JP2023515286A - 卵胞の老化の処置のための卵胞形成を調節する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本明細書に提供されるのは、女性の卵胞形成を調節するため、および特に卵胞の活性と成熟と未熟（原始）との卵胞の枯渇を調節するための抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の修飾されたタンパク質に関連する方法および組成物である。ある実施形態では、女性の卵胞の老化を調節または阻害することは、卵巣の老化を処置し、卵巣の加齢を休止または遅延させ、および／または閉経の開始および／または閉経に関連する症状、性腺毒性の処置によって引き起される早発卵巣の減退、または卵胞形成および卵巣生物学を調節する遺伝子の遺伝子変異に起因する疾患あるいは疾病を遅らせる。【選択図】図２
Description
相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された、米国仮特許出願第６２／９３５，０４８の利益を主張するものであり、これはその全体が引用により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された、米国仮特許出願第６２／９３５，０４８の利益を主張するものであり、これはその全体が引用により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、本開示は、卵巣の老化の処置のための卵胞形成を調節、卵巣の加齢を休止または遅らせる、閉経または閉経期を遅らせる、閉経または閉経期の症状を処置またはそれ以外では緩和する、あるいはそれらの組み合わせのための方法および組成物に関連する。
引用による組み込み
特許、特許出願、特許公報、ジャーナル、本、文献、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照と引用は、本開示を通して行われた。このような全ての文書はあらゆる目的でそれら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
特許、特許出願、特許公報、ジャーナル、本、文献、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照と引用は、本開示を通して行われた。このような全ての文書はあらゆる目的でそれら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
多くの例では、女性は、卵巣の老化を処置する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）および／または卵巣の加齢（例えば卵巣の老化）を制御する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。多くの例では、卵巣の加齢は、時間、遺伝的および／または環境要因によって引き起こされ得る。さらに、ある例では、性腺毒性の処置（例えば、限定的ではないが化学および放射線治療および／または卵巣摘出）を受ける多くの女性は、彼女たちの卵巣予備能の欠乏を減少させる（例えば、予防する、低減する、阻害する）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。いくつかの例では、卵巣予備能の早期欠乏を経験する多くの女性は、彼女たちの卵巣予備能の欠乏を減少させる（例えば、予防する、低減する、阻害する、および／または遅らせる）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。多くの例では、卵巣予備能の早期喪失を発症する遺伝的素因を有する女性は、卵胞形成を調節する（例えば、予防する、減少させる、阻害する、および／または遅らせる）および／または彼女たちの卵巣予備能の欠乏を減少させる（例えば、予防する、低減する、阻害する、および／または遅らせる）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。いくつかの例では、例えば、卵胞形成および卵巣の生物学（例えばＡＲ、ＢＭＰ１５、ＥＳＲ１、ＦＩＧＬＡ、ＦＭＲ１、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ３、ＦＳＨＲ、ＧＡＬＴ、ＧＤＦ９、ＩＮＨＡ、ＮＯＢＯＸ、ＮＲ５Ａ１、ＳＹＣＰ２Ｌ、ＴＧＦＢＲ３）に重要である遺伝子中の変異を有する女性は、彼女たちの卵巣予備能の欠乏を制御する（例えば、予防する、低減する、阻害する、および／または遅らせる）治療から恩恵を受けるだろう。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、女性（例えば、閉経前および閉経期の女性）において卵巣の老化を処置する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）および／または卵巣の加齢（例えば、老化）を制御する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）治療方法である。いくつかの実施形態では、（例えば、さらに閉経の開始を制御している一方で）、本明細書に提供される方法は、卵巣予備能の生理的なおよび／または早期の欠乏を処置する（例えば、阻害する、予防する、重症度を低減する、またはそれ以外では緩和する）工程を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、（例えば、治療上有効な量および／または方式で）本明細書により詳細に記載される治療剤を投与する工程を含む。いくつかの例では、そのような治療は、卵母細胞、胚、または卵巣の組織の低温保存はどのように女性の生殖能を保存することができるのかというアプローチに類似しているが、それは侵襲性が低く、必ずしも女性が卵巣過刺激、体外受精（ＩＶＦ）、または組織除去のための手術を受ける必要はない。いくつかの例では、卵母細胞、胚、および卵巣の組織の低温保存が、女性が妊娠を試みる時期を遅らせることを可能にするのと同様に、このような治療は女性がライフイベントに合わせて妊娠を計画することを可能にする。例えば、いくつかの例では、本明細書に提供される方法または治療は、早発閉経のリスクに直面する女性において受胎能を増加させる方法を伴う（例えば、本明細書に提供される方法を使用するこのような女性は閉経を遅らせ、妊娠するために自身により長い機会を与え、例えば、およびそれによって、自身の後の人生で妊娠することを可能にする。）様々な例では、本明細書に記載されるように、多くの女性は、早期閉経のリスク、および最終的には彼女たちが子供をもち家族をもつという望みを果たすことができる前に、彼女たちの生殖可能な期間の終わりに直面する。したがって、ある例では、本明細書に提供される治療は、特に女性が潜在的に性腺毒性の処置の身体的および精神的ストレスに直面する場合、女性の精神的および／または身体的な健康の改善において極めて価値がある。
多くの例では、女性は、閉経（および／または閉経移行期）の開始を制御する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。さらに、ある例では、多くの女性は閉経移行期（および／または閉経）と関連する症状を処置する（例えば、阻害する、予防する、重症度を低減する、またはそれ以外では緩和する）治療を歓迎するおよび／または恩恵を受けるだろう。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、女性（例えば閉経期の女性）の閉経の開始を制御する（例えば、遅らせる、阻害する、または予防する）治療方法である。いくつかの実施形態では、（例えば、さらに閉経の開始を制御している一方）、本明細書に提供される方法は、閉経移行期と関連する症状を処置する（例えば、阻害する、予防する、重症度を低減する、またはそれ以外では緩和する）工程を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、（例えば、治療上有効な量および／または方式で）本明細書により詳細に記載される治療剤を投与する工程を含む。いくつかの例では、そのような治療は、月経と関連する他の症状をさらに緩和する一方、避妊がどのように妊娠を制御するのかというアプローチに類似している。いくつかの例では、避妊が、女性が彼女の人生を管理し計画することを可能にするのと同様に、このような治療は女性がライフイベントに合わせて閉経を計画することを可能にする。例えば、いくつかの例では、本明細書に提供される方法または治療は、４０歳を超えた女性の受胎能を増加させる方法を伴う（例えば、本明細書に提供される方法を使用するこのような女性は閉経を遅らせ、妊娠するために自身により長い機会を与え、例えば、およびそれによって、自身の後の人生で妊娠することを可能にする。）いくつかの例では、治療（例えばさらに）は、本明細書に記載されるほてりおよび／または他の症状など、（例えば閉経および／または閉経移行期と関連する）症状を緩和する。いくつかの例では、そのような効果は、閉経および／または閉経移行期を経る間、女性の人生の質を改善するのに適している。様々な例では、本明細書に記載されるように、多くの女性が、彼女たちの人生において感情的および／または身体的に試みている間、閉経移行期を経験し、最終的に閉経を経験する。したがって、ある例では、本明細書に提供される治療は、特に女性の人生において感情的および身体的な移行期間の間、女性の精神的および／または身体的な健康の改善において極めて価値がある。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、卵巣の機能を改善または保護するためにＡＭＨの修飾タンパク質に関連する方法および組成物である。いくつかの実施形態では、ＡＭＨの修飾タンパク質に関連する方法および組成物は卵巣の内分泌機能を改善または保護する。いくつかの実施形態では、卵巣の内分泌機能の喪失は卵胞の喪失の結果である。いくつかの実施形態では、卵巣の機能または卵巣の内分泌機能の喪失は、性腺毒性の処置（例えば化学療法、放射線、および外科的切除）の結果である。いくつかの実施形態では、卵巣の機能または卵巣の内分泌機能の喪失の結果は、性機能、免疫機能、グルコース代謝、メンタルヘルス、睡眠、妊娠、心臓機能、骨密度、神経認知機能、またはそれらの組み合わせに関連する調節不全または障害である。いくつかの実施形態では、卵巣の機能または卵巣の内分泌機能の破壊の結果は、不妊症、心血管疾患、骨粗鬆症、自己免疫の疾病、糖尿病、肥満症、脱毛、脳卒中、痴呆、またはそれらの組み合わせなどの病的状態を結果としてもたらす。本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、性機能、免疫機能、グルコース代謝、メンタルヘルス、睡眠、妊娠、心臓機能、骨密度、神経認知機能、またはそれらの組み合わせを維持するまたは改善するためにＡＭＨの修飾タンパク質に関連する方法および組成物である。本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、化学療法によって誘発された卵巣不全（ＣＩＯＦ）、不妊症、および心血管疾患、骨粗鬆症、自己免疫の疾病、糖尿病、肥満症、脱毛、脳卒中、痴呆、またはそれらの組み合わせなどの病的状態に関連する他の閉経を予防するために、ＡＭＨの修飾タンパク質に関連する方法および組成物である。本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、卵巣の老化を遅らせるまたは予防するために、ＡＭＨの修飾タンパク質に関連する方法および組成物である。
閉経の開始の予測不可能性は受胎の計画を困難および管理不能にする。さらに、閉経の症状は女性の精神的および身体的な健康に有害である。これらの問題を解決するために、本明細書に記載される本開示のある実施形態は、卵巣の老化を処置および閉経の開始および／または閉経移行期（および／または閉経）に関連する症状を制御するための方法および組成物を含む。いくつかの例では、卵巣の老化の処置および閉経の開始および／または閉経移行期および／または閉経に関連する症状の制御は、本明細書に提供される方法を介して達成され、ここで、方法は卵胞形成を調節する（例えば、阻害する、遅らせる、または低減する［例えば、速度を遅らせる］）。
ある実施形態では、本明細書に提供されるのは、卵巣の老化の処置のための、卵胞形成の調節（例えば、阻害、低減）のための、またはそれに使用される方法および組成物である。いくつかの例では、原始卵胞の活性化または欠乏は漸進的に生殖能を低減する。いくつかの例では、原始卵胞の活性化または欠乏は漸進的に卵巣の機能または卵巣の内分泌機能を低減する。いくつかの例では、女性の卵胞の加速した活性化または欠乏は（例えば、未熟な原始卵胞が排卵前の卵胞になるなど、卵胞が成熟する生物学的プロセスを介して）、生殖能を低減する。いくつかの例では、女性の卵胞の加速した活性化または欠乏は（例えば、未熟な原始卵胞が排卵前の卵胞になるなど、卵胞が成熟する生物学的プロセスを介して）、卵巣の機能または卵巣の内分泌機能を低減する。本明細書のある実施形態で提供されるのは、女性の卵胞形成を阻害することによってなど、卵巣の老化をおくらせる、および生殖能と卵巣の機能を拡張する方法である（例えば、方法は治療上有効な量および／または方式においてなど、（例えばそれを必要とする）女性に本明細書に提供される薬剤を投与する工程を含む）。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、卵胞形成および卵巣の老化を調節することによってなど、閉経および／または閉経移行期の症状またはそれに関連する症状を処置するための方法である（例えば、本明細書に記載されるプロセスに従う）。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、治療上有効な量の本明細書に記載された薬剤を（例えば、それが必要な）女性に投与することなどによって、卵胞形成および卵巣の老化を調節する（例えば、遅らせるまたは低減する（例えば、速度を遅くする）方法である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、治療上有効な量の本明細書に記載された薬剤を（例えば、それが必要な）女性に投与することなどによって、卵胞成熟（および／または死）および／または未熟の（例えば、原始）卵胞の欠乏を調節する（例えば、遅らせるまたは低減する［例えば、速度を遅らせる］）方法である。
ある実施形態では、（例えば、卵巣の老化を処置する、卵胞形成を調節する、閉経を制御する、閉経期の開始を処置するなど）本明細書に提供される方法は、（例えば、本明細書により詳細に記載されるような、治療上有効な量および／または方式で）それに適した（例えば、治療）薬剤を投与する工程を含む。特定の実施形態では、薬剤は、タンパク質の形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーのポリペプチド、またはその変異体（さらに本明細書では「修飾タンパク質」と呼ぶ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される薬剤および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物である。
ある実施形態では、本明細書に提供されるのは、卵胞形成（例えば、その速度）を調節する（例えば、ダウンレギュレートする）、卵巣の老化を調節する（例えば、減少させる、遅らせる、阻害する、予防する）、（例えば、未熟または原始）卵胞の欠乏（例えば、その速度）を調節する（例えば、ダウンレギュレートする）、および／または卵胞成熟（例えば、その速度）を調節する（例えば、ダウンレギュレートする）薬剤である。特定の実施形態では、薬剤は、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリータンパク質、またはその変異体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、卵胞を発育することによって産生されるホルモン、抗ミュラー管ホルモン（「ＡＭＨ」）、またはその変異体である。いくつかの例では、卵胞成熟の速度および／または（例えば、原始）卵胞の欠乏を低減することなどによって、ＡＭＨ活性を増加させることは、閉経の開始を遅らせ、閉経の症状を緩和し、および／または早発卵巣不全（ＰＯＩ）を処置する。
ある実施形態では、本開示はさらに、卵巣予備能の減少または原始卵胞の動員および成熟の速度の増加を特定すること、並びに閉経を遅らせるために本明細書に記載される本開示の組成物を投与することを含む。いくつかの例では、閉経を遅らせることは、女性の妊娠可能時期の増加を提供する。いくつかの例では、閉経を遅らせることは、閉経を早める併存症および疾病の開始の第一次予防を結果としてもたらす。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、配列番号：１を有する野生型抗ミュラー管ホルモンの修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８～４５２での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳを含む、置換あるいは挿入、ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間のグリコシル化部位の挿入、ｃ）ＴＧＦ－βファミリータンパク質のＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、ｄ）配列番号：１のアミノ酸位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換、ｅ）ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加、ｆ）糖タンパク質のモチーフの付加、およびｇ）ＡＭＨのＮ末端領域の欠失およびＡＭＨのＣ末端での修飾あるいはタンパク質配列の挿入、からなる群から選択される少なくとも２つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、モチーフＲＡＱＲＳ内の前記置換は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する異なるタンパク質の前記切断認識部位、または異なるプロアテーゼによって認識のために最適化された切断部位と、ＲＡＱＲＳを置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、（ａ）アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｂ）ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換、（ｃ）アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０でのグルタミン（Ｑ）の残基の置換、（ｄ）リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｅ）アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２でのセリン（Ｓ）の残基の置換、および（ｆ）位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）による位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０での前記グルタミン（Ｑ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２での前記セリン（Ｓ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０での前記グルタミン（Ｑ）の残基の置換、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２での前記セリン（Ｓ）の残基の置換、および位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、（ａ）ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、（ｂ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｃ）セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、（ｄ）セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、（ｅ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換、からなる群から選択される置換を含む。前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）による位置５０１での前記プロリン（Ｐ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびアスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、Ｃ末端領域における４つのアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＰＮＡＳ、ＰＮＳＳ、ＬＮＳＳ、ＭＮＡＳ、またはＧＮＨＴを用いるＰＲＹＧの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＧＮＨＴを用いるＧＮＨＶの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記ＴＧＦ－βファミリータンパク質は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に応じた配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に応じた配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、前記分泌、前記切断、安定性、またはそれらの組み合わせを改善するために修飾される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記修飾されたＮ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記修飾されたＮ末端領域は、配列番号：８０、８１、１４８、または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾タンパク質は非ＡＭＨシグナルペプチドを用いるＡＭＨのシグナルペプチドの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記非ＡＭＨシグナルペプチドは、アズロシジン（Ａｚｕｒｏｄｉｃｉｎ）、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＣＤ５、免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ－ＨＣ）、免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ－ＬＣ）、トリプシノーゲン、プロラクチン、エラスチン、ＨＭＭ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン、またはＩｇＫａｐｐａに由来する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドタグはＳｔｒｅｐタグ、Ｆｌａｇタグ、またはポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、前記モチーフは少なくとも１つのセリン（Ｓ）の残基の付加を含む。いくつかの実施形態では、前記モチーフは１～６のセリン（Ｓ）の残基の付加を含む。いくつかの実施形態では、前記糖タンパク質の前記モチーフはヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、前記糖タンパク質の前記モチーフはＣＧＢ３タンパク質に由来する、いくつかの実施形態では、前記モチーフは、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、またはＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列を含む。いくつかの実施例では、アミノ酸位置２５４でのアルギニン（Ｒ）はセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、またはアラニン（Ａ）で置換される。いくつかの実施形態では、前記ＡＭＨの前記Ｎ末端領域の前記欠失および前記ＡＭＨのＣ末端での挿入は、ｈＣＧまたはＦｃ ＩｇＧ１重鎖定常領域のＣＴＰの挿入を含む。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、配列番号：１を有する野生型抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）タンパク質の修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、（ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８、４４９、または４５１での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳを含む、置換あるいは挿入、ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間のグリコシル化部位の挿入、ｃ）ＴＧＦ－βファミリータンパク質のＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、ｄ）配列番号：１のアミノ酸位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換、ｅ）ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加、ｆ）糖タンパク質のモチーフの付加、およびｇ）ＡＭＨのＮ末端領域の欠失およびＡＭＨのＣ末端での修飾あるいはタンパク質配列の挿入、からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、ａ）アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、ｂ）ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換、ｃ）リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、およびｄ）位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、および位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、（ａ）ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、（ｂ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｃ）セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、（ｄ）セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、（ｅ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換、からなる群から選択される置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１での前記プロリン（Ｐ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびアスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、Ｃ末端領域における４つのアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＰＮＡＳ、ＰＮＳＳ、ＬＮＳＳ、ＭＮＡＳ、またはＧＮＨＴを用いるＰＲＹＧの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＧＮＨＴを用いるＧＮＨＶの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記ＴＧＦ－βファミリータンパク質は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１のＮ末端領域は、配列番号：１４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に応じた配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に応じた配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、前記分泌、前記切断、安定性、またはそれらの組み合わせを改善するために修飾される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１の前記修飾されたＮ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記修飾されたＮ末端領域は、配列番号：８０、８１、１４８、または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドタグはＳｔｒｅｐタグ、Ｆｌａｇタグ、またはポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、前記モチーフは少なくとも１つのセリン（Ｓ）の残基の付加を含む。いくつかの実施形態では、前記モチーフは１～６のセリン（Ｓ）の残基の付加を含む。いくつかの実施形態では、前記糖タンパク質の前記モチーフはヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、前記糖タンパク質の前記モチーフはＣＧＢ３タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、前記モチーフは、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、またはＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＭＨタンパク質の前記修飾形態は、さらに、配列番号：１の位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置２５４でのアルギニン（Ｒ）はセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、またはアラニン（Ａ）で置換される。
