CN115287213B - 一株嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)EuAs‑D‑S6及其应用，属于微生物技术领域。该菌株保藏编号为：CGMCC NO.24418，保藏日期为2022年2月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株主要解决乳扇以自然发酵“酸水”生产乳扇的模式，改善产品卫生状况，减少污染环节，提升产品拉伸性能，增强乳扇特有风昧，延长乳扇保质期，而且能避免在乳扇制作中添加明矾，保证食品安全问题。

Description

一株嗜热链球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株嗜热链球菌及其应用。

背景技术

乳扇是我国云南地区特有的发酵乳制品，属于拉伸型酸凝奶酪。乳扇是一种含水分较少、营养丰富，呈乳白色、状如折扇的牛奶薄片，生吃、干吃、油炸、煎烤均可。在我国西南地区广受消费者喜爱，有助于填补国产奶酪市场份额的空缺。乳扇的传统生产工艺是：取酸浆加热至63-65℃，按一定比例加入新鲜牛奶，边加热边用筷子往一个方向进行搅拌，牛奶蛋白在酸和热的双重作用下形成凝块，将凝块取出，用手揉成胶质饼状，再将其两翼卷入手指粗细的竹筷上，将竹筷的一端向外撑大，使凝块变为扇形，最后将其挂在固定的梯形架上，晾干后即为乳扇。

目前乳扇生产仍存在诸多问题，主要原因是乳扇的生产依然沿袭传统的家庭手工作坊式，生产工艺、设备的落后导致其与工业标准化生产相比产率低下，产量不足；同时由于生产者依靠自身经验制作，没有标准可供参照，生产的产品风昧等品质迥异。在传统的乳扇生产中，较为突出的问题主要有以下几方面：一是乳扇形成使用的“酸水”，由于是自然发酵产生，“酸水”中的菌系较复杂，大约有十多种，主要是乳杆菌，发酵条件难以控制，经常在“酸水”的表面会有大量的霉菌生长，酸度也不易一致，因而用酸量只能是凭经验确定，产品质量和卫生条件很难控制，从而限制了乳扇的发展。二是乳扇生产中最重要的制作工艺是拉伸步骤，牛奶蛋白的凝块在热乳清中通过拉伸，使凝块变得均匀且富有弹性，细腻且有黏性后迅速拉长扯薄，成为扇形。如果酸水加入牛奶后拉伸性不好，就会影响乳扇的品质。传统制作工艺对生产过程中凝块的形成要求较苛刻，拉伸条件是PH值4.9，因此产品酸度高，口感较酸。三是在乳扇传统制作工艺中，为了提高乳扇出品率、拉伸性能及油炸后酥脆的口感，会在原料奶中添加明矾，而明矾对人体健康不利特别影响智力发育，带来食品不健康的问题。四是乳扇保质期短，传统工艺制作的乳扇，很容易受到大肠杆菌的污染，保质期一般只有30天。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明目的之一是从乳扇的乳清中分离筛选出一株嗜热链球菌EuAs-D-S6，主要解决乳扇以自然发酵“酸水”生产乳扇的模式，改善产品卫生状况，减少污染环节，提升产品拉伸性能，增强乳扇特有风昧，延长乳扇保质期，而且能避免在乳扇制作中添加明矾，保证食品安全问题。

本发明的另一目的是提供一株嗜热链球菌EuAs-D-S6在制备乳扇中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)EuAs-D-S6，其特征在于：该菌株保藏编号为：CGMCCNO.24418，保藏日期为2022年2月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明保藏说明：

分类命名：嗜热链球菌。

拉丁名：Streptococcus thermophilus。

参椐的生物材料：EuAs-D-S6。

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏机构简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2022年2月22日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.24418。

嗜热链球菌EuAs-D-S6的筛选方法是：采集云南大理洱源邓川地区自然发酵产生的乳清，无菌操作，按照10倍稀释法，对不同样品依次进行稀释，选取适宜的稀释浓度，用经过灭菌的MC固体培养基倾倒平板，于37℃条件下培养2～3天；挑取一定数量的特征菌落，在MC平板上反复划线纯化直至得到单菌落；将其分别转移至MC斜面培养基上，纯化后保存，将保存菌种分别进行乳扇拉伸试验筛选、16srDNA基因测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为嗜热链球菌EuAs-D-S6。

