CN115279787B - 抗硬骨抑素构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了与硬骨抑素结合的抗硬骨抑素分子(例如，抗硬骨抑素抗体，例如，双特异性抗硬骨抑素抗体)、编码抗硬骨抑素氨基酸序列的核酸分子、包含该核酸分子的载体、含有该载体的宿主细胞、抗硬骨抑素构建体的制备方法、含有抗硬骨抑素构建体的药物组合物以及抗硬骨抑素构建体或组合物的使用方法。

Description

抗硬骨抑素构建体及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2021年9月26日提交的申请号为PCT/CN2021/120612的国际申请的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本公开涉及抗硬骨抑素构建体(例如抗硬骨抑素抗体)及其用途。
以ASCII文本文件提交序列表
以下提交的ASCII文本文件的全部内容通过引用合并于此：计算机可读形式的(CRF)序列表(文件名：210912000241SEQLIST.TXT，记录日期：2021年9月20日，大小：386,061字节)。
背景技术
通过基因定位研究发现了SOST基因产物硬骨抑素(sclerostin)作为人类骨形成抑制剂的功能，该研究将SOST基因的功能缺失突变确定为高骨量(HBM)骨硬化症的致病因素(Balemans et al.,2001Hum.Mol.Genet.10,537-543；Brunkow et al.,2001Am.J.Hum.Genet.68,577-589)。在小鼠身上，由于骨形成增加，SOST基因的缺失导致骨量和骨强度增加，而人硬骨抑素转基因的过表达则导致骨量减少和骨强度降低(Ke etal.,2012Endocr.Rev.33,747-783.).
本文中引用的所有公开说明、专利、专利申请和已发表专利申请的全部公开内容均通过引用合并于此。
发明简述
以下内容仅为说明性内容，而不是以任何方式进行限制。即，以下内容是为了介绍本发明所述的抗硬骨抑素的新型分子的优势、有益效果及其用途。因此，以下内容并不旨在限制要求保护的主体的基本技术特征，也不用于确定要求保护的主体的范围。
本申请一方面提供了抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素(例如人硬骨抑素)的抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，例如本文所述的任何抗硬骨抑素构建体。在一些实施方式中，所述抗体部分是一种抗体或其抗原结合片段，选自全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、dsscFv、(dsFv)2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、scFv-Fv融合、双体抗体(diabody)、三体抗体(tribody)和四体抗体(tetrabody)。在一些实施方式中，该构建体是包含Fc片段的全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体部分是scFv片段。
本申请另一方面提供了抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素(例如人硬骨抑素)的抗体部分和第二部分。在一些实施方式中，所述第二部分包含半衰期延长部分(例如Fc片段)。在一些实施方式中，所述第二部分包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGFβ)、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
在一些实施方式中，所述第二部分包含特异性识别抗原的第二抗体部分。在一些实施方式中，提供了抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分(包含但不限于本文所述的抗硬骨抑素抗体部分)以及特异性识别Dickkopf-1(DKK1)或核因子κβ配体的受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa beta Ligand,RANKL)的第二抗体部分。识别DKK1或RANKL的抗体部分可以是任何抗DKK1抗体部分或抗RANKL抗体部分(包含但不限于本文所述的抗体部分)。在一些实施方式中，第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链Fv(scFv)片段、scFv-scFv、微型抗体(nanobody)、双体抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)。在一些实施方式中，所述第二抗体部分是包含Fc片段的全长抗体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分是单链Fv(scFv)片段。在一些实施方式中，所述第二抗体部分是scFv片段，其中所述抗硬骨抑素抗体部分是包含Fc片段的全长抗体。在一些实施方式中，所述scFv片段与全长抗体的重链和/或轻链(例如，N端和/或C端)(通过连接子或不通过连接子)融合。在一些实施方式中，该构建体包含：a)具有第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端至C端包含，i)VL，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；b)具有第一重链的第二多肽，所述第二多肽从N端至C端包含：i)VH，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)和iii)第一Fc结构域；c)具有第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到C端包含，i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)和iii)第二Fc结构域；以及d)具有第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。第一CH1或第二CH1和/或第一Fc结构域或第二Fc结构域可以在不脱离本发明的构思的前提下，进行若干变形或改进。
本申请另一方面提供了抗硬骨抑素构建体，可以与本文所述的任何一种抗硬骨抑素构建体竞争性地与硬骨抑素特异性结合。
本申请另一方面提供了药物组合物，包括本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任何一种以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，该组合物还包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
本申请另一方面提供了编码本文所述的任何一种抗硬骨抑素的构建体或所述抗硬骨抑素构建体的其中一部分(例如，其中一种或多种多肽)的分离的核酸分子。
本申请另一方面提供了包含本文所述任何一种分离的核酸分子的载体。
本申请另一方面提供了分离的宿主细胞，包含本文所述的分离的核酸分子和/或载体中的任何一种。
本申请另一方面提供了生成抗硬骨抑素构建体的方法，包括：a)在有效表达抗硬骨抑素构建体或其中一部分(例如，其中一种或多种多肽)的条件下培养本文所述的任何分离的宿主细胞；以及b)从宿主细胞中获得所表达的抗硬骨抑素构建体或其中一部分。
本申请另一方面提供了治疗个体疾病或病症的方法，包括让个体使用有效量的抗硬骨抑素的构建体，诸如本文所述的任何一种抗硬骨抑素的构建体或本文所述的任何一种药物组合物。在一些实施方式中，所述疾病或病症是指骨相关病症。在一些实施方式中，所述骨相关病症包括成骨不全、骨硬化、骨质疏松症(男性和/或女性)、老年性骨质疏松症、骨延迟愈合、骨折延迟愈合或不愈合、佩吉特病、不活动引起的骨质丢失、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、炎症诱导的骨丢失，包括关节炎引起的骨丢失，或者与a)骨量或骨质丢失或两者丢失和/或b)骨结构和骨质异常相关的其他疾病或病症。在一些实施方式中，将抗硬骨抑素构建体或药物组合物肠胃外给药到个体体内。在一些实施方式中，该方法还包括使用第二种药物或疗法(例如，抗DKK1抗体或抗RANKL抗体)。在一些实施方式中，第二种药物或疗法包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。在一些实施方式中，个体是指人。
附图说明
图1示出了硬骨抑素上第二个环上的“IGRGKWWR”基序的序列和构象，以说明硬骨抑素和LDL受体相关蛋白6(LRP6)之间的相互作用。
图2示出了使用硬骨抑素第二个环上的合成肽片段对单克隆抗体93B1B7的硬骨抑素表位作图。
图3示出了罗莫单抗(Romosozumab)不识别来自单克隆抗体93B1B7结合的人硬骨抑素的第二环的肽。
图4示出了单克隆抗体93B1B7和罗莫单抗占据不同的硬骨抑素表位，并且没有交叉阻断彼此与硬骨抑素的结合。
图5示出了示例性双特异性抗体结构的示意图。
图6示出了来自生物层干涉(BLI)传感图的结果，证明了人硬骨抑素和DKK1与双特异性抗体的增量结合；
图7示出了食蟹猴接受30mg/kg皮下给药后双特异性抗体的血清浓度。
具体实施方式
本申请提供了与硬骨抑素特异性结合的新型抗硬骨抑素构建体(例如抗硬骨抑素单克隆抗体或多特异性抗体)、抗硬骨抑素构建体的制备方法以及所述构建体的使用方法(例如，治疗疾病或病症的方法)。本文所述的示例性抗硬骨抑素构建体获得了有益效果。例如，与罗莫单抗相比，示例性抗硬骨抑素分子对硬骨抑素表现出更高的结合亲和力。参见实施例3、5和6(表5、表7和表8)。
I.定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，前提是只要它们表现出了所需的抗原结合活性。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。所述轻链和重链的可变区负责抗原的结合。所述重链和轻链的可变区可以称为“VH”和“VL”，两条链中的可变区通常包含三个高变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR区段可按Kabat、Chothia或Al-Lazikani的编号惯例(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR插入到被称为框架区(FR)的侧翼区段之间，所述框架区比CDR具有更高的保守性，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体归类。抗体的五种主要类别或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别具有α、δ、ε、γ和μ重链，其中几个主要抗体类别分为亚类，例如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或IgGA2(α2重链)。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双体抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定性diabody(ds diabody)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(双体抗体(diabody))、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼科单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施方式中，抗原结合片段可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR，所述CDR被移植到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
可变区“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中形成六个高变环(重链和轻链各3个环)，该高变环包含用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体与抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的半个Fv)也具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整可变区。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方式中，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，该多肽连接子使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Plückthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
本文所用的术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这些特定区已经描述于：Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.，美国卫生与公共服务部，“具有免疫学意义的蛋白质序列”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；and Honegger and Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括彼此比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义指代抗体或移植抗体或其变体的CDR均落入本文定义和使用的术语的范围内。下表1列出了包含上述各参考文献定义的CDR的氨基酸残基作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；EhrenmannF.et al.,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；and Adolf-Bryfogle J.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用整体并入本文，以用于本申请中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。在一些实施方式中，本文提供的CDR序列基于IMGT编号定义。例如，CDR序列可以通过VBASE2工具(http:///www.vbase2.org/vbase2.php，另见Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W:VBASE2，整合的V基因数据库。《核酸研究》2005年1月1日；33(数据库发布)：D671-4，其全部内容通过引用合并于此)。
本文所用的术语“骨质疏松症”是指绝经前特发性骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、绝经期骨质疏松症、卵巢切除术后骨质疏松症、废用性骨质疏松症、药物诱导的骨质疏松症、吸收不良引起的骨质疏松症、手术后吸收不良性骨质疏松症和/或老年性骨质疏松症。
本文所用的术语“骨质减少症”是指绝经前特发性骨质减少症、绝经后骨质减少症、老年性骨质减少症、药物诱导的骨质减少症、废用性骨质减少症、新生儿骨质减少症和/或失重引起的宇航员骨质减少症。
本文所用的术语“代谢性骨病”包括但不限于肾性骨营养不良、原发性和继发性甲状旁腺功能亢进症、家族性甲状旁腺功能亢进综合征、甲状旁腺疾病、骨营养不良、骨软骨病、高磷酸酯酶症。
本文所用的术语“骨坏死”是指骨的缺血性坏死、潜水引起的缺血性坏死、颌骨的骨坏死。
本文所用的术语“骨丢失”是指绝经后骨丢失、不活动引起的骨丢失、失重引起的骨丢失、疾病相关的面部骨丢失、疾病相关的颅骨丢失、疾病相关的颌骨骨丢失、疾病相关的颅骨骨丢失、空间旅行相关的骨丢失、糖皮质激素诱导的骨丢失、药物诱导的骨丢失、器官移植相关的骨丢失、肾移植相关的骨丢失，HIV相关的骨丢失、生长激素丢失相关的骨丢失、囊性纤维化相关的骨丢失、化疗相关的骨丢失、肿瘤诱导的骨丢失、癌症相关的骨丢失、激素消融性骨丢失、口腔骨丢失、肝素诱导的骨丢失、炎症诱导的骨丢失，包括关节炎引起的骨丢失，或者与a)骨量或骨质丢失或两者丢失和/或b)骨结构和骨质异常相关的其他疾病或病症，失重引起的骨丢失。
本文所用的术语“骨不连”或“骨延迟愈合”是指骨折延迟愈合或不愈合、髋部骨折、融合或关节融合后的假性关节炎、骨溶解、术后溶骨、脊柱融合后的骨不连、脊柱融合的增强/加速、关节成形术后的慢性疼痛。
本文所用的术语“骨软化症”是指维生素D抵抗性骨软化症、钙缺乏症、肌肉减少症、癌症相关的肌肉减少症、肿瘤诱导性骨软化症。
本文所用的术语“骨折”包括但不限于压缩性骨折、脆性骨折、病理性骨折、应力性骨折、髋部骨折、股骨颈骨折、非典型髋部骨折、股骨粗隆间骨折、肿瘤疾病引起的骨骨折。
本文所用的术语“高钙血症”包括恶性肿瘤的高钙血症、高钙血症引起的肌病、慢性肾脏疾病引起的高钙血症。
本文所用的术语“多发性骨髓瘤相关骨病症”是指多发性骨髓瘤性骨病和多发性骨髓瘤病引起的骨质疏松症。
本文所用的术语“原发性骨肿瘤”包括骨肉瘤、骨软骨瘤、成骨细胞瘤、骨软骨黏液瘤、破骨细胞瘤、骨样骨瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、软骨样纤维瘤、粘液样软骨肉瘤、肉瘤、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨膜肉瘤、胶质瘤、巨细胞瘤、巨细胞肉瘤、巨细胞血管纤维瘤、血管内皮肉瘤、未分化肉瘤、纤维肉瘤、骨囊肿、动脉瘤、多发性内分泌肿瘤。
用于“恶性肿瘤骨转移”的术语“恶性肿瘤”包括乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、胸腺癌。
本文所用的术语“炎性或感染性骨病”是指骨髓炎、化脓性骨髓炎、强直性脊柱炎。
本文所用的术语“骨髓或血液学疾病”是指白血病、恶性淋巴瘤、血液恶性肿瘤、血液病、骨髓疾病。
本文所用的术语“罕见的肌肉骨骼疾病”包括成骨不全、骨硬化病、胫骨先天性假关节、内生瘤病、纤维发育不良、戈谢病、马凡综合征、遗传性多发外生骨疣、神经纤维瘤病、成骨不全、骨质疏松症、骨斑点症、硬化性病变、假关节病变、肢骨纹状肥大、青少年关节炎、地中海贫血、粘多糖病、特纳综合征、Pown综合征、克兰费尔特综合征、麻风病、佩特兹氏病、青少年特发性脊柱侧凸、温彻斯特综合征、Menkes病、缺血性骨病(如儿童股骨头缺血性坏死、局限性游走性骨质疏松)、特发性婴儿高钙血症、肢端肥大症、性腺功能减退症、阿-麦-斯三氏综合征、铝骨病、进行性骨干发育不良、骨硬化症及婴儿神经轴突营养不良、异常骨硬化、致密性成骨不全症、Gorham-Stout综合征、囊性血管瘤病、佩吉特病、青少年佩吉特病、骨质疏松症-白眼病综合征、典型或非典型囊性纤维化的骨质疏松症、胫骨-桡骨异常-骨折、X连锁低磷酸盐骨软化症、家族性骨发育不良、骨斑点症、蜡泪样骨病、颅骨干骺端发育不良、神经胶质瘤综合征、颅骨锁骨发育不良、Hajdu-Cheney综合征、Winchester-Torg综合征、Cole-Carpenter综合征、低磷酸盐血症、遗传性高磷酸化症、进行性骨化性纤维发育不良、家族性低钙血症、假性甲状旁腺功能减退症、肢端骨发育不良、艾肯综合征、多发性软骨瘤病、维生素D羟化缺陷性佝偻病、低磷酸盐血症性佝偻病。
本文所用的术语“软骨相关疾病”包括但不限于软骨瘤病、软骨发育不良、软骨营养不良性肌强直、皮质旁软骨瘤、膝关节软骨撕裂、骨关节炎、骨软骨营养不良。
本文所用的术语“肌肉相关疾病”包括肌肉减少症和癌症相关的肌肉减少症。
“促进骨骼或关节手术后的愈合”中使用的术语“手术”是指骨科手术、牙科手术、植入手术、关节置换、保留关节的手术、牵张成骨、骨延长、植骨、骨美容手术和骨修复，如骨折愈合、骨不连愈合、骨折延迟愈合和颅面复原。
表1：CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人的命名法，见上文
2残基编号遵循Chothia等人的命名法，见上文
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法，见上文
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法，见上文
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名方法，见上文
“Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体，是指用于Kabat等人的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统，见上文。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含与可变结构域的框架区(FR)或高变区(HVR)的缩短或插入相对应的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后的插入的残基(例如，根据Kabat编号的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体的Kabat残基编号。
除非本文另有说明，否则免疫球蛋白重链中残基的编号为Kabat等人的EU索引的编号，见上文。“Kabat的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
“人源化”形式的非人类(例如，啮齿类动物)抗体是包含源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区(HVR)的残基被来自非类种属(供体抗体)的高变区的残基所取代，例如具有理想的抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基所取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中的残基。这些修饰是为了进一步改善抗体的性能。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有，至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环均与非人免疫球蛋白的高变环相对应，并且所有或基本上所有FR均是人免疫球蛋白序列。可选地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。更多详细信息见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)生成人抗体。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。制备人单克隆抗体可以使用Cole et al.,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991).See also van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原给予转基因动物来制备，转基因动物已被修饰以响应抗原激发产生此类抗体，但其内源性位点已被禁用，例如，免疫的异种小鼠(关于XENOMOUSE TM技术，例如，参见美国专利US 6,075,181和US 6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，另见，例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
本文确定的相对于多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在将任何保守取代作为序列同一性的一部分对序列进行比对之后，与所比较的多肽中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以通过本领域技术范围内的各种方式进行比对，例如，使用公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于衡量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，在本文中，使用序列比较计算机程序MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic AcidsResearch 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)生成氨基酸序列同一性百分比值。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的同一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的相同位置被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，则这两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当两个序列对齐以获得最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指相对于含有抗原结合位点的免疫球蛋白的另一部分(可变结构域)具有更保守氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定结构域的氨基酸序列归属为两种明显不同的类型之一，称为“κ”和“λ”。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从约第118位氨基酸延伸至约第215位氨基酸(EU编号系统)。
“铰链区”通常定义为IgG中与人IgG1的Glu216至Pro230相对应的区域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)).可以通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置，将其他IgG同种型的铰链区域与IgG1序列进行比对。
人IgG Fc区(也称为“C2”结构域)的“CH2结构域”通常从约第231位氨基酸231延伸至约第340位氨基酸。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域不紧密配对。相反，在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两条N-连接的支链碳水化合物链。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,MolecImmunol.22:161-206(1985).
“CH3结构域”(也称为“C3”结构域)包括Fc区中CH2结构域C端残基的延伸(即，约氨基酸残基341至抗体序列的C端，通常在IgG的氨基酸残基446或447处)。