本明細書に記載されるのは、卵巣の老化を処置するために、卵胞形成を調節する方法であって、前記方法は、本明細書に記載される修飾タンパク質のいずれかを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記投与する工程は、前記修飾タンパク質の皮内注射、皮下注射、経皮送達、皮下送達、または輸血を含む。いくつかの実施形態では、前記投与する工程は徐放性皮下装置の投与を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾タンパク質はベクターで発現される。いくつかの実施形態では、ベクターが微生物ベクターである。いくつかの実施形態では、前記方法はさらに、基底胞状卵胞の数、卵胞刺激ホルモンレベル、および／または抗ミュラー管ホルモンレベルを評価する工程、および前記評価する工程の少なくとも部分的に基づいて、投与される組成物の用量を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記修飾タンパク質は毎日投与される。いくつかの実施形態では、投与される用量は約０．５ｍｇ～約１．０ｍｇである。いくつかの実施形態では、投与される前記修飾タンパク質の量は、患者において卵巣の老化を処置する、閉経を遅らせる、および／または閉経症状を緩和するには十分である。いくつかの実施形態では、投与される前記修飾タンパク質の量は、（ｉ）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、および／またはエストラジオールの１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つのすべてが閾値から逸脱するかどうか、（ｉｉ）ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、および／またはエストラジオールの任意の１つ以上の確認されたレベルが閾値からどれほど逸脱するか、またはそれらの組み合わせに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、投与される前記修飾タンパク質の量は、閉経および／または閉経移行期に関連する１つ以上の特性の評価によって決定される。いくつかの実施形態では、閉経および／または閉経移行期に関連する前記１つ以上の特性は、気分の変化、肥満度指数（ＢＭＩ）の変化、体重の変化、保水の変化、食欲の変化、ほてりの変化、月経周期の規則性の変化、性衝動の変化、睡眠メトリックの変化、エネルギーレベルの変化、またはそれらの１つ以上の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記方法はさらに、生体サンプル中の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＢＡＦＣ、黄体ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、エストラジオール値、基礎体温、またはそれらの組み合わせを評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記方法はさらに、例えば、個体の超音波を通して可視化することによって、卵胞の数（ＢＡＦＣ）を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、生体サンプルは組織、血液、唾液、尿、または月経液である。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、野生型ＡＭＨタンパク質の修飾された形態であって、修飾タンパク質が、切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入、グリコシル化部位の挿入、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの異なるメンバーのＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、異なるタンパク質のシグナルペプチド用いるＡＭＨにおけるシグナルペプチドの置換、ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加、および糖タンパク質ファミリーのメンバーの野生型配列のモチーフの付加（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチド）、からなる群から選択される１つまたは１より多い変異の組み合わせを含む、修飾された形態を含む組成物である。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は外因性の微生物ベクターで発現される組換えタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号：１を有する野生型タンパク質の修飾された形態を含む。いくつかの実施形態では、変異は切断認識部位内および／またはそれに隣接する置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はモチーフＲＡＱＲＳ（配列番号：１２０）内の置換を含み、ここではモチーフは野生型タンパク質の切断認識部位内または隣接している。いくつかの実施形態では、モチーフＲＡＱＲＳ内の置換は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する異なるタンパク質の切断認識部位または異なるプロテアーゼによる認識のために最適化された切断部位を用いるＲＡＱＲＳ（配列番号：１２０）の置き換えを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する異なるタンパク質の切断認識部位は、ＴＧＦＢ１、またはＢＭＰ１５、またはＧＤＦ９、またはＢＭＰ２、またはＢＭＰ４、またはＢＭＰ６、またはＢＭＰ７、またはＢＭＰ８Ｂ、またはＧＤＦ１５、またはＩＮＨＢＡにおけるものを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼによる切断のために最適化された切断認識部位は、フューリン、またはエンテロキナーゼによって認識されたものを含む。いくつかの実施形態では、変異は活性タンパク質および／またはタンパク質の活性の産生を増加および／またはタンパク質を安定化させる。いくつかの実施形態では、変異はさらに、野生型ＡＭＨの配列におけるアミノ酸２５４－２５５で二塩基の切断部位内の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異は異なるアミノ酸を用いる位置２５４でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はセリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）、またはアラニン（Ａ）を用いる位置２５４でのアルギニン（Ｒ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異は活性タンパク質の形成に必要なものとは異なる切断プロセスによって生成された産物の産生を減少させる。いくつかの実施形態では、変異はさらに、グリコシル化部位の挿入を含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化部位の挿入は、Ｃ末端領域における４つのアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域のアミノ酸の置換は、配列ＰＮＡＳまたはＰＮＳＳ、あるいはＬＮＳＳ、あるいはＭＮＡＳ、あるいはＧＮＨＴの導入を含む。いくつかの実施形態では、修飾はヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチドの付加を含む。いくつかの実施形態では、修飾はＴＧＦ－βスーパーファミリーにおける異なるタンパク質のＮ末端領域を用いる野生型ＡＭＨのＮ末端領域の置き換えを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおける異なるタンパク質のＮ末端領域は、シグナルペプチドが修飾されたＴＧＦＢ１のもの、またはシグナルペプチドおよび切断部位が修飾されたＴＧＦＢ２のものを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、野生型またはＡＭＨの修飾された形態へのペプチドタグの付加を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドタグはＳｔｒｅｐタグ、ＦＬＡＧ、またはポリヒスチジンタグを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、野生型ＡＭＨにおけるシグナルペプチドを異なるタンパク質のシグナルペプチドと置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨのものを置き換えるシグナルペプチドは、アズロシジン（ａｚｕｒｏｄｉｃｉｎ）、またはＩＬ２、またはＩＬ６、またはＣＤ５の、またはＩｇ重鎖、またはＩｇ軽鎖、またはトリプシノーゲン、またはプロラクチン、またはエラスチン、またはＨＭＭシグナルペプチドあるいはヒトインフルエンザ赤血球凝集素、またはＩｇＫａｐｐａのものである。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、薬学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は食塩水で懸濁させられ、静脈内の（ＩＶ）バッグに含有される。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、卵胞形成、閉経、閉経移行期、または個人のそれらと関連する症状を調節するまたは容易にするためのシステムであって、前記システムは、個体の１つ以上の生体レベルまたはスコア、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の生体レベルまたはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の生体レベルまたはスコア、基礎胞状卵胞数（ＢＡＦＣ）の生体レベルまたはスコア、黄体ホルモン（ＬＨ）の生体レベルまたはスコア、プロゲステロン、エストラジオールの生体レベルまたはスコア、基礎体温のレベル、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の生体スコアを含む第１のデータベース、１つ以上の基準レベルまたはスコア、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のレベルまたはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）のレベルまたはスコア、基礎胞状卵胞数（ＢＡＦＣ）の生体レベルまたはスコア、黄体ホルモン（ＬＨ）の生体レベルまたはスコア、プロゲステロン、エストラジオールの生体レベルまたはスコア、基礎体温のレベル、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の基準レベルまたはスコアを含む第２のデータベース、および第２のデータベースの１つ以上の基準レベルまたはスコアに対して第１のデータベースの生体レベルまたはスコアを処理するように個々にまたは集団的にプログラムされる１つ以上のコンピュータプロセッサであって、それによって個体が（例えば、特定の）治療プロトコルを必要とすることを決定する、コンピュータプロセッサを含む。いくつかの実施形態では、治療プロトコルは複数の可能な治療プロトコルの１つである。いくつかの実施形態では、治療プロトコルは治療剤（例えば、先行する請求項のいずれか１つ）の第１の量の投与を必要とし、複数の可能な治療プロトコルは第１の量とは異なる量の治療剤の投与を必要とする。いくつかの実施形態では、システムはさらに、個体の１つ以上の特性レベルまたはスコアを含む第３のデータベース、および１つ以上の基準特性レベルまたはスコアを含む第４のデータベース、並びに第２のデータベースの１つ以上の基準特性レベルまたはスコアに対して第１のデータベースの特性レベルまたはスコアを処理するように個々にまたは集団的にさらにプログラムされる１つ以上のコンピュータプロセッサであって、それによって第２のデータベースの１つ以上の基準レベルまたはスコアに対する第１のデータベースの生体レベルまたはスコアを集団的に比較して、個体が治療プロトコルを必要とすることを決定する、コンピュータプロセッサを含む。いくつかの実施形態では、システムはさらに、１つ以上のバイオセンサ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の生体レベルまたはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の生体レベルまたはスコア、基礎胞状卵胞数（ＢＡＦＣ）の生体レベルまたはスコア、黄体ホルモン（ＬＨ）の生体レベルまたはスコア、プロゲステロン、個体のエストラジオールの生体レベルまたはスコア、基礎体温のレベル、またはそれらの組み合わせに関連する個体の生体データを取得または受け取るように構成された１つ以上のバイオセンサを含む。いくつかの実施形態では、バイオセンサは個体への移植または付着のために構成されたセンサである。いくつかの実施形態では、バイオセンサは、唾液に基づくセンサ、皮膚に基づくセンサ（例えば皮膚用パッチ剤）、皮膚下のセンサ、子宮内のセンサ、または膣のセンサである。いくつかの実施形態では、バイオセンサは体液を分析するように構成されたセンサである。いくつかの実施形態では、体液は唾液、血液、尿、または月経液である。いくつかの実施形態では、システムはさらに、生体データを個体の１つ以上の生体レベルまたはスコアに変換するように構成された１つ以上のコンピュータプロセッサを含む。いくつかの実施形態では、システムはさらに、治療プロトコルを表示するように構成されたディスプレイを含む。いくつかの実施形態では、システムはさらに、治療プロトコルに応じて治療剤を投与するように構成された装置を含む。いくつかの実施形態では、装置のシステムは、治療プロトコルに応じて治療剤を自動的に投与するように構成される。
本開示の様々な実施形態が本明細書中で示され記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。本開示から逸脱することなく、多数の変更、変化、および置換がなされることが、当業者によって理解され得る。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代案が利用され得ることを理解されたい。
定義
本出願にわたって、本開示の様々な実施形態は範囲の形式（ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で提示されてもよい。範囲の形式における記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを、理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲、同様にその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものであると考慮されなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６といった、具体的に開示されたサブ範囲、同様に、例えば１、２、３、４、５、および６といった範囲内にある個々の数字を有するものとして考慮されなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
本出願にわたって、本開示の様々な実施形態は範囲の形式（ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で提示されてもよい。範囲の形式における記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを、理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲、同様にその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものであると考慮されなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６といった、具体的に開示されたサブ範囲、同様に、例えば１、２、３、４、５、および６といった範囲内にある個々の数字を有するものとして考慮されなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、つまり、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、用語は所定値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲内を意味し得る。代替的に、用語は１桁内、好ましくはある値の５倍、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
「隣接して」、「隣接する」という用語は、タンパク質のアミノ酸残基または領域あるいは面積の間の近接した線形および／または近接した空間的近接を指す。
「切断認識部位」および「切断部位」という用語は、酵素によって認識されたタンパク質またはポリペプチド部位を指す。具体的な例では、これらの用語は、ペプチド配列および／または部位特異的なプロテアーゼがタンパク質を切断するか切るモチーフを指す。
「卵胞（ｆｏｌｌｉｃｌｅ）」および「卵胞（ｏｖａｒｉａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）」という用語は、卵胞内部で発育する卵母細胞または未熟な卵母細胞を含有する卵巣で発見された細胞の凝集を指す。
「卵胞形成」という用語は、卵巣の卵胞が（未熟な）卵母細胞の成熟を含有するプロセスまたはそのいかなる段階を指し、原始細胞から排卵前の卵胞までおよび／または未熟な卵母細胞から卵子までの進行のいかなる段階を含む。
「卵母細胞」という用語は、減数分裂によって女性の半数性の卵細胞（卵子）に成熟することができる細胞を指す。
「糖タンパク質ホルモンファミリー」は、限定されないが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、脊椎動物黄体形成ホルモン（ＬＨ）、脊椎動物卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および脊椎動物甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む。
「グリコシル化部位」という用語は、炭水化物または炭水化物部分が付着することができるポリペプチドまたはタンパク質における分子またはアミノ位置を指す。
「ヒト絨毛性ゴナドトロピン」という用語は、アナログ、誘導体、および変異体を含む任意のヒト絨毛性ゴナドトロピンを指す。
「挿入」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質への１つ以上のアミノ酸残基または分子の付加を指す。
「閉経症状」および「閉経期症状」という用語は、卵巣の加齢、ホルモン変化、および／または閉経に関連する他の生体プロセスによって少なくとも部分的に引き起こされる閉経の前、最中、および後に女性に生じる症状および疾患を指す。
「修飾された」および「変異された」および「変異体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの野生型バージョンに対して変更されたタンパク質またはポリペプチド、および好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸残基が野生型バージョンに対して置換または削除あるいは付加されたタンパク質またはポリペプチドを指す。
「モチーフ」または「アミノ酸モチーフ」という用語は、ポリペプチド鎖または三次構造内の近接するアミノ酸の１セット、および好ましくは、繰り返されるおよび／または生物学的意義を有すると考えられる近接するアミノ酸の１セットを指す。
「卵巣予備能」という用語は、健康で成功した妊娠を結果としてもたらす受精ができる卵細胞、および卵巣ホルモンを生成し、卵巣の内分泌機能の根底にある分子をシグナル伝達することができる卵巣の卵胞細胞を提供するための卵巣の能力を指す。
「置換」という用語は、異なる「置き換え」アミノ酸残基または分子を用いる１つ以上のアミノ酸残基または分子の置き換えを指す。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。対象は、幼児、年少者、青少年、成人、および老人の対象を含む任意の年齢であり得る。インビボで取得されたかインビトロで培養された生物学的存在の組織、細胞、およびそれらの子孫はまた包含される。「対象」、「個体」、または「患者」という名称は、必ずしも医療従事者の監督を伴わない。
「形質転換増殖因子ベータスーパーファミリータンパク質」、「ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質」、「ＴＧＦ－βタンパク質」、「ＴＧＦ－βスーパーファミリーのタンパク質」、または他の変異体は、ＡＭＨに限定されないが、それを含むＴＧＦ－β受容体と相互作用する細胞調節タンパク質を指す。
「野生型」という用語は、自然発生の微生物によって発現されたポリペプチドまたはタンパク質、または自然発生の微生物から単離されたポリペプチドまたはタンパク質の特性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、複数形を同様に含むことが意図されている。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「とともに（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が、詳細な記載および／または請求項のいずれかで使用される程度まで、そのような用語は、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に類似した方法で含まれるように意図されている。
修飾されたＡＭＨタンパク質に関する方法および組成物
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質に関する組成物と方法である。いくつかの例では、本明細書に記載されているような修飾されたＡＭＨタンパク質は改善された生物活性を含む。いくつかの例では、タンパク質への修飾は、それらがタンパク質の生物学的に活性な形態を保持するのを促進するという点でタンパク質の機能を改善する。例えば、いくつかの例では、タンパク質の切断された形態のみが生物学的に活性であり、修飾は切断をより効率的にし、それによって、タンパク質の生物活性を増強する。いくつかの例では、修飾はタンパク質の分泌を増加させる。いくつかの例では、修飾はタンパク質の改善された安定性を結果としてもたらす。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質に関する組成物と方法である。いくつかの例では、本明細書に記載されているような修飾されたＡＭＨタンパク質は改善された生物活性を含む。いくつかの例では、タンパク質への修飾は、それらがタンパク質の生物学的に活性な形態を保持するのを促進するという点でタンパク質の機能を改善する。例えば、いくつかの例では、タンパク質の切断された形態のみが生物学的に活性であり、修飾は切断をより効率的にし、それによって、タンパク質の生物活性を増強する。いくつかの例では、修飾はタンパク質の分泌を増加させる。いくつかの例では、修飾はタンパク質の改善された安定性を結果としてもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、受精能力のピークを遅らせるためなど（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、卵胞形成および卵巣の老化を調節する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬剤および／または組成物の投与は、卵胞の活性化および成熟の速度を低減する。ある実施形態では、受精能力のピークを遅らせるためなど、本明細書に提供される治療はさらに、個体が再産生する準備ができたときなど、最初の投与後の時点で、薬剤または組成物の投与を停止することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、女性の生殖の寿命を延長するための方法である。いくつかの例では、提供された薬剤または組成物を投与することは、女性の生殖の寿命を延長する。
本明細書に記載されるのは、ある実施形態では、卵巣の機能を改善または保護するためにＡＭＨの修飾タンパク質に関する方法と組成物である。いくつかの例では、本明細書に提供された組成物の薬剤を投与することは、卵巣の内分泌機能を拡張し、卵巣の老化および不全を遅らせるか予防する。いくつかの実施形態では、ＡＭＨの修飾タンパク質に関する方法と組成物は、卵巣の内分泌機能を改善するか保護する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＡＭＨの修飾タンパク質に関する方法と組成物は、性機能、免疫機能、グルコース代謝、メンタルヘルス、睡眠、妊娠、心臓機能、骨密度、神経認知機能、またはそれらの組み合わせを改善または維持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＡＭＨの修飾タンパク質に関する方法と組成物は、閉経を早める併存症および疾病の症状を遅らせるか低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、性腺毒性の治療（例えば、卵巣の内分泌機能を含む、卵巣に対する損傷を引き起こし、受精能力を損なわせ、化学療法、放射線、および外科的切除を含む処置）を受ける女性の卵巣予備能を維持するためなど、卵胞および卵巣の老化を調節する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬剤および／または組成物を投与する工程は、性腺毒性の処置によって引き起こされた原始卵胞の活性化または損傷を低減する。ある実施形態では、本明細書に提供された治療はさらに、性腺毒性の処置中に卵巣予備能を維持するためなど、性腺毒性の処置後の時点で薬剤または組成物の投与を停止することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、女性の生殖の寿命を延長するための方法である。いくつかの例では、提供された薬剤または組成物を投与することは、女性の生殖の寿命を延長する。いくつかの例では、本明細書に提供された組成物の薬剤を投与することは、卵巣の内分泌機能を拡張し、卵巣の老化および不全を遅らせるか予防する。いくつかの実施形態では、ＡＭＨの修飾タンパク質に関する方法と組成物は、卵巣の内分泌機能を改善するか維持する。
一般的に、プロＡＭＨ（切断前）および処理されたＡＭＨ（切断後、Ｎ末端およびＣ末端が未だに非共有結合で結合される場合）は、両方とも閉経前の女性の循環血清で存在する。これらの２つの形態間の比率は年齢とともにおよび同じ卵巣周期内で変化する。本明細書の様々な実施形態で提供されるある方法は、修飾ＴＧＦ－βタンパク質を含む組成物を投与することによって、これら２つの形態のＡＭＨ（例えば、その変異体を含む）の相対レベルを変化させるためのものであり、および／または（例えば、卵胞形成を制御する方法、または本明細書の他の方法において）含むものである。
ある実施形態では、本開示の組成物は、卵巣周期に含まれるＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質など、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、卵巣の卵胞（またはその卵胞細胞）で産生されるタンパク質（例えば、ＡＭＨ）である。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、修飾されたＴＧＦ－βタンパク質である（さらに本明細書ではＴＧＦ－βタンパク質変異体と呼ぶ）。より特定の実施形態では、タンパク質変異体は、野生型に対して、そこで生物活性を修飾するため（例えば、増加する）および／または（例えば、野生型に対して）その安定性を改善するために、修飾される。ある例では、修飾された生物活性は、受容体および／またはシグナルタンパク質あるいはホルモン（例えばＡＭＨ）レベルに結合するタンパク質の能力の修飾を含む。いくつかの例では、分泌に先立って、ＴＧＦ－βファミリーメンバーは、ＡＭＨのように、ジスルフィド結合をもつ二量体に関連付ける（例えば、図６に例示されるように）。これらはファミリーメンバーに依存するホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。タンパク質の折り畳みは、二量体の各単量体内の非共有結合の形成を結果としてもたらす。タンパク質のＮ末端部分のＣ末端リガンドドメインのタンパク質切断後、ジスルフィドと非共有結合が十分に折り畳まれた潜在形態で分子を維持するように作用する。タンパク質はこの形態で分泌されるが、Ｎ末端領域がリガンド部位から分離されるまで、それは受容体に結合することができない。切断されたＡＭＨのｃ末端ドメインは強力な下流反応を誘発する。
