CN115287252A - 一种气单胞菌属菌株及其在免疫调节中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无菌斑马鱼模型构建方法。构建获得的无菌斑马鱼具有用于筛选出对机体造血及免疫有活性功能的肠道微生物的用途。筛选获得的活性肠道微生物能够用于造血系统、免疫系统功能调节，具体地，可用于自闭症患者肠道和造血功能调节。本发明具体公开了一株命名为b1‑3的Aero.veronii菌株及其应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种气单胞菌属菌株及其在免疫调节中的应用。
背景技术
动物是机体自身与菌群共同构成的生态系统，越来越多的证据表明，健康的菌群对于其宿主的正常发育有着重要的影响。人体每毫升胃肠道内容物中有大概1014的微生物，涵盖了超过5000个菌种。已有研究证明肠道菌群的组成与机体免疫、过敏性疾病、肠道炎症、肿瘤、糖尿病、心血管疾病和血脂障碍症有关，具体相互作用机制仍有待深入研究。
无菌动物模型的建立与应用，为研究菌群与宿主发育的关联提供了更有力的途径。通过无菌动物、限菌动物(接种特定菌种的动物)与常规饲养动物的比较，可以评估特定细菌对于宿主发育、生理功能、免疫等方面的影响，无菌动物模型已成为研究菌群对宿主功能影响的重要工具。
相较传统上使用的无菌小鼠模型，斑马鱼有着体积小，更易大量获得，便于快速大规模培养，且分子、细胞、组织水平上与哺乳动高度相似等优势。从药物研发的角度来看，寻找对免疫具有调节作用的细菌，以通过调节肠道菌群实现改善机体免疫异常低下或亢进的作用，具有潜在的应用意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种无菌斑马鱼模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)成年雌雄斑马鱼交配，收集受精卵；2)在含抗生素的胚胎培养液中进行受精卵培养；3)胚胎进行消毒剂浸泡和/或漂白液浸泡处理；4)胚胎无菌性检测。
进一步地，所述抗生物选择氨苄西林、卡那霉素和两性霉素B；所述消毒剂为PVP-I及次氯酸钠(NaClO)。
进一步地，所述氨苄西林用量为100ng/mL，卡那霉素用量为 5mg/mL，两性霉素B用量为250ng/mL。
进一步地，所述胚胎培养液为ABEM。
进一步地，所述PVP-I使用浓度为0.1％，浸泡时长两分钟左右；所述次氯酸钠漂白液浓度为0.003％，浸泡时长20分钟左右。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述构建方法获得的无菌斑马鱼模型在药物筛选中的应用。
进一步的，所述药物为能够调节造血系统、免疫系统功能的肠道微生物。
进一步地，所述肠道微生物能够调节斑马鱼、人、以及其他动物的造血系统和/或免疫系统功能。
进一步地，所述所述药物能够调节自闭症患者肠道及造血功能异常。
本发明第三方面提供了一种药物筛选方法，其特征在于，包括在无菌斑马鱼中定植野生斑马鱼肠道菌群以筛选对造血系统、免疫系统具有调节作用的肠道微生物。
进一步地，所述无菌斑马鱼通过本发明第一方面所述的方法获得。
本发明第四方面提供了由本发明第三方面所述的筛选方法筛选获得的肠道微生物。
本发明第五方面提供了一种维氏气单胞菌Aeromonas veronii(Aero. Veronii)菌株，命名为b1-3，已于2022年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.24443。
本发明第六方面提供了本发明第四方面所述的肠道微生物或本发明第五方面所述的Aero.Veronii菌株b1-3在制备用于造血系统、免疫系统功能调节的药物中的应用；优选地，制备用于自闭症患者造血系统、免疫系统调剂的药物。
本发明的有益效果是：
1)本发明提供的一种无菌斑马鱼模型构建方法，相对于小鼠模型构建方法具有更加方便、快捷，易于大规模筛选的特点。较细胞培养方法更具系统性，结果更能反应机体复杂环境的真实情况的特点。
2)利用上本发明构建的无菌斑马鱼模型，结合原位杂交的方法考察造血干细胞及淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞的表达数量，能够实现大规模筛选对造血系统、免疫系统具有活性的肠道微生物的目的；本发明的无菌模型有利于进一步从分子机制层面上研究肠道菌群对机体造血系统发育及免疫调控作用的机理。
3)本发明筛选出了对造血干细胞及免疫具有调节作用的菌株 Aeromonasveronii b1-3，可通过将其定植到斑马鱼胚胎肠道中改善肠道微环境，以降低自闭症斑马鱼机体异常增高的免疫、炎症状态，并最终恢复该自闭症鱼体的造血干细胞、免疫细胞的异常，具有潜在的改善自闭症患者肠道及造血功能异常的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1常规(CV)和无菌饲养(GF)环境下斑马鱼造血干细胞(cmyb)、淋巴细胞(rag1)、中性粒细胞(mpx)、粒细胞(L-plastin)的表达情况。
图1A显示cmyb表达差异，图1B显示rag1、mpx、L-plastin表达差异。
图2常规饲养(CV)、无菌饲养(GF)及无菌再重新接种细菌(CONV，conventionalized)的胚胎髓系前体细胞的数量。