本文中的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位的氨基酸残基或Pro230延伸至其羧基端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体的生产或纯化过程中去除，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组成可包括去除所有K447残基的抗体群、未去除K447残基的抗体群和具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群。本文所述的用于抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。首选FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的选择性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在其胞浆结构域方面不同。活化受体FcγRIIA在其胞浆结构域中含有一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆结构域中含有一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。FcR综述见Ravetch andKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；and de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他FcR，包括将来将确定的FcR，包含在本文术语“FcR”中。
本文所用的术语“表位”是指抗体或抗体部分与之结合的抗原上的特定原子或氨基酸的基团。如果两个抗体或抗体部分与抗原表现出竞争性结合，则可结合抗原内的相同表位。
如本文所用，存在等摩尔浓度的第一抗体或其片段时，当第一抗体或其片段抑制其片段的第二抗体的靶抗原结合至少约50％(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的至少约任何一个)时，第一抗体或其片段“竞争”与靶抗原结合，反之亦然。PCT公开说明WO 03/48731描述了基于其交叉竞争的“结合”抗体的高通量工艺。
这里所用的术语“特异性结合”、“特异性识别”和“针对于”是指可衡量和可重现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定了存在包括生物分子在内的异质分子群时是否存在靶标。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分是以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或比其与其他靶标的结合更长的持续时间来结合该靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方式中，抗体与不相关靶标的结合程度小于测量的抗体与靶标结合程度约10％，例如，通过放射免疫分析(RIA)。在一些实施方式中，特异性结合靶标的抗体具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方式中，抗体特异性结合在不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在一些实施方式中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。抗体或抗原结合域的结合特异性可通过本领域已知的方法实验测定。此类方法包括但不限于Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BLI、BIACORETM检测和肽扫描。
“分离”抗体(或构建体)是从其生产环境的组成部分中鉴定、分离和/或回收的抗体(例如，天然或重组)。优选地，分离的多肽不与来自其生产环境的所有其他组分结合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是一种核酸分子，是从至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出来的，其通常与该污染核酸分子在其产生的环境中相关联。优选地，分离的核酸不与生产环境相关联的所有组分结合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中发现的形式或环境。因此，分离的核酸分子与编码本文所述天然存在于细胞中的多肽和抗体的核酸不同。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置。
当核酸与另一个核酸序列处于功能关联时，它是“可操作地连接”的。例如，如果序列前导序列或分泌前导序列的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接到编码序列；或者核糖体结合位点如果被定位成便于翻译，则可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”是指连接的DNA序列是连续的，并且在存在分泌前导序列的情况下，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制性位点结合完成连接。如果不存在此类位点，则按照常规操作规程使用合成的寡核苷酸适配子或连接子。
本文所用的术语“载体”是指能够传播与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括载体作为自复制核酸结构以及掺入其所引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由此衍生的后代，不考虑传代次数。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，可能含有突变。本文包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变子代。
本文所用的“治疗”或“治疗”是获得有益或理想结果(包括临床结果)的方法。在本申请中，有益或理想的临床结果包括但不限于以下一个或多个：减轻由疾病引起的一个或多个症状、减小疾病的程度、稳定疾病、防止或延迟疾病的传播、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态、缓解疾病(部分或全部)、降低治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病进展、提高或改善生活质量、增加体重和/或延长生存期。本申请的方法设想了这些治疗方面中的任何一个或多个。
术语“抑制”是指任何表型特征的减少或停止，或指该特征的发生率、程度或可能性的降低或停止。“减少”或“抑制”是指与参考文献相比降低、减少或停止活性、功能和/或量。在某些实施方式中，通过“减少”或“抑制”是指引起总体减少20％或更大的能力。在另一个实施方式中，通过“减少”或“抑制”是指引起总体减少50％或更大的能力。在又一个实施方式中，通过“减少”或“抑制”是指引起总体减少75％、85％、90％、95％或更大的能力。
本文所用的“参考”是指用于比较的任何样品、对照品或水平。参考可以从健康和/或非患病样品获得。在一些示例中，参考可以从未经治疗的样品获得。在一些示例中，参考来自个体的非患病或未经治疗的样品。在一些示例中，参考来自非个体或患者的一个或多个健康个体。
本文所用的“延缓疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延迟疾病的发展。根据疾病史和/或正在接受治疗的个体的情况，这种延迟可能具有不同的时间长度。对本领域技术人员而言，显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不会发生疾病。
本文所用的“预防”包括对可能易患该疾病但尚未被诊断为疾病的个体中的疾病的发生或复发提供预防。
如本文所用，为了“抑制”功能或活性是与除了所关注的条件或参数以外的其它相同条件相比或与另一种条件相比时降低功能或活性。例如，与不存在抗体的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的抗体降低了肿瘤的生长速率。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换地用于指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施方式中，个体是指人。
药物的“有效量”是指在达到预期的治疗或预防性结果所需的剂量和时间段内有效的量。具体剂量可根据以下一种或多种情况变化：所选的特定药剂、待遵循的给药方案、是否与其他化合物组合使用、给药时间、待成像的组织和携带它的物理递送系统。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式存在并且不含有对将要使用制剂的个体产生不可接受的毒性的额外组分的制剂。此类制剂可以是无菌的。
“药学上可接受的载体”是指本领域常规用于与治疗药物一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料、制剂辅助剂或载体，与所述药物共同包含供个体使用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对受体无毒，并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所使用的制剂。药学上可接受的载体或辅料优选地符合毒理学和生产试验的要求标准和/或包含在美国食品药品监督管理局编写的非活性成分指南中。
“无菌”制剂为无菌的或基本无活微生物及其孢子。
与一种或多种进一步治疗药物“联合”给药包括以任何顺序同时(合并)和连续给药。
术语“同时”在本文中用于指两种或多种治疗药物的使用，其中至少部分给药在时间上重叠，或其中一种治疗药物的使用相对于另一种治疗药物的使用是在短时间内。例如，两种或多种治疗药物以不超过约60分钟的时间间隔使用，例如不超过约30、15、10、5或1分钟。
术语“顺序”在本文中用于指两种或多种治疗药物的使用，其中一种或多种药物在一种或多种其他药物停药之后继续使用。例如，使用两种或多种治疗药物的时间间隔超过约15分钟，例如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周或1个月或更长时间。
本文所用的“结合”是指除了另一种治疗模式之外还使用一种治疗方式。因此，“结合”是指在向个体施用一种治疗方式之前、期间或之后施用另一种治疗方式。
术语“药品说明书”是指通常包含在治疗产品商业包装中的说明，其中包含关于此类治疗产品使用的适应症、使用、剂量、给药、综合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂的任何制品(例如，包装或容器)或试剂盒，例如用于治疗疾病或病症的药物、或用于特异性检测本文所述的生物标志物的探针。在某些实施方式中，制品或试剂盒作为用于执行本文所述方法的单元被推广、分销或销售。
应理解，本文所述的应用的实施方式包括“由”和/或“基本上由”实施方式组成。
本文中对“约”值或参数的引用包括(和描述)针对该值或参数本身的变化。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求中使用，除非上下文明确另有说明，否则单数形式“一”、“或”和“所述”包括复数引用。
II.抗硬骨抑素构建体
本申请提供了包含抗硬骨抑素抗体部分的抗硬骨抑素构建体，所述抗硬骨抑素抗体部分与本文所述的硬骨抑素(SOST基因表达的蛋白产物)特异性结合。
硬骨抑素是一种分泌型糖蛋白，具有C端半胱氨酸结样(CTCK)结构域，与骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂的DAN(神经母细胞瘤差异筛选选择基因畸变)家族具有序列相似性。该基因的功能缺失突变与常染色体隐性遗传疾病硬化症有关，后者可导致进行性骨过度生长。该基因下游的缺失导致硬骨抑素表达减少，与一种称为vanBuchem病的较轻型疾病相关。
在一些实施方式中，提供了一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，所述抗体部分结合到硬骨抑素上的表位，其中所述表位包含SEQ IDNO:186所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争硬骨抑素的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，所述VH包含：i)具有SEQ ID NO:1-4和12中任一项的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5-8和13中任一项的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii)具有SEQ ID NO：9-11和14中任一项的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含：i)具有SEQ ID NO:15-17中任一项的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18和19中任一项的氨基酸序列的LC-CDR2，和iii)具有SEQ IDNO:20和21中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，和iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同源一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含：i)具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的LC-CDR2，和iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。在一些实施方式中，VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含：i)具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的LC-CDR2，和iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，提供了一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:22所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:23所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
b)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:25所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
c)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:26所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:27所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
d)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:29所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
e)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:30所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
f)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:32所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:33所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
g)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:34所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:35所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
h)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:36所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:37所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
i)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:38所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:39所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
j)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:40所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:41所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
k)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:88所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
l)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:89所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或者
m)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL内具有SEQID NO:90所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该构建体包含或者是一种抗体或其抗原结合片段，选自全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、dsscFv、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、双体抗体(diabody)、三体抗体(tribody)和四体抗体(tetrabody)。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分是全长抗体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分是scFv或dsscFv。
在一些实施方式中，上述抗硬骨抑素抗体部分包含选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂交中的免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方式中，上述抗硬骨抑素抗体部分或全长抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂交中的免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方式中，所述Fc片段具有与相应野生型Fc片段相比降低的效应子功能。在一些实施方式中，所述Fc片段具有与相应野生型Fc片段相比增强的效应子功能。
在一些实施方式中，抗体部分包含本文所述任何一个抗体部分的人源化抗体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含或者是抗硬骨抑素融合蛋白。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含或者是多特异性抗硬骨抑素构建体(例如双特异性抗体)。
在一些实施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。
a)抗体亲和力
抗体部分的结合特异性可通过本领域已知的方法实验测定。此类方法包括但不限于Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BLI、BIACORETM检测和肽扫描。
在一些实施方式中，抗体部分与硬骨抑素之间结合的KD为约10-7M至约10-12M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M，约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M，约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M或约10-7M至约10-9M。
在一些实施方式中，抗体部分和硬骨抑素之间结合的KD高于约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M中的任何一个。在一些实施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些实施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些实施方式中，抗体部分和硬骨抑素之间结合的Kon为约103M-1s-1至约108M-1s-1、约103M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约105M-1s-1，约105M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1，或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方式中，抗体部分与硬骨抑素之间结合的Kon约为103M-1s-1至约105M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1，约106M-1s-1至约108M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方式中，抗体部分与硬骨抑素之间结合的Kon不超过103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中的任何一个。在一些实施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些实施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些实施方式中，抗体部分和硬骨抑素之间结合的Koff为约1s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-3s-1、约10-3s-1至约10-4s-1，约10-4s-1至约10-5s-1，约10-5s-1至约10-6s-1，约1s-1至约10-5s-1，约10-2s-1至约10-6s-1，约10-3s-1至约10-6s-1，约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方式中，抗体部分与硬骨抑素之间结合的Koff为至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中的任何一个。在一些实施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些实施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分或抗硬骨抑素构建体的结合亲和力高于(例如，具有较小的KD值)现有的抗硬骨抑素抗体(例如，罗莫单抗)。
b)嵌合或人源化抗体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)是嵌合抗体。描述了某些嵌合抗体，例如，美国专利US 4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一些实施方式中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体是其中所述类别或亚类已经与亲本抗体发生变化的“类别切换”抗体。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)是人源化抗体。通常，对非人抗体进行人源化以降低对人体的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)来源于非人抗体，FR(或其部分)来源于人抗体序列。可选地，人源化抗体还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基由来自非人抗体的相应残基取代(例如，衍生HVR残基的抗体)，例如，以恢复或提高抗体的特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法的综述参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，其进一步描述参见，例如，Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321以及US 7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“重新表面处理”)；Dall’Acqua et al.,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；and Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)andKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人体框架区包含但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；and Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)and Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
应当理解的是，小鼠衍生抗体的人源化是一种常见且常规使用的技术。因此，应当理解，序列表中公开的任何和所有抗硬骨抑素抗体的人源化形式都可用于临床前或临床环境。如果在这样的临床前或临床环境中使用任何引用的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合区域的人源化形式，则预计当时的人源化形式将具有与原始非人源化形式相同或相似的生物活性和特征。
c)人抗体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)是人抗体(称为人结构域抗体，或人dAb)。人抗体可使用本领域已知的各种技术生成。关于人抗体的描述，通常参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001),Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008),and Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)。能够产生全人源单域抗体(或sdAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见，例如，US20090307787A1，美国专利US 8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794.