したがって、いくつかの例では、ＡＭＨの翻訳後修飾と他のＴＧＦ－βタンパク質は、それらの生物活性を調節する。ある例では、ＡＭＨを含むＴＧＦ－βファミリーメンバーの切断された形態のみが、生物活性である。いくつかの例では、本明細書に提供されたタンパク質変異体に存在する修飾は、野生型ＡＭＨに対して切断認識部位内またはそれに隣接する置換または挿入を含む。ある例では、（例えば、切断の効率を改善するために）修飾される切断部位は、タンパク質活性化に必要ではない切断部位である。いくつかの例では、（例えば、切断の効率を減少させるために）修飾される切断部位は、タンパク質活性化に必要ではない切断部位である。ある実施形態では、修飾は、グリセリン部位の挿入、またはグリセリン部位内の置換であり、いくつかの例では、野生型ＴＧＦ－βタンパク質に対してより安定した切断または切断されていない組換えタンパク質を結果としてもたらす。いくつかの例では、修飾は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別メンバーのＮ末端領域を用いるＡＭＨのＮ末端領域の置き換えである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別メンバーのＮ末端領域を用いるＡＭＨのＮ末端領域の置き換えであり、ここでは、ＴＧＦ－βファミリータンパク質は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾は、ＡＭＨのＮ末端ペプチドの除去、およびペプチドを安定化させることができるＣ末端ペプチドへの要素の付加である。いくつかの実施形態では、安定化要素は、ｈＣＧのＣＴＰの付加またはＦｃ ＩｇＧ１重鎖定常領域の付加であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ペプチドはポリマーを使用して安定化させられる。いくつかの実施形態では、ポリマーは線状ポリマーまたは分枝ポリマーである。適切な線状ポリマーまたは分枝ポリマーの実施例は、線状ポリエチレングリコールまたは分枝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、線状ポリプロピレングリコールまたは分枝ポリプロピレングリコール、線状ポリビニルアルコールまたは分枝ポリビニルアルコール、線状ポリ乳酸または分枝ポリ乳酸、線状ポリグリコール酸または分枝ポリグリコール酸、線状ポリグリシンまたは分枝ポリグリシン、線状ポリ酢酸ビニルまたは分枝ポリ酢酸ビニル、デキストラン、または他のそのようなポリマー、あるいは当技術分野で知られている先のまたは結合する他のポリマーの任意の２つ以上を結合させるコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分枝を含む。ある例では、修飾は、より高い効率で分泌される異なるタンパク質において、シグナルペプチドを用いる野生型ＡＭＨにおけるシグナルペプチドの置き換えである。いくつかの例では、修飾はタンパク質精製を促進するためのペプチドタグの挿入である。
いくつかの例では、ＡＭＨの野生型は配列番号：１のアミノ酸配列を含む。
特定の例では、ＡＭＨの野生型のアミノ酸配列は次のとおりである。
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８～４５２での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳ（配列番号：１２０）を含む、置換あるいは挿入、ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間のグリコシル化部位の挿入、ｃ）ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡのＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、ｄ）非ＡＭＨシグナルペプチドを用いるＡＭＨのシグナルペプチドの置換、ｅ）ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加、およびｆ）糖タンパク質のモチーフの付加、からなる群から選択される少なくとも２つの修飾を含む野生型抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）タンパク質の修飾された形態である。
ある実施形態では、ＡＭＨは、アミノ酸４５１と４５２との間に生じる、第１の切断（配列の‘／’を用いてマーキングされた）を用いる、アミノ酸４４８－４５１で切断認識部位を含有する。ある実施形態では、一次切断部位はアミノ酸４４８、４４９、４５０、４５１、および４５２を含む。ある実施形態では、二次切断部位（配列の‘／／’を用いてマーキングされた）は、配列番号：１のアミノ酸２５４と２５５との間にある。
ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおける一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＡＱＲＳ ５
（配列番号：１２０）を含む。
ＲＡＱＲＳ ５
（配列番号：１２０）を含む。
いくつかの例では、切断認識部位は、ＴＧＦ－βファミリーメンバーの切断された形態のみが生物活性であるため（例えば、受容体に結合することができる）、標的とされる。ある例では、切断をより効率的にする修飾は、タンパク質の生物活性を増強することができる。ある例では、生物学的に活性な形態のレベルを増強することは卵胞形成を減少させる。本明細書の特定の実施形態では、閉経の開始を遅らせ、卵胞の活性化、卵胞の成熟の速度を低減し、および／または原始卵胞の欠乏の速度を低減するためなど、切断認識部位内および／またはそれに隣接する置換および／または挿入を含む形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーの修飾タンパク質を投与する工程（例えば、それを必要とする女性などの女性に）を含む方法である。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は切断認識部位に隣接するまたは切断認識部位内のアミノ酸モチーフ内の置換を有する。ある実施形態では、修飾タンパク質では、野生型ＡＭＨにおいて切断部位に隣接するまたは切断部位内のアミノ酸は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの他のメンバーの切断部位に隣接するおよび／または切断部位内のアミノ酸を用いて置き換えられる。ある実施形態では、モチーフが由来するＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーは、卵巣で発現されるおよび／または役割を果たすと知られている。いくつかの実施形態では、モチーフが由来するＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーは、ＡＭＨを活性化するものと同じか似ているプロテアーゼによってタンパク質の切断によって活性化される。例えば、ある実施形態では、切断部位に隣接するまたは切断部位内のモチーフの変異は、異なるＴＧＦ－βスーパーファミリーメンバーのアミノ酸配列で見つかった切断部位を用いて野生型ＡＭＨにおける切断部位を置き換えることを含む。ある実施形態では、切断部位に隣接するまたは切断部位内のモチーフの変異は、タンパク質分解酵素による切断のために最適化される切断部位を用いる野生型ＡＭＨにおける切断部位の置き換えを含む。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨにおける切断部位はフューリンまたはエンテロキナーゼによって切断されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨにおける切断部位はフューリンまたはエンテロキナーゼの切断部位を含むように修飾されている。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨにおける切断部位はＴＧＦＢ１、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＮＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＢＡ、またはそれらの組み合わせの切断部位を含むように修飾されている。例えば、いくつかの実施形態では、切断部位に隣接するまたは切断部位内のモチーフの修飾は、表１に表記された置換の１つを含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、（ａ）アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｂ）ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換、（ｃ）アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０での前記グルタミン（Ｑ）の残基の置換、（ｄ）リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、（ｅ）アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２での前記セリン（Ｓ）の残基の置換、および（ｆ）位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入からなる群から選択される配列番号：１を含む野生型ＡＭＨタンパク質に対する置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０でのグルタミン（Ｑ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２でのセリン（Ｓ）の残基の置換である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０でのグルタミン（Ｑ）の残基の置換、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２でのセリン（Ｓ）の残基の置換、位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である。
いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２－１４のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２－１４のいずれかに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、野生型ＡＭＨタンパク質のアミノ酸４４８－４５２への以下の修飾のいずれかを含む。（１）１Ｒ〉Ｘ、２Ａ〉Ｘ、３Ｑ〉Ｘ、４Ｒ〉Ｘおよび／または５Ｓ〉Ｘ、（２）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｈ、３Ｑ〉Ｒ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ａ、（３）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｒ、３Ｑ〉Ｔ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｑ、（４）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｈ、３Ｑ〉Ｒ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｇ、（５）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｅ、３Ｑ〉Ｋ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｑ、（６）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ａ、３Ｑ〉Ｋ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｓ、（７）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｔ、３Ｑ〉Ｔ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｓ、（８）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｓ、３Ｑ〉Ｉ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｓ、（９）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｔ、３Ｑ〉Ｐ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ａ、（１０）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｒ、３Ｑ〉Ａ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ａ、（１１）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ｒ、３Ｑ〉Ｒ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ｇ、（１２）１Ｒ〉Ｒ、２Ａ〉Ａ、３Ｑ〉Ｒ、４Ｒ〉Ｋ、５Ｓ〉Ｒおよび／または６－〉Ｒ、あるいは（１３）１Ｒ〉Ｄ、２Ａ〉Ｄ、３Ｑ〉Ｄ、４Ｒ〉Ｄ、５Ｓ〉Ｋおよび／または６－〉Ｓ、（１４）１Ｒ〉Ｇ、２Ａ〉Ｒ、３Ｑ〉Ｒ、４Ｒ〉Ｒおよび／または５Ｓ〉Ａ、（１５）１－〉Ｒ、２－〉Ａ、３Ｒ〉Ｒ、４Ａ〉Ｋ、５Ｑ〉Ｒおよび／または６Ｒ〉Ｒ、（１６）１－〉Ｄ、２Ｒ〉Ｄ、３Ａ〉Ｄ、４Ｑ〉Ｄ、５Ｒ〉Ｋおよび／または６Ｓ〉Ｓ。
ある実施形態では、変異されたタンパク質は、以下の配列のいずれかを含む。
ある実施形態では、本明細書に提供された（例えば、治療）薬剤、または本明細書に提供された組成物あるいは方法における（例えば、治療）薬剤は、修飾タンパク質である。特定の実施形態では、修飾タンパク質は、タンパク質の野生型バージョンに対する、グリコシル化部位の挿入、あるいはグリコシル化部位内の置換を含む。いくつかの例では、そのような配列を有する修飾タンパク質（例えば、ＡＭＨ）は、より安定した切断されたおよび／または切断されていないタンパク質（例えば、組換えＡＭＨなどのＡＭＨ）を提供する。ある実施形態では、変異は、グリコシル化部位の１つ以上の３－４アミノ酸挿入を含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化部位の付加は、ａ）ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、ｂ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、ｃ）セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、ｄ）セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびｅ）アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換からなる群から選択される（野生型タンパク質に対する）置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１での前記プロリン（Ｐ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびアスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記グリコシル化部位の前記挿入は、Ｃ末端領域における４つのアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＰＮＡＳ、ＰＮＳＳ、ＬＮＳＳ、ＭＮＡＳ、またはＧＮＨＴを用いるＰＲＹＧの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端領域における前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＧＮＨＴを用いるＧＮＨＶの置換を含む。
いくつかの例では、いくつかの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）がグリコシル化される場所と同様の、Ｃ末端ドメインにおけるα－ヘリックスモチーフの上流に挿入される。ある例では、変異は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含有している異なるモチーフを用いる、ＡＭＨ野生型配列における配列ＰＲＹＧ（配列番号．１３３）を有するアミノ酸５０１－５０４の置き換えを含む。ある例では、野生型配列を置き換えるモチーフは、配列ＰＮＡＳ（配列番号 １３８）またはＰＮＳＳ（配列番号 １３９）を含むグリコシル化のためのコンセンサス配列を含有する。いくつかの例では、野生型配列を置き換えるモチーフは、ＢＭＰタンパク質のＣ末端において見つかったグリコシル化部位である。いくつかの例では、モチーフは、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４のＣ末端ペプチドにおいて見つかったグリコシル化部位の修飾である。ある例では、野生型配列を置き換えるモチーフは、配列ＬＮＳＳ（配列番号 １３６）を含むグリコシル化のためのコンセンサス配列を含有する。ある例では、モチーフは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ８ＢのＣ末端ペプチドで見つかったグリコシル化部位の修飾である。ある例では、野生型配列を置き換えるモチーフは、配列ＭＮＡＳ（配列番号：１３７）を含むグリコシル化のためのコンセンサス配列を含有する。他の例では、変異は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含有している異なるモチーフを用いる、ＡＭＨ野生型配列において配列ＧＮＨＶを有するアミノ酸５０４－５０７の置き換えを含む。ある例では、野生型配列を置き換えるモチーフは、ＧＮＨＴ（配列番号 １４０）であるグリコシル化のためのコンセンサス配列を含有する。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２、１５－１９、６９－７３、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８、または１７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２、１５－１９、６９－７３、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８、または１７０のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１３８、１３９、１３６、１３７、または１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１３８、１３９、１３６、１３７、または１４０のいずれか１つの、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、グリコシル化部位の挿入は、図１および表２に表記された置換の１つを含む。
ある実施形態では、変異させられたタンパク質は、これらの修飾の１つを含む。
ある実施形態では、変異は、タンパク質に糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーの野生型配列のモチーフ（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質［ｈＣＧ］のカルボキシ末端ペプチド）の付加を含む。特定の実施形態では、修飾タンパク質は、タンパク質にヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチドの融合に起因する野生型タンパク質のキメラ形態である。特定の実施形態では、モチーフは、ｈＣＧタンパク質のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ペプチドは高分子を使用して安定化させられる。いくつかの実施形態では、ポリマーは線状ポリマーまたは分枝ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーはＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリマーはＰＥＧ分枝を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＴＧＦ－βファミリーメンバーはＡＭＨであり、挿入されたモチーフはアミノ酸配列ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号．２０）である。いくつかの実施形態では、挿入されたモチーフは、ｈＣＧタンパク質のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）のすべてまたは一部であり、ＡＭＨタンパク質配列とｈＣＧタンパク質の（ＣＴＰ）との間にリンカー配列が付加されたものである。いくつかの実施形態では、リンカーは３つまたは４つの残基配列である。例えば、いくつかの実施形態では、リンカー配列はＳＳＳであり、挿入されたモチーフはアミノ酸配列ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号．２１）である。さらに、いくつかの実施形態では、リンカー配列はＳＳＳＳであり、挿入されたモチーフはアミノ酸配列ＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号．２２）である。
ある実施形態では、変異させられたタンパク質は、これらの修飾の１つを含む。
ある実施形態では、変異は、ＡＭＨ野生型配列における二次切断部位内またはそれに隣接する１つ以上のアミノ酸残基の修飾を含む。特定の実施形態では、二次切断部位は例えば二塩基のモチーフである。いくつかの実施形態では、二次切断部位は、ＡＭＨ野生型配列のアミノ酸２５４と２５５との間にある。いくつかの実施形態では、二次切断部位を含有しているモチーフはアミノ酸配列ＰＲＳＥを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、以下のアミノ酸配列：ＰＳＳＥ、ＰＱＳＥ、またはＰＡＳＥのいずれかを用いるＰＲＳＥモチーフの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２、１６７、２３－２５、または７７－７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：２、１６７、２３－２５、または７７－７９に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、二次切断部位モチーフは切断部位を隣接する１つ以上のアミノ酸を修飾することによって変異され得る。いくつかの実施形態では、修飾は、野生型ＡＭＨタンパク質の二次切断部位を含有しているモチーフへの以下の修飾のいずれかを含む。（１）１Ｐ〉Ｐ、２Ｒ〉Ｓ、３Ｓ〉Ｓ、および／または４Ｅ〉Ｅ、（２）１Ｐ〉Ｐ、２Ｒ〉Ｑ、３Ｓ〉Ｓ、および／または４Ｅ〉Ｅ、あるいは（３）１Ｐ〉Ｐ、２Ｒ〉Ａ、２Ｓ〉Ｓ、および／または４Ｅ〉Ｅ。例えば、いくつかの実施形態では、切断部位に隣接する、または切断部位内のモチーフの変異は、表３に表記された置換の１つを含む。
ある実施形態では、変異させられたタンパク質は、これらの配列の１つを含む。
ある実施形態では、変異は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域（つまり、Ｃ末端成熟領域を生成するためにタンパク質分解的に切断されるＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのプロタンパク質配列の野生型形態内の領域）と、野生型ＡＭＨ配列のＮ末端領域との置き換えを含む（つまり、Ｃ末端成熟領域を生成するためにタンパク質分解的に切断される野生型ＡＭＨプロタンパク質配列内のペプチド、例えば、配列番号：１４５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、またはそれに応じたペプチドを含む）。ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、卵巣において発現されるおよび／または活性であるＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である（例えば、ＧＤＦ９、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＴＧＦＢ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ）。ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である（例えば、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡ）。ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡのＮ末端領域である。特定の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、キメラ（つまり、２つの異なるＴＧＦ－βファミリーメンバーの成熟領域に関連したプロペプチド）が生成される場合に、分泌を増強すると示されたＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である。特定の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、例えば、配列番号 １４６に対して少なくとも９０％の配列同一性含む、または配列番号 １４６に応じた、ＴＧＦＢ１のＮ末端領域である。他の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、安定性を増強すると示されたＴＧＦ－βスーパーファミリーの別メンバーのＮ末端領域である。特定の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、ＧＤＦ１５のものである。ある実施形態では、置き換えられるＡＭＨの領域は、別のＴＧＦ－βファミリーメンバーのＮ末端ペプチドおよび切断酵素（切断部位）によって認識されたアミノ酸モチーフを含む。いくつかの実施形態では、モチーフは、Ｎ末端ペプチドが得られたＴＧＦ－βメンバーのＣ末端ペプチドの第１のアミノ酸を含む。ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、野生型シグナルペプチドが異なるタンパク質のシグナルペプチドと置き換えられたＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である。ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号 １６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むか、配列番号 １６４に応じたＩｇＫにおけるものである。他の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、安定性を増強すると示されたＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である。特定の実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、配列番号 １４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むか、配列番号 １４７に応じたＴＧＦＢ２のＮ末端領域である。ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、野生型シグナルペプチドが異なるタンパク質のシグナルペプチド（例えばＩｇＫ）と置き換えられた、および切断部位がフューリン（例えばＲＫＫＲＲＳ）（配列番号 １３）による切断のために最適化された切断部位によって置き換えられた、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのＮ末端領域である。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、配列番号：１４７、１４８、１４９、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、または１８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨにおけるものを置き換えるＮ末端領域は、配列番号：１４７、１４８、１４９、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、または１８４に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１６５、２６、２７、８１、または８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１６５、２６、２７、８１、または８２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある実施形態では、ＡＭＨの野生型形態のＮ末端領域の変異は、表４に表記された置換の１つを含む。
ある実施形態では、修飾タンパク質は、以下のアミノ酸配列のいずれか、または以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を含む配列を含む。