图3不同肠道菌株对无菌斑马鱼胚胎造血干细胞的作用。
图4 Aeromonas 1菌株对无菌斑马鱼胚胎中性粒细胞的作用。
图5 Aeromonas veronii strain b1-3菌株全基因组测序结果。
图6原位杂交技术检测肠道菌群处理对chd8-/-斑马鱼、野生型斑马鱼中造血干细胞(cmyb)水平的影响。
图7原位杂交技术检测肠道菌群处理对chd8-/-斑马鱼、野生型斑马鱼中中性粒细胞(mpx)水平的影响。
图8 Aero.veronii strain b1-3菌株对自闭症斑马鱼模型中造血干细胞水平的影响。
图9 Aero.veronii strain b1-3菌株对自闭症斑马鱼模型中中性粒细胞水平的影响。
图10 Aero.veronii strain b1-3菌株对自闭症斑马鱼模型中促炎因子肿瘤坏死因子(TNFα)水平的影响。
具体实施方式
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明中所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，“3dpf”指受精后三天，“5dpf”指受精后五天。
实施例1无菌斑马鱼模型构建及其功能检测
1.1无菌斑马鱼模型构建
无菌斑马鱼胚胎模型构建方法为：将成熟斑马鱼按雌：雄2:1的数量比放入产卵缸内，次日晨拿掉隔板，使成年雌雄斑马鱼交配产卵，1h 后收集受精卵，转移至含抗生素(氨苄西林(100μg/mL)、卡那霉素 (5μg/mL)和两性霉素B(250ng/mL))的胚胎培养液(具体配置方法见下文)中，放入28.5℃培养箱培养。每间隔2h筛选健康的胚胎至新的装有抗生素胚胎培养液培养皿中，孵育4-6h后转移至生物安全柜。胚胎用无菌胚胎培养液洗涤3次，浸入0.1％PVP-I溶液(Adamas，42099A) 2min，无菌胚胎培养液洗涤3次，0.003％漂白液(Aladdin，S101636) 浸泡20min后，无菌胚胎培养液再次洗涤3次，筛选健康胚胎转移至装有20ml无菌胚胎培养液的组织培养瓶中，每瓶20个胚胎，28.5℃培养箱培养。
受精后3天(3dpf)的胚胎，移液枪头吹打机械脱壳，取500μl培养液加入LB液体培养基中，28.5℃过夜培养以检测胚胎的无菌性。无菌胚胎培养液配制：
储备液A：250mL去离子水(ddH2O)，20g NaCl(国药，10019318)， 1g KCl(国药，10016308)；
储备液B：100mL ddH2O,0.358g无水Na2HPO4(国药，20040690),0.6g KH2PO4(泰坦Greagent，G82821B)；
储备液C：250mL ddH2O,4.68g CaCl2·2H2O(Adamas，10224A)；
储备液D：250mL ddH2O,6.15g MgSO4·7H2O(国药，M110776)；
储备液E：250mL ddH2O,8.75g NaHCO3(国药，10018990)
胚胎培养液工作液配置：5L ddH2O中加入50mL储备液A，5mL储备液 B，50mL储备液C，50mL储备液D，50mL储备液E，盐酸(国药，53100277) 调节pH至7.2。配好的胚胎培养液用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌即得到无菌胚胎培养液。
含抗生素的胚胎培养液配制：
500mL胚胎培养液中，加入500mL浓度为100mg/mL氨苄西林(国药， XW00695342)储备液(终浓度100mg/mL)，50mL浓度为50mg/mL卡那霉素(阿拉丁，K103024)储备液(终浓度5mg/mL)，15.6mL二甲亚砜(Adamas，75927N)配置的浓度为8mg/mL两性霉素B(阿拉丁，A105482)储备液(终浓度250ng/mL)。
1.2原位杂交检测无菌斑马鱼的造血干细胞、免疫细胞水平
4％的多聚甲醛(PFA)(Adamas，46556B)固定3dpf、5dpf及6dpf 的胚胎，固定后的胚胎经漂白、脱水处理后，通过原位杂交方法(Thisse and Thisse,Nat Protoc 3(1):59-69,2008)，以c-myb(髓系祖细胞，可反应造血干细胞数量)(Mahony,Fish et al.Blood 128(10):1336-1345,2016)、 rag1(淋巴祖细胞)(Xue,Liu et al.Cell Rep 27(5):1567-1578.e1565,2019)、 L-plastin(粒细胞)(Mahony,Fish et al.Blood 128(10):1336-1345,2016)、 mpx(中性粒细胞)(Cai,Wang et al.Cance Science,112(9):3884-3894，2021)为标记分子，对比常规饲养(CV)、无菌饲养(GF)的胚胎不同血液细胞数量。结果如图1A和图1B所示，可以看出：无菌处理后，缺乏肠道共生微生物的胚胎(GF)的造血干细胞(cmyb)、淋巴细胞(rag1)、中性粒细胞(mpx)、粒细胞(L-plastin，中性粒细胞和巨噬细胞)数量都明显低于正常培养的斑马鱼胚胎。
实施例2无菌斑马鱼的肠道微生物重植
