可互换性，各种说明性组件、块、模块、电路和步骤已经在上面大体上根据它们的功能进行了描述。
结合本文公开的实施方案描述的各种说明性逻辑块、模块和电路可以用通用处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他可编程逻辑器件、分立门或晶体管逻辑、分立硬件组件或设计用于执行本文所述功能的其任何组合来实现或执行。通用处理器可以是微处理器，但在备选方案中，处理器可以是任何常规处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器也可以作为计算设备的组合来实现，例如，DSP和微处理器的组合、多个微处理器、一个或多个微处理器与DSP核心相结合，或任何其他这样的配置。
结合本文公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可以直接体现在硬件中，体现在由一个或多个处理器执行的软件模块中，或者体现在两者的组合中。软件模块可以驻留在RAM内存、闪存、ROM内存、EPROM内存、EEPROM内存、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM或本领域已知的任何其他形式的存储介质中。示例性存储介质偶联到处理器，使得处理器可以从存储介质读取信息并将信息写入存储介质。在替代方案中，存储介质可以集成到处理器中。处理器和存储介质可以驻留在ASIC中。ASIC可以驻留在用户终端中。在替代方案中，处理器和存储介质可以作为分立组件驻留在用户终端中。
根据本文的描述，作为非限制性示例，合适的计算设备包括服务器计算机、台式计算机、膝上型计算机、笔记本计算机、小型笔记本计算机、上网本计算机、网平板计算机、机顶计算机、流媒体设备、手持式计算机、因特网设备、移动智能手机、平板计算机、个人数字助理、视频游戏控制台和传播媒介。本领域技术人员还将认识到具有任选计算机网络连接性的选定电视、视频播放器和数字音乐播放器适用于在此描述的系统中。在各种实施方案中，合适的平板计算机包括本领域技术人员已知的具有菜单、托板和可转换配置的那些。
在一些实施方案中，计算设备包括被配置为执行可执行指令的操作系统。例如，操作系统是软件，包括程序和数据，该操作系统管理设备的硬件并为应用的执行提供服务。本领域技术人员将认识到，以非限制性实例的方式，合适的服务器操作系统包括FreeBSD、OpenBSD、Linux、/>Mac OS X/>Windows和/>本领域技术人员将认识到，以非限制性实例的方式，合适的个人计算机操作系统包括/> Mac OS和类UNIX操作系统，例如/>在一些实施方案中，操作系统由云计算提供。本领域技术人员还将认识到合适的移动智能手机操作系统包括，作为非限制性示例，/>OS、/>Research In/>BlackBerry/>Windows/>OS、Windows/>OS、/>和/>本领域技术人员还将认识到，合适的媒体流设备操作系统包括，作为非限制性示例，AppleGoogle/>Google/> 和本领域技术人员还将认识到合适的视频游戏控制台操作系统包括，作为非限制性示例，/> Xbox/>Microsoft Xbox One、/> Wii/>和/>非暂时性计算机可读存储介质
在一些实施方案中，本文所公开的平台、系统、介质和方法包括一个或多个非暂时性计算机可读存储介质，其编码有程序，所述程序包括可由任选联网的计算设备的操作系统执行的指令。在进一步的实施方案中，计算机可读存储介质是计算设备的有形组件。在更进一步的实施方案中，计算机可读存储介质任选地从计算设备移除。在一些实施方案中，计算机可读存储介质，以非限制性实例的方式，包括CD-ROM、DVD、闪存设备、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、分布式计算系统(包括云计算系统和服务器)等。在一些情况下，程序和指令永久地、基本上永久地、半永久地或非暂时性地编码在介质上。
数据库
在一些实施方案中，本文公开的平台、系统、介质和方法包括一个或多个数据库，或其用途。鉴于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到许多数据库适用于信息(例如，生物学信息或参考信息，例如水平或得分)的存储和检索。在各种实施方案中，作为非限制性示例，合适的数据库包括关系型数据库、非关系型数据库、面向对象的数据库、对象数据库、实体关系模型数据库、关联数据库和XML数据库。另外的非限制性示例包括SQL、PostgreSQL、MySQL、Oracle、DB2和Sybase。在一些实施方案中，数据库是基于因特网的。在进一步的实施方案中，数据库是基于网络的。在仍进一步的实施方案中，数据库是基于云计算的。在特定实施方案中，数据库是分布式数据库。在其他实施方案中，数据库基于一个或多个本地计算机存储设备。