ある実施形態では、変異は、組換えタンパク質が産生されるとそれを精製するために使用され得るポリペプチドタンパク質タグの付加を含む。いくつかの実施形態では、タグはエピトープタグである。いくつかの実施形態では、タグはアフィニティータグ（つまりアフィニティー技術を使用して、容易に精製することができるモチーフ）である。いくつかの実施形態では、ＳｔｒｅｐタグはＡＭＨ配列に挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧタグはＡＭＨ配列に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグはＡＭＨ配列に挿入される。例えば、ある実施形態では、ＡＭＨ配列に挿入されたタグは以下のタグ（表５）の１つである：配列番号：１５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むか配列番号：１５０に応じたＳｔｒｅｐタグ、配列番号：１５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むか配列番号：１５１に応じたＦＬＡＧタグ、配列番号：１９４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヒスチジンタグ。いくつかの実施形態では、挿入されたタグは、配列番号：１５０、１５１、または１９４に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１６９、２８、２９、または１９５を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：１６９、２８、２９、または１９５に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、タグはＡＭＨの野生型形態に挿入される。ある実施形態では、タグはＡＭＨの変異された形態に挿入され、１つ以上の他の修飾と組み合わせて使用される。ある実施形態では、ＡＭＨまたは修飾されたＡＭＨのＣ末端領域が切断後に精製され得るように、タグは一次切断部位の後に（例えば、それのＣ末端側で）挿入される。
ある実施形態では、変異させられたタンパク質は、これらの修飾の１つを含む。
ある実施形態では、変異は、異なるタンパク質のシグナルペプチドとＡＭＨの野生型形態におけるシグナルペプチドとの置き換えを含む。特定の実施形態では、高効率で自然に分泌されるタンパク質のシグナルペプチドは、ペプチドが付加される変異されたタンパク質の分泌を改善する。いくつかの実施形態では、置き換えられる野生型ＡＭＨのペプチドは、野生型タンパク質の残基１－２４を含み、アミノ酸配列：ＭＲＤＬＰＬＴＳＬＡＬＶＬＳＡＬＧＡＬＬＧＴＥＡを含む。他の実施形態では、置き換えられる野生型ＡＭＨのペプチドは、野生型タンパク質の残基１－２５を含み、アミノ酸配列：ＭＲＤＬＰＬＴＳＬＡＬＶＬＳＡＬＧＡＬＬＧＴＥＡＬを含む。例えば、ある実施形態では、野生型ＡＭＨのシグナルペプチドは、以下のタンパク質の１つのシグナルペプチドと置き換えられる（表６）：アズロシジン、ＩＬ２、ＩＬ６、ＣＤ５、免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ－ＨＣ）、免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ－ＬＣ）、トリプシノーゲン、プロラクチン、エラスチン、ヒトインフルエンザヘマグルチニン、ＩｇＫａｐｐａ。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨのシグナルペプチドは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって生成されたシグナルペプチドと置き換えられる。いくつかの実施形態では、野生型ＡＭＨのシグナルペプチドは、配列番号：１５３－１６４のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含むシグナルペプチドと置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：３０－５３または８２－１１９のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＡＭＨタンパク質は、配列番号：３０－５３または８２－１１９のいずれかに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、変異されたタンパク質は、これらの修飾の１つを含む。
いくつかの実施形態では、変異されたタンパク質は、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチドを含むポリペプチドである（表７）。いくつかの実施形態では、ＡＭＨのＣ末端ペプチドを含むタンパク質は、ＡＭＨのＮ末端部分を欠いている。いくつかの実施形態では、ＡＭＨのＣ末端ペプチドは、修飾タンパク質の分泌を可能にするおよび／または容易にするシグナルペプチド（例えば、ＩＬ２シグナルペプチドまたはＨＭＭシグナルペプチド）に連結される。いくつかの例では、シグナルペプチドに連結されたＡＭＨのＣ末端ペプチドは、タンパク質の精製を容易にするために、結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）ＩｇＧ１重鎖定常領域の配列を連結される。いくつかの実施形態では、ＡＭＨのＣ末端領域はｈＣＧタンパク質のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＴＰはリンカー（例えばＳＳＳまたはＳＳＳＳ）によってＡＭＨのＣ末端ペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ペプチドはポリマーを使用して安定化させられる。いくつかの実施形態では、ポリマーは線状ポリマーまたは分枝ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーはＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリマーはＰＥＧ分枝を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載された変異は組み合わせて使用され得る。特定の実施形態では、変異はそれらが影響するタンパク質（例えばＡＭＨ）の領域およびそれらが導入する型の変化に基づいて群に分割され得る。群Ａは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質の一次切断部位への修飾を含む。群Ｂは、グリコシル化部位が配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質に導入される修飾を含む。群Ｃは、Ｃ末端ペプチドが配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質に付加される修飾を含む。群Ｄは、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質における二次（つまり、タンパク質活性化に必要な切断ではない）切断部位への修飾を含む。群Ｅは、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：１７２、配列番号：１７３、配列番号：１７５、配列番号：１７７、配列番号：１７９、配列番号：１８１、配列番号：１８３、配列番号：１８５、配列番号：１８７、配列番号：１８９、配列番号：１９１、配列番号：１９３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質のＮ末端ドメインへの修飾を含む。群Ｆは、タグエピトープが配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：１９５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質における一次切断部位（つまり、タンパク質活性化に必要な切断）の下流に挿入される修飾を含む。群Ｇは、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３のいずれか１つに対して、少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じたタンパク質のシグナルペプチドへの修飾を含む。群Ｈは、配列番号：５４（図２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むかそれに応じた、Ｎ末端ペプチドが不在であるＡＭＨの修飾された配列を含む。ある実施形態では、異なる群の修飾は組み合わせられ、同じ修飾タンパク質に導入される。例えば、群Ａの０または１つの修飾、および、群Ｂの０または１つの修飾、および、群Ｃの０または１つの修飾、および、群Ｄの０または１つの修飾、および、群Ｅの０または１つの修飾、および、群Ｆの０または１つの修飾、および、群Ｇの０または１つの修飾、および、群Ｈの０または１つの修飾、ある実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つおよび／または８つの群の任意の組み合わせの修飾が同じ修飾タンパク質に導入され得る。
ある実施形態では、異なる種類の修飾の組み合わせは、下記のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせを含む：１）野生型ＡＭＨ配列へのＳｔｒｅｐ－タグの付加。２）野生型ＡＭＨ配列の野生型配列へのＦＬＡＧタグの付加。３）天然の切断部位がＴＧＦＢ１の切断部位によって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４）天然の切断部位がＢＭＰ１５の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５）天然の切断部位がＧＤＦ９における切断部位によって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。６）天然の切断部位がＢＭＰ２の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。７）天然の切断部位がＢＭＰ４の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。８）天然の切断部位がＢＭＰ６の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。９）天然の切断部位がＢＭＰ７の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１０）天然の切断部位がＢＭＰ８Ｂの切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１１）天然の切断部位がＧＤＦ１５の切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１２）天然の切断部位がＩＮＨＢＡの切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１３）天然の切断部位がフューリン切断に最適化された切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１４）天然の切断部位がエンテロキナーゼ切断に最適化された切断部位と置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１５）ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＬＮＳＳによって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１６）ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＭＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１７）ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＰＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１８）ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＰＮＳＳによって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。１９）ＧＮＨＶ部位（残基５０４－５０７）がＧＮＨＴによって置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２０） ｈＣＧ（ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）由来のＣＴＰ配列が付加される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２１）ｈＣＧ＋リンカー（ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）由来のＣＴＰ配列が付加される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２２）ｈＣＧ＋リンカー（ＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）由来のＣＴＰ配列が付加される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２３）二次的な二塩基の切断部位ＲＳ（残基２５４－２５５）がＳＳへと変異される、野生型ＡＭＨ配列、およびＳｔｒｅｐ－タグは一次切断部位の後に付加され得る。２４）二次的な二塩基の切断部位ＲＳ（残基２５４－２５５）がＱＳへと変異される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２５）二次的な二塩基の切断部位ＲＳ（残基２５４－２５５）がＡＳへと変異される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２６）Ｎ末端ペプチドがＴＧＦＢ２のＮ末端ペプチドに置換され、シグナルペプチドがＩｇＫのシグナルペプチドに置換され、および、切断部位はｆｕｒｉｎ切断に最適化される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２７）Ｎ末端ペプチドがＴＧＦＢ１のＮ末端ペプチドに置換され、シグナルペプチドがＩｇＫのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２８）シグナルペプチド（残基１－２４）がアズロジシンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。２９）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３０）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩＬ６のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３１）シグナルペプチド（残基１－２４）がＣＤ５のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３２）シグナルペプチド（残基１－２４）が免疫グロブリン重鎖のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３３）シグナルペプチド（残基１－２４）が免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３４）シグナルペプチド（残基１－２４）がトリプシノーゲンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３５）シグナルペプチド（残基１－２４）がプロラクチンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３６）シグナルペプチド（残基１－２４）がエラスチンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐタグは切断部位の後に付加され得る。３７）シグナルペプチド（残基１－２４）がＨＭＭのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐタグは切断部位の後に付加され得る。３８）シグナルペプチド（残基１－２４）がヒトインフルエンザヘマグルチニンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。３９）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩｇＫａｐｐａのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４０）シグナルペプチド（残基１－２５）がアズロジシンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４１）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４２）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩＬ６のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４３）シグナルペプチド（残基１－２５）がＣＤ５のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４４）シグナルペプチド（残基１－２５）が免疫グロブリン重鎖のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４５）シグナルペプチド（残基１－２５）が免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４６）シグナルペプチド（残基１－２５）がトリプシノーゲンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４７）シグナルペプチド（残基１－２５）がプロラクチンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４８）シグナルペプチド（残基１－２５）がエラスチンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。４９）シグナルペプチド（残基１－２５）がＨＭＭのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５０）シグナルペプチド（残基１－２５）がヒトインフルエンザヘマグルチニンのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５１）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩｇＫａｐｐａのシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨ配列。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５２）シグナルペプチドがＩＬ２のシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチド。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５３）シグナルペプチドがＨＭＭシグナルペプチドに置換される、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチド。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５４）シグナルペプチドがＩＬ２のシグナルペプチドで置換され、および、ｈＣＧのＣＴＰがペプチドのＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチド。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５５）シグナルペプチドがＨＭＭのシグナルペプチドで置換され、および、ｈＣＧのＣＴＰがペプチドのＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチド。Ｓｔｒｅｐ－タグは切断部位の後に付加され得る。５６）シグナルペプチドがＩＬ２およびＦｃ ＩｇＧ１重鎖定常領域のシグナルペプチドで置換され、および、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位がシグナルペプチドとＡＭＨのＣ末端ペプチドとの間に付加される、野生型ＡＭＨのＣ末端ペプチド。５７）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位はＧＤＦ９における切断部位と置換され、ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＰＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ。５８）シグナルペプチド（残基１－２４）がＨＭＭのシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位はＧＤＦ９における切断部位に置換され、および、ｈＣＧ（リンカーの有無に関わらず）のＣＴＰがタンパク質のＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨ。５９）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位は、フューリン切断に最適化された切断部位で置換され、ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）は、ＰＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ。６０）シグナルペプチド（残基１－２４）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位は、フューリン切断に最適化された切断部位に置換され、および、ｈＣＧ（リンカーの有無に関わらず）のＣＴＰはタンパク質のＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨ。６１）ＰＲＹＧ部位（完全な野生型ＡＭＨ配列における残基５０１－５０４）がＰＮＡＳによって置換される、ＩＬ２のシグナルペプチドに結合されたＡＭＨの野生型Ｃ末端ペプチド。６２）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位がＧＤＦ９における切断部位に置換され、ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＰＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ。６３）シグナルペプチド（残基１－２５）がＨＭＭのシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位はＧＤＦ９における切断部位に置換され、および、ｈＣＧ（リンカーの有無に関わらず）のＣＴＰがタンパク質のＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨ。６４）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位がフューリン切断に最適化された切断部位に置換され、ＰＲＹＧ部位（残基５０１－５０４）がＰＮＡＳによって置換される、野生型ＡＭＨ。６５）シグナルペプチド（残基１－２５）がＩＬ２のシグナルペプチドに置換され、ＡＭＨ切断部位は、フューリン切断に最適化された切断部位に置換され、および、ｈＣＧ（リンカーの有無に関わらず）のＣＴＰはタンパク質のＣ末端端末に付加される、野生型ＡＭＨ。
いくつかの実施形態では、修飾されるＡＭＨタンパク質は、配列番号：５５－１１９のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾されるＡＭＨタンパク質は、配列番号：５５－１１９のどれに対しても、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、同一性を含む。
いくつかの実施形態では、異なる群由来の修飾、例えば、群Ａ由来の０または１つの修飾、群Ｂ由来の０または１つの修飾、群Ｃ由来の０または１つの修飾、群Ｄ由来の０または１つの修飾、群Ｅ由来の０または１つの修飾、群Ｆ由来の０または１つの修飾、群Ｇ由来の０または１つの修飾、および、群Ｈ由来の０または１つの修飾、または、それらの任意の組合わせが、組み合わされ、同じ修飾タンパク質中に導入される。いくつかの実施形態では、複数の群のうち、１、２、３、４、５、６、７、および／または８つの群のあらゆる組み合わせ由来の修飾が、同じ修飾タンパク質に導入され得る。
ある実施形態では、修飾されるペプチドの配列は、以下の表８に提供される配列のうちの１つである。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列、または配列番号５５－１１９のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を含む。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列または配列番号５５－１１９のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列または配列番号５５－１１９のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列または配列番号５５－１１９のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列または配列番号５５－１１９のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の相同性を含む。いくつかの例では、修飾されるペプチドは、表８に明記される配列または配列番号５５－１１９のいずれか１の、少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、または４００以上のアミノ酸を有する、少なくとも部分を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載された変異は、タンパク質の活性を修飾し（例えば、増加させ）、および／またはタンパク質を安定させ（例えば、生物活性および／または生物学的活性型の保持を支援し）、および／または、タンパク質の分泌を増加させ、および／または、二次的な部位での切断によって生成されるタンパク質副産物の産生を減少させる。特定の実施形態では、タンパク質はＡＭＨまたはそれらの変種であり、および、ＡＭＨまたはそれらの変種のレベルを増加させることは、卵胞の活性化、卵胞の成熟、および／または（例えば、初期）卵胞の欠乏の速度を減少させることなどによって、卵巣の老化および／または閉経期の開始（あるいは閉経移行期）を制御し（例えば、遅延させ）、閉経期（あるいは閉経移行期）の症状を緩和および／または早すぎる卵巣機能不全（ＰＯＩ）を処置し、性腺毒性のある処置中に卵巣予備能と機能を保護する。
本明細書の特定の実施形態において、必要とする女性において、卵巣の老化および卵胞喪失の速度を減少させるプロセスが、提供される。特定の実施形態では、前記プロセスは、個体（例えば、必要とする女性）に本明細書に記載された薬剤を投与することを含む。ある実施形態では、卵胞の喪失は、卵胞形成および／または（例えば、初期）卵胞の欠乏（卵巣予備能の欠乏など）を介して生じる。いくつかの例では、重大な卵胞喪失（例えば、成熟と欠乏の組み合わせ通じての）は、閉経の開始に相関する。ある例では、重大な卵胞喪失（例えば、成熟と欠乏の組み合わせを通じての）は、閉経移行期の開始（例えば、卵胞集団の臨界閾値に到達すると）に相関する。
様々な実施形態において、本明細書のプロセスに従って投与される薬剤は、任意の適切な投与技術または製剤を利用して投与される。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬剤は、本明細書に記載されるものなどの、任意の適切な形態で製剤される。ある実施形態では、本開示の方法は、本明細書に記載される薬剤または組成物のいずれかの送達または投与を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、薬剤または組成物を投与することは、皮内注射、皮下注射、経皮的送達、皮膚下の送達、または輸血によって薬剤または組成物を投与すること含む。いくつかの実施形態では、薬剤または組成物の投与は、除放性の皮膚下の装置によって達成される。
ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、年齢、基底胞状卵胞の計数、卵胞刺激ホルモンレベル、エストラジオール、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、基礎体温、および／または抗ミュラー管ホルモンレベルを評価する工程をさらに含む。いくつかの実施形態に、投与のタイミングおよび／または投与量は、年齢、基底胞状卵胞の数、卵胞刺激ホルモンレベル、エストラジオール、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、基礎体温、および／または抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）レベルに基づいて、少なくとも部分的に決定される。いくつかの実施形態では、薬剤（または同一物を含む組成物）の投与は、毎日行なわれる。ある実施形態では、約０．５ｍｇから約１ｍｇ薬剤などの、任意の適切な量の薬剤が投与される。ある実施形態では、投与される薬剤および／または組成物の量は、卵胞形成を調節する（例えば、減少させる）、（例えば、投与計画実施中に）閉経を調節する（例えば、遅らせる）、（例えば、必要とする）女性の閉経あるいは閉経移行期症状を緩和する、および／または本明細書に記載される他の有益な効果のために十分である。
ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、前記薬剤による処置の利益を得ることができる女性を識別するために、卵巣予備能の早すぎる欠乏を示す女性の遺伝的リスクを評価する工程をさらに含む。特定の実施形態では、卵胞形成および／または卵巣生物学関して重大な遺伝子中の突然変異（例えば、ＡＲ、ＢＭＰ１５、ＥＳＲ１、ＦＩＧＬＡ、ＦＭＲ１、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ３、ＦＳＨＲ、ＧＡＬＴ、ＧＤＦ９、ＩＮＨＡ、ＮＯＢＯＸ、ＮＲ５Ａ１、ＳＹＣＰ２Ｌ、ＴＧＦＢＲ３）をもつ女性は、前記薬剤で処置されるのに適格である。
ある実施形態では、本明細書において、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質を（例えば、薬学的に許容可能な賦形剤とともに）含む組成物が提供される。ある実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）（例えば、野生型バージョンのＡＭＨ、配列番号：１またはその変異体）である。