人抗体(例如，人dAbs)可通过向转基因动物施用免疫原来制备，所述转基因动物已经过修饰，以针对抗原激发产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白位点，其取代内源性免疫球蛋白位点，或存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白位点通常被灭活。关于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另见，例如，描述XENOMOUSE TM技术的美国专利US6,075,181和US 6,150,584；描述技术的美国专利US 5,770,429；描述K-M />技术的美国专利US 7,041,870，以及描述/>技术的美国专利申请公开说明US 2007/0061900)。可进一步修饰来自此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人恒定区结合。
人抗体(例如，人dAbs)也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；and Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的描述也可以参见Liet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括例如在美国专利US 7,189,826(描述利用杂交瘤细胞系产生人单克隆IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)的描述也可以参见Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)and Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人抗体(例如，人dAbs)也可以通过分离选自人源噬菌体显示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成。然后可以将这种可变结构域序列与理想的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术如下所述。
d)文库衍生抗体
本文所述的抗硬骨抑素抗体部分可以通过筛选组合文库来分离具有所需活性或活性的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有理想结合特性的抗体的多种方法是本领域已知的。此类方法的综述参见，例如，Hoogenboom et al.Methodsin Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)，进一步描述参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；and Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。已经描述了构建单结构域抗体文库的方法，例如，参见美国专利US 7371849.
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后筛选抗原结合噬菌体，如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。噬菌体通常以scFv片段或Fab片段的形式展示抗体片段。免疫来源的文库提供了免疫原的高亲和力抗体，不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆天然库(例如，来自人)以提供针对广泛范围的非自身抗原和自身抗原的单一来源的抗体，而不进行任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高变的CDR3区域并在体外完成重排，来合成天然文库，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体库的专利公开说明包括，例如：美国专利US 5,750,373和美国专利公开说明US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936和US2009/0002360。
从人抗体库中分离出来的抗体或抗体片段被视为本文中的人抗体或人抗体片段。
e)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方式中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。需关注的替代突变位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代见表2“优选取代”一项。更实质性的变化在表2的“示例性取代”一项中提供，在下文中参考氨基酸侧链类别进行进一步描述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并对产品进行理想活性筛选，例如，保留/改善抗原结合，降低免疫原性，或改善ADCC或CDC。
表2.氨基酸取代
原始氨基酸 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；Norleucine Leu
氨基酸可根据常见的侧链性质进行分组：(1)疏水性：去甲亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响主链构象的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将其中一个类的一个成员替换为另一个类。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如，人源化抗体或人抗体)。通常，所选的用于进一步研究的所得变体将针对于亲本抗体修饰(例如，改善)某些生物学特性(例如，亲和力增加，免疫原性降低)并/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地生成，例如，使用诸如本文所述的基于噬菌体显示的亲和力成熟技术。简言之，一个或多个HVR残基发生突变，且是噬菌体上显示的和针对特定生物学活性(例如，结合亲和力)选择的变体抗体。
修改(例如替换)可以在HVR中进行，例如，提高抗体亲和力。此类修改可以在HVR“热点”中进行，即，由体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)，检测所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择获得亲和力成熟的描述可以参见，例如，Hoogenboom et al.Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方式中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库，以鉴定具有理想亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中有几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机分组。可以对参与抗原结合的HVR残基进行特异性鉴定，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是CDR-H3和CDR-L3通常是靶向的。
在一些实施方式中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，保守性修改(例如，如本文中提供的保守取代)不会显著降低结合亲和力，可以在HVR中进行。此类修改可能在HVR“热点”或CDR之外。
一种鉴定可能靶向诱变的抗体残基或区域的可用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，一个残基或一组目标残基(例如，带电残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定并被中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在氨基酸位置引入进一步的取代，证明对初始取代具有功能敏感性。或者，或另外，抗原抗体复合物的晶体结构，以确定抗体和抗原之间的接触点。这些接触残基和相邻残基可以作为取代的候选物被靶向或消除。可以筛选多个变体来确定它们是否含有理想的性质。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有100个或多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体与酶的N端或C端融合(例如，对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽。
f)糖基化变体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)被改变以增加或降低结构糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列来创建或删除一个或多个糖基化位点来方便完成抗体糖基化位点的添加或删除。
当抗体部分包含Fc区时，可改变附着在其上的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一个分支的双触角寡糖，通常通过N-连接附着在Fc区CH2结构域的Asn297上。参见，例如，Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着在双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，可以对抗体部分中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善性质的抗体变体。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)具有缺乏(直接或间接)附着在Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算Asn297糖链内岩藻糖的平均量，相对于通过MALDI-TOF质谱法测量的附着在Asn 297上的所有糖结构的总和(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)测定岩藻糖的量，如WO2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，Asn297也可能位于297位上游或下游约±3个氨基酸处，即，由于抗体的微小序列变异，在294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。美国专利公开说明US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的公开说明的示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO2005/0357778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004).能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka etal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请US 2003/0157108A1,Presta,L；and WO 2004/056312 A1,Adams et al.，特别是在示例11)中，和敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；and WO2003/085107)。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)具有二分寡糖，例如，其中附着在抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc平分。此类抗体变体可能具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变示例的描述参见，例如，WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利US 6,602,684(Umana et al.)和US2005/0123546(Umanaet al.).还提供了在附着在Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能具有改善的CDC功能。此类抗体变体的描述参见，例如，WO 1997/30087(Patel etal.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；and WO 1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变体和轻链恒定区变体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素抗体部分)包含Fc片段。
术语“Fc区”、“Fc结构域”、“Fc片段”或“Fc”是指包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端非抗原结合区。该术语包括天然Fc区和变体Fc区。在一些实施方式中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可能存在也可能不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。除非本文另有说明，否则IgG或Fc区中的氨基酸残基的编号是基于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991所述的抗体的EU编号系统，也称为EU索引。
在一些实施方式中，Fc片段来自免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂交中的一种。在一些实施方式中，Fc片段来自免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂交中的一种。
在一些实施方式中，所述Fc片段具有与相应野生型Fc片段相比降低的效应子功能。(例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)水平测量的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的降低的效应子功能)。
在一些实施方式中，Fc片段是指IgG1 Fc片段。在一些实施方式中，IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方式中，Fc片段是指IgG2或IgG4Fc片段。在一些实施方式中，Fc片段是指包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4Fc片段。在一些实施方式中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方式中，Fc片段包含N297G突变。
在一些实施方式中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含一个或多个氨基酸位置的一个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方式中，Fc片段衍生自来源于大鼠Fc区序列(例如、大鼠IgG2 Fc)或小鼠Fc区序列(例如，小鼠IgG1 Fc)。
在一些实施方式中，Fc片段包含人IgG2 Fc区。
在一些实施方式中，Fc片段包含人IgG4 Fc区。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含选自S228P、T366W和任选H435R中的一个或多个(例如两个、三个或四个)取代。除非另有说明，否则本文所述修饰的编号基于EU索引。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区，所述修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W和可选的H435R。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含选自F126C、L128C、C131S、F170C、P161C、V173C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R中的一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)取代。在一些实施方式中，所述Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含：a)C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V，b)选自F126C、L128C、F170C、P161C和V173C中的取代之一，和c)可选的H435R。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含选自F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R中的一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)取代。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R。在一些实施方式中，所述Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含L128C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、F170C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R。在一些实施方式中，Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、V173C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R。在一些实施方式中，所述Fc片段包含修饰的人IgG4重链Fc区和可选的Y436F，所述修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、P171C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)包含S228P、T366W的第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，以及可选的Y436F，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含：a)C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可选的H435R，和b)选自F126C、L128C、F170C、P161C和V173C中的取代之一。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，所述第一修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含F126C、C131S、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，所述第一修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含L128C、C131S、228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，所述第一修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、F170C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，所述第一修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、V173C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含：a)第一修饰的人IgG4重链Fc区，和b)第二修饰的人IgG4重链Fc区，所述第一修饰的人IgG4重链Fc区包含S228P、T366W，所述第二修饰的人IgG4重链Fc区包含C131S、F171C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含具有F118C、S121C、Q160C、S162C、S176C和/或C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含具有S121C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含具有F118C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含具有S176C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，所述抗硬骨抑素构建体包含具有Q160C和C214S修饰的人Igκ轻链恒定区。在一些实施方式中，所述抗硬骨抑素构建体包含具有S162C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，Fc片段具有一些但不是所有的效应子功能，这使得其成为某些应用的理想候选物，在这些应用中，抗体部分在体内的半衰期是重要的，但某些效应器功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性试验以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可进行Fc受体(FcR)结合试验，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总见表2(Ravetch and Kinet,Annu Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页。用于评估目标分子ADCC活性的体外试验的非限制性示例描述，见美国专利US 5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I etal.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.etal.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性试验方法(例如，参见流式细胞术的ACTI TM非放射性细胞毒性试验(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性试验(Promega,Madison,WI)。用于此类试验的有效效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，可在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中。还可进行C1q结合试验，以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC试验(例如，参见Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；and Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能降低的抗体包含Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的抗体(美国专利US 6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸265位、269位、270位、297位和327位中的两个或多个被取代的Fc突变体，包括被残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利US 7,332,581)。在一些实施方式中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方式中，Fc片段包含N297G突变。
描述了与FcR结合改善或减少的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利6,737,056；WO 2004/056312,and Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001).)