实施例
实施例1：经修饰蛋白质
产生了表8的多个经修饰的多肽(蛋白质)并将其用于后续实验。
实施例2：稳定性
制备表8的野生型和经修饰的多肽(蛋白质)并测试其稳定性，包括在正常和加速条件下在盐水中的稳定性。表达、纯化和评估经修饰蛋白质的稳定性。将序列克隆到表达载体(例如pcDNA3.4)中。根据文献(Papakostas等人,Protein Expr Purif.2010年3月；70(1):32–38)将构建体转染到哺乳动物细胞系(例如CHO、HEK293T、Expi293、ExpiCHO细胞)中，并产生稳定的细胞系长达14天。
对于ExpiCHO细胞，以下程序用于产生蛋白质。简而言之，用预热至37℃的新鲜ExpiCHOTM表达培养基将ExpiCHO-STM培养物稀释至6×106个活细胞/mL的最终密度。轻轻旋转烧瓶以混合细胞。然后使用冷试剂(4℃)制备ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA复合物，如下所述。将ExpiFectamineTMCHO试剂瓶轻轻倒置4-5次混合。用1mL-30mL冷的OptiPROTM培养基稀释质粒DNA(20ul-600ul体积)。将该管通过涡旋和/或倒置进行混合。用于转染的DNA量为0.5ug-1.0ug质粒DNA/mL培养体积。将80uL-2400uL ExpiFectamineTM CHO试剂用920ul-28mL OptiPROTM培养基稀释，并通过涡旋试管和/或倒置或轻轻移液2-3次来混合。将稀释的ExpiFectamineTM CHO试剂添加到稀释的DNA中。通过涡旋试管或倒置混合。将ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA复合物(来自以上)在室温孵育1-5分钟，然后将溶液缓慢转移到步骤4的培养瓶中，在添加过程中轻轻涡旋培养瓶。将细胞在37℃培养箱(具有空气中8％CO2的湿润气氛)中在轨道摇床上培养。
培养1天后，添加150uL-4500uL ExpiFectamineTM CHO增强剂和6mL-180mLExpiCHOTMFeed，在添加过程中轻轻涡旋烧瓶。将培养瓶放回37℃培养箱(具有8％CO2的湿润气氛)中伴随振荡。然后在转染后8-14天收获蛋白质。
通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和小规模纯化针对稳定性分析每个构建体的表达。使用硫酸铵沉淀来纯化蛋白质，其中添加硫酸铵以分离级分(例如20-30％)以沉淀出不需要的蛋白质。将硫酸铵粉末缓慢加入蛋白质中，然后在4℃混合30分钟。然后将样品离心，回收的上清液含有目的蛋白。然后将上清液加载到离子交换(IEX)柱中，并在盐梯度下洗涤和洗脱蛋白质，然后使用小麦胚芽亲和树脂。含有标签(例如strep标签、flag标签)的蛋白质通过合适的亲和柱(例如Strep-Tactin柱)或抗FLAG抗体纯化。在经修饰蛋白质的表达和纯化之后，使用工业标准技术对每种蛋白质进行热应力聚集测试。类似物的质量根据以下方法确定：SEC(MALS)、还原性和非还原性SDS-PAGE、全质量分析、在PBS中的稳定性、比较4℃与40℃长达一个月通过SEC评估多聚化、冻/融稳定性和溶解度。大规模蛋白质表达用于生成用于实验的经修饰蛋白质，包括体外效力、功效和稳定性的测定。
实施例3：功效
评估表7的野生型和稳定的经修饰的多肽(蛋白质)(来自实施例1)的效果。
具体而言，使用表达AMHR2的上皮卵巢癌细胞系(人细胞系，例如SKOV3、OVCAR3、OVCAR8，和小鼠细胞系，例如MOVCAR5009)进行经修饰蛋白质的体外效力评估，这些细胞是通过AMHR2对经修饰蛋白质的活性有反应的细胞并且因此是经修饰蛋白质功效的读出。使用XTT增殖测定用经修饰蛋白质处理72小时后通过抑制增殖的活性来分析蛋白质的功效。使用胱天蛋白酶Glo 3/7细胞凋亡测定，通过在用经修饰蛋白质处理48小时和72小时时刺激细胞凋亡的活性来分析蛋白质的功效。通过使用TaqMan rt-qPCR并使用SCF引物，通过在用经修饰蛋白质处理48和72小时时的干细胞因子(SCF)的表达来分析蛋白质的功效。
还进行了体内药代动力学。在给药后1、2、4、7和24小时连续收集血浆以评估两种施用途径(i.p和s.c.)。AMH类似物的血浆水平通过ELISA进行评估，并用于确定药代动力学参数，包括半衰期、Cmax和Tmax。还使用磷酸化-Smad活化测定测试经修饰蛋白质的离体接合。