ある実施形態では、修飾タンパク質（例えば、ＡＭＨの変異体）は、以下の突然変異の１つ以上を含む：挿入または欠失（インデル）、タンパク質の野生型のバージョンに対する置換、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーまたは糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーの野生型配列由来のモチーフの付加。ある実施形態では、挿入または欠失は、切断認識部位内に、または切断認識部位に隣接して、置換を含む。ある実施形態では、置換は、アミノ酸モチーフ内に置換を含み、いくつかの例では、野生型タンパク質の切断認識部位内またはすぐ側に、置換を含む。いくつかの例では、突然変異は、糖鎖付加部位の挿入、または糖鎖付加部位内の置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの異なるメンバーのＮ末端基ペプチドによるＡＭＨのＮ末端基ペプチドの置換を含む。ある実施形態では、突然変異は、異なるタンパク質のシグナルペプチドによるＡＭＨのシグナルペプチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、例えば、組換え型タンパク質の純化を促進するペプチドタグの挿入を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾の組み合わせは同じタンパク質に導入される。
ある実施形態では、修飾された（例えば、ＴＧＦ－βスーパーファミリー）タンパク質は、対象中で、自然発生のタンパク質に対して、増大された活性を有する。ある実施形態では、修飾された（例えば、ＴＧＦ－βスーパーファミリー）タンパク質は、自然発生のタンパク質に対して、増大された安定性と半減期を有する。ある実施形態では、修飾タンパク質は、より高い効率で精製され、および／または、副産物（例えば、タンパク質配列内の二次的な部位での切断によって生成されたペプチド）の量を低減させて産生される。
ある実施形態では、修飾タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の、共有結合または非共有結合の連結、あるいはアマルガム化によって、翻訳後に修飾される。いくつかの実施形態では、分子のペグ化は、それらの免疫原性または抗原性を減少させる。他の実施形態では、分子のペグ化は、水溶解度を増加させ、および腎クリアランスを減少させることにより、それらの循環時間を延長する。
ある実施形態では、本明細書に記載されるものなどの（例えば、タンパク質の野生型のバージョンに関する突然変異を包含する形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーの組換え型タンパク質）、修飾タンパク質をコードする組み換え遺伝子が、本明細書に提供される。いくつかの例では、遺伝子は、微生物による（例えば、細菌の、ウイルスの）ベクター（例えば、プラスミドあるいはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））の一部として提供される。いくつかの例では、タンパク質は、培養物中で、例えば、大腸菌、乳酸桿菌属、酵母、または他の適切な生物体内で、発現される。いくつかの例では、組み換えの遺伝子は個体（例えば、必要とする女性）に送達される（例えば、リポソームまたは他のナノ粒子中のプラスミドとして）（例えば、細胞それ自体においてなど、個体において、修飾タンパク質の発現をもたらすために）。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるどの組成物も（例えば、タンパク質または遺伝子を含む）、薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される、修飾タンパク質（または核酸）を含む組成物は、食塩水に懸濁され、および、例えば、静脈内用（ＩＶ）バッグに封入される。
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質を含む組換え型タンパク質を、卵胞形成を調節する、卵巣の老化を減少させる、閉経を遅らせる、および／または、患者における閉経症状を緩和するために十分な量で、被験体（例えば、必要とする女性）に投与する工程を含む。
ある実施形態では、本明細書で提供される様々な方法は、本明細書で提供されるような、治療有効量の薬剤（例えば、本明細書で提供される修飾タンパク質）の投与を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、閾値から（例えば、下または上に）逸脱する、基底胞状卵胞の数（ＢＡＦＣ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオール値を有する女性に投与される。いくつかの実施形態では、ＢＡＦＣ、ＦＳＨ（ＡＭＨ）、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオール値は、任意の適切な手法で、および組織、血液、または唾液などの、任意の適切な生体試料から、または温度計または超音波などの装置を通じて、確認される。いくつかの実施形態では、投与される薬剤の治療有効量は、少なくとも一部は、（１）閾値から（例えば、下に）逸脱するＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ、または７つすべてに基づき、および／または（２）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールのいずれか１つ以上の確認された値がどの程度閾値から（例えば、どの程度下に）逸脱しているかに基づく。いくつかの実施形態では、薬剤の治療有効量は、気分、体容量指数（ＢＭＩ）、体重の変化、ホットフラッシュ、保水性、食欲、月経周期規則性、性衝動、睡眠メトリック、エネルギーレベル、またはなどをする、それらの１つ以上の任意の組み合わせに基づくなど、１つ以上の特徴（例えば、閉経および／または閉経移行期に関連した症状または症状の評価（例えば、スコア））に、少なくとも部分的に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、個体（例えば、本明細書により詳細に記載されたような）に投与するべき薬剤の適切な治療有効量を決定するなどのために、そのようなレベル（またはそれらに関連するスコア）を評価する工程を含む。
さらに、本明細書において、ある実施形態では、治療をモニタリングするための、および／または提供するための、システムを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、個体における卵胞形成、卵巣の老化、閉経、閉経移行期、またはそれらに関する症状の調節するための、あるいは調節を促進するための、システムが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、個体（女性）の妊娠可能時期を広げるための、本明細書で提供される方法などによる、システムが提供される。さらに、本明細書に提供されるシステムは、本明細書に企図される他の療法を容易にするのに有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステムは：第１のデータベースであって、１つ以上の生体レベルまたは個体のスコア、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の生体レベルまたはスコアを含む１つ以上の生物学的スコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の生体レベルまたはスコア、基底胞状卵胞計数（ＢＡＦＣ）の生体レベルまたはスコア、プロゲステロンの生体レベルまたはスコア、ＬＨの生体レベルまたはスコア、および／またはエストラジオールの生体レベル、スコア、基礎体温の値、またはそれらの組み合わせを含む、第１のデータベース；１つ以上の基準レベルまたはスコアを含む第２のデータベースであって、前記１つ以上の基準レベルまたはスコアは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の値またはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の値またはスコア、基底胞状卵胞計数（ＢＡＦＣ）の値またはスコア、プロゲステロンの生体レベルまたはスコア、ＬＨの生体レベルまたはスコア、エストラジオールの生体レベルまたはスコア、基礎体温の値、または、それらの組み合わせを含む、第２のデータベース；および第２のデータベースの１つ以上の基準レベルまたはスコアに対して第１のデータベースの生体レベルまたはスコアを処理するように個々にまたは集団的にプログラムされる１つ以上のコンピュータプロセッサであって、それによって個体が（例えば、特定の）治療プロトコルを必要とすることを決定する、コンピュータプロセッサを含む。
いくつかの実施形態では、治療プロトコル（例えば、提供される、または提供のために表示される）は、複数の可能な治療プロトコルのうちの１つである。いくつかの実施形態では、様々な治療プロトコルは、ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールのうち１つ以上の生体レベルもしくは（例えば、レベルに関連づけられる）スコアに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、様々な治療プロトコルは、投与されるべき治療有効量の薬剤、投与されるべき治療有効量の薬剤の頻度、投与経路など、またはそれらの１つ以上の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、複数の可能な治療プロトコルのうちのいくつかまたはすべては、様々な量（例えば、互いに異なる、および／または表示された治療プロトコルの量とは異なる）の投与を要求する。
いくつかの実施形態では、システムは、個体の１つ以上の特性レベルまたはスコアを含む第３のデータベース、および１つ以上の基準特性レベルまたはスコアを含む第４のデータベースを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のコンピュータプロセッサは、第２のデータベースの１つ以上の基準特性レベルまたはスコアに対して第１のデータベースの特性レベルまたはスコアを処理するように個々にまたは集団的にさらにプログラムされ、それによって第２のデータベースの１つ以上の基準レベルまたはスコアに対する第１のデータベースの生体レベルまたはスコアを集団的に比較して、個体が治療プロトコルを必要とすることを決定する。
いくつかの実施形態では、システムは１以上のバイオセンサを含む。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオセンサは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の生体レベルまたはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の生体レベルまたはスコア、ＢＡＦＣの生体レベルまたはスコア、プロゲステロンの生物学的値またはスコア、ＬＨの生体レベルまたはスコア、個体のエストラジオールの生体レベルまたはスコア、基礎体温の値、またはそれらの組み合わせに関連する、生物学データなどの、個体からの生物学データを取得するかまたは受け取るように構成される。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の生体レベルまたはスコア、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の生体レベルまたはスコア、ＢＡＦＣ、生体レベルまたはプロゲステロンのスコアの生体レベルまたはスコア、ＬＨの生体レベルまたはスコア、個体のエストラジオールの生体レベルまたはスコア個体、基礎体温の値、またはそれらの組み合わせを評価するために適切な生物学的データを取得するのに適切な任意のセンサなどの、いかなる適切なバイオセンサでも任意選択的に利用される。いくつかの実施形態では、バイオセンサは、個体への移植または接着のために構成されたセンサである。いくつかの実施形態では、バイオセンサは体温を分析するように構成されたセンサである。いくつかの実施形態では、バイオセンサは温度センサ（例えば、温度計）である。いくつかの実施形態では、バイオセンサは、唾液に基づくセンサ、皮膚に基づくセンサ（例えば、皮膚用パッチ）、皮下センサ、子宮内センサ、または膣センサである。いくつかの実施形態では、バイオセンサは体液を分析するように構成されたセンサである。いくつかの実施形態では、体液は唾液、血液、尿、または月経液である。いくつかの実施形態では、システムはさらに、生体データを個体の１つ以上の生体レベルまたはスコアに変換するように構成された１つ以上のコンピュータプロセッサ（例えば、当該システムの他のコンピュータプロセッサと同じか又は異なる）を含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるシステムによって特定された治療プロトコルは、個体または医療提供者など向けに表示される。いくつかの例では、個体または医療提供者は、その後治療プロトコルに応じる（例えば、本明細書で提供される、治療プロトコルに従って修飾タンパク質、または他の薬剤を個体に投与することによって）。特定の実施形態では、システムは、治療プロトコルを表示するように構成されたディスプレイを含む。
いくつかの実施形態では、システムは、治療プロトコルに従って治療剤を（例えば、自動的に）投与するように構成された装置を含む。いくつかの実施形態において、装置は移植される装置である。いくつかの実施形態では、システムが治療プロトコルに従って治療剤を（例えば、自動的に）投与するように構成されたデバイスを含む場合であっても、ディスプレイは、同様に、個体のおよび／または医療提供者が治療プロトコル（例えば、現在使用中および／または前の）を監視することを可能にするために、存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、受精能力のピークを遅らせる、または機能を維持するなど（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、卵胞形成および卵巣の老化を調節する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬剤および／または組成物の投与は、卵胞の活性化の速度を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬剤および／または組成物の投与は、卵胞の成熟の速度を低減する。ある実施形態では、受精能力のピークを遅らせるためなど、本明細書に提供される治療はさらに、個体が再産生する準備ができたときなど、最初の投与後の時点で、薬剤または組成物の投与を停止することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって）、女性の生殖の寿命を延長するための方法である。いくつかの例では、提供された薬剤または組成物を投与することは、女性の生殖の寿命を延長する。いくつかの例では、提供される薬剤または組成物を投与することは、卵巣機能と卵巣の内分泌機能を保護する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって、）性腺毒性の治療（例えば、卵巣に対する損傷を引き起こし、受精能力を損なわせる、化学療法、放射線、および外科的切除を含む、処置）を受ける女性の卵巣予備能を維持するためなど、卵胞形成および卵巣の老化を調節する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬剤および／または組成物を投与する工程は、性腺毒性の処置によって引き起こされた原始卵胞の動員を減少させる。ある実施形態では、本明細書に提供された治療は、性腺毒性の処置中に卵巣予備能を維持するためなど、性腺毒性の処置後の時点で薬剤または組成物の投与を停止することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、（例えば、治療上有効な量および／または方式で、本明細書に提供される薬剤を女性に投与することによって、）女性の生殖の寿命を延長するための方法である。いくつかの例では、提供された薬剤または組成物を投与することは、女性の生殖の寿命を延長する。いくつかの例では、提供される薬剤または組成物を投与することは、卵巣機能と卵巣の内分泌機能を保護する。
一般的に、プロＡＭＨ（切断前）および処理済みのＡＭＨ（切断後、Ｎ末端およびＣ末端が未だに非共有結合で結合される場合）は、両方とも閉経前の女性の循環血清中に存在する。これらの２つの形態間の比率は年齢とともにおよび同じ卵巣周期内で変化する。本明細書の様々な実施形態で提供されるある方法は、修飾ＴＧＦ－βタンパク質を含む組成物を投与することによって、これら２つの形態のＡＭＨ（例えば、その変異体を含む）の相対レベルを変化させるためのものであり、および／または（例えば、卵胞形成を制御する方法、または本明細書の他の方法において）含むものである。
ある実施形態では、本開示の組成物は、卵巣周期に含まれるＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質など、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの修飾タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、卵巣の卵胞（またはその卵胞細胞）で産生されるタンパク質（例えば、ＡＭＨ）である。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、修飾されたＴＧＦ－βタンパク質である（さらに本明細書ではＴＧＦ－βタンパク質変異体と呼ぶ）。より特定の実施形態では、タンパク質変異体は、野生型に対して、そこで生物学的活性を修飾するため（例えば、増加する）および／または（例えば、野生型に対して）その安定性を改善するために、修飾される。ある例では、修飾された生物学的活性は、受容体および／またはシグナルタンパク質あるいはホルモン（例えばＡＭＨ）レベルに結合するタンパク質の能力の修飾を含む。いくつかの例では、分泌に先立って、ＴＧＦ－βファミリーメンバーは、ＡＭＨのように、ジスルフィド結合をもつ二量体に関連付ける。（例えば、図６に例示されるように）。これらはファミリーメンバーに依存するホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。タンパク質の折り畳みは、二量体の各単量体内の非共有結合の形成を結果としてもたらす。タンパク質のＮ末端部分のＣ末端リガンドドメインのタンパク質切断後、ジスルフィドと非共有結合が十分に折り畳まれた潜在形態で分子を維持するように作用する。タンパク質はこの形態で分泌されるが、Ｎ末端領域がリガンド部位から分離されるまで、それは受容体に結合することができない。切断されたＡＭＨのＣ末端ドメインは、強力な下流反応を誘発する。
したがって、いくつかの例では、ＡＭＨの翻訳後修飾と他のＴＧＦ－βタンパク質は、それらの生物学的活性を調節する。ある例では、ＡＭＨを含む、ＴＧＦ－βファミリーメンバーの、切断された形態のみが、生物学上活性である。いくつかの例では、本明細書に提供されたタンパク質変異体に存在する修飾は、野生型ＡＭＨに対して切断認識部位内またはそれに隣接する置換または挿入を含む。ある例では、（例えば、切断の効率を改善するために）修飾される切断部位は、タンパク質活性化に必要ではない切断部位である。いくつかの例では、（例えば、切断の効率を減少させるために）修飾される切断部位は、タンパク質活性化に必要ではない切断部位である。ある実施形態では、修飾は、グリセリン部位の挿入、またはグリセリン部位内の置換であり、いくつかの例では、野生型のＴＧＦ－βタンパク質に対してより安定した切断または切断されていない組換えタンパク質を結果としてもたらす。いくつかの例では、修飾は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別メンバーのＮ末端領域を用いるＡＭＨのＮ末端領域の置き換えである。ある例では、修飾は、より高い効率で分泌される異なるタンパク質において、シグナルペプチドを用いる野生型ＡＭＨにおけるシグナルペプチドの置き換えである。いくつかの例では、修飾はタンパク質精製を促進するためのペプチドタグの挿入である。
いくつかの例では、ＡＭＨの野生型は配列番号：１のアミノ酸配列を含む。
特定の例では、ＡＭＨの野生型のアミノ酸配列は次のとおりである。
本明細書における組成物のいくつかの実施形態では、配列番号：１を含む野生型の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）タンパク質の修飾された形態は、次からなる群から選択される少なくとも２つの修飾を含む：ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８－４５２での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳ（配列番号：１２０）を含む、置換あるいは挿入；ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間の糖鎖付加部位の挿入；ｃ）ＡＭＨにおけるＮ末端領域の、ＴＧＦ＊ファミリー（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ）の異なるメンバーのＮ末端領域を用いる置換；ｄ）非ＡＭＨシグナルペプチドを用いるＡＭＨのシグナルペプチドの置換；ｅ）ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加；ｆ）糖タンパク質のモチーフの付加；および、ｇ）野生型ＡＭＨ由来のＮ末端ペプチドの除去、および安定させる修飾の付加。
ある実施形態では、ＡＭＨは、アミノ酸４５１と４５２との間に生じる、第１の切断（配列の‘／’」を用いてマーキングされた）を用いる、アミノ酸４４８－４５１で切断認識部位を含有する。ある実施形態では、初代切断部位はアミノ酸４４８、４４９、４５０、４５１と４５２を含む。ある実施形態では、二次切断部位（配列の’／／’を用いるマーキングされた）は、配列番号：１のアミノ酸２５４と２５５の間にある。
ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおける一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＡＱＲＳ ５
（配列番号：１２０）を含む。
ＲＡＱＲＳ ５
（配列番号：１２０）を含む。
ある実施形態では、野生型ＴＧＦＢ１を初代切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＨＲＲＡ ５
（配列番号：１２１）を含む。
ＲＨＲＲＡ ５
（配列番号：１２１）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ１５における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＲＴＲＱ ５
（配列番号：１２２）を含む。
ＲＲＴＲＱ ５
（配列番号：１２２）を含む。
ある実施形態では、野生型ＧＤＦ９における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＨＲＲＧ ５
（配列番号：１２３）を含む。
ＲＨＲＲＧ ５
（配列番号：１２３）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ２における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＥＫＲＱ ５
（配列番号：１２４）を含む。
ＲＥＫＲＱ ５
（配列番号：１２４）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ４における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＡＫＲＳ ５
（配列番号：１２５）を含む。
ＲＡＫＲＳ ５
（配列番号：１２５）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＴＴＲＳ ５
（配列番号：１２６）を含む。
ＲＴＴＲＳ ５
（配列番号：１２６）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ７における一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＳＩＲＳ ５
（配列番号：１２７）を含む。
ＲＳＩＲＳ ５
（配列番号：１２７）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ８Ｂを初代切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＴＰＲＡ ５
（配列番号：１２８）を含む。
ＲＴＰＲＡ ５
（配列番号：１２８）を含む。
ある実施形態では、野生型ＧＤＦ１５を初代切断部位の配列は、モチーフ：
ＧＲＲＲＡ ５
（配列番号：１２９）を含む。
ＧＲＲＲＡ ５
（配列番号：１２９）を含む。
ある実施形態では、野生型ＩＮＨＢＡにおける一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＲＲＲＧ ５
（配列番号：１３０）を含む。
ＲＲＲＲＧ ５
（配列番号：１３０）を含む。
ある実施形態では、フューリン切断に最適化された一次切断部位の配列は、モチーフ：
ＲＡＲＫＲＲ
（配列番号：１３１Ａ）
ＲＡＲＫＲＲＳ ７
（配列番号：１３１Ｂ）
ＲＫＫＲＲＳ ６
（配列番号：１３１Ｃ）
ＫＫＲＲＳ ５
（配列番号：１３１Ｄ）
ＲＫＫＲＲ ５
（配列番号：１３１Ｅ）
ＫＫＲＲ ４
（配列番号：１３１Ｆ）を含む。
ＲＡＲＫＲＲ
（配列番号：１３１Ａ）
ＲＡＲＫＲＲＳ ７
（配列番号：１３１Ｂ）
ＲＫＫＲＲＳ ６
（配列番号：１３１Ｃ）
ＫＫＲＲＳ ５
（配列番号：１３１Ｄ）
ＲＫＫＲＲ ５
（配列番号：１３１Ｅ）
ＫＫＲＲ ４
（配列番号：１３１Ｆ）を含む。
ある実施形態では、エンテロキナーゼ切断における一次切断部位の配列は、モチーフ：ＤＤＤＤＫＳ ６
（配列番号：１３２）
ＤＤＤＤＫ ５
（配列番号：１３２Ｂ）を含む。
（配列番号：１３２）
ＤＤＤＤＫ ５
（配列番号：１３２Ｂ）を含む。
ある実施形態では、修飾タンパク質は以下の突然変異の１つを含む：挿入または欠失（インデル）、タンパク質の野生型のバージョンに対する置換、および（例えば、糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーの野生型配列由来の）モチーフの付加。ある実施形態では、挿入または欠失は、切断認識部位内に、または切断認識部位に隣接して、置換を含む。ある実施形態では、置換は、アミノ酸モチーフ内に置換を含み、いくつかの例では、野生型タンパク質の切断認識部位内またはすぐ側に、置換を含む。ある実施形態では、突然変異は、糖鎖付加部位の挿入、または糖鎖付加部位内の置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの異なるメンバーのＮ末端基ペプチドによるＡＭＨのＮ末端基ペプチドの置換を含む。ある実施形態では、突然変異は、異なるタンパク質のシグナルペプチドによるＡＭＨのシグナルペプチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、例えば、組換え型タンパク質の純化を促進するペプチドの挿入を含む。
いくつかの例では、プロＴＧＦ－βタンパク質（ｐｒｏ－ＴＧＦ－β ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の切断を担う酵素は、ＰＣ５（ＰＣＳＫ５によりコードされる）、フューリン（ＰＣＳＫ３によりコードされる）、およびＰＡＣＥ４（ＰＣＳＫ６）などの、サブチリシン／ｋｅｘｉｎ様プロタンパク質コンベルターゼ（ＳＰＣ）のメンバーである。典型的には、これらの酵素用の認識部位は、ＲＸＸＲコンセンサスモチーフ（Ｘ＝任意のアミノ酸残基）（例えば、これは通常ＴＧＦ－βファミリーのすべてのメンバーの間で保存される）に相当する４つのアミノ酸から構成される。例えば、ＡＭＨでは、この配列はＲＡＱＲである。典型的には、切断認識部位に隣接するアミノ酸配列は、プロタンパク質切断の効率を調節する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書で記載される目的のために本明細書に記載される修飾タンパク質を投与する工程を含み、例えば、投与（および／または、投与後の修飾タンパク質のインビボでの存在）は、それぞれのＴＧＦ－βプロタンパク質の切断を促進し、および／または、生物学的に活性な形態のレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（例えば、本明細書に提供される薬剤または組成物の投与によって）それぞれのＴＧＦ－βプロタンパク質の切断を促進する、および／または生物学的に活性な形態のレベルを増加させる方法である。ある実施形態では、薬剤または組成物は、卵巣の老化を処置するべく、卵胞形成を調節する（例えば、減少させる）ために投与される。
ある実施形態では、修飾タンパク質は、切断部位に隣接して又は切断部位内などに、表１に表記された置換のうちの１つなどの、野生型タンパク質のモチーフの突然変異を含む。
ある特定の実施形態では、タンパク質の突然変異または修飾は、糖鎖付加部位の挿入（例えば、野生型ＡＭＨ配列における残基を置換する、３－４アミノ酸挿入）を含む。自然発生のＡＭＨアミノ酸配列は、Ｃ末端領域α－ヘリックスの上流にｎ－グリコシル化部位を含まない。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ８Ｂは、Ｃ末端領域（図１）におけるα－ヘリックスの上流にｎ－グリコシル化を有する。いくつかの例では、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ８Ｂにおいて見出される部位に同様のｎ－グリコシル化部位は、α－ヘリックスの上流に付加され、および／または、成熟したタンパク質の安定性（例えば、およびそれゆえに、数度）を改善する。いくつかの例では、そのような配列を有する修飾されたＡＭＨタンパク質は、より多くの安定した切断または非切断の組み換えＡＭＨを生成する。特定の実施形態では、グリコシル化部位の挿入は、ＡＭＨ野生型配列（ＰＲＹＧＮＨＶ（配列番号：１３３））における、アミノ酸５０１と５０４の間に行なわれる。いくつかの実施形態では、挿入は、ＬＮＳＳ（配列番号：１３６）、またはＭＮＡＳ（配列番号：１３７）、またはＰＮＡＳ（配列番号：１３８）、またはＰＮＳＳ（配列番号１３９）である。特定の実施形態で、グリコシル化部位の挿入が、野生型配列（ＰＲＹＧＮＨＶ（配列番号：１３３））のアミノ酸５０４と５０７の間に行なわれ、および、前記挿入はＧＮＨＴ（配列番号：１４０）である。ある実施形態では、野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ４のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列は、以下のモチーフ：