在一些实施方式中，Fc片段是指IgG1Fc片段。在一些实施方式中，IgG1Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方式中，Fc片段是指IgG2或IgG4Fc片段。在一些实施方式中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4Fc片段。
在一些实施方式中，抗体部分包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如，Fc区298位、333位和/或334位的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方式中，在Fc区中进行修改(即，改善或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利US 6,194,551、WO 99/51642and Idusogie etal.J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
在一些实施方式中，所述抗体部分变体包含变体Fc区，所述变体Fc区包含改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。半衰期增加且改善了与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体的描述见US2005/0014934A1(Hinton et al.)，所述新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim etal.,J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述Fc区改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包含在250位、252位、254位、256位、307位、308位、428位、434位(美国专利US 7,371,826)的一个或多个Fc区残基处具有取代的变体，包含具有M428L和N434S的所谓“LS”Fc突变体(WO 2009/086320)以及包含M252Y、S254T和T256E的所谓“YTE”Fc突变体(WO 2002/060919)。
另见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利US 5,648,260；美国专利US 5,624,821；以及涉及Fc区变体的其他示例的WO 94/29351。
h)半胱氨酸工程化抗体变体
在一些实施方式中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体部分，例如，“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基取代。在具体实施方式中，取代的残基位于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，反应性巯基由此定位在抗体的可接近位点处，并且可以用于将抗体与其他部分(例如药物部分或连接子药物部分)偶联，以产生抗体-药物偶联物，如本文进一步所述。在一些实施方式中，以下残基中的任何一个或多个可由半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体部分可以按照例如美国专利US7,521,541中所述生成。
i)抗体衍生物
在一些实施方式中，本文所述的抗体部分可以进一步修饰，以便包括本领域已知且容易获得的其他非蛋白部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧六环、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、丙二醇/环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在生产中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着在抗体上的聚合物的数量可以变化，如果附着了多于一种聚合物，则可以是相同的或不同的分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考量来确定，包括但不限于待改善的抗体的具体性质或功能、抗体衍生物是否将在规定条件下用于诊断等。
在一些实施方式中，抗体部分可以进一步修饰，以便包括一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段。本文中可互换地使用的“生物活性”或“生物活性的”是指在体内展示生物活性以执行具体功能。例如，它可以是指与特定生物分子如蛋白质、DNA等的组合，然后促进或抑制此类生物分子的活性。在一些实施方式中，生物活性蛋白或其片段包括作为活性原料药用于患者以预防或治疗疾病或病症的蛋白质和多肽，以及用于诊断的蛋白质和多肽，例如用于诊断检查或体外检测的酶，以及用于患者以预防疾病的蛋白质和多肽(如疫苗)。
多特异性抗硬骨抑素构建体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，其包含根据本文所述抗硬骨抑素抗体部分中任何一个的抗硬骨抑素抗体部分和特异性识别第二抗原的第二结合部分(例如第二抗体部分)。在一些实施方式中，所述多特异性抗硬骨抑素分子包含抗硬骨抑素抗体部分和特异性识别第二抗原的第二抗体部分。在一些实施方式中，第二抗原是免疫检查点分子。在一些实施方式中，第二抗原是DKK1(Dickkopf Wnt信号通路抑制剂1)或RANKL(核因子-κB受体活化因子配体)。
靶向硬骨抑素和RANKL的多特异性构建体
本申请提供了靶向硬骨抑素和RANKL的多特异性构建体。在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分。在一些实施方式中，硬骨抑素是指人硬骨抑素。在一些实施方式中，RANKL是指人RANKL。
RANKL(核因子-κB受体活化因子配体)，又称肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)，是骨保护素的配体，作为破骨细胞分化和活化的关键因子。该蛋白被证明是一种树突状细胞存活因子，参与调节T细胞依赖性免疫应答。据报道，T细胞活化可诱导该基因的表达，并导致破骨细胞生成和骨丢失增加。该蛋白通过涉及SRC激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)的信号复合物激活抗凋亡激酶AKT/PKB，表明该蛋白可以在细胞凋亡的调控中发挥作用。小鼠相关基因的靶向破坏导致严重的骨硬化和破骨细胞的缺乏。缺陷小鼠表现出T淋巴细胞和B淋巴细胞早期分化缺陷，妊娠期间未能形成小叶-肺泡乳腺结构。
示例性抗RANKL抗体部分
在一些实施方式中，本文所述的多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗RANKL抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争RANKL的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗RANKL抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中VH包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗RANKL部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH链区域内具有SEQ ID NO:72所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL链区域内具有SEQ ID NO:73所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含特异性识别RANKL的第一抗体部分和特异性识别硬骨抑素的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分包含抗RANKL单域抗体(sdAb)部分，其中所述第二抗体部分包含全长抗体，所述全长抗体包含重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)以及Fc片段。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb与包含Fc片段的全长抗体的两条重链融合。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb与全长抗体的两条轻链融合。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb与全长抗体的重链或轻链的N端融合。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb与全长抗体的重链或轻链的C端融合。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb通过连接子(例如本文所述的任何连接子)与全长抗体融合。在一些实施方式中，抗RANKLsdAb不通过连接子与全长抗体融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含特异性识别RANKL的第一抗体部分和特异性识别硬骨抑素的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分包含抗RANKL单域抗体(sdAb)部分，所述第二抗体部分包含重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述构建体包含：a)两条嵌合重链，每条嵌合重链从N端到C端包含：i)VH，ii)第一重链恒定结构域(“CH1结构域”)，iii)抗RANKL sdAb，和iv)Fc结构域，其中所述两个Fc结构域形成Fc片段；b)包含VL和轻链恒定结构域(“CL结构域”)的两条轻链。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb通过第一连接子与Fc结构域融合。在一些实施方式中，抗RANKL sdAb通过第二连接子与VH融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含特异性识别RANKL的第一抗体部分和特异性识别硬骨抑素的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分包含抗RANKL单域抗体(sdAb)部分，所述第二抗体部分包含重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述构建体包含：a)第一重链，所述第一重链从N端至C端包含：i)抗RANKL sdAb，和ii)第一Fc结构域；b)第二重链，所述第二重链从N端到C端包含：i)VH，ii)第一重链恒定结构域(“CH1结构域”)和iii)第二Fc结构域；以及c)包含VL和轻链恒定结构域(“CL结构域”)的轻链，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。
在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个包含T366W突变和可选的S354C突变，另一个Fc结构域包含T366S突变、L368A突变、Y407V突变和可选的Y349C突变。
在一些实施方式中，所述第二抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的第三抗体部分竞争RANKL的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)根据本文所述抗硬骨抑素抗体部分中任何一个所述的抗硬骨抑素抗体部分；b)特异性识别RANKL的第二抗体部分(抗RANKL抗体部分，诸如本文所述的抗RANKL抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，所述抗硬骨抑素VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述抗硬骨抑素VL包含：i)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
在一些实施方式中，所述抗硬骨抑素VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述抗硬骨抑素VL包含：i)具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
在一些实施方式中，上述氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方式中，氨基酸取代仅限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异的(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)具有两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗硬骨抑素全长抗体的至少两条重链融合的抗RANKL抗体部分(如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗RANKL抗体部分与两条重链的N端融合。在一些实施方式中，抗RANKL抗体部分与两条重链的C端融合。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)抗RANKL抗体部分，所述抗RANKL抗体部分包含具有两条重链和两条轻链的全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗RANKL全长抗体的至少一条或两条重链融合的抗硬骨抑素抗体部分(例如本文所述的抗硬骨抑素抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条重链的N端融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条重链的C端融合。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异的(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)具有两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗硬骨抑素全长抗体的至少两条轻链融合的抗RANKL抗体部分(例如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗RANKL抗体部分与两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，抗RANKL抗体部分与两条轻链的C端融合。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异的(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)具有两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗RANKL全长抗体的至少两条轻链融合的抗硬骨抑素抗体部分(例如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条轻链的C端融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含：特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分包含单链Fv片段(scFv)，所述单链Fv片段包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述第二抗体部分是包含第二重链可变区(VH-2)、第二轻链可变区(VL-2)和Fc片段的全长抗体。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链或轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链或轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分通过第一连接子(例如本文所述的任何连接子)与全长抗体融合。在一些实施方式中，第一抗体部分不通过连接子与全长抗体融合。在一些实施方式中，VH-1通过第二连接子(例如本文所述的任何连接子)与VL-1融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构建体，包含：特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分是包含第一重链可变区(VH-1)、第一轻链可变区(VL-1)和Fc片段的全长抗体，所述第二抗体部分包含单链Fv片段(scFv)，所述单链Fv片段包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的重链或轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的重链或轻链两者的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分通过第一连接子(例如本文所述的任何连接子)与全长抗体融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体融合。在一些实施方式中，VH-2通过第二连接子(例如本文所述的任何连接子)与VL-2融合，以便能够正确地组装scFv。在一些实施方式中，VH-2不通过连接子与VL-2融合。
在一些实施方式中，提供了特异性识别硬骨抑素和RANKL的多特异性构建体，包含：第一抗体部分和第二抗体部分，其中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述构建体包含：a)具有第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端至C端包含：i)VL-1，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；b)具有第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i)VH-1，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)，和iii)第一Fc结构域；c)具有第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到C端包含：i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)，和iii)第二Fc结构域；和d)具有第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别硬骨抑素，第二抗体部分特异性识别RANKL。在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别RANKL，第二抗体部分特异性识别硬骨抑素。
在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个包含T366W突变和可选的S354C突变，另一个Fc结构域包含T366S突变、L368A突变、Y407V突变和可选的Y349C突变，其中编号基于EU索引。
在一些实施方式中，i)第一CH1结构域和第一CL结构域或ii)第二CH1结构域和第二CL结构域均选自：a)CH1结构域，其中141位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中116位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；b)CH1结构域，其中168位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中164位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；c)CH1结构域，其中126位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中121位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；d)CH1结构域，其中128位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中118位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；e)CH1结构域，其中170位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中176位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代非为半胱氨酸氨基酸；f)CH1结构域，其中171位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中162位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；g)CH1结构域，其中173位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中160位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代非半胱氨酸氨基酸；其中编号基于EU索引。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构构建体，包含：特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含第一重链可变区(VH-1)，每条轻链包含第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含抗RANKL单链Fv片段(scFv)，所述抗RANKL单链Fv片段(scFv)包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述第二抗体部分与抗硬骨抑素全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQID NO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-2包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，提供了特异性识别硬骨抑素和RANKL的多特异性构建体，包含：第一抗体部分和第二抗体部分，其中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述构建体包含：a)具有第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端至C端包含：i)VL-1，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；b)具有第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i)VH-1，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)，和iii)第一Fc结构域；c)具有第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到C端包含：i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)，和iii)第二Fc结构域；和d)具有第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段，第一抗体部分特异性识别硬骨抑素，第二抗体部分特异性识别RANKL。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-2包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链具有SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别RANKL的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别RANKL的第二抗体部分。在一些实施方式中，所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别RANKL的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别RANKL的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述第二抗体部分：具有第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别RANKL的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89或170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子/不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，抗RANKL抗体部分和抗硬骨抑素抗体部分通过连接子(例如本文所述的任何连接子中的任何一个)与允许结合部分发挥适当作用的任何可操作形式彼此融合。
靶向硬骨抑素和DKK1的多特异性构建体
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)根据本文所述的抗硬骨抑素抗体部分中的任何一个的抗硬骨抑素抗体部分；b)特异性识别DKK1的第二抗体部分(抗DKK1抗体部分)。
DKK1(Dickkopf相关蛋白1)是dickkopf蛋白家族的一员。该家族的成员是分泌蛋白，其特征为两个富含半胱氨酸的结构域，介导蛋白-蛋白质相互作用。DKK1与LRP6共受体结合，抑制β-连环蛋白依赖性Wnt信号传递。该基因在胚胎发育中发挥作用，可能在成人骨形成中起重要作用。
示例性抗DKK1抗体部分
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争DKK1的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争DKK1的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争DKK1的结合表位，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中VH包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中VH包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，多特异性抗硬骨抑素构建体中使用的抗DKK1抗体部分(诸如scFv)包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中VH包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，VL包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，抗DKK1部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH链区域内具有SEQ ID NO:60、62或64所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含VL链区域内具有SEQ ID NO:61、63或65所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)包含两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗硬骨抑素全长抗体的至少两条重链融合的抗DKK1抗体部分(如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗DKK1抗体部分与两条重链的N端融合。在一些实施方式中，抗DKK1抗体部分与两条重链的C端融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)抗DKK1抗体部分，所述抗DKK1抗体部分包含具有两条重链和两条轻链的全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗DKK1全长抗体的至少一条或两条重链融合的抗硬骨抑素抗体部分(例如本文所述的抗硬骨抑素抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条重链的N端融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条重链的C端融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)包含两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗硬骨抑素全长抗体的至少两条重轻链融合的抗DKK1抗体部分(如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗DKK1抗体部分与两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，抗DKK1抗体部分与两条轻链的C端融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)抗DKK1抗体部分，所述抗DKK1抗体部分包含具有两条重链和两条轻链的全长抗体，其中每条重链包含重链可变区(VH)，每条轻链包含轻链可变区(VL)，b)与抗DKK1全长抗体的至少一条或两条轻链融合的抗硬骨抑素抗体部分(例如本文所述的抗体部分中的任何一个)。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与两条轻链的C端融合。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分和抗DKK1抗体部分通过连接子(例如本文所述的任何连接子)与允许结合部分发挥适当作用的任何可操作形式彼此融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分与抗DKK1抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，VL-1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ IDNO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60、164或166的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:61、165或167的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ IDNO:166的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2与所述VL-2的C端融合。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:93的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:93的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:96的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:96的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:99的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:99的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:102的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:102的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:104的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:105的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:107的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:108的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:110的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:111的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:113的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:114的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:119的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:119的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:125的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:125的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分具有第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，VL-1包含SEQID NO:89或170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60、164或166的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:61、165或167的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQID NO:165的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-1上的G44C突变和VL-1上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:119的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:119的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:122的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述多特异性构建体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，每条轻链包含SEQID NO:122的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，VL-1包含SEQID NO:89或170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，VH-1和VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89或170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)抗硬骨抑素构建体，包含：a)特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b)特异性识别DKK1的第二抗体部分，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中所述VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv。在一些实施方式中，所述VH-2融合到所述VL-2的N端。在一些实施方式中，所述VH-2可选地与附接到VH-2的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-2的C端。在一些实施方式中，所述VH-2和所述VL-2通过连接子(例如，GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，所述scFv是dsscFv，可选地包含：a)根据SEQ ID NO:60编号的VH或VH-2中的G44C突变，以及b)根据SEQ ID NO:61编号的VL或VL-2中的G100C突变。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第二抗体部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体，第一抗体部分是包含VH-1和VL-1的scFv。在一些实施方式中，所述VH-1与所述VL-1的N端融合。在一些实施方式中，所述VH-1可选地与附接到VH-1的C端的单个丙氨酸氨基酸融合到VL-1的C端。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，所述VH-1和所述VL-1不通过连接子融合。在一些实施方式中，scFv转化为具有由VH-2上的G44C突变和VL-2上的G100C突变形成的H44-L100二硫键的dsscFv。在一些实施方式中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的N端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的C端融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分通过连接子(例如GS连接子，例如(GGGGS)4)融合。在一些实施方式中，第一抗体部分和第二抗体部分不通过连接子融合。