与现有技术相比，本发明的有益效果有：

1、能稳定提高乳扇拉伸性能和保证“酸水”酸度的基本一致性，克服不良酸感。用本专利菌株生产的乳扇因其发酵过程中产生的代谢产物能改变牛奶酪蛋白的网状结构，利于牛奶拉伸，同时产生的游离氨基酸和多肽较多达0.3421(％w/w)，对酸昧起缓冲作用。本发明菌株嗜热链球菌Ouya-D-S6凝乳时间6小时，凝乳酸度43°T，终点酸度109°T，生产的乳扇口感酸昧较柔和。

2、产联乙酰稳定。本发明菌株在38℃发酵蛋白质含量为3.0％的脱脂乳，18小时产生联乙酰为4.1376mg/L，继续发酵至72小时，产生联乙酰为4.8725mg/L。用该菌种对牛奶进行发酵，产生很好的风昧，有利于乳扇特有香昧的形成，经比较，过高的联乙酰含量，会产生不新鲜馊昧，过低则发酵昧不足。

3、用该菌株发酵牛奶后制作乳扇，比原来自然发酵“酸水”制作乳扇，其拉伸性好，凝块光滑、有光泽、香昧好，而且保质期更长，达到50天，传统工艺生产制作乳扇保质期一般只有30天。

4、用该菌株发酵牛奶后制作乳扇，能提高产品成品率。用该菌株发酵牛奶后制作乳扇的成品率达9.2％，而传统工艺制作乳扇的成品率一般在8％左右。附图说明

图1为本发明所述嗜热链球菌EuAs-D-S6的菌落形态图。

图2为本发明所述嗜热链球菌EuAs-D-S6的革兰氏染色图。

图3为本发明所述嗜热链球菌EuAs-D-S6的16srDNA基因序列。

图4为本发明所述嗜热链球菌EuAs-D-S6抑制大肠杆菌的抑菌圈图。

图5为用本发明所述嗜热链球菌EuAs-D-S6制得乳扇拉伸后的外观形态图。

图6为传统工艺制得乳扇拉伸后的外观形态图。

具体实施方式

下面结合实施例，作进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：菌株的分离纯化及鉴定

1.菌株的分离纯化及保藏

无菌操作，按照10倍稀释法，对不同样品依次进行稀释，选取适宜的稀释浓度，用经过灭菌的MC固体培养基倾倒平板，于37℃条件下培养2～3天；挑取一定数量的特征菌落，在MC平板上反复划线纯化直到得到单菌落；将其分别转移至MC斜面培养基上，做好标记，于4℃条件下保藏。

2.牛奶初发酵试验

2.1将做好标记并保存完整的纯菌株取出，用MC液体培养基使其充分活化，按3％的接种量接种于含蛋白质含量为3.0％的脱脂乳中，37℃培养18小时，取出放4℃冰箱保存24h为1代菌种，充分休眠后，按3％的接种量接种1代菌种于含蛋白质含量为3.0％的脱脂乳中，37℃培养18小时，取出放4℃冰箱保存24h为2代菌种。如此反复接种培养10代，每代观察凝乳状态、酸度变化、菌种形态。本专利菌株10代转接酸度滴定结果见表1。酸度的测定方法采用国标法GB5009.239-2016。

表1：嗜热链球菌EuAs-D-S6转接十代酸度结果

代数	1代	2代	3代	4代	5代	6代	7代	8代	9代	10代
											酸度(0T)	108	107	110	109	107	108	109	109	110	109

从表1的实验结果表明：在相同培养基、培养时间、培养温度及同样检测条件下，嗜热链球菌EuAs-D-S6转接每一代凝乳都较好、酸度稳定。

2.2菌株拉伸试验

将凝乳完整、酸度稳定的菌株进一步热烫拉伸试验，即按2％接种量接种于75±1℃灭菌的牛奶中42±2℃发酵1.5小时，加入瑞士乳杆菌Ouya-D-L5，在42±1℃条件下发酵72h，热烫拉伸，下表2是节选部分分离菌株和本专利菌株实验拉伸结果，从表2中可以看出最终只有嗜热链球菌EuAs-D-S6发酵的牛奶达到制作乳扇要求。