ＬＮＳＴ
（配列番号：１３４）を含む。
ＬＮＳＴ
（配列番号：１３４）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６およびＢＭＰ７のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列は、モチーフ：
ＭＮＡＴ
（配列番号：１３５）を含む。
ＭＮＡＴ
（配列番号：１３５）を含む。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ４のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列は、ＡＭＨ配列の構造および／または安定性への摂動を減少させるために修飾され、挿入される修飾配列は：
ＬＮＳＳ
（配列番号：１３６）である。
ＬＮＳＳ
（配列番号：１３６）である。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ４のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列はＡＭＨ配列構造および／または安定性への摂動を減少させるために修飾され、および、挿入される、修飾配列は：
ＭＮＡＳ
（配列番号：１３７）である。
ＭＮＡＳ
（配列番号：１３７）である。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ４のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列はＡＭＨ配列構造および／または安定性への摂動を減少させるために修飾され、および、挿入される修飾配列は：
ＰＮＡ
（配列番号：１３８）である。
ＰＮＡ
（配列番号：１３８）である。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ４のＣ末端領域におけるグリコシル化部位の配列はＡＭＨ配列構造および／または安定性への摂動を減少させるために修飾され、および、挿入される修飾配列は以下のものである：ＰＮＳＳ（配列番号：１３９）
ある実施形態では、野生型ＡＭＨにおける配列ＧＮＨＶは、グリコシル化部位を生成するために以下の配列を用いて修飾される：
ＧＮＨＴ
（配列番号：１４０）
ＧＮＨＴ
（配列番号：１４０）
ある例では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質のＰサブユニット（ＣＧＢ３遺伝子によってコード化した）の（野生型タンパク質におけるＯ連結されたオリゴ糖類で修飾される、４つのセリン残基を持つカルボキシ末端伸長）は、タンパク質のより長い半減期に寄与する。
ある例では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンをコードするＣＧＢ３の野生型の配列は：
ＣＧＢ３は、アミノ酸１４０－１６４にＣ末端伸長を有し、これは、配列番号：１４１の野生型タンパク質においてＯ連結されたオリゴ糖類で修飾される４つのセリン残基（アミノ酸１４０、１４６、１５１、および１５７）を含む。
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーの野生型配列由来などの、モチーフの付加を含む。ある実施形態では、モチーフは、アミノ酸配列ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号：１４２）などの、ヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質のカルボキシ端末ペプチドのすべてまたは部分を含む。
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーの野生型配列由来などの、モチーフの付加を含む。ある実施形態では、モチーフは、アミノ酸配列ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号：１４３）または配列ＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号：１４４）などの、リンカーの付加を伴うヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質のカルボキシ端末ペプチドのすべてまたは部分を含む。
ある実施形態では、変異は、ＡＭＨ野生型配列における第２次切断部位内またはそれに隣接する１つ以上のアミノ酸残基の修飾を含む。いくつかの実施形態では、二次切断部位は、例えば、ＡＭＨ野生型配列のアミノ酸２５４（Ｒ）と２５５（Ｓ）との間である。ある実施形態では、修飾は、異なるアミノ酸による、切断部位の前でのアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態では、修飾は、切断の前にアルギニン（Ｒ）をセリン（Ｓ）で、またはグルタミン（Ｑ）で、またはアラニン（Ａ）で、置換することを含む。
ある実施形態では、突然変異は、野生型ＡＭＨ配列のＮ末端領域（すなわち、Ｃ末端の成熟した領域を生成するためにタンパク質分解により切断される野生型ＡＭＨプロタンパク質配列内のペプチド）（例えば、配列番号１４５）の、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバー由来のＮ末端領域（すなわち、Ｃ末端の成熟領域を生成するためにタンパク分解により切断されるＴＧＦ－βスーパーファミリーの別のメンバーのプロタンパク質配列の野生型形態内のペプチド）による置き換えを含む。例えば、修飾は、野生型ＡＭＨにおけるＮ末端領域の、ＴＧＦＢ１またはＴＧＦＢ２のＮ末端領域の少なくとも一部による置き換えを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢ１またはＴＧＦＢ２のＮ末端領域におけるシグナルペプチドおよび／または切断部位は、修飾ペプチドの分泌および／または切断を改善するために、修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡのＮ末端領域の少なくとも一部による、野生型ＡＭＨにおけるＮ末端領域の置き換えを含む。
ある実施形態では、野生型ＡＭＨのＮ末端領域は以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＴＧＦＢ１のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＴＧＦＢ２のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＴＧＦＢ１のＮ末端領域は、配列：
ある実施形態では、野生型ＴＧＦＢ２のＮ末端領域は、以下の配列を生成するために、野生型シグナルペプチドをＩｇＫのシグナルペプチドに置換し、および野生型切断部位をフューリン切断に最適化された部位に置換することにより、修飾される。
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ１５のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＧＤＦ９のＮ末端領域は配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ２のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ４のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ６のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
（配列番号：１８２）
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ７のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＢＭＰ８ＢのＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＧＤＦ１５のＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＩＮＨＡのＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、野生型ＩＮＨＢＡのＮ末端領域は、以下の配列を含む：
ある実施形態では、突然変異は、ポリペプチドタンパク質タグの、ＡＭＨ野生型配列への、またはＡＭＨ修飾配列への付加を含む。ある例では、前記タグは、産生されるとすぐに、組換え型タンパク質を精製するために使用することができる。ある実施形態では、タグは、一次切断部位の後に付加される。特定の実施形態では、タグは、例えば、アミノ酸４５２（セリン、Ｓ）と４５３（アラニン、Ａ）の間に、挿入される。ある実施形態では、タグは以下のうちの１つである：Ｓｔｒｅｐ－タグ、Ｆｌａｇタグ、またはポリヒスチジンタグ。
ある実施形態では、Ｓｔｒｅｐ－タグの配列は：
ＷＳＨＰＱＦＥＫ ８
（配列番号：１５０）である。
ＷＳＨＰＱＦＥＫ ８
（配列番号：１５０）である。
ある実施形態では、ＦＬＡＧタグの配列は：
ＤＹＫＤＤＤＤＫ ８
（配列番号：１５１）である。
ＤＹＫＤＤＤＤＫ ８
（配列番号：１５１）である。
ある実施形態では、ポリヒスチジンタグの配列は：
ＨＨＨＨＨＨ ６
（配列番号：１９４）である。
ＨＨＨＨＨＨ ６
（配列番号：１９４）である。
ある実施形態では、突然変異は、異なるタンパク質のシグナルペプチドによる野生型形態のＡＭＨにおけるシグナルペプチドの置き換えを含む。特定の実施形態では、高能率で自然に分泌されるタンパク質由来のシグナルペプチドは、ペプチドが付加される変異されたタンパク質の分泌を改善する。例えば、ＡＭＨにおけるシグナルペプチドを置き換えるシグナルペプチドは以下のうちの１つでありえる：アズロジシン（ａｚｕｒｏｄｉｃｉｎ）、ＩＬ２、ＩＬ６、ＣＤ５、免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ－ＨＣ）、免疫グロブリン軽鎖（ＩｇＬＣ）、トリプシノーゲン、プロラクチン、エラスチン、ＨＭＭ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン、ＩｇＫａｐｐａ。
ある実施形態では、ポリヒスチジンＡｚｕｒｏｄｉｃｉｎの配列は：
ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬ ＡＧＬＬＡＳＳＲＡ １９
（配列番号：１５３）である。
ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬ ＡＧＬＬＡＳＳＲＡ １９
（配列番号：１５３）である。
ある実施形態では、ＩＬ２におけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩ ＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ ２０
（配列番号：１５４）である。
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩ ＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ ２０
（配列番号：１５４）である。
ある実施形態では、ＩＬ６におけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＮＳＦＳＴＳＡＦＧ ＰＶＡＦＳＬＧＬＬＬ ＶＬＰＡＡＦＰＡＰ ２９
（配列番号：１５５）である。
ＭＮＳＦＳＴＳＡＦＧ ＰＶＡＦＳＬＧＬＬＬ ＶＬＰＡＡＦＰＡＰ ２９
（配列番号：１５５）である。
ある実施形態では、ＣＤ５におけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡ ＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡ ＳＣＬＧ ２４
（配列番号：１５６）である。
ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡ ＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡ ＳＣＬＧ ２４
（配列番号：１５６）である。
ある実施形態では、Ｉｇ重鎖におけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬ ＬＡＶＴＰＧＡＨＰ １９
（配列番号：１５７）である。
ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬ ＬＡＶＴＰＧＡＨＰ １９
（配列番号：１５７）である。
ある実施形態では、Ｉｇ軽鎖におけるシグナルペプチドの配列は：ＭＡＷＳＰＬＦＬＴＬ ＩＴＨＣＡＧＳＷＡ １９
（配列番号：１５８）である。
（配列番号：１５８）である。
ある実施形態では、トリプシノーゲンにおけるシグナルペプチドの配列は：ＭＮＬＬＬＩＬＴＦＶ ＡＡＡＶＡ １５
（配列番号：１５９）である。
（配列番号：１５９）である。
ある実施形態では、プロラクチンにおけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＮＩＫＧＳＰＷＫＧ ＳＬＬＬＬＬＶＳＮＬ ＬＬＣＱＳＶＡＰ ２８
（配列番号：１６０）である。
ＭＮＩＫＧＳＰＷＫＧ ＳＬＬＬＬＬＶＳＮＬ ＬＬＣＱＳＶＡＰ ２８
（配列番号：１６０）である。
ある実施形態では、エラスチンにおけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＡＧＬＴＡＡＡＰＲ ＰＧＶＬＬＬＬＬＳＩ ＬＨＰＳＲＰ ２６
（配列番号：１６１）である。
ＭＡＧＬＴＡＡＡＰＲ ＰＧＶＬＬＬＬＬＳＩ ＬＨＰＳＲＰ ２６
（配列番号：１６１）である。
ある実施形態では、生成されるＨＭＭシグナルペプチドの配列は：
ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬ ＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷ Ａ ２１
（配列番号：１６２）である。
ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬ ＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷ Ａ ２１
（配列番号：１６２）である。
ある実施形態では、ヒトインフルエンザヘマグルチニンにおけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩ ＦＣＬＶＦＡ １６
（配列番号：１６３）である。
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩ ＦＣＬＶＦＡ １６
（配列番号：１６３）である。
ある実施形態では、ＩｇＫａｐｐａにおけるシグナルペプチドの配列は：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶ ＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ ２０
（配列番号：１６４）である。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶ ＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ ２０
（配列番号：１６４）である。
ある実施形態では、修飾タンパク質は、本明細書に記載の、および／またはさらなる他の変更などの、１つ以上の突然変異または付加を含む。他の変更は本開示の範囲内にある。例えば、本開示の修飾タンパク質は、非限定的な例として、次のうちのいずれかのアミノ酸配列含むポリペプチドが挙げられる：配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：１７２、配列番号：１７３、配列番号：１７５、配列番号：１７７、配列番号：１７９、配列番号：１８１、配列番号：１８３、配列番号：１８５、配列番号：１８７、配列番号：１８９、配列番号：１９１、配列番号：１９３、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：１９５、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４）．
いくつかの例では、修飾タンパク質は、図９にリストされた、１つ以上の修飾配列を含む。図９は、本明細書に記載された組成物の配列を含む。図９は、本明細書で提供される様々な修飾タンパク質の中にある例示的な修飾（例えば、配列）を説明する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載された任意の配列番号などの、本明細書に記載されたような、アミノ酸配列を含むポリペプチドである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、組み換えのポリペプチドまたはタンパク質である。ある実施形態では、（例えば、組み換えの）ポリペプチドには、本明細書に記載された配列との、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％あるいは少なくとも９８％の、配列同一性がある。特定の実施形態では、（例えば、組み換えの）ポリペプチドは、本明細書に記載されるような（言いかえれば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドが野生型アミノ酸配列を含まないという条件付きで、本明細書に記載されている配列同一性として、本明細書で提供されるポリペプチド）などの、野生型タンパク質の修飾タンパク質またはタンパク質変異体である。ある実施形態では、ポリペプチドまたは修飾タンパク質は、本明細書に記載されたものなどの、野生型タンパク質の機能タンパク質変異体である。特定の実施形態では、機能性タンパク質変異体は、本明細書に記載された結果を達成するのに適切な活性を有する。ある実施形態では、機能性タンパク質変異体は、野生型タンパク質の活性に少なくとも匹敵する（例えば、それらの活性の少なくとも８０％、活性の少なくとも９０％、または活性の少なくとも１００％の）活性を有する。いくつかの実施形態では、（例えば、機能性）タンパク質変異体（またはそれらの活性形態）は、野生型タンパク質の活性に少なくとも匹敵する（例えば、それらの活性の少なくとも８０％、活性少なくとも９０％、または安定性の少なくとも１００％の）安定性を有する。特定の実施形態では、（例えば、機能性）タンパク質変異体は、野生型タンパク質よりも、（例えば、本明細書に記載される、方法などの、結果の達成において）さらに活性であり、およびさらに安定しておいる（例えば、より遅いく分解する、および／または、より低いクリアランスを有する）。
ある実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載の薬剤（例えば、タンパク質変異体）の、単独での、または１つ以上の他の薬剤および／または療法と組み合わせの、投与を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、任意の適切な技術を使用するなどして、本明細書で提供される治療を必要とする女性を判定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、投与量（例えば、投与量を増加または減少）および／または処置プロトコルもしくは処方計画に対する変更は、以前の評価または他の値などと比較して、（例えば、特定された）基底胞状卵胞計数、卵胞刺激ホルモン、エストラジオール、基礎体温、および／またはＡＭＨレベルの分析などに基づいて、本明細書に記載された処置方法（例えば、投与頻度を増加または減少させる）中になされる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に記載される治療用タンパク質の投与の前および／または後などに（例えば、ベースライン値を確認するために、処置の前に、処置の結果を評価するなどのために、処置の後、または処置計画の最中に）、基底胞状卵胞計数、卵胞刺激ホルモン、エストラジオール、基礎体温、および／またはＡＭＨのレベルを評価する工程を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される薬剤（本明細書に記載の修飾タンパク質（タンパク質変異体）など）を含み、さらに、生理学的に許容可能な担体または賦形剤も含む（例えば、医薬）組成物が、本明細書において提供される。ある実施形態では、組成物は、滅菌状態である。ある実施形態では、医薬組成物は投与の特定のモードのために製剤される。
ある実施形態では、治療有効量の薬剤（例えば、本明細書で提供される修飾タンパク質）の投与を含め、必要とする女性において、卵胞形成を調節するのための、閉経および／または閉経移行期を遅らせるための、妊娠可能期間を拡張するための、ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールなどのレベルの異常（あるいは閉経または閉経移行期の）に関する疾病または障害、またはそれらに関する症状を処置するための、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、治療上有効な量の薬剤を、必要とする女性に投与することを含む。いくつかの実施形態では、必要とする女性は、ＢＡＦＣ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールが閾値の下（または上）のレベルである女性である。いくつかの実施形態では、ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールのレベルは、組織、血液、または唾液などの、任意の適切な生体試料から、または温度感知もしくは超音波の方法を通じて把握される。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬剤は、少なくとも部分的に、（１）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ全てが閾値から逸脱するか（例えば、下であるか）、および／または、（２）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールのいずれか１つ以上の確認された値がどの程度閾値から（例えば、どの程度下に又は上に）逸脱しているか、に基づく。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬剤は、少なくとも部分的に、気分、ボディマス指数（ＢＭＩ）、体重の変化、ほてり、保水、食欲、月経周期規則性、性欲、睡眠メトリクス、エネルギーレベルなど、またはそれらの１以上の任意の組み合わせに基づくなど、閉経期および／または閉経移行期に関連する１以上の特性（例えば、症状または症状評価（例えば、スコア））に基づいて、決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は：（ａ）個体の生体試料中の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＢＡＦＣ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールの生体レベル（例えば、組織、血液、唾液中の、または超音波による）を評価（例えば、判定および／またはスコアリング）する、工程；および（ｂ）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールのレベルが閾値から逸脱する（例えば、下または上である）場合など、（例えば、少なくとも部分的に、（ａ）の評価に基づいて）治療有効量の薬剤（例えば、本明細書に提供される）を個体に投与する、工程を含む。いくつかの実施形態では、投与される治療有効量の薬剤が、（１）少なくとも部分的に、個体のＦＳＨ、ＡＭＨ、ＢＡＦＣ、ＬＨ、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオールの生体レベルの評価に、および（２）少なくとも部分的に、個体の疾病の評価に、基づくなど、方法は、個体の（例えば、表現型の）疾病（例えば、閉経期または閉経移行期症状）を評価する（例えば、存在を特定するおよび／またはスコア化する）工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬剤の治療有効量の決定に関連する疾病（例えば、閉経期または閉経移行期症状）は、以下に基づくか（例えば、得点、変化、増加、または減少）である。気分、ＢＭＩ（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、体重（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、ほてり（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、水分保持（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、食欲（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、月経周期の規則性（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、性欲（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、睡眠指標（例えば、そのスコア、変化、増加、減少）、（例えば、スコア、変化、増加、又は減少）エネルギーレベル、等、又はこれらの任意の組合せを含む。
図７は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＢＡＦＣ、ＬＨ、プロゲステロン、および／またはエストラジオールの（例えば、組織、血液、または唾液中の、あるいは超音波により可視化される）生体レベル、および／または閉経期および／または閉経移行期の症状の特徴に関連するなど、種々の入力の評価を伴う方法の概要を示す図である。概要に示され、本明細書でより詳細に説明されるように、そのような方法に関連するシステムも本明細書で企図される。
本明細書で提供される医薬組成物において、任意の適切な賦形剤および／または担体は、任意選択で、（例えば、治療有効量の）薬剤（例えば、本明細書に記載の修飾タンパク質またはタンパク質変異体）と組み合わされる。いくつかの実施形態において、適切な薬学的に許容される担体は、限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、マンニトール、スクロースなどの糖類、ブドウ糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンなど、およびその組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、活性化合物と劇的に反応しない、またはその活性を妨害しない１つ以上の補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色料、香料および／または芳香物質など）を含む。いくつかの実施形態では、静脈内投与のために適している水溶性担体が使用される。いくつかの実施形態では、医薬組成物または医薬は、ある量（典型的には小さな量）の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含有している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液剤、懸濁液、乳剤、錠剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は粉末である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐剤として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準担体を含み得る。例えば、特定の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、典型的には、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。
ある実施形態では、所望または必要である場合、組成物は、注射部位の痛みを緩和するためなどの、可溶化剤および／または局所麻酔剤も含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、別々に供給されるか、又は単位剤形中に一緒に混合され得る。いくつかの実施形態では、組成物が注入によって投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本開示に従う使用のための組成物または薬剤は、任意の適切な経路によって投与される。ある実施形態では、開示の組成物の投与は、組成物の皮内注射、皮下注射、経皮的な送達、皮膚下送達、または輸血を含む。ある実施形態では、化合物の投与は、持続放出の皮下の機器による場合がある。ある実施形態では、組成物は静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は皮下に投与される。ある実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口、経鼻腔）的に投与される。所望の場合、１つを超える経路が同時に使用され得る。