在一些实施方式中，提供了特异性识别硬骨抑素和DKK1的多特异性构建体，包含：第一抗体部分和第二抗体部分，其中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述构建体包含：a)具有第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端至C端包含：i)VL-1，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；b)具有第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i)VH-1，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)，和iii)第一Fc结构域；c)具有第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到c端包含：i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)，和iii)第二Fc结构域；和d)具有第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别硬骨抑素，第二抗体部分特异性识别DKK1。在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别DKK1，第二抗体部分特异性识别硬骨抑素。
在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个包含T366W突变和可选的S354C突变，另一个Fc结构域包含T366S突变、L368A突变、Y407V突变和可选的Y349C突变，其中编号基于EU索引。
在一些实施方式中，i)第一CH1结构域和第一CL结构域或ii)第二CH1结构域和第二CL结构域均选自：a)CH1结构域，其中141位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中116位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；b)CH1结构域，其中168位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中164位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；c)CH1结构域，其中126位的氨基酸取代为半胱氨酸，220位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中121位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；d)CH1结构域，其中128位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中118位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；e)CH1结构域，其中170位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中176位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；f)CH1结构域，其中171位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中162位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；g)CH1结构域，其中173位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中160位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；其中编号基于EU索引。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366W、H435R和Y436F的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有S121C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有F126C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有S121C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366W、H435R和Y436F的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有L128C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有F118C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有L128C、C131S、S228P、T366W和H435R的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有F118C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有F170C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有S176C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一重链包含具有S228P、T366S、L368A和Y407V的修饰的人IgG4重链Fc区；第二重链包含具有V173C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修饰的人IgG4重链Fc区；第二轻链包含具有Q160C和C214S的修饰的人Igκ轻链恒定区。
在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别硬骨抑素，第二抗体部分特异性识别DKK1。在一些实施方式中，所述VH-1包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:88或160的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-1包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，a)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3；b)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，第一抗体部分特异性识别DKK1，第二抗体部分特异性识别硬骨抑素。在一些实施方式中，所述VH-2包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-2具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL-2具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:87或168的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:88或169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:87或169的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:89或170的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述VL-2包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，a)所述VH-1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3；b)所述VH-1包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c)所述VH-1包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-1包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性构构建体，包含：特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分，其中所述第一抗体部分是包含两条重链和两条轻链的抗硬骨抑素全长抗体，其中每条重链包含第一重链可变区(VH-1)，每条轻链包含第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含抗RANKL单链Fv片段(scFv)，所述抗DKK1单链Fv片段(scFv)包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述第二抗体部分与抗硬骨抑素全长抗体的两条重链的C端融合。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-2包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，提供了特异性识别硬骨抑素和DKK1的多特异性构建体，包含：第一抗体部分和第二抗体部分，其中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，所述构建体包含：a)具有第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端至C端包含：i)VL-1，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；b)具有第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i)VH-1，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)，和iii)第一Fc结构域；c)具有第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到C端包含：i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)，和iii)第二Fc结构域；和d)具有第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段，第一抗体部分特异性识别硬骨抑素，第二抗体部分特异性识别DKK1。在一些实施方式中，所述VH-1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方式中，所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述VH-2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL-2包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的至少约任何一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(例如，双特异性)构建体，包含：a)具有第一可变重链可变区(VH-1)和第一重链恒定区的第一重链，其中所述第一重链包含SEQ IDNO:146的氨基酸序列；b)具有第一轻链可变区(VL-1)和第一轻链恒定区的第一轻链，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；c)具有第二可变重链可变区(VH-2)和第二重链恒定区的第二重链，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列；和d)具有第二轻链可变区(VL-2)和第二轻链恒定区的第二轻链，其中第二轻链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列，VH-1和VL-1包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分，VH-2和VL-2包含特异性识别DKK1的第二抗体部分。抗硬骨抑素融合蛋白或抗体药物偶联物
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体是包含抗硬骨抑素抗体部分(例如，抗硬骨抑素scFv)和第二部分的融合蛋白或抗体药物偶联物。
在一些实施方式中，第二部分包含半衰期延长部分。在一些实施方式中，半衰期延长部分是白蛋白结合部分(例如，白蛋白结合抗体部分)。
在一些实施方式中，第二部分包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分和第二部分通过连接子(例如“连接子”部分中描述的任何连接子)融合。在一些实施方式中，抗硬骨抑素抗体部分和第二部分不通过连接子融合。
连接子
在一些实施方式中，本文所述的抗硬骨抑素构建体包含两个部分(例如，在上述多特异性构建体中，抗硬骨抑素抗体部分和半衰期延长部分、抗硬骨抑素抗体部分和第二结合部分)之间的一个或多个连接子。抗硬骨抑素构建体中使用的连接子的长度、柔韧性程度和/或其他性质可能对性质有一些影响，包括但不限于亲和力，一种或多种特定抗原或表位的特异性或亲和力。例如，可以选择较长的连接子来确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰。在一些实施方式中，连接子(诸如肽连接子)包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，这样相邻结构域彼此之间可以自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联物可以是合适的肽连接子。在一些实施方式中，连接子是非肽连接子。在一些实施方式中，连接子是肽连接子。在一些实施方式中，连接子是不可裂解连接子。在一些实施方式中，连接子是可裂解连接子。
连接子其他考虑因素包括对所得化合物物理或药代动力学特性的影响，例如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定以及计划降解)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
肽连接子
肽连接子可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，可以使用来源于仅重链抗体的铰链区的序列作为连接子，例如参见WO1996/34103。
肽连接子可以具有任何合适的长度。在一些实施方式中，肽连接子的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多氨基酸。在一些实施方式中，肽连接子的长度不超过100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少氨基酸。在一些实施方式中，肽连接子的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸中、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸和约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任何一个。
这种肽连接子的一个基本技术特征是，所述肽连接子不包含任何聚合活性。肽连接子的特征，包括不促进二级结构，在本领域是已知的，并且如Dall’Acqua et al.(Biochem.(1998)37,9266-9273),Cheadle et al.(Mol Immunol(1992)29,21-30)andRaag and Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中所述。在“肽连接子”中，特别优选的氨基酸是Gly。此外，优选也不促进任何二级结构的肽连接子。域之间的相互连接可以由例如，基因工程提供。制备融合的和操作连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域众所周知的(例如，WO 99/54440,Ausubel,Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.1989and 1994or Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。
肽连接子是一种稳定的连接子，不能被蛋白酶特别是基质金属蛋白酶(MMPs)裂解。
连接子也可以是柔性连接子。示例性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQ IDNO:78)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO:79)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:80)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:81)和(GGGS)n(SEQ ID NO:82)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性连接子。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可能能够作为组分之间的中性拴系。甘氨酸能比丙氨酸进入更多的phi-psi空间，并且比侧链长的残基限制小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。本领域技术人员知道，抗体融合蛋白的设计可包括全部或部分柔性的连接子，使得连接子可以包括柔性连接子部分以及赋予较弱柔性结构以提供所需抗体融合蛋白结构的一个或多个部分。
此外，示例性连接子还包括诸如(GGGGS)n(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列，其中n是1至8之间的整数，例如，(GGGGS)3(SEQ ID NO:76)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:77)或(GGGGS)6(SEQ ID NO:83)。在一些实施方式中，肽连接子包含(STSGSGKPGSGEGS)n(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中n是1至3之间的整数。
非肽连接子
两个部分的偶联可以通过将结合两个分子的任何化学反应来完成，只要两个部分保留各自的活性，即，该抗硬骨抑素多特异性抗体的两个部分能够分别与硬骨抑素和第二种抗原结合。该连接子可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插层、配位结合和络合。在一些实施方式中，结合是指共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子来实现。在这种情况下，许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白质分子。例如，代表性偶联剂可以包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表并不旨在详尽地描述本领域已知的各种类型的偶联剂，而是代表更常见的偶联剂(参见Killen and Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen et al.,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；and Vitettaet al.,Science 238:1098(1987))。
可应用于本申请的连接子如参考文献所述(参见，例如Ramakrishnan,S.et al.,Cancer Res.44:201-208(1984)，描述了MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯的用途)。在一些实施方式中，本文使用的非肽连接子包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基-α-甲基-α-(2-嘧啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.,Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.,Cat#21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)和(v)与EDC偶联的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.,Cat.#24510)。
上述连接子含有具有不同属性的组分，因此可能生成具有不同理化性质的双特异性抗体。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳香族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。含NHS酯的连接子的溶解度低于磺基NHS酯。此外，连接子SMPT含有空间位阻二硫键，可以形成稳定性更高的抗体融合蛋白。二硫键通常不如其他连接稳定，因为二硫键在体外被裂解，导致可用的抗体融合蛋白较少。特别是磺基-NHS可以提高碳化亚胺偶联的稳定性。碳二亚胺偶联(如EDC)与磺基-NHS结合使用时，形成的酯比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解。
III.制备方法
在一些实施方式中，提供了一种与硬骨抑素特异性结合的抗硬骨抑素构建体或抗体部分以及在制备抗硬骨抑素构建体或抗体部分时生成的组合物例如多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞或培养基的制备方法。本文所述的抗硬骨抑素构建体或抗体部分或组合物可通过如下一般描述且在示例中更具体描述的许多方法制备。
抗体表达和产生
本文所述的抗体(包括抗硬骨抑素单克隆抗体、抗硬骨抑素双特异性抗体和抗硬骨抑素抗体部分)可使用本领域中任何已知的方法制备，包括下文和示例中描述的方法。
单克隆抗体
单克隆抗体从基本上同源的抗体群中获得，即，组成抗体群的个体抗体是相同的，除了少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特性不是离散抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用首次由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，也可以可通过重组DNA方法制备(美国专利US 4,816,567)。在杂交瘤方法中，如上所述，免疫小鼠或其他适当的宿主动物，如仓鼠或骆驼，以诱导产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103(Academic Press,1986))。关于骆驼免疫，另参见示例1。
免疫剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。免疫剂可由纯化的全长或截短的硬骨抑素多肽或其变体或片段(即，肽)组成。此类肽可通过较大多肽的蛋白水解切割、通过重组分子方法产生，或者可以通过本文所述和本领域已知的方法化学合成。基于人硬骨抑素与LRP6复合物的晶体结构(Kim,J.2020,Nat Commun 11:5357-5357)，发现含有“IGRGKWWR”基序(SEQ ID NO:186)的第二环尖端是硬骨抑素与LRP6的第一螺旋桨结构域结合的主要结合决定簇。用作免疫剂的肽通常可以具有来自覆盖第二环上的“IGRGKWWR”基序的硬骨抑素氨基酸序列的至少7个连续氨基酸的氨基酸序列，如本文所述，而且，优选地具有至少8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸，所述连续氨基酸包含“IGRGKWWR”基序。某些其他优选的肽制剂包含覆盖“IGRGKWWR”基序的硬骨抑素序列的至少8个但不超过12个或更多个连续氨基酸，并且其他优选的肽制剂包含第二环硬骨抑素多肽的24个连续氨基酸。其他优选的肽制剂包含在其第二环中覆盖“IGRGKWWR”基序的8至24个连续氨基酸之间的任何整数氨基酸，或包含全长硬骨抑素序列的多肽。在一个实施方式中，免疫剂是全长人硬骨抑素，或者优选地，是其第二环的一部分，例如，如本文所述，在第二环内合成肽，覆盖氨基酸110-133，或者优选地，119-130，或者更优选地，116-126，或者更优选地，118-125，以产生特异性识别硬骨抑素上第二环的“IGRGKWWR”基序的抗体。一般来说，如果需要人源性细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，如果需要非人源哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress(1986),pp.59-103。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是能够有效融合、支持所选择的抗体生成细胞稳定高水平地产生抗体并且对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞。其中，优选鼠骨髓瘤细胞系，如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，可从美国加州圣地亚哥索尔克生物研究所的细胞分配中心获得，以及SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)，可以从美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系也已被描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。
对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析，以生成直接针对该抗原的单克隆抗体。优选地，通过免疫沉淀或体外结合试验(如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或体外结合试验(如放射免疫分析(RIA)或酶联试验(ELISA))测定。此类技术和试验在本领域中是已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。为了选择特异性中和硬骨抑素抑制Wnt活性能力的单克隆抗体，可以筛选所得杂交瘤，从而使用ELISA或BLI方法确定是否存在与全长人硬骨抑素和含有“IGRGKWWR”基序的第二环的多肽反应的抗体。优选产生特异性结合全长硬骨抑素和含有其“IGRGKWWR”基序的肽的单克隆抗体的杂交瘤，如示例3和4所述。使用HEK293/TCF/LEF/Wnt1报告基因分析(Hannoush RN.,2008,PLoS ONE,3:e3498)选择能够阻断、损害或抑制全长人硬骨抑素与低密度脂蛋白受体相关蛋白家族成员例如LRP5或LRP6结合的单克隆抗体，如示例7所述。
在鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或活性抗体的杂交瘤细胞后，克隆体可通过有限稀释方法亚克隆，并通过标准方法生长(Goding，见上文)。为此，适用的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为肿瘤在哺乳动物体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分离。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备，如美国专利US 4,816,567中所述的方法，如上所述。使用常规程序很容易分离编码单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA放入表达载体中，然后转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，这些细胞不会以其他方式产生免疫球蛋白，从而在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)and Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方式中，可以使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中所述的技术将抗体从生成的抗体噬菌体文库中分离。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠抗体和人抗体。后续公开说明描述了通过链重排生成高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
DNA也可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列来修饰(美国专利US 4,816,567；Morrison,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过共价连接到免疫球蛋白编码序列上非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来修饰。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备方法在本领域中是众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区的任何点截短，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以用另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段，可以使用本领域已知的常规技术来完成。
嵌合或杂交抗体也可在体外使用合成蛋白质化学中的已知方法制备，包括使用交联剂的方法，例如，免疫毒素可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键构建。用于此目的的合适试剂的示例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁嘧啶甲酯。
编码抗体部分的核酸分子
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的抗硬骨抑素构建体或抗体部分中的任何一种的多核苷酸。在一些实施方式中，提供了使用本文所述方法中的任何一种制备的多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)的重链的多核苷酸和轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些这样的实施方式中，重链和轻链由一个核酸分子或两个单独的核酸分子表达为两种单独的多肽。在一些实施方式中，例如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方式中，编码抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，翻译时，前导序列位于重链或轻链的N端。如上所述，前导序列可以是天然重链或轻链的前导序列，或可以是另一个异源前导序列。
在一些实施方式中，多核苷酸是指DNA。在一些实施方式中，多核苷酸是指RNA。在一些实施方式中，RNA是指mRNA。
可以使用本领域常规的重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是适于在选定宿主细胞中表达的表达载体。
核酸构建体
在一些实施方式中，提供了包含本文所述的多核苷酸中的任何一种的核酸构建体。在一些实施方式中，提供了使用本文所述的任何方法制备的核酸构建体。
在一些实施方式中，所述核酸构建体还包含可操作地连接到所述多核苷酸的启动子。在一些实施方式中，所述多核苷酸对应于基因，其中所述启动子是所述基因的野生型启动子。
载体
在一些实施方式中，提供了一种载体，包含编码本文所述抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)中任何一个的重链和/或轻链的任何多核苷酸或本文所述的核酸构建体。在一些实施方式中，提供了使用本文所述的任何方法制备的载体。载体包含编码抗硬骨抑素构建体中的任何一种的多核苷酸，例如抗体、scFvs、融合蛋白或本文所述的其它形式的构建体(例如，抗硬骨抑素scFv)。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方式中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方式中，重链和轻链从载体表达为两种单独的多肽。在一些实施方式中，重链和轻链表达为单个多肽的一部分，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方式中，第一载体包含编码重链的多核苷酸，第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方式中，将第一载体和第二载体以相似的量(例如相似的摩尔量或相似的质量)转染到宿主细胞中。在一些实施方式中，将摩尔比或质量比在5:1至1:5之间的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方式中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用1:1至1:5的质量比。在一些实施方式中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用1:2的质量比。
在一些实施方式中，选择优化用于在CHO或CHO衍生细胞或NS0细胞中表达多肽的载体。描述了示例性的此类载体，例如，参见Running Deer et al.,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004).