表2：部分分离菌株拉伸试验结果

3.菌株的鉴定

3.1菌种的形态学特征

EuAs-D-S6的菌落在MC固体培养基上的菌落为红色、湿润、光滑、有溶钙圈，其菌落形态见图1。EuAs-D-S6在显微镜下为革兰氏染色阳性，形状为椭圆形，呈链状，EuAs-D-S6革兰氏染色镜检照片见图2。

3.2菌株生理生化特征鉴定

对分离纯化所得到菌落分别接触酶试验、糖发酵试验、VP实验、淀粉水解实验、明胶实验，EuAs-D-S6菌株的生理生化特征见表3，根据试验结果将初步鉴定的菌株分类保藏，用于进一步的鉴定。

表3：EuAs-D-S6菌株的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“++”表示产酸产气，

“--”表示不产酸不产气，“+-”表示产酸不产气。

3.3菌株的分子生物学鉴定

用MC液体培养基活化EuAs-D-S6，然后根据UNI-Q柱式细菌DNA抽提试剂盒的实验步骤提取细菌基因组，用0.8％琼脂糖凝胶跑电泳观察提取到基因组。以提取到的基因组为模板，采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和541R(5′-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)为上下游引物，采用PCR扩增试剂盒，50ul的反应体系进行PCR反应。反应参数：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃充分延伸10min。根据设计的引物进行16srDNA扩增，将含有目标片段的PCR产物测序。测序结果输入NCBI数据库中，利用Blast软件比对分析。得到序列与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)相似，16srDNA基因序列如图3所示。

结合EuAs-D-S6的形态观察、生理生化试验及16srDNA基因序列分析，本发明的EuAs-D-S6菌株鉴定为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，于2022年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.24418

实施例2.菌株抑菌能力

2.1EuAs-D-S6母液的制备

取保存的EuAs-D-S6菌株，接种于MC液体培养基中，37℃发酵18h进行活化，连续活化3代，制成菌种母液备用。

2.2EuAs-D-S6抑制大肠杆菌的测定

采用滤纸片法测定，包括下述步骤：

(1)取2.1制备的EuAs-D-S6母液，放入已灭菌处理的滤纸片，浸泡10分钟后，备用；

(2)倒好伊红美兰琼脂平板，凝固后加入1ml乳糖胆盐培养的大肠杆菌培养物，用涂抹棒将大肠杆菌涂匀伊红美兰琼脂平板；

(3)将带有乳酸菌的滤纸片平整地置于伊红美兰琼脂平板上，4℃扩散过夜，置于37℃培养24h观察抑菌圈的出现，并测量抑菌圈大小结果见表4和图4。

表4：EuAs-D-S6菌株抑制大肠杆菌所形成抑菌圈的大小

	第1代	第3代	第5代	第7代	第9代
						抑菌圈直径(cm)	0.89	0.91	0.91	0.90	0.89

从表4中可以得出，嗜热链球菌EuAs-D-S6在十代以内抑制大肠杆菌的能力变化不大，抑菌圈的大小在0.89cm--0.91cm之间。

实施例3.EuAs-D-S6菌株生长能力及加工特性

1、水解蛋白能力的测定：蛋白质的水解能力以发酵乳的pH4.6可溶性氮为评价指标。将以脱脂乳RSM(12％w/v)为培养基保存的待试菌株充分活化，生长稳定后分别以3％的接种量接种到已灭菌的RSM(12％w/v)中，于37℃条件下培养，当凝乳的pH值下降到4.6时取出放置在4℃下保存，7天后测定酸乳中的pH4.6可溶性氮。可溶性氮的测定方法是：取10ml的上面发酵酸乳加入20mlpH4.6的醋酸缓冲溶液，将混合液的最终pH值调为4.6，在3500rpm的条件下离心20min，用微量凯氏定氮的方法测定上清液。