向根据实施例1所述的方法获得的3dpf的无菌斑马鱼胚胎(培养液中，加入未做无菌处理常规培养胚胎的培养液，使无胚胎重新获得正常发育阶段的肠道微生物，固定5dpf的胚胎，以c-myb(髓系祖细胞菌) 为标记分子，对比常规饲养(CV)、无菌饲养(GF)及无菌再重新接种细菌(CONV，conventionalized)的胚胎髓系前体细胞的数量，可反应肠道微生物对造血干细胞的重要性。结果如图2所示，可见，给无菌的胚胎重新接种回肠道共生菌群后，可恢复无菌胚胎的造血干细胞数量。
实施例3斑马鱼的肠道菌群分离及筛选
取成年的野生型斑马鱼，放入含0.016％三卡因(梯希爱，T0941) 的溶液中麻醉，无菌条件下显微镜下解剖取出斑马鱼完整的肠道组织，玻璃研磨棒充分研磨破碎肠道组织，破碎后的组织加入500μl无菌生理盐水重悬，依次10倍梯度稀释至10-6。每个稀释度取100μl涂布于LB 琼脂培养基(生工生物，B530111)培养皿上，培养皿28.5℃培养约48h，挑取培养板上不同形态的单菌落，菌落扩增后20％甘油(Adamas， 66258C)冻存于-20℃待分析。经16s rRNA基因全长测序后，NCBI数据库比对，去掉重复的菌株，共得到31株共10个菌属的不同菌株。10 个菌属为不动菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、克雷白氏杆菌菌属(Klebsiella)、微杆菌属 (Microbacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、毗邻单胞菌属 (Plesiomona)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)。
实施例4斑马鱼肠道特定菌株的作用验证
向3dpf的无菌斑马鱼胚胎(具体方法见实施例1)培养液中，加入 104cfu/ml某特定的菌株的菌液培养，PFA固定5dpf的胚胎，样本经漂白、脱水处理后，以c-myb为标记分子进行原位杂交，检测特定菌株对造血干细胞的发育的影响。通过前述的模型方法，筛选我们从斑马鱼肠道中分离的细菌，由结果可看到，有的菌株对无菌斑马鱼胚胎有促进作用，有的菌株则没有促进作用(图3)。
另外，5dpf的胚胎样品，经以mpx为标记分析进行原位杂交，结果可见Aeromonas 1虽对造血干细胞没有促进作用，但增加中性粒细胞表达(图4)。对Aero.1进行全基因组测序，以进行更深入的菌种鉴定及功能基因分析(图5)。据全基因组测序结果，Aero.1为Aero.Veronii，菌株编号b1-3。Aero.Veronii b1-3菌株已于2022年02月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24443。实施例5正常的斑马鱼肠道菌群对无菌处理后自闭症斑马鱼模型 (chd8-/-)的作用探究
5.1chd8-/-自闭症斑马鱼模型的构建及无菌处理
利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼chd8基因敲除品系，sgRNA序列为：5’-GGTGTGTCTGCTTCAGGATG AGG-3’，位于chd8基因的第 12号外显子。将该序列连接入pDR274(Addgene plasmid#42250)质粒中，得到的质粒pDR274-chd8-sgRNA，然后经HindIII-HF(NEB,R3104S) 线性化，MAXIscriptTM T7转录酶(Ambion,AM1312)转录得到chd8 sgRNA。将chd8 sgRNA及Cas9 mRNA一起注射到单细胞状态下的斑马鱼胚胎中，胚胎长至2～3个月大时，切取部分尾鳍组织，提取DNA用 T7E1试剂盒(NEB,M0302S)鉴定筛选出突变的斑马鱼(Babon,McKenzie et al.Methods Mol Biol 152:187-199，2000)。进一步测序鉴定，得到一个5个bp缺失的突变 (5’-gactatgtatatgtggtgtgtctgcttcagGATGAGGAACCTTTCAATCCAGATTA TGTGGAAGTTGATCGTATTTTGGACGAGTCACATAGTGTTGATAAA GACAACGGGGAGgtagg-3’,下划线标记碱基为删除掉的碱基)。
无菌的chd8-/-斑马鱼胚胎模型的建立方法，同实施例1.1野生型无菌斑马鱼胚胎模型的建立。
5.2肠道菌群处理自闭症斑马鱼模型
通过原位杂交技术检测肠道菌群处理对chd8-/-斑马鱼、野生型斑马鱼中造血干细胞(cmyb)、中性粒细胞(mpx)水平的影响。结果表明(图 6和图7)，常规环境培养下，chd8突变(chd8-/-)鱼系相比野生型(WT) 鱼系的造血干细胞(cmyb)数量减少，中性粒细胞(mpx)数量明显增多。而经无菌处理后，再重新接种来自野生型斑马鱼培养液中的微生物群，可以使chd8-/-突变胚胎造血干细胞数量增加，中性粒细胞数量降低，向正常状态靠近。
实施例6 Aero.Veronii b1-3对自闭症斑马鱼模型的功能探究
向3dpf的chd8基因突变的自闭症斑马鱼胚胎培养液中加入菌液 Aero.1(Aero.veronii strain b1-3)，5dpf时原位杂交检测斑马鱼尾部 (CHT)部位造血干细胞数量，从结果可见Aero.veronii strain b1-3可增加chd8-/-造血干细胞数量(图8)。