宿主细胞
在一些实施方式中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方式中，提供了使用本文所述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞能够在发酵条件下产生本文所述的抗体部分中的任何一种。
在一些实施方式中，本文所述的抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)可在原核细胞(如细菌细胞)中表达；或在真核细胞中表达，如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。这种表达可以根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞(Crucell)；以及NS0细胞。在一些实施方式中，本文所述的抗体部分(例如，抗硬骨抑素抗体部分)可以在酵母中表达。参见，例如，美国公开说明US 2006/0270045 A1。在一些实施方式中，基于其对抗体部分的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力来选择具体的真核宿主细胞。例如，在一些实施方式中，CHO细胞产生的多肽具有比在293细胞中产生的相同多肽更高水平的唾液酸化。
可以通过任何方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞中，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法的描述参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据任何合适的方法，核酸可以瞬时或稳定地转染到所需的宿主细胞中。
本申请还提供了包含本文所述的多核苷酸或载体中的任何一种的宿主细胞。在一些实施方式中，本发明提供了包含抗硬骨抑素抗体的宿主细胞。能够过表达异源DNA的任何宿主细胞均可用于分离编码目标抗体、多肽或蛋白的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性示例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。另见PCT公开说明WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(如酿酒酵母、粟酒酵母或乳酸杆菌)。
在一些实施方式中，抗体部分在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统的描述参见，例如，Sitaraman et al.,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo et al.,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003).培养基
在一些实施方式中，提供了包含本文所述的任何抗体部分、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施方式中，提供了使用本文所述的任何方法制备的培养基。
在一些实施方式中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，HAT培养基)。在一些实施方式中，培养基不包含血清。在一些实施方式中，培养基包含血清。在一些实施方式中，培养基是指D-MEM或RPMI-1640培养基。
抗体部分的纯化
抗硬骨抑素构建体(例如，抗硬骨抑素单克隆抗体或多特异性抗体)可以通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和力基质或疏水相互作用层析。合适的亲和力配体包括ROR1胞外结构域和结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可用于结合恒定区并纯化包含Fc片段的抗硬骨抑素构建体。疏水相互作用层析，例如丁基柱或苯基柱，也可适用于纯化一些多肽，如抗体。离子交换层析(例如阴离子交换层析和/或阳离子交换层析)也适用于纯化一些多肽，如抗体。混合模式层析(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化一些多肽，如抗体。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
IV.治疗方法
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体的疾病或病症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的抗硬骨抑素构建体或药物组合物。在一些实施方式中，所述疾病或病症是骨相关疾病或软骨相关疾病、骨髓或血液学疾病、骨骼肌肉系统罕见病、肌肉相关疾病或癌症。
本文所述的方法适用于任何骨相关疾病或病症。在一些实施方式中，骨相关疾病包括成骨不全、骨质疏松症或骨质减少症(男性和/或女性)、骨坏死、骨延迟愈合、骨折不愈合、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤相关骨病症、原发性骨肿瘤、恶性肿瘤的骨转移、炎性或感染性骨病、骨软化症、高钙血症、佩吉特病、不活动引起的骨丢失、糖皮质激素诱导的骨丢失、炎症诱导的骨丢失，包括关节炎诱导的骨丢失、宇航员骨质疏松症/骨质减少症和失重引起的骨丢失，或者与a)骨量或骨质丢失或两者丢失和/或b)骨结构和骨质异常相关的其他疾病或病症。在一些实施方式中，骨相关疾病是指骨质疏松症或骨质减少症。在一些实施方式中，骨相关病症是指成骨不全。在一些实施方式中，骨相关病症是指多发性骨髓瘤和多发性骨髓瘤相关骨病症。
在一些实施方式中，疾病或病症是指软骨病症。在一些实施方式中，软骨病症包括软骨瘤病、软骨发育不良、软骨发育不全、骨骺发育不良、软骨营养不良性肌强直、皮质旁软骨瘤、膝关节软骨撕裂、骨纤维发育不良、骨关节炎、成骨不全、低磷酸盐性佝偻病或骨软骨营养不良。
在一些实施方式中，疾病或病症是指肌肉相关疾病。在一些实施方式中，肌肉相关疾病是指肌肉减少症和癌症相关的肌肉减少症。
在一些实施方式中，疾病或病症是指癌症(例如，血液恶性肿瘤，例如，多发性骨髓瘤)。
在一些实施方式中，提供了一种促进个体骨骼或关节手术后愈合的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗硬骨抑素构建体(例如本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任何一种)。
在一些实施方式中，提供了治疗个体疾病或病症(例如，骨相关疾病)的方法，包括向所述个体施用有效安装的抗硬骨抑素构建体，所述抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQ ID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
在一些实施方式中，提供了治疗个体疾病或病症(例如骨相关疾病)，包括向所述个体施用有效量的多特异性构建体，所述多特异性构建体包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别RANKL的第二抗体部分。在一些实施方式中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中VH-1包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL-1包含：i)具有SEQ ID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，提供了治疗个体疾病或病症(例如骨相关疾病)，包括向所述个体施用有效量的多特异性构建体，所述多特异性构建体包含特异性识别硬骨抑素的第一抗体部分和特异性识别DKK1的第二抗体部分。在一些实施方式中，所述第一抗体部分包含第一重链可变区(VH-1)和第一轻链可变区(VL-1)，其中VH-1包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL-1包含：i)具有SEQ ID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，所述第二抗体部分包含第二重链可变区(V-H-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中：a)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3；b)所述VH-2包含具有SEQID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物(例如人类)。
抗硬骨抑素构建体的给药剂量和给药方法
用于治疗如本文所述的疾病或病症的抗硬骨抑素构建体施用至个体的给药方案(例如特定剂量和频率)可以根据具体的抗硬骨抑素构建体(例如抗硬骨抑素单克隆抗体或多特异性抗体，如抗硬骨抑素融合蛋白)、给药方式以及正在治疗的疾病或病症的类型而变化。
在上述任何方面的一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体(例如抗硬骨抑素单克隆抗体或多特异性抗体)的有效量在约0.001μg/kg至约500mg/kg总体重的范围内，例如约0.005μg/kg至约100mg/kg、约0.01μg/kg至约50mg/kg或约0.01μg/kg至约5mg/kg。
在一些实施方式中，治疗包括多次施用抗硬骨抑素构建体(例如约2、3、4、5、6、7、8、9或10次施用抗硬骨抑素构建体)。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体以约每天、每周、每周两次、每月一次、每三个月一次、每六个月或每年一次的频率施用。
抗硬骨抑素构建体可通过各种途径施用至个体(例如人)，包括例如静脉内、关节内、动脉内、腹腔内、肺内、口服、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透粘膜和经皮。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含在药物组合物中，同时施用到个体中。在一些实施方式中，可以使用组合物的持续释放制剂。在一些实施方式中，所述组合物经静脉注射。在一些实施方式中，所述组合物经腹腔注射。在一些实施方式中，所述组合物经静脉注射。在一些实施方式中，所述组合物经腹腔注射。在一些实施方式中，所述组合物经肌肉注射。在一些实施方式中，所述组合物经皮下注射。在一些实施方式中，所述组合物经静脉注射。在一些实施方式中，所述组合物口服。
联合治疗
本申请还提供了向个体施用抗硬骨抑素构建体以治疗疾病或病症(例如骨相关疾病)的方法，其中所述方法还包括施用第二种药物或疗法。在一些实施方式中，第二中药物或疗法是用于治疗疾病或病症的标准或常用的药物或疗法。
在一些实施方式中，提供了治疗个体疾病或病症(例如，骨相关疾病)，包括向个体施用a)有效量的抗硬骨抑素构建体(例如本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任何一种)；和b)第二种疗法或药物。在一些实施方式中，第二中疗法或药物是抗DKK1抗体或抗RANKL抗体。在一些实施方式中，第二种药物或疗法包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
在一些实施方式中，提供了治疗个体疾病或病症(例如，骨相关疾病)，包括向个体施用a)有效量的抗硬骨抑素构建体(例如本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任何一种)；和b)抗DKK1抗体。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，所述抗DKK1抗体包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3，VL-2包含具有SEQID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，提供了个体治疗疾病或病症(例如，骨相关疾病)，包括向个体施用a)有效量的抗硬骨抑素构建体(例如本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任何一种)；和b)抗RANKL抗体。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；VL包含：i)具有SEQID NO:15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，所述抗RANKL抗体包含第二重链可变区(V-H-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中：a)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3；b)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c)所述VH-2包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体和第二种药物或疗法同时施用。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体和第二种药物或疗法同时施用。在一些实施方式中，抗硬骨抑素构建体和第二种药物或疗法依次施用。
V.组成、试剂盒和制品
本文还提供了包含本文所述的抗硬骨抑素构建体或抗硬骨抑素抗体部分、编码抗体部分的核酸、包含编码抗体部分的核酸的载体或包含核酸或载体的宿主细胞的组合物(例如制剂，如药物组合物)。
在一些实施方式中，提供了包含抗硬骨抑素构建体(例如本文所述的抗硬骨抑素构建体中的任一种)和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，该组合物还包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
本文所述的抗硬骨抑素构建体的合适制剂可通过将具有所需纯度的抗硬骨抑素构建体或抗硬骨抑素抗体部分与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来获得(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式存在。可接受的载体、辅料或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体无毒，包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄基氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸甲酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如烯丙基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。适用于皮下给药的冻干制剂如WO97/04801所述。此类冻干制剂可以用合适的稀释剂复溶至高蛋白浓度，并且复溶制剂可皮下注射给本文将成像、诊断或治疗的个体。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这很容易通过以下方式实现，例如，通过除菌过滤膜过滤。
还提供了包含本文所述的抗硬骨抑素构建体或抗硬骨抑素抗体部分中的任何一者的试剂盒。该试剂盒可用于本文所述的调节细胞组合物或治疗的任何方法。
在一些实施方式中，提供了包含特异性结合到硬骨抑素的抗硬骨抑素构建体的试剂盒。
在一些实施方式中，该试剂盒还包括能够将抗硬骨抑素构建体递送到个体体内的装置。用于诸如胃肠外递送的应用的一类装置是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。吸入装置也可用于某些应用。
在一些实施方式中，该试剂盒还包括用于治疗疾病或病症的治疗药物，例如，骨相关疾病，例如，成骨不全、骨硬化或与骨丢失相关的疾病或病症。
本申请的试剂盒采用合适的包装。适用的包装包括但不限于西林瓶、一般瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。试剂盒可以选择提供其他组件，如缓冲液，以及解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。所述制品可以包括容器和容器上或与容器相关联的标签或药品说明书。适用的容器包括西林瓶(如密封西林瓶)、一般瓶子、罐子、柔性包装等。通常，容器盛装组合物，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的西林瓶)。标签或药品说明书表明组合物用于对个体的具体病症进行成像、诊断或治疗。标签或药品说明书还将包括用于个体适用组合物和用于对个体成像的说明。标签可以包括复溶和/或使用的说明。盛装组合物的容器可以是多用途西林瓶，允许复溶制剂重复给药(例如，给药2-6次)。药品说明书是指通常包含在商业化诊断产品包装中的说明书，其中包含关于此类诊断产品使用的适应症、用法、用量、给药、禁忌症和/或警告信息。此外，所述制品还可以包括包含药学上可接受的缓冲液(例如无菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和葡萄糖溶液)的第二容器。还可以包括从商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
所述试剂盒或制品可以包括组合物的多种单位剂量和使用说明书，其包装量足以在药房(例如，医院药房和配制药房)中储存和使用。
本领域技术人员知道，在本发明的发明构思范围内可能有多个实施方式。现将参考以下非限制性示例对本发明进行更详细的描述。以下具体实施方式及实施例进一步说明了本发明，但应理解地，不应被解释为以任何方式限制其范围。
具体实施方式
实施方式1。一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，其中所述抗体部分结合到硬骨抑素上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列。
实施方式2。一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，其中所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
所述VH包含具有SEQ ID NO:1-4和12中任一项的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQID NO:5-8和13中任一项的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9-11和14中任一项的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；以及
所述VL包含具有SEQ ID NO:15-17、85和86中任一项的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18和19中任一项的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20和21中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
实施方式3实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中：
a)所述VH包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQID NO:15或16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
b)所述VH包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ IDNO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式4。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式5。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式6。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式7。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式8。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式9。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式10。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:21中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式11。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式12。实施方式1或2所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含具有SEQID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式13。一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，其中所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别具有具有SEQ ID NO:22所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:23所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
b)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:24所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:25所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
c)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:26所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:27所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
d)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:28所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:29所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
e)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含VH内具有SEQ ID NO:30所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:31所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
f)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:32所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:33所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