2、生长能力的测定：取实施例2中2.1制备的EuAs-D-S6母液，以3％的接种量接入10mL已灭菌的MRS中，于37℃条件下培养，从测定初始菌数开始每隔2h测定OD值(光密度)至24h为止，绘制生长曲线结果见表5。

表5：EuAs-D-S6生长曲线表(OD值)

时间	2h	4h	6h	8h	10h	12h
							OD值	0.013	0.033	0.213	0.546	0.677	0.712
时间	14h	16h	18h	20h	22h	24h
							OD值	0.740	0.853	0.845	0.833	0.834	0.839

从表中可以得出，16小时以前EuAs-D-S6每隔2h检测的OD值是在不断增加的，也就是随着发酵时间的增加，EuAs-D-S6的活菌数不断增加，到16小时达到最高值0.853。之后随着时间的延长OD值有下降趋势，有些菌开始衰退死亡，因此本专利菌株EuAs-D-S6的最佳发酵时间16小时。

3、产酸能力的测定：乳酸菌的产酸能力以单位时间酸度的变化为评价指标。取实施例2中2.1制备的EuAs-D-S6母液，以3％的接种量接种到10mL已灭菌的RSM(12％w/v)中，于37℃条件下培养。每隔2h用滴定法(国标法GB5009.239-2016)对发酵液进行酸度检测，结果见表6。

表6：EuAs-D-S6产酸曲线表(单位：°T)

时间	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20	22	24	48	72
															酸度	24	32	43	52	59	71	80	88	92	99	106	108	110	109

5、产香能力的测定：菌株的产香能力以其发酵产生的主要风昧物质之一联乙酰含量作为评价指标。将以脱脂乳RSM(12％w/v)为培养基保存的待试菌株充分活化，生长稳定后分别以3％的接种量接种到100mL已灭菌的RSM(12％w/v)中，于37℃条件下培养10h后取出放置在4℃下保存经过24h后测定酸乳中的联乙酰含量。EuAs-D-S6的生长能力及加工性能见表7。

表7：EuAs-D-S6的生长能力及加工性能

实施例4：EuAs-D-S6在制备乳扇中的应用

使用本发明菌株EuAs-D-S6制备乳扇的工艺是：鲜乳→巴氏杀菌(75±1℃，15s)→发酵(按2％的添加量加入EuAs-D-S6，42±1℃，90min)→发酵液+“酸水”按4∶1混合→加热(63-65℃)→搅拌→凝固→揉团→洗涤→缠绕→上架→晾干→成品。(而乳扇传统制作工艺是：鲜乳→过滤→鲜乳滤液+“酸水”按3∶1混合→加热(63-65℃)→搅拌→凝固→揉团→洗涤→缠绕→上架→晾干→成品。)

对比例A

重复实施例4使用本发明菌株EuAs-D-S6制备乳扇的工艺步骤，不同的是用本专利菌株EuAs-D-S6发酵原料奶的时间调整为30min。

对比例B

重复实施例4使用本发明菌株EuAs-D-S6制备乳扇的工艺步骤，不同的是用本专利菌株EuAs-D-S6发酵原料奶的时间调整为60min。

对比例C

重复实施例4使用本发明菌株EuAs-D-S6制备乳扇的工艺步骤，不同的是用本专利菌株EuAs-D-S6发酵原料奶的时间调整为120min。

实施例5：EuAs-D-S6菌株所制得的乳扇与传统工艺制得的乳扇的性能对比。

以本发明筛选的EuAs-D-S6菌株和传统生产工艺制得的乳扇进行对比，从感官评价、质构评价、保质期和卫生指标相结合的方法对其性能进行比较。

质构评价方法：将乳扇切小块，锅里放油、烧至三成热，改用小火。用竹筷夹住乳扇一端，放入锅中，迅速在油里滑过，来回数次，乳扇受热后表面呈现泡状，主要观察乳扇受热后表面起泡的大小、数量及酥脆程度。

保质期内对比：在相同的温度、湿度条件下储存，观察乳扇的外观、质地、风昧、口感变化情况。本发明筛选的EuAs-D-S6菌株和传统生产工艺制得的乳扇的感官评价、质构评价、成品率等比较见表8。