体内卵巢卵泡生成/衰老小鼠模型用于分析野生型和经修饰蛋白质的效果。使用野生型和经修饰蛋白质建立抑制卵泡生成的效果和时间过程。时间点：2、4、6周。使用组织学和血浆雌二醇(E2)水平的评估作为额外的定量评估，对卵巢和卵泡分期进行定量评估。
体内卵巢化学毒性小鼠模型用于进一步分析野生型和经修饰蛋白质的效果。按照单次高剂量环磷酰胺150mg/kg i.p.的方案，使用已确定的引起卵巢毒性的化疗(例如环磷酰胺)剂量水平。分析在化疗前1天开始使用经修饰蛋白质治疗，每天给药，持续8天的效果。在化疗剂量后1周牺牲小鼠，并使用组织学和血浆雌二醇(E2)水平的评估作为额外的定量评估对卵巢进行定量评估。通过使用确定的引起卵巢毒性的化疗(例如环磷酰胺)剂量水平按照每周一次给药持续4周的方案研究慢性影响。使用每日给药持续4周，分析用经修饰蛋白质治疗的效果。在化疗开始后第28天牺牲小鼠，并使用组织学和血浆雌二醇(E2)水平的评估作为额外的定量评估对卵巢进行定量评估。在化疗开始前0、1、2、3、4周以及整个化疗施用期间，分析用野生型和经修饰蛋白质治疗的效果。治疗后1周牺牲，并使用组织学对卵巢进行定量评估。评估化疗治疗期间的发情周期。化疗停止后8周进行交配，并评估产仔数和到达首次分娩时间。化疗停止后20周，使用促排卵方案，牺牲小鼠，并定量回收的卵母细胞数。

Claims (8)

1.一种与AMHR2结合并改善或保护所述受试者的卵巢功能的AMH激动剂，其中所述AMH激动剂包含具有SEQ ID NO:1的野生型AMH蛋白的经修饰蛋白，所述经修饰蛋白包含：
a)非AMH信号肽代替SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-24；
b)与SEQ ID NO：1的氨基酸残基25-449的序列同一性；和
c)在SEQ ID NO：1的氨基酸位置448至452处的切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的替换或插入。
2.如权利要求1所述的AMH激动剂，其中所述非AMH信号肽包含三个连续的亮氨酸(L)氨基酸残基。
3.如权利要求1或2所述的AMH激动剂，其中在切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的所述替换或插入包括在位点450用精氨酸(R)或赖氨酸(K)替换谷氨酰胺(Q)氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的AMH激动剂，其中在切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的所述替换或插入进一步包括：在位点451用赖氨酸(K)替换精氨酸(R)氨基酸残基；以及紧接在位点451之后插入两个连续的精氨酸(R)氨基酸残基。
5.一种与AMHR2结合的AMH激动剂在制备用于基于从受试者获得的生物样品中促卵泡激素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)和/或雌二醇的水平改善或保护所述受试者的卵巢功能的药物中的应用，其中所述AMH激动剂包含具有SEQ ID NO:1的野生型AMH蛋白的经修饰蛋白，所述经修饰蛋白包含：
a)非AMH信号肽代替SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-24；
b)与SEQ ID NO：1的氨基酸残基25-449的序列同一性；和
c)在SEQ ID NO：1的氨基酸位置448至452处的切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的替换或插入。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述非AMH信号肽包含三个连续的亮氨酸(L)氨基酸残基。
7.如权利要求5或6所述的应用，其中在切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的所述替换或插入包括在位点450用精氨酸(R)或赖氨酸(K)替换谷氨酰胺(Q)氨基酸残基。
8.如权利要求7所述的应用，其中在切割识别位点内或附近的一个或多个氨基酸的所述替换或插入进一步包括：在位点451用赖氨酸(K)替换精氨酸(R)氨基酸残基；以及紧接在位点451之后插入两个连续的精氨酸(R)氨基酸残基。
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