采用q-PCR请检测7dpf时胚胎全身的中性粒细胞基因(mpx，引物 F：5’-TCCAAAGCTATGTGGGATGTGA-3’，引物R：5’- GTCGTCCGGCAAAACTGAA-3’)表达水平，由结果可见自闭症斑马鱼胚胎正常情况下，由于疾病使机体处于的高炎症状态，中性粒细胞水平相比野生型斑马鱼异常增高。无菌处理chd8-/-胚胎可降低mpx表达水平，缓解炎症。另外，给以正常培养的chd8-/-菌液Aero.veronii strain b1-3后，同样可以降低其全身中性粒细胞数量，使chd8-/-突变体模型中异常亢进的免疫状态得到缓解(图9)。
实施例7 Aero.Veronii strain b1-3菌株对自闭症模型斑马鱼体内促炎因子肿瘤坏死因子(TNFα)水平的影响
7dpf时，斑马鱼的造血干细胞转移至其肾脏部位(类似哺乳动物的骨髓)，因此RT-qPCR检测7dpf时肾脏中TNFα基因(引物F：5’- GCGCTTTTCTGAATCCTACG-3’，引物R：5’-TGCCCAGTCTGTCTCCTTCT-3’)(He,Zhang et al.Blood 125(7): 1098-1106,2015)表达水平，以反应其造血干细胞内该因子表达水平。
由图10可见，给以正常chd8-/-培养液中加入Aero.veronii strain b1-3 菌液后，可以降低其肾脏中肿瘤坏死因子的表达水平，使chd8-/-突变体模型中异常亢进的免疫状态得到缓解。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.一种无菌斑马鱼模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)成年雌雄斑马鱼交配，收集受精卵；2)在含抗生素的胚胎培养液中进行受精卵培养；3)胚胎进行消毒剂浸泡和/或漂白液浸泡；4)胚胎无菌性检测。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述抗生物选择氨苄西林、卡那霉素和两性霉素B；所述消毒剂为PVP-I及次氯酸钠(NaClO)。
3.根据权利要求1或2所述的方法获得的无菌斑马鱼模型在药物筛选中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为能够调节造血系统、免疫系统功能的肠道微生物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物能够调节自闭症患者肠道及造血功能异常。
6.一种药物筛选方法，其特征在于，包括在无菌斑马鱼中定植野生斑马鱼肠道菌群以筛选对造血系统、免疫系统具有调节作用的肠道微生物。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述无菌斑马鱼通过权利要求1或2所述的构建获得。
8.根据权利要求6或7所述的筛选方法获得的肠道微生物；优选地，所述肠道微生物为菌株Aero.Veronii b1-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24443。
9.一种Aero.veronii菌株，命名为b1-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24443。
10.根据权利要求8所述的肠道微生物或权利要求9所述的菌株在制备用于造血系统、免疫系统功能调节的药物中的应用。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103141425A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 中国农业科学院饲料研究所 | 无菌斑马鱼的生产方法 |
| CN104278026A (zh) * | 2013-07-12 | 2015-01-14 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用 |
| CN112245596A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-01-22 | 浙江大学 | 一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103141425A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 中国农业科学院饲料研究所 | 无菌斑马鱼的生产方法 |
| CN104278026A (zh) * | 2013-07-12 | 2015-01-14 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用 |
| CN112245596A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-01-22 | 浙江大学 | 一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| E MELANCON 等: "Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry", METHODS CELL BIOL., vol. 138, pages 13 - 14 * |
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