本发明筛选的EuAs-D-S6菌株和传统生产工艺制得的乳扇在保质期内的感官评价与微生物指标见表9。

表8：本发明筛选的EuAs-D-S6菌株和传统生产工艺制得的乳扇的感官评价、质构评价、成品率比较

从表8可以看出，传统制作工艺生产和采用本发明筛选的EuAs-D-S6菌株制作的乳扇不管从成品率、凝块拉伸性和质构评价方面差异明显，采用本专利菌株生产乳扇凝块光滑，拉伸性好，其感官形态见图5，传统工艺生产乳扇凝块拉伸后的感官形态见图6。采用本专利菌株生产乳扇经油炸后表面起泡大小均匀、酥脆，而且成品率高出传统工艺约1％，同时乳扇香昧浓郁。采用本专利菌株EuAs-D-S6发酵牛奶的时间是关键工艺，发酵时间短(对比例A、对比例B)，代谢产物不利于牛奶酪蛋白形成网状结构，凝块光滑，能拉伸，但拉伸时容易将牛奶凝块拉断，口感品尝对比例B香昧要好于对比例A。发酵时间长(对比例C)，代谢产物有利于牛奶酪蛋白形成网状结构，但同时也有另外一些副产物产生，即制作出的乳扇乳酸昧过浓，和乳扇原本风昧差异较大。综合凝块拉伸性和口感，最终选择嗜热链球菌EuAs-D-S6的发酵时间为90min。

表9：本发明筛选的EuAs-D-S6菌株和传统生产工艺制得的乳扇在保质期内的感官评价与微生物指标

从表9中可以看出，传统工艺生产开始微生物指标较高，后面有下降趋势，主要原因估计是在储存的过程中水分挥发，由于微生物生长和水分活度关系较大，到后期由于微生物大量繁殖，致使乳扇变质。在保质期内，用本专利菌株EuAs-D-S6生产的乳扇，微生物指标，大肠杆菌、霉菌酵母都未检出，说明本专利菌株EuAs-D-S6对大肠杆菌有一定的抑菌作用。

序列表

<110> 云南欧亚乳业有限公司

<120> 一株嗜热链球菌及其应用

<130> 2022

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> Streptococcus thermophilus

<400> 1

cgtgctatac atgcagtaga acgctgaaga gaggagcttg ctcttcttgg atgagttgcg 60

aacgggtgag taacgcgtag gtaacctgcc ttgtagcggg ggataactat tggaaacgat 120

agctaatacc gcataacaat ggatgacaca tgtcatttat ttgaaagggg caattgctcc 180

actacaagat ggacctgcgt tgtattagct agtaggtgag gtaatggctc acctaggcga 240

cgatacatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc ggcaatgggg gcaaccctga ccgagcaacg 360

ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgtaagtcaa gaacgggtgt 420

gagagtggaa agttcacact gtgacggtag cttaccagaa agggacggct aactacgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgt aggtcccgag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga 540

gcgcaggcgg tttgataagt ctgaagttaa aggctgtggc tcaaccatag ttcgctttgg 600

aaactgtcaa acttgagtgc agaaggggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagatatat ggaggaacac cggtggcgaa agcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga 720

ggctcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgagtgctag gtgttggatc ctttccggga ttcagtgccg aagctaacgc attaagcact 840

ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 960

ccgatgctat ttctagagat agaaagttac ttcggtacat cggtgacagg tggtgcatgg 1020

ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat 1080

tgttagttgc catcattcag ttgggcactc tagcgagact gccggtaata aaccggagga 1140

aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggttggtac aacgagttgc gagtcggtga cggcgagcta atctcttaaa gccaatctca 1260

gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1320

agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag 1380

tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc agccgcctaa ggtgac 1436

Claims (2)

1.一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)EuAs-D-S6，其特征在于：该菌株保藏编号为：CGMCC NO.24418，保藏日期为2022年2月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种如权利要求1所述的一株嗜热链球菌EuAs-D-S6在制备乳扇中的应用。