g)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:34所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:35所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
h)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:36所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:37所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
i)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:38所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:39所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
j)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:40所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:41所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
k)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:87所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:88所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
l)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:87所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:89所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或者
m)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:87所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ IDNO:90所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
实施方式14。实施方式1-13中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和87中任一项的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；和/或，所述VL包含SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和88-90中任一项的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
实施方式15。实施方式14所述的抗硬骨抑素构建体，其中：
a)所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
b)所述VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
c)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
d)所述VH包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
e)所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
f)所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
g)所述VH包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
h)所述VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
i)所述VH包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
j)所述VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
k)所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；
l)所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；或者
m)所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
实施方式16。一种抗硬骨抑素构建体，包含特异性识别硬骨抑素的抗体部分，所述抗体部分是人源化抗体部分，来源于包含重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)的抗硬骨抑素抗体，其中：
a)所述VH包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
b)所述VH包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
c)所述VH包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
d)所述VH包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
e)所述VH包含具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
f)所述VH包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
g)所述VH包含具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:20中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；或者
h)所述VH包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，或其具有HC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；所述VL包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:21中任一项的氨基酸序列的LC-CDR3，或其具有LC-CDR中多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。
实施方式17。实施方式1-16中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗体部分是一种抗体或其抗原结合片段，选自全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、二硫键稳定性scFv(dsscFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、双体抗体(diabody)、三体抗体(tribody)和四体抗体(tetrabody)。
实施方式18。实施方式1-17中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述构建体是包含Fc片段的全长抗体。
实施方式19。实施方式17所述的抗硬骨抑素构建体，其中抗体部分是scFv片段。
实施方式20。实施方式1-19中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述硬骨抑素是人硬骨抑素。
实施方式21。实施方式1-17和19-20中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素构建体还包含第二部分。
实施方式22。实施方式21所述的抗硬骨抑素构建体，其中第二部分包含特异性识别抗原的第二抗体部分。
实施方式23。实施方式22所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分包含第二重链可变区(VH-2)和轻链可变区(VL-2)。
实施方式24。实施方式22或23所述的抗硬骨抑素构建体，其中抗原是DKK1。
实施方式25。实施方式24所述的抗硬骨抑素构建体，其中DKK1是人DKK1。
实施方式26。实施方式24或25所述的抗硬骨抑素构建体，其中第二抗体部分与包含第三重链可变区(VH-3)和第三轻链可变区(VL-3)的第三抗体部分竞争DKK1的结合表位，其中：
a)所述VH-3包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含具有SEQID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3；
b)所述VH-3包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含具有SEQID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
c)所述VH-3包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含具有SEQID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式27。实施方式26所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH-2包含具有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-2包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式28。实施方式26所述的抗硬骨抑素构建体，其中VH-2包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-2包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式29。实施方式26所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH-2包含具有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-2包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式30。实施方式22或23所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗原是RANKL。
实施方式31。实施方式30所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗原是人RANKL。
实施方式32。实施方式30或31所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分与包含第三重链可变区(VH-3)和第三轻链可变区(VL-3)的第三抗体部分竞争RANKL的结合表位，其中所述VH-3包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含具有SEQID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式33。实施方式31所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH-2包含具有SEQ IDNO:66的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-2包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方式34。实施方式22-33中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链Fv(scFv)片段、scFv-scFv、微型抗体(nanobody)、双体抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)。
实施方式35。实施方式34所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分是包含两条重链、两条轻链和Fc片段的全长抗体，所述抗硬骨抑素抗体部分是包含与VL融合的VH的单链Fv(scFv)片段。
实施方式36。实施方式35所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分与所述全长抗体的一条或两条重链融合。
实施方式37。实施方式34-36中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分与所述全长抗体的一条或两条轻链融合。
实施方式38。实施方式36或37所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分与所述全长抗体的一条或两条重链或轻链的N端融合。
实施方式39。实施方式36-38中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分与所述全长抗体的一条或两条重链或轻链的C端融合。
实施方式40。实施方式36-39中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分通过第一连接子与所述全长抗体融合。
实施方式41。实施方式36-39中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分不通过连接子与所述全长抗体融合。
实施方式42。实施方式40所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第一连接子是选自SEQ ID NO:74-84的GS连接子。
实施方式43。实施方式35-42中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH通过第二连接子与所述VL融合。
实施方式44。实施方式43所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VH、第二连接子和VL。
实施方式45。实施方式43所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述scFv片段N端到C端包含：VL、第二连接子和VH以及可选的C端丙氨酸残基。
实施方式46。实施方式43-45中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二连接子包含SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列。
实施方式47。实施方式23-33中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv片段，所述抗硬骨抑素抗体部分是包含两条重链、两条轻链和Fc片段的全长抗体。
实施方式48。实施方式46所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分与所述全长抗体的两条重链融合。
实施方式49。实施方式47或48所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二抗体部分与所述全长抗体的两条轻链融合。
实施方式50。实施方式48或49所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗体部分与所述全长抗体的两条重链或轻链的N端融合。
实施方式51。实施方式47-50中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗体部分与所述全长抗体的两条重链或轻链的C端融合。
实施方式52。实施方式47-51中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗体部分通过第一连接子与所述全长抗体融合。
实施方式53。实施方式47-51中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述抗体部分不通过连接子与所述全长抗体融合。
实施方式54。实施方式52所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第一连接子是选自SEQ ID NO:74-84的GS第一连接子。
实施方式55。实施方式47-54中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH-2通过第二连接子与所述VL-2融合。
实施方式56。实施方式47-54中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述VH-2不通过连接子与所述VL-2融合。
实施方式57。实施方式55所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VH-2、第二连接子和VL-2。
实施方式58。实施方式55所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VL-2、第二连接子和VH-2，以及可选的C端丙氨酸残基。
实施方式59。实施方式55和57-58中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述第二连接子包含SEQ ID NO:76或77的氨基酸序列。
实施方式60。实施方式35-59中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述scFv是二硫键稳定性scFv(“dsscFv”)。
实施方式61。实施方式60所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述dsscFv包含：a)根据SEQ ID NO:60的编号的VH或VH-2中的G44C突变，和b)根据SEQ ID NO:61的编号的VL或VL-2中的G100C突变。
实施方式62。实施方式35-61中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述构建体包含：
1)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
2)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
3)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
4)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
5)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；
6)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；
7)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；
8)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；
9)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；
10)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列；
11)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列；
12)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列；
13)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列；
14)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列；
15)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列；
16)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；
17)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列；
18)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列；
19)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列；
20)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列；
21)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；
22)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；
23)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；
24)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；
25)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；
26)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；
27)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；
28)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；
29)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列；
30)两条重链，每条重链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列；以及两条轻链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条轻链包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列；
31)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；
32)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；
33)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；
34)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；或者
35)两条重链，其与所述抗硬骨抑素的抗体部分或第二抗体部分融合，每条重链包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列；以及两条轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