ある実施形態では、組成物は、ヒト患者への送達、例えば、皮下送達システムまたは静脈内送達システム内に、あるいはそれとともに、パッケージングされる。組成物は、静脈内のバッグにおいて包含される場合がある。皮下のシステムは、持続放出のシステムであり得る。
ある実施形態では、本開示のそのような修飾タンパク質は、修飾タンパク質の組換え発現を含むが、これに限定されない、当業者に公知の任意の方法によって製造される。ある実施形態では、発現ベクター系が十分に確立され、適切な生産／精製プロトコルが十分に記載かつ検証されてきたため、この系は、本明細書に記載の組み換えタンパク質の製造のために使用される。タンパク質をコードする発現ベクターは、標準技法によって宿主細胞へトランスフェクトされる。ベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞侵入ペプチド、またはリポスフィアを使用してもよい。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外来性（例えば、宿主細胞中に天然に存在しない）外部ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に用いられる様々な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン・トランスフェクション等を包含することが意図される。いくつかの例では、組み換え型タンパク質の産生は、細菌性の生殖と発酵産生を含み、ここで目的の遺伝子をコードするプラスミドは、細菌細胞（例えば、大腸菌）（Ｅ． ｃｏｌｉ）に形質転換され、マスターとワーキングセルバンクをつくるために繁殖され、さらに、プラスミドを高収率で含む産生細胞を作製するためにバイオリアクター（例えば、発酵槽）で培養され、その後、精製および製剤安定化されるが、このとき産生細胞は溶解され、目的の遺伝子を有するプラスミドＤＮＡは、複数の精製方法によって精製され、および送達のために製剤化される。遠心分離による感染細胞の収穫、界面活性剤を溶媒とするタンパク質溶解化、続くカラムを伴う精製などが行なわれる。
特定の実施形態では、組成物の治療有効量は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、約０．０５ｍｇ／ｋｇ以上、約０．１ｍｇ／ｋｇ以上、約０．５ｍｇ／ｋｇ以上、約１． ０ｍｇ／ｋｇ以上、約１．５ｍｇ／ｋｇ以上、約２．０ｍｇ／ｋｇ以上、約２．５ｍｇ／ｋｇ以上、約５．０ｍｇ／ｋｇ以上、約７．５ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１２．５ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上である。
いくつかの実施形態では、組成物の治療有効量は一度だけの投与量として投与されるか、または定期的に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、隔月、毎月、毎月２回、３週間に１回、隔週、毎週、毎週２回、毎週３回、１日１回、投与される。
コンピューティングシステム
図８を参照すると、内蔵される命令セットが、デバイスに本開示の静的コードスケジューリングのための態様および／または方法論のいずれか１つ以上を実施または実行させるために、実行可能である、コンピュータシステム１００（例えば、処理またはコンピューティングシステム）を含む、例示的なマシンが描かれたブロック図が示されている。図８の構成要素は、例示に過ぎず、特定の実施形態を実装する、任意のハードウェア、ソフトウェア、組み込みロジック構成要素、または２つ以上のそのような構成要素の組み合わせの使用または機能性の範囲を制限するものではない。
図８を参照すると、内蔵される命令セットが、デバイスに本開示の静的コードスケジューリングのための態様および／または方法論のいずれか１つ以上を実施または実行させるために、実行可能である、コンピュータシステム１００（例えば、処理またはコンピューティングシステム）を含む、例示的なマシンが描かれたブロック図が示されている。図８の構成要素は、例示に過ぎず、特定の実施形態を実装する、任意のハードウェア、ソフトウェア、組み込みロジック構成要素、または２つ以上のそのような構成要素の組み合わせの使用または機能性の範囲を制限するものではない。
コンピュータシステム１００は、バス１４０を介して互いに、および他の構成要素と通信する、１つ以上のプロセッサ１０１、メモリ１０３、およびストレージ１０８を含んでもよい。バス１４０はまた、ディスプレイ１３２、１つ以上の入力デバイス１３３（例えば、キーパッド、キーボード、マウス、スタイラスなどを含んでもよい）、１つ以上の出力デバイス１３４、１つ以上のストレージデバイス１３５、および様々な有形記憶媒体１３６を連結してもよい。これらの要素はすべて、バス１４０に直接、または１つ以上のインターフェースやアダプタを介してインターフェースする場合がある。例えば、様々な有形の記憶媒体１３６は、ストレージ媒体インターフェース１２６経由でバス１４０とインターフェースすることができる。コンピュータシステム１００は、１つ以上の集積回路（ＩＣ）、プリント回路基板（ＰＣＢ）、モバイルハンドヘルドデバイス（携帯電話またはＰＤＡなど）、ラップトップまたはノートブックコンピュータ、分散型コンピュータシステム、コンピューティンググリッド、またはサーバーを含むがこれらに限定されない任意の適切な物理形態を有し得る。
コンピュータシステム１００は、機能を実行する１つ以上のプロセッサ（複数可）１０１（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）または汎用グラフィックス処理装置（ＧＰＧＰＵ））を含む。プロセッサ（複数可）１０１は、任意選択で、命令、データ、またはコンピュータアドレスの一時的なローカルストレージのためのキャッシュメモリユニット１０２を含む。プロセッサ（複数可）１０１は、コンピュータ可読命令の実行を支援するように構成される。コンピュータシステム１００は、プロセッサ（複数可）１０１が、メモリ１０３、ストレージ１０８、ストレージデバイス１３５、および／または記憶媒体１３６などの１つまたは複数の有形のコンピュータ可読記憶媒体で具現化された非一過性のプロセッサ実行可能命令を実行する結果として、図８に描かれた構成要素の機能性を提供し得る。コンピュータ可読媒体は、特定の実施形態を実装するソフトウェアを格納してもよく、プロセッサ（複数可）１０１は、そのソフトウェアを実行してもよい。メモリ１０３は、１つ以上の他のコンピュータ可読媒体（大容量記憶装置（複数可）１３５、１３６など）から、またはネットワークインターフェース１２０などの適切なインターフェースを介して１つ以上の他のソースからソフトウェアを読み取り得る。ソフトウェアは、プロセッサ（複数可）１０１に、本明細書で説明または例示する１つまたは複数のプロセス、または１つまたは複数のプロセスの１つまたは複数のステップを実行させ得る。そのような処理またはステップを実行することは、メモリ１０３に格納されたデータ構造を定義すること、およびソフトウェアによって指示されるようにデータ構造を修正することを含む場合がある。
メモリ１０３は、ランダムアクセスメモリ構成要素（例えば、ＲＡＭ１０４）（例えば、スタティックＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、ダイナミックＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ）、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）など）、読み取り専用メモリ構成要素（例えば、ＲＯＭ１０５）およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない種々の構成要素（例えば機械読み取り可能メディア）を含んでもよい。ＲＯＭ１０５は、プロセッサ（複数可）１０１にデータおよび命令を一方向に通信するように作用し、ＲＡＭ１０４は、プロセッサ（複数可）１０１とデータおよび命令を双方向に通信するように動作し得る。ＲＯＭ１０５およびＲＡＭ１０４は、後述する任意の適切な有形のコンピュータ可読媒体を含んでもよい。一例では、起動時などに、コンピュータシステム１００内の要素間で情報を転送するのに役立つ基本ルーチンを含む、基本入出力システム１０６（ＢＩＯＳ）が、メモリ１０３に格納され得る。
固定ストレージ１０８は、任意でストレージ制御ユニット１０７を介して、プロセッサ（複数可）１０１と双方向に接続される。固定ストレージ１０８は、追加のデータ記憶容量を提供し、また、本明細書に記載される任意の適切な有形のコンピュータ可読媒体を含み得る。ストレージ１０８は、オペレーティングシステム１０９、実行ファイル（複数可）１１０、データ１１１、アプリケーション１１２（アプリケーションプログラム）などを格納するために使用されてもよい。ストレージ１０８は、光ディスクドライブ、ソリッドステートメモリデバイス（例えば、フラッシュベースのシステム）、または上記のいずれかの組合せも含み得る。ストレージ１０８の情報は、適切な場合には、メモリ１０３の仮想メモリとして組み込んでもよい。
一例では、ストレージ装置（複数可）１３５は、ストレージ装置インターフェース１２５を介して（例えば、外部ポートコネクタ（図示せず）を介して）コンピュータシステム１００と取り外し可能にインターフェース接続され得る。特に、ストレージ装置（複数可）１３５および関連する機械可読媒体は、コンピュータシステム１００のための機械可読命令、データ構造、プログラムモジュール、および／または他のデータの不揮発性および／または揮発性ストレージを提供することができる。一例として、ソフトウェアは、完全にまたは部分的に、ストレージ装置（複数可）１３５上の機械可読媒体内に存在してもよい。別の例では、ソフトウェアは、完全にまたは部分的に、プロセッサ（複数可）１０１内に存在してもよい。
バス１４０は、種々様々のサブシステムを接続する。本明細書では、バスとは、必要に応じて、共通の機能を果たす１つまたは複数のデジタル信号線を包含し得る。バス１４０は、メモリバス、メモリコントローラ、周辺バス、ローカルバス、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用する、いくつかのタイプのバス構造のいずれでもよい。例として、また限定するものではないが、そのようなアーキテクチャには、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、拡張ＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、ビデオ電子標準協会ローカルバス（ＶＬＢ）、周辺コンポーネント相互接続（ＰＣＩ）バス、ＰＣＩ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＣＩ－Ｘ）バス、加速グラフィックスポート（ＡＧＰ）バス、ハイパートランスポート（ＨＴＸ）バス、シリアル先進技術添付（ＳＡＴＡ）バスおよびそれらの任意の組合せが含まれる。
コンピュータシステム１００はまた、入力装置１３３を含む場合がある。一例として、コンピュータシステム１００のユーザは、入力装置１３３を介してコマンドおよび／または他の情報をコンピュータシステム１００に入力し得る。入力装置（複数可）１３３の例としては、アルファ・数字入力装置（例えば、キーボード）、ポインティング装置（例えば、マウスまたはタッチパッド）、タッチパッド、タッチスクリーン、マルチタッチスクリーン、ジョイスティック、スタイラス、ゲームパッド、音声入力装置（例えば、マイク、音声応答システムなど）、光学スキャナ、ビデオまたは静止画像キャプチャ装置（例えば、カメラ）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、入力装置はＫｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐ Ｍｏｔｉｏｎなどである。入力デバイス（複数可）１３３は、シリアル、パラレル、ゲームポート、ＵＳＢ、ＦＩＲＥＷＩＲＥ、ＴＨＵＮＤＥＲＢＯＬＴ、または上記の任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な入力インターフェース１２３（例えば、入力インターフェース１２３）のいずれかを介してバス１４０にインターフェースする場合がある。
特定の実施形態では、コンピュータシステム１００がネットワーク１３０に接続されている場合、コンピュータシステム１００は、ネットワーク１３０に接続されている他のデバイス、具体的にはモバイルデバイスおよびエンタープライズシステム、分散コンピューティングシステム、クラウドストレージシステム、クラウドコンピューティングシステムなどと通信する場合がある。コンピュータシステム１００との間の通信は、ネットワークインターフェース１２０を介して送信されてもよい。例えば、ネットワークインターフェース１２０は、ネットワーク１３０から１つ以上のパケット（インターネットプロトコル（ＩＰ）パケットなど）の形態で着信通信（他のデバイスからの要求または応答など）を受信してもよく、コンピュータシステム１００は、処理のために着信通信をメモリ１０３に保存してもよい。コンピュータシステム１００は、同様に、メモリ１０３に１つ以上のパケットの形態で発信通信（他のデバイスへの要求または応答など）を格納し、ネットワークインターフェース１２０からネットワーク１３０に通信してよい。プロセッサ（複数可）１０１は、処理のためにメモリ１０３に格納されたこれらの通信パケットにアクセスしてもよい。
ネットワークインターフェース１２０の例としては、ネットワークインタフェースカード、モデム、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ネットワーク１３０またはネットワークセグメント１３０の例としては、分散コンピューティングシステム、クラウドコンピューティングシステム、広域ネットワーク（ＷＡＮ）（例えば、インターネット、企業ネットワーク）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）（例えば、オフィス、建物、キャンパスまたは他の比較的小さい地理的空間に関連するネットワーク）、電話ネットワーク、２つのコンピューティングデバイス間の直接接続、ピアツーピアネットワーク、およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ネットワーク１３０などのネットワークは、通信の有線モードおよび／または無線モードを採用してもよい。一般に、任意のネットワークトポロジーが使用されてもよい。
情報とデータはディスプレイ１３２を通じて表示することができる。ディスプレイ１３２の例としては、陰極線管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ－ＬＣＤ）、パッシブマトリクス型有機ＥＬ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリクス型有機ＥＬ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイなどの有機液晶ディスプレイ（ＯＬＥＤ）、プラズマディスプレイ、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ディスプレイ１３２は、バス１４０を介して、プロセッサ（複数可）１０１、メモリ１０３、および固定ストレージ１０８、ならびに入力デバイス（複数可）１３３などの他のデバイスにインターフェースすることができる。ディスプレイ１３２は、ビデオインターフェース１２２を介してバス１４０に連結されており、ディスプレイ１３２とバス１４０間のデータの転送は、グラフィックスコントロール１２１を介して制御され得る。いくつかの実施形態では、そのディスプレイはビデオプロジェクターである。いくつかの実施形態では、ディスプレイは、ＶＲヘッドセットなどのヘッドマウントディスプレイ（ＨＭＤ）である。さらなる実施形態では、適切なＶＲヘッドセットとしては、非限定的な例として、ＨＴＣ Ｖｉｖｅ、Ｏｃｕｌｕｓ Ｒｉｆｔ、Ｓａｍｓｕｎｇ Ｇｅａｒ ＶＲ、マイクロソフトＨｏｌｏＬｅｎｓ、Ｒａｚｅｒ ＯＳＶＲ、ＦＯＶＥ ＶＲ、Ｚｅｉｓｓ ＶＲ Ｏｎｅ、Ａｖｅｇａｎｔ Ｇｌｙｐｈ、Ｆｒｅｅｆｌｙ ＶＲヘッドセットなどが挙げられる。またさらなる実施形態において、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどの装置の組み合わせである。
ディスプレイ１３２に加えて、コンピュータシステム１００は、オーディオスピーカ、プリンタ、ストレージ装置、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の他の周辺出力デバイス１３４を含み得る。そのような周辺出力デバイスは、出力インターフェース１２４を介してバス１４０に接続されてもよい。出力インターフェース１２４の例としては、シリアルポート、パラレル接続、ＵＳＢポート、ＦＩＲＥＷＩＲＥポート、ＴＨＵＮＤＥＲＢＯＬＴポート、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、または代替的に、コンピュータシステム１００は、回路にハードワイヤードされたまたはそうでなければ具現化された論理の結果として機能性を提供してもよく、それは、ソフトウェアに代わってまたはソフトウェアと共に動作して、本明細書に説明または例示された１つまたは複数のプロセス、または１つまたは複数のプロセスの１つまたは複数のステップを実行し得る。本開示におけるソフトウェアへの言及は、論理を包含する場合があり、論理への言及は、ソフトウェアを包含する場合がある。さらに、コンピュータ可読媒体への言及は、適切な場合、実行のためのソフトウェアを格納する回路（ＩＣなど）、実行のための論理を具現化する回路、またはその両方を包含し得る。本開示は、ハードウェア、ソフトウェア、またはその両方の任意の適切な組み合わせを包含する。
当業者は、本明細書に開示された実施形態に関連して説明された様々な例示的論理ブロック、モジュール、回路、およびアルゴリズムステップは、電子ハードウェア、コンピュータソフトウェア、または両者の組み合わせとして実装され得ることを理解するであろう。ハードウェアおよびソフトウェアのこの互換性を明白に例証するために、様々な例示的なコンポーネント、ブロック、モジュール、回路、および工程が、一般にそれらの機能性の点から上に記載されてきた。
本明細書に開示される実施形態に関して記載される、様々な例示となる論理的なブロック、モジュール、および回路は、汎用プロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のプログラマブルロジック装置、ディスクリートゲートまたはトランジスタロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、あるいは本明細書に記載される機能を実行するように設計されたそれらの任意の組み合わせで実施または実行され得る。汎用プロセッサは、マイクロプロセッサであってもよいが、代案として、プロセッサは、任意の従来のプロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、または状態マシンであってもよい。プロセッサはまた、コンピューティング装置の組み合わせ、例えば、ＤＳＰとマイクロプロセッサの組み合わせ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアに関連する１以上のマイクロプロセッサ、あるいは他のそのような構成として実施され得る。
本明細書に開示された実施形態に関連して説明される方法またはアルゴリズムのステップは、ハードウェアで直接具体化されてもよく、１つ以上のプロセッサ（複数可）によって実行されるソフトウェアモジュールで、またはその２つの組み合わせで具体化されてもよい。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭメモリ、フラッシュメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、レジスター、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭに、あるいは当該技術分野で既知の記憶媒体の他の形態で存在し得る。典型的な記憶媒体は、プロセッサが、記憶媒体から情報を読み取ることができ、記憶媒体に情報を書き込むことができるように、プロセッサに接続される。代替的に、記憶媒体は、プロセッサに統合され得る。プロセッサおよび記憶媒体は、ＡＳＩＣに存在し得る。ＡＳＩＣはユーザ端末に存在することがある。代替では、プロセッサと記憶媒体は、ユーザ端末の中の独立したコンポーネントとして存在してもよい。
本明細書の記載に従って、適切なコンピューティング装置は、非限定的な例として、サーバコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノート型コンピュータ、サブノート型コンピュータ、ネットブックコンピュータ、ネットパッドコンピュータ、セットトップコンピュータ、メディアストリーミング装置、ハンドヘルドコンピュータ、インターネット家電、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、携帯情報端末、ビデオゲーム機、および伝達手段を含んでいる。当業者は、随意のコンピュータネットワーク接続を有する、選択されたテレビ、ビデオプレーヤー、およびデジタル音楽プレーヤーが、本明細書に記載されるシステムにおける使用に適していることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、適切なタブレットコンピュータは、当業者に既知のブックレット、スレート、および変換可能な構成を有するものを含む。
いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、実行命令を行うように構成されたオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、例えば、装置のハードウェアを制御し、アプリケーションの遂行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適切なサーバーオペレーティングシステムが、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、及びＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者は、適切なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、及び、ＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸのようなオペレーティングシステムを含むことを認識するであろう。いくつかの実施形態において、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者はまた、適切なモバイルスマートフォンのオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、及びＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者はまた、適切なメディアストリーミング装置のオペレーティングシステムが、限定されない例として、Ａｐｐｌｅ ＴＶ（登録商標）、Ｒｏｋｕ（登録商標）、Ｂｏｘｅｅ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ ＴＶ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｈｒｏｍｅｃａｓｔ（登録商標）、Ａｍａｚｏｎ Ｆｉｒｅ（登録商標）、及びＳａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＨｏｍｅＳｙｎｃ（登録商標）を含むことを認識する。当業者はまた、適切なビデオゲームコンソールのオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｓｏｎｙ（登録商標）ＰＳ３（登録商標）、Ｓｏｎｙ（登録商標）ＰＳ４（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｘｂｏｘ ３６０（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｘｂｏｘ Ｏｎｅ、Ｎｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）Ｗｉｉ（登録商標）、Ｎｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）Ｗｉｉ Ｕ（登録商標）、またはＯｕｙａ（登録商標）を含み得ることを認識する。
非一時的なコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、任意選択でネットワーク化されたコンピューティング装置のオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含むプログラムでエンコードされる１つ以上の非一時的なコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体を含む。さらなる実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体はコンピューティング装置の有形の構成要素である。またさらなる実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体は、コンピューティング装置から任意選択で除去可能である。いくつかの実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む分散コンピューティングシステムを含む。いくつかの場合では、プログラムと命令は媒体上で永久に、実質的に永久に、半永久に、または非一時的にエンコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、任意選択でネットワーク化されたコンピューティング装置のオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含むプログラムでエンコードされる１つ以上の非一時的なコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体を含む。さらなる実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体はコンピューティング装置の有形の構成要素である。またさらなる実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体は、コンピューティング装置から任意選択で除去可能である。いくつかの実施形態では、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む分散コンピューティングシステムを含む。いくつかの場合では、プログラムと命令は媒体上で永久に、実質的に永久に、半永久に、または非一時的にエンコードされる。
データベース
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は１つ以上のデータベース、あるいは同等物の使用を含む。本明細書に提供される本開示の点から見て、当業者は、多くのデータベースが情報（例えば、レベルまたはスコアなどの、生体または基準情報）のストレージおよび回収に適していることを認識するであろう。様々な実施形態では、適切なデータベースは、非限定的な例として、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向型データベース、オブジェクトデータベース、エンティティ関係モデルデータベース、結合性データベース、およびＸＭＬデータベースを含んでいる。さらに非限定的な例としては、ＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、ＭｙＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、ＤＢ２、およびＳｙｂａｓｅを含む。いくつかの実施形態では、データベースはインターネットベースである。さらなる実施形態では、データベースはウェブを利用したものである。またさらなる実施形態では、データベースはクラウドコンピューティングを利用したものである。特定の実施形態では、データベースは分散型データベースである。他の実施形態では、データベースは１つ以上のローカルコンピュータメモリ装置に基づいている。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は１つ以上のデータベース、あるいは同等物の使用を含む。本明細書に提供される本開示の点から見て、当業者は、多くのデータベースが情報（例えば、レベルまたはスコアなどの、生体または基準情報）のストレージおよび回収に適していることを認識するであろう。様々な実施形態では、適切なデータベースは、非限定的な例として、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向型データベース、オブジェクトデータベース、エンティティ関係モデルデータベース、結合性データベース、およびＸＭＬデータベースを含んでいる。さらに非限定的な例としては、ＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、ＭｙＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、ＤＢ２、およびＳｙｂａｓｅを含む。いくつかの実施形態では、データベースはインターネットベースである。さらなる実施形態では、データベースはウェブを利用したものである。またさらなる実施形態では、データベースはクラウドコンピューティングを利用したものである。特定の実施形態では、データベースは分散型データベースである。他の実施形態では、データベースは１つ以上のローカルコンピュータメモリ装置に基づいている。
実施例１．修飾タンパク質
表８の複数の修飾されたポリペプチド（タンパク質）を生成し、後の実験に使用する。
表８の複数の修飾されたポリペプチド（タンパク質）を生成し、後の実験に使用する。
実施例２：安定性
表８の野生型および修飾されたポリペプチド（タンパク質）を製造し、正常および加速条件の生理食塩水における安定性を含む、安定性に関して試験した。修飾タンパク質を発現させ、精製し、安定性に関して評価した。配列を発現ベクターにクローン化する（例えばｐｃＤＮＡ３．４）。構築物を哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞）に形質転換し、文献（Ｐａｐａｋｏｓｔａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２０１０ Ｍａｒｃｈ； ７０（１）： ３２－３８）に従って、安定した細胞株を１４日間生成する。
表８の野生型および修飾されたポリペプチド（タンパク質）を製造し、正常および加速条件の生理食塩水における安定性を含む、安定性に関して試験した。修飾タンパク質を発現させ、精製し、安定性に関して評価した。配列を発現ベクターにクローン化する（例えばｐｃＤＮＡ３．４）。構築物を哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞）に形質転換し、文献（Ｐａｐａｋｏｓｔａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２０１０ Ｍａｒｃｈ； ７０（１）： ３２－３８）に従って、安定した細胞株を１４日間生成する。
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞については、以下の手順を使用してタンパク質を生成する。簡潔に言えば、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）培養物を、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で、６×１０６の生存細胞／ｍＬの最終密度に希釈し、あらかじめ３７°Ｃに温めた。フラスコを優しく回流し、細胞を混合する。その後、下に述べられるように、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を冷たい試薬（４°Ｃ）を使用して調製する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯの試薬びんを優しく反転する。４－５回混合する。（２０ｕｌ－６００ｕｌの体積における）プラスミドＤＮＡを、１ｍＬ－３０ｍＬの冷たいＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈する。管を回流および／または反転することで混合する。形質転換するために、使用されるＤＮＡ量は、１ｍＬの培養体積当たり、０．５ｕｇ－１．０ｕｇのプラスミドＤＮＡである。８０ｕＬ－２４００ｕＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、９２０ｕｌ－２８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、管を回流および／または反転あるいは２－３回優しく分注することにより混合する。希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、希釈したＤＮＡに付加する。管を回流または反転より混合する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体（上記の）を、室温で１－５分間インキュベートし、その後、付加中にフラスコを優しく回流しながら、工程４の培養フラスコに溶液をゆっくりと移す。オービタルシェーカー上で、空気中ＣＯ２が８％ある湿気のある環境の３７°Ｃのインキュベータで、細胞を培養する。
培養の１日後、１５０ｕＬ－４５００ｕＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサーおよび６ｍＬ－１８０ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィードを、付加中にフラスコを優しく回流させながら付加する。培養フラスコを振盪させながら、ＣＯ２が８％ある湿気のある環境の３７°Ｃのインキュベータに返す。その後、形質転換の８－１４日後、タンパク質を収穫する。
安定性のための各構築物の発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、および小規模精製によって分析する。タンパク質を硫酸アンモニウムの沈殿物を使用して精製し、不要なタンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウムを付加して、カット（例えば、２０－３０％）を分離する。硫酸アンモニウム粉末をタンパク質にゆっくり付加し、その後、４°Ｃで３０分間混合したままにする。その後、サンプルを遠心沈殿させ、回復した上澄みは目的のタンパク質を含有する。その後、上澄みをイオン交換（ＩＥＸ）カラムに投入し、タンパク質を洗浄し、塩勾配に続き小麦麦芽の親和性樹脂で溶出する。タグを含有するタンパク質（例えばｓｔｒｅｐタグ、ｆｌａｇタグ）を、適切なアフィニティカラム、例えば、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎカラムまたは抗ＦＬＡＧ抗体で精製する。修飾タンパク質の発現と精製に続いて、各タンパク質は、業界標準の技術を使用する熱応力による凝集の測定の対象である。アナログの品質を以下の方法に従って決定する。ＳＥＣ（ＭＡＬＳ）、減少したおよび減少していないＳＤＳ－ＰＡＧＥ、全質量分析、ＰＢＳにおける安定性、４°Ｃと４０°Ｃを最大１か月間比較し、ＳＥＣによる多量体化、凍結／解凍の安定性と溶解性を評価する。インビトロの効能、有効性、および安定性のためのアッセイを含む実験のために、大規模タンパク質発現を生成された修飾タンパク質に使用する。
実施例３：有効性
表７の野生型および安定した修飾されたポリペプチド（タンパク質）（例１の）の効果について評価する。
表７の野生型および安定した修飾されたポリペプチド（タンパク質）（例１の）の効果について評価する。
特異的に、ＡＭＨＲ２を介して修飾タンパク質の活性に応答するため、修飾タンパク質の有効性の読み取りである細胞であるＡＭＨＲ２（ヒト細胞株、例えば、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８、およびマウス細胞株、例えば、ＭＯＶＣＡＲ５００９）を発現する、上皮の卵巣癌の細胞株を使用して、修飾タンパク質のインビトロの効能を評価する。ＸＴＴ増殖アッセイを使用して、修飾タンパク質を用いた７２時間の処置後、増殖の阻害のための活性によって、タンパク質の有効性を分析する。Ｃａｓｐａｓｅ Ｇｌｏ ３／７ のアポトーシスアッセイを使用して、修飾タンパク質を用いた４８時間および７２時間の処置で、アポトーシスの刺激のための活性によって、タンパク質の有効性を分析する。ＳＣＦのためのプライマーを使用するＴａｑＭａｎ ｒｔ－ｑＰＣＲを使用することによって、修飾タンパク質を用いた４８時間および７２時間の処置で、幹細胞因子（ＳＣＦ）の発現によって、タンパク質の有効性を分析する。
インビボの薬物動態学をさらに実施する。２つの投与経路（ｉ．ｐとｓ．ｃ．）を、投与後１、２、４、７、および２４時間で、採取した血漿を順次評価した。ＡＭＨアナログの血漿レベルを、ＥＬＩＳＡによって評価し、半減期、Ｃｍａｘ、およびＴｍａｘを含む薬物動態パラメータを決定するために使用する。修飾タンパク質をさらに、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｍａｄ活性化アッセイを使用して、エクスビボエンゲージメントに関して試験した。
インビボの卵巣の卵胞形成／老化のマウスモデルを、野生型および修飾タンパク質の効果を分析するために利用する。野生型および修飾タンパク質を使用して、卵胞形成の抑制の効果および時間的経過を確立する。時点：２、４、６週間。追加の定量的評価として、組織学および血漿エストラジオール（Ｅ２）レベルの評価を使用して、卵巣および卵胞の段階の定量的評価を行う。
インビボの卵巣の化学毒性のマウスモデルをさらに、野生型および修飾タンパク質の効果をさらに分析するために利用する。１５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．のシクロホスファミドの単一高投与量を用いるプロトコルに続いて、卵巣の毒性を引き起こす化学療法（例えばシクロホスファミド）の確立された投与量レベルを使用する。８日間毎日投与する化学療法の１日前に開始する修飾タンパク質を用いる処置の効果を分析する。化学療法投与の１週間後の嚢マウスであり、追加の定量的評価として、組織学および血漿エストラジオール（Ｅ２）レベルの評価を使用して、卵巣の定量的評価を行う。４週間の間に週に１回の投与を用いるプロトコルに続いて、卵巣の毒性を引き起こす化学療法（例えばシクロホスファミド）の確立された投与量レベルを使用することによって、慢性効果を研究した。４週間の毎日の投与を使用する修飾タンパク質を用いた処置の効果を分析する。化学療法の開始後２８日目の嚢マウスであり、追加の定量的評価として、組織学および血漿エストラジオール（Ｅ２）レベルの評価を使用して、卵巣の定量的評価を行う。化学療法の開始前０、１、２、３、４週間前の処置を用いる野生型および修飾タンパク質を用いる処置、および化学療法の投与にわたる処置の効果を分析する。処置後１週間の嚢であり、組織学を使用して卵巣の定量的評価を行う。化学療法による処置中の発情周期を評価する。化学療法中止の８週間後に交配を行い、産子数と最初の出産までの時間を評価する。化学療法中止の２０週間後に、排卵誘発プロトコル、嚢を使用し、回収した卵母細胞の数を定量化する。
Claims (82)
- 配列番号：１を有する野生型抗ミュラー管ホルモンの修飾されたタンパク質であって、前記修飾されたタンパク質は、
ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８～４５２での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳを含む、置換あるいは挿入、
ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間のグリコシル化部位の挿入、
ｃ）ＴＧＦ－βファミリータンパク質のＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、
ｄ）配列番号：１のアミノ酸位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換、
ｅ）ＡＭＨ内のペプチドタグの付加、
ｆ）糖タンパク質のモチーフの付加、および
ｇ）ＡＭＨのＮ末端領域の欠失およびＡＭＨのＣ末端での修飾あるいはタンパク質配列の挿入、からなる群から選択される少なくとも２つの修飾を含む、修飾されたタンパク質。 - モチーフＲＡＱＲＳ内の前記置換は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する異なるタンパク質の前記切断認識部位、または異なるプロアテーゼによって認識のために最適化された切断部位と、ＲＡＱＲＳを置き換えることを含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、
ａ．アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、
ｂ．ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換、
ｃ．アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０でのグルタミン（Ｑ）の残基の置換、
ｄ．リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、
ｅ．アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２でのセリン（Ｓ）の残基の置換、および
ｆ．位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入からなる群から選択される、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。 - 前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０での前記グルタミン（Ｑ）の残基の置換である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２での前記セリン（Ｓ）の残基の置換である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５０での前記グルタミン（Ｑ）の残基の置換、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、またはリジン（Ｋ）を用いる位置４５２での前記セリン（Ｓ）の残基の置換、および位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、
ａ．ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、
ｂ．アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、
ｃ．セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、
ｄ．セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、
ｅ．アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換、からなる群から選択される置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。 - 前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１での前記プロリン（Ｐ）の残基の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびアスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換、を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、Ｃ末端領域の４つのアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記Ｃ末端領域の前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＰＮＡＳ、ＰＮＳＳ、ＬＮＳＳ、ＭＮＡＳ、またはＧＮＨＴを用いるＰＲＹＧの置換を含む、請求項１８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記Ｃ末端領域の前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＧＮＨＴを用いるＧＮＨＶの置換を含む、請求項１８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ＴＧＦ－βファミリータンパク質は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡからなる群から選択される、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に応じた配列を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に応じた配列を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、分泌または前記切断を改善するために修飾される、請求項２１～２５のいずれか１つに記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記修飾されたＮ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記修飾されたＮ末端領域は、配列番号：８０、８１、１４８、または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の修飾されたタンパク質。
- 非ＡＭＨシグナルペプチドを用いるＡＭＨのシグナルペプチドの置換をさらに含む、
請求項１に記載の修飾されたタンパク質。 - 前記非ＡＭＨシグナルペプチドは、アズロシジン、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＣＤ５、免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ－ＨＣ）、免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ－ＬＣ）、トリプシノゲン、プロラクチン、エラスチン、ＨＭＭ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン、またはＩｇＫａｐｐａに由来する、請求項２８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ペプチドタグはＳｔｒｅｐ－タグ、Ｆｌａｇタグ、またはポリヒスチジンタグである、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは少なくとも１つのセリン（Ｓ）の残基の付加を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは１～６のセリン（Ｓ）の残基の付加を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記糖タンパク質の前記モチーフはヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質に由来する、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記糖タンパク質の前記モチーフはＣＧＢ３タンパク質に由来する、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、またはＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項３４に記載の修飾されたタンパク質。
- アミノ酸位置２５４でのアルギニン（Ｒ）はセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、またはアラニン（Ａ）で置換される、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ＡＭＨの前記Ｎ末端領域の前記欠失および前記ＡＭＨのＣ末端での前記挿入は、ｈＣＧまたはＦｃ ＩｇＧ１重鎖定常領域のＣＴＰの挿入を含む、請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
- 配列番号：１を有する野生型抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）タンパク質の修飾されたタンパク質であって、前記修飾されたタンパク質は、
ａ）配列番号：１のアミノ酸位置４４８、４４９、または４５１での切断認識部位内またはそれに隣接する置換あるいは挿入であって、ここで前記切断認識部位が配列ＲＡＱＲＳを含む、置換あるいは挿入、
ｂ）配列ＰＲＹＧを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０１と５０４との間、あるいは配列ＧＮＨＶを有する配列番号：１のアミノ酸位置５０４と５０７との間のグリコシル化部位の挿入、
ｃ）ＴＧＦ－βファミリータンパク質のＮ末端領域を用いるＡＭＨにおけるＮ末端領域の置換、
ｄ）配列番号：１のアミノ酸位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換、
ｅ）ＡＭＨ配列内のペプチドタグの付加、
ｆ）糖タンパク質のモチーフの付加、および
ｇ）ＡＭＨのＮ末端領域の欠失およびＡＭＨのＣ末端での修飾あるいはタンパク質配列の挿入、からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む。 - 前記置換または挿入は、
ａ）アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、
ｂ）ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９でのアラニン（Ａ）の残基の置換、
ｃ）リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、および
ｄ）位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入からなる群から選択される、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。 - 前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換である、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換である、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記置換または挿入は、アスパルテート（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）を用いる位置４４８での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４４９での前記アラニン（Ａ）の残基の置換、リジン（Ｋ）またはアスパルテート（Ｄ）を用いる位置４５１での前記アルギニン（Ｒ）の残基の置換、および位置４５２の後のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）の残基の挿入である、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、
ａ．ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、
ｂ．アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、
ｃ．セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、
ｄ．セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、
ｅ．アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換、からなる群から選択される置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。 - 前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１での前記プロリン（Ｐ）の残基の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を用いる位置５０１でのプロリン（Ｐ）の残基の置換、アスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０２でのアルギニン（Ｒ）の残基の置換、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を用いる位置５０３でのチロシン（Ｙ）の置換、セリン（Ｓ）を用いる位置５０４でのグリシン（Ｇ）の置換、およびアスパラギン（Ｎ）を用いる位置５０７でのバリン（Ｖ）の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記グリコシル化部位の前記挿入は、Ｃ末端領域の４つのアミノ酸の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記Ｃ末端領域の前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＰＮＡＳ、ＰＮＳＳ、ＬＮＳＳ、ＭＮＡＳ、またはＧＮＨＴを用いるＰＲＹＧの置換を含む、請求項５１に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記Ｃ末端領域の前記４つのアミノ酸の前記置換は、ＧＮＨＴを用いるＧＮＨＶの置換を含む、請求項４６に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ＴＧＦ－βファミリータンパク質は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１５、ＩＮＨＡ、またはＩＮＨＢＡからなる群から選択される、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４６に応じた配列を含む、請求項５４に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、配列番号：１４７に応じた配列を含む、請求項５４に記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記Ｎ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記Ｎ末端領域は、分泌または前記切断を改善するために修飾される、請求項５６～５８のいずれか１つに記載の修飾されたタンパク質。
- ＴＧＦ－β１の前記修飾されたＮ末端領域またはＴＧＦ－β２の前記修飾されたＮ末端領域は、配列番号：８０、８１、１４８、または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５９に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ペプチドタグはＳｔｒｅｐ－タグ、Ｆｌａｇタグ、またはポリヒスチジンタグである、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは少なくとも１つのセリン（Ｓ）の残基の付加を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは１～６のセリン（Ｓ）の残基の付加を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記糖タンパク質の前記モチーフはヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質に由来する、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記糖タンパク質の前記モチーフはＣＧＢ３タンパク質に由来する、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記モチーフは、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、またはＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項６５に記載の修飾されたタンパク質。
- 前記ＡＭＨタンパク質の前記修飾形態は、さらに、配列番号：１のアミノ酸位置２５４－２５５での二塩基の切断部位内の置換を含む、請求項３８に記載の修飾されたタンパク質。
- アミノ酸位置２５４でのアルギニン（Ｒ）はセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、またはアラニン（Ａ）で置換される、請求項６７に記載の修飾されたタンパク質。
- 卵巣の老化を処置するために卵胞形成を調節する方法であって、前記方法は、請求項１～６８のいずれか１つに記載の修飾されたタンパク質を投与する工程を含む、方法。
- 前記投与する工程は、前記修飾されたタンパク質の皮内注射、皮下注射、経皮送達、皮下送達、または輸血を含む、請求項６９に記載の方法。
- 前記投与する工程は徐放性皮下装置の投与を含む、請求項６９に記載の方法。
- 前記修飾されたタンパク質はベクターで発現される、請求項６９に記載の方法。
- 前記ベクターは微生物ベクターである、請求項７２に記載の方法。
- 基底胞状卵胞の数、卵胞の刺激ホルモンレベル、および／または抗ミュラー管ホルモンレベルを評価する工程、および前記評価する工程の少なくとも部分的に基づいて、投与される組成物の用量を決定する工程をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
- 前記修飾されたタンパク質は毎日投与される、請求項６９に記載の方法。
- 投与される用量は約０．５ｍｇ～約１．０ｍｇである、請求項７５に記載の方法。
- 投与される前記修飾されたタンパク質の量は、患者において卵巣の老化を処置する、閉経を遅らせる、および／または閉経症状を緩和するには十分である、請求項６９に記載の方法。
- 投与される前記修飾されたタンパク質の量は、（ｉ）ＢＡＦＣ、ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、および／またはエストラジオールの１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つのすべてが閾値から逸脱するかどうか、（ｉｉ）ＦＳＨ、ＡＭＨ、ＬＨ、プロゲステロン、および／またはエストラジオールの任意の１つ以上の確認されたレベルが閾値からどれほど逸脱するか、またはそれらの組み合わせに基づいて決定される、請求項７７に記載の方法。
- 投与される前記修飾されたタンパク質の量は、閉経および／または閉経移行期に関連する１つ以上の特性の評価によって決定される、請求項７７に記載の方法。
- 閉経および／または閉経移行期に関連する前記１つ以上の特性は、気分の変化、肥満度指数（ＢＭＩ）の変化、体重の変化、保水の変化、食欲の変化、ほてりの変化、月経周期の規則性の変化、性衝動の変化、睡眠メトリックの変化、エネルギーレベルの変化、またはそれらの１つ以上の任意の組み合わせである、請求項７９に記載の方法。
- 生物サンプル中の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＢＡＦＣ、黄体ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、基礎体温、および／またはエストラジオール値を評価する工程をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
- 前記サンプルは組織、血液、唾液、尿、または月経液である、請求項８１に記載の方法。
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