实施方式63。实施方式23-33中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述构建体包含：
a)包含第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端到C端包含：i)VL，ii)第一轻链恒定结构域(“第一CL结构域”)；
b)包含第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i)VH，ii)第一重链恒定结构域(“第一CH1结构域”)，和iii)第一Fc结构域；
c)包含第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到c端包含：i)VH-2，ii)第二重链恒定结构域(“第二CH1结构域”)，和iii)第二Fc结构域；以及
d)包含第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i)VL-2，ii)第二轻链恒定结构域(“第二CL结构域”)；
其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。
实施方式64。实施方式63所述的抗硬骨抑素构建体，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个包含T366W突变和可选的S354C突变，另一个Fc结构域包含T366S突变、L368A突变、Y407V突变和可选的Y349C突变，其中编号基于EU索引。
实施方式65。实施方式63或64所述的抗硬骨抑素构建体，其中：i)第一CH1结构域和第一CL结构域，或ii)第二CH1结构域和第二CL结构域均选自：
a)CH1结构域，其中141位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中116位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
b)CH1结构域，其中168位的氨基酸置为换半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中164位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
c)CH1结构域，其中126位的氨基酸置为换半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中121位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
d)CH1结构域，其中128位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中118位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
e)CH1结构域，其中170位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中176位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
f)CH1结构域，其中171位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中162位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
g)CH1结构域，其中173位的氨基酸取代为半胱氨酸，131位(例如，在IgG2或IgG4中)或220位(例如，在IgG1中)的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；以及CL结构域，其中160位的氨基酸取代为半胱氨酸，214位的半胱氨酸取代为非半胱氨酸氨基酸；
其中编号基于EU索引。
实施方式66。实施方式63-65中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，包含：
1)第一多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；
2)第一多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；
3)第一多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列；
4)第一多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；
5)第一多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列；
6)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列；
7)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列；
8)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列；
9)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；
10)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列；
11)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列；
12)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列；
13)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列；
14)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列；
15)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列；
16)第一多肽包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。
实施方式67。实施方式21所述的抗硬骨抑素构建体，其中第二部分包含半衰期延长部分。
实施方式68。实施方式67所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述半衰期延长部分是指Fc片段。
实施方式69。实施方式18、35-66和68中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段及其组合和杂交中的一种。
实施方式70。实施方式69所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段及其组合和杂交中的一种。
实施方式71。实施方式69或70所述的抗硬骨抑素构建体，其中Fc片段包含H435R突变和Y436F突变。
实施方式72。实施方式69-71中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中，所述Fc片段具有与相应野生型Fc片段相比降低的效应子功能。
实施方式73。实施方式69-71中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述Fc片段具有：a)与相应野生型Fc片段相比增强的效应子功能，和/或b)与相应野生型Fc片段相比增强的FcRn结合亲和力。
实施方式74。实施方式21所述的抗硬骨抑素构建体，其中所述构建体是抗体-药物偶联物或抗体融合蛋白。
实施方式75。实施方式74所述的抗硬骨抑素构建体，其中第二部分包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)、降钙素及其组合中的一种或几种。
实施方式76。一种抗硬骨抑素构建体，与实施方式1-75中任一项所述的抗硬骨抑素构建体竞争性地与硬骨抑素特异性结合。
实施方式77。一种药物组合物，包含实施方式1-76中任一项所述的抗硬骨抑素构建体和药学上可接受的载体。
实施方式78。实施方式77所述的药物组合物，所述组合物还包含药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)、降钙素及其组合中的一种或几种。
实施方式79。一种分离核酸，编码实施方式1-76中任一项所述的抗硬骨抑素构建体。
实施方式80。一种载体，包含实施方式79所述的分离的核酸分子。
实施方式81。一种分离宿主细胞，包含实施方式79所述的分离的核酸分子或实施方式80所述的载体。
实施方式82。一种制备抗硬骨抑素构建体的方法，包含：
a)在有效表达抗硬骨抑素构建体或其一部分的条件下培养实施方式81所述的分离的宿主细胞；以及
b)从宿主细胞获得表达的抗硬骨抑素构建体或其一部分。
实施方式83。一种治疗和/或预防个体的疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的实施方式1-76中任一项所述的抗硬骨抑素构建体，或实施方式77或78所述的药物组合物。
实施方式84。实施方式83所述的方法，其中所述疾病或病症是骨相关疾病或软骨相关病症、骨髓或血液学疾病、骨骼肌肉系统罕见病、肌肉相关疾病或癌症。
实施方式85。实施方式84所述的方法，其中所述骨相关疾病包括成骨不全、骨质疏松症或骨质减少症(男性和女性)、骨坏死、骨延迟愈合、骨折不愈合、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤相关骨病症、原发性骨肿瘤、恶性肿瘤的骨转移、炎性或感染性骨病、骨软化症、高钙血症、佩吉特病、不活动引起的骨丢失、糖皮质激素诱导的骨丢失、炎症诱导的骨丢失，包括关节炎诱导的骨丢失、宇航员骨质疏松症/骨质减少症和失重引起的骨丢失，或者与a)骨量或骨质丢失或两者丢失和/或b)骨结构和骨质异常相关的其他疾病或病症。
实施方式86。实施方式85所述的方法，其中所述骨相关疾病是指骨质疏松症或骨质减少症。
实施方式87。实施方式85所述的方法，其中所述骨相关疾病是指成骨不全。
实施方式88。实施方式85所述的方法，其中所述骨相关疾病是指多发性骨髓瘤和多发性骨髓瘤相关骨病症。
实施方式89。实施方式84所述的方法，其中所述软骨疾病包括软骨瘤病、软骨发育不良、软骨发育不全、骨骺发育不良、软骨营养不良性肌强直、皮质旁软骨瘤、膝关节软骨撕裂、骨纤维发育不良、骨关节炎、成骨不全、低磷酸盐性佝偻病或骨软骨营养不良。
实施方式90。实施方式84所述的方法，其中所述肌肉相关疾病指是肌肉减少症和癌症相关的肌肉减少症。
实施方式91。一种促进个体骨骼或关节手术后愈合的方法，包括向个体施用有效量的实施方式1-76中任一项所述的抗硬骨抑素构建体和/或实施方式77或78所述的药物组合物。
实施方式92。实施方式83-91中任一项所述的方法，其中所述抗硬骨抑素构建体通过皮下注射、静脉注射、肌内注射、口服或肠外给药的方式施用到所述个体中。
实施方式93。实施方式83-92中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用第二种药物或疗法。
实施方式94。实施方式93所述的方法，其中所述第二种药物或疗法包括抗DKK1抗体。
实施方式95。实施方式93所述的方法，其中所述第二种药物或疗法包括抗RANKL抗体。
实施方式96。实施方式93所述的方法，其中第二种药物或疗法包括药剂，选自甲状旁腺激素(PTH)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、双膦酸盐、前列腺素E(PGE)受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子(肌生长抑制素)和降钙素中的一种。
实施方式97。实施方式83-96中任一项所述的方法，其中所述个体是指人。
实施例
以下实施例完全是应用的示例，因此不应被认为以任何方式限制应用。以下实施例和详细描述是为了说明，而不是进行限制。
实施例1.抗硬骨抑素单克隆抗体的制备
抗人SOST单克隆抗体是通过免疫小鼠产生的。使用的是实验用BALB/c小鼠(18-20g，7-8周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司)和C57小鼠(18-20g，7-8周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司)。这些动物在SPF级实验室饲养1周，12/12小时光照/黑暗周期，温度20-25℃，湿度40％-60％。
将带有His标签(HST-H5245，Acro Biosystems)的人SOST重组蛋白作为免疫原。使用专有佐剂(批号20200120)进行乳化，然后向抗原中加入等体积的佐剂，使总体积达到300μl。将抗原/佐剂溶液用电混合机乳化，并且用多维旋转器混合。用75％乙醇消毒后，皮下注射抗原/佐剂溶液。将抗原乳化，并在第0、14、28天接种。在脾细胞融合前3天，向每只小鼠腹腔(IP)注射50μg生理盐水配制的抗原溶液进行加强免疫。在第22、36和45天进行血液滴度检测。第3次免疫后，选择血滴度最高的2只趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。用电细胞操作器(BTX，ECM2001)常规的融合程序，将脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，获得杂交瘤细胞。用实施例3所述的ELISA方法测定小鼠血清与人硬骨抑素的结合活性，并选择体外结合活性良好的单克隆杂交瘤细胞株。结果如表5所示。
实施例2.抗硬骨抑素单克隆抗体的克隆和测序
杂交瘤测序过程如下。根据试剂技术手册，从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后根据PrimeScriptTM第1链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。根据cDNA末端快速扩增(RACE)标准操作规程(SOP)扩增重链和轻链抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆至标准克隆载体中。进行菌落PCR，以筛选出大小合适的插入片段的克隆体。最终提供了共有序列(consensus sequence)。
序列分析
分析所有构建体的DNA序列数据，并确定重链和轻链的共有序列。表3和表4列出了各种抗体的VH和VL CDR和共有序列。
表3.各种抗体的VH CDR和共有序列。
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表4.各种抗体的VL CDR
实施例3.ELISA法测定抗硬骨抑素抗体与硬骨抑素的结合
通过ELISA捕获试验测定抗体特异性结合硬骨抑素的能力。用小鼠His标记的人硬骨抑素(NCBI参考编号为NP_079513.1)[0.5μg/mg]的包被缓冲液(PBS，pH7.4)以100μl/孔在96孔半面积中包被平板，并在室温下孵育1小时或4℃下过夜。用100μl/孔的洗涤液(含0.2％吐温20的PBS，BIO-RAD)洗涤平板一次。然后将平板在封闭液(含1％BSA、1％山羊血清和0.5％吐温20的PBS；100μl/孔)中于室温(RT)下孵育1小时。然后将不同浓度(1000、333.3、111.1、37.0、12.3、4.1、1.4、0.5、0.15、0.05ng/ml)的抗硬骨抑素抗体、阳性对照抗体罗莫单抗或非硬骨抑素相关IgG(人或小鼠IgG，阴性对照)以20μl/孔的封闭液加入到各孔中，将平板在室温下孵育1小时。向每个孔(20ml/孔)中加入用封闭液稀释(1:50,000稀释)的NeutrAvidin HRP(Pierce，目录号31001)，将平板在室温下孵育1小时，然后用100ml/孔的洗涤液洗涤3次。向平板中加入SuperSignal ELISA Femto(ThermoFisherScientific，目录号37074)工作溶液(20ml/孔)。使用光度计在425nm处读取信号。
如下表5所示，与罗莫单抗相比，所检测的抗硬骨抑素抗体表现出相当或更有利的EC50值。具体来说，与罗莫单抗相比，93B1B7表现出了更有利的EC50值。
表5.抗硬骨抑素鼠抗体的ELISA活性
实施例4.抗硬骨抑素抗体结合表位的鉴定
靶向正确的表位是选择单克隆抗体以实现预期作用机制的关键步骤(Wilson,PC,2012,Nat.Rev.Immunol.12,709-719)。针对合成的基于肽的抗B细胞表位的抗体生产已广泛用于开发已知领域各种疾病的治疗性抗体和疫苗(Ben-Yedidia T.,1997,Curr OpinBio technol 8:442-448；Bijker MS,2007,Expert Rev Vaccines 6:591-603)，所获得的抗体的特异性优势仅限于确定的表位。NMR和晶体学结构证明硬骨抑素上的第二环可直接与低密度脂蛋白受体相关蛋白家族成员(如LRP5或LRP6)相互作用，并阻断LRPs和Wnt家族成员之间的相互作用。根据人硬骨抑素与LRP6复合物的晶体结构(Kim,J.2020,Nat.Commun.11:5357-5357)，发现包含图1所示的“IGRGKWWR”基序(SEQ ID NO:186)的环尖端是硬骨抑素与LRP6的第一螺旋桨结构域结合的主要结合决定簇。
用生物膜层干涉技术(Gator,Probe Life)检测抗体93B1B7与化学合成的肽的结合，所述肽包含来自图2所示人和小鼠硬骨抑素第二环的序列。将肽生物素化(NHS-生物素试剂，Thermo，#21343)，并使用0.5μg/ml溶液固定在链霉亲和素生物传感器上。使用5μg/mlmAb 93B1B7的动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温-20，0.2％BSA)作为分析物，结合传感图见图2。93B1B7以高亲和力识别人硬骨抑素上具有相同“IGRGKWWR”(SEQ ID NO:186)基序的pep1(SEQ ID NO:185)、pep5(SEQ ID NO:187)和pep6(SEQ ID NO:188)。相反，罗莫单抗不能识别这些肽，如图3所示。
为了进一步证明93B1B7的结合表位与罗莫单抗的结合表位完全不同，将5μg/ml的罗莫单抗固定在抗HFC探针上，并依次加入2μg/ml的人硬骨抑素和5μg/ml的93B1B7的动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％的吐温-20，0.2％的BSA)作为分析物。结合传感图见图4，表明罗莫单抗和93B1B7可以通过占据不同的结合位点同时结合硬骨抑素，从而不相互交叉阻断。因此该结合表位(“IGRGKWWR”基序，SEQ ID NO:186)是本文抗体特有的，不与罗莫单抗的结合表位重叠。
这里发现的大多数抗硬骨抑素抗体都具有非常相似的结合活性和CDR序列(见表3和表4)，因此我们认为它们具有相同的特异性和结合表位。因此，本文发现的这些抗体进一步证实它们与具有“IGRGKWWR”基序(SEQ ID NO:186)的硬骨抑素上的特异性表位结合。这使得它们能够完全阻止硬骨抑素和LRP6之间的结合，从而导致比其他抗硬骨抑素抗体(如罗莫单抗)更强的硬骨抑素中和。这与观察结果一致，即本文公开的抗体在硬骨抑素结合和中和活性方面比罗莫单抗更有利，如以下示例所述。
实施例5.抗硬骨抑素抗体的人源化
抗体93B1B7通过将互补决定区(CDR)移植到人种系框架上进行人源化。所选择的轻链种系受体序列为人VK2 A19V区和VK1 O12V区加JK4 J区(V-BASE，https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php)。所选择的重链种系受体序列为人VH1 1-18V区加JH4 J区(V BASE，https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php)。CDR从供体移植到受体序列符合Kabat(Kabat et al.1987)的定义，但使用Chothia/Kabat联合定义的CDR-H1和H2除外。通过自动合成方法(Vanzyme lnc.)构建编码包含初始V区序列的全长IgG4P抗体的基因，并通过寡核苷酸定向诱变修饰生成最终移植版本。为了保持完全活性并保持高热稳定性，保留了人源化重链(Kabat编号)93位(酪氨酸)和94位(丝氨酸)的供体残基，并将43位的受体残基(谷氨酰胺)变更为赖氨酸，因为该位置的赖氨酸出现的次数更多。同样，保留人源化轻链(Kabat编号)46位(精氨酸)的供体残基。此外，通过将30位的甘氨酸残基突变为丝氨酸以去除轻链CDR L1中的一个潜在天冬氨酸异构化位点。生成人源化抗硬骨抑素抗体hAb-1、hAb-2和hAb-3，其CDR、VH和VL序列见表6。
表6.示例性人源化抗硬骨抑素抗体的CDR、VH和VL序列
实施例6.生物膜层干涉技术检测人源化抗硬骨抑素抗体与人和食蟹猴硬骨抑素的结合动力学
使用Gator仪器(Probe Life)，采用生物膜层干涉技术测定人源化抗硬骨抑素抗体与人和食蟹猴硬骨抑素的结合亲和力。使用5μg溶液将抗体固定在抗HFC生物传感器上。使用动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温-20，0.2％BSA，10μM生物素)将人硬骨抑素和食蟹猴硬骨抑素以4μg/ml连续稀释2倍作为分析物。使用Gator软件，根据数据的全局拟合(1:1)计算亲和力(KD)和动力学参数(Kon和Koff)。
结果如下表7所示。与参比品罗莫单抗相比，人源化抗体hAb-1和hAb-2对人和食蟹猴硬骨抑素的亲和力更高。
表7.人源化抗体抗不同种属硬骨抑素的结合动力学
实施例7.抗硬骨抑素抗体在HEK293/TCF/LEF/Wnt1细胞中的硬骨抑素中和活性
根据基于HEK293的试验测定，抗体能够中和硬骨抑素并阻断Wnt1诱导的TCF/LEF荧光素酶活性。
Wnt蛋白是一个分泌型糖蛋白家族，是小鼠和人类成骨细胞分化和活性的关键调节因子。Wnt信号由卷曲(Fzd)家族的七通道跨膜G蛋白偶联受体家族和箭头/LRP家族的共受体，如LRP5和LRP6，或RYK或ROR跨膜酪氨酸激酶传导。已知的Wnt与Fzd受体和辅助受体的结合激活了多个不同的细胞内信号级联反应，历史上分为经典的β-连环蛋白依赖性途径和非经典的β-连环蛋白非依赖性途径。β-连环蛋白是一种重要的转录共激活因子，可调节Wnt信号传递过程中的基因转录。Wnt与Fzd受体复合物的结合导致LRP5/6复合物磷酸化，随后稳定细胞质中的β-连环蛋白。然后将稳定的β-连环蛋白转位到细胞核中，并与高迁移率族(HMG)型转录因子的淋巴增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)家族相互作用，刺激靶基因的表达。
在Wnt信号通路拮抗剂及其抗体阻断剂的研究中，细胞系HEK293/TCF/LEF/Wnt1来源于Askgene(Askgene,CA)。使用表达TCF/LEF萤火虫荧光素酶报告基因的HEK293细胞系分析Wnt信号拮抗剂(如硬骨抑素和DKK1)的抑制活性。加入硬骨抑素或DKK1可拮抗Wnt1信号，使荧光素酶活性降低。相反，加入硬骨抑素或DKK1抗体可阻断信号减弱并恢复荧光素酶活性。到达后，细胞用含10％胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-美西普乙醇、1％青霉素/链霉素、400μg/ml G418和2μg/ml嘌呤霉素的L-谷氨酰胺(Life Technologies,CA)在RPMI1640培养基中培养。收获细胞，以30,000个细胞/孔的浓度接种至白色96孔板中。
当检测拮抗剂的抑制作用时，去除培养基，向每个孔中加入50μl含10mM LiCl的试验培养基(不含G418和嘌呤霉素的培养基)。将检测的硬骨抑素和DKK1蛋白连续稀释，向试验平板中加入等量拮抗剂，在37℃、5％CO2条件下培养6小时。然后加入100μl/孔的One-Step萤火虫荧光素酶(Pierce,CA)试剂，使用BioTek Gen5发光酶标仪(Winooski,VT)测定荧光素酶活性。检测抗体的中和活性时，在试验培养基中连续稀释待测抗体和对照抗体。加入固定量的硬骨抑素或DKK1蛋白，孵育15分钟。然后，将50μl的培养基转移至试验板中，在37℃、5％CO2条件下孵育6小时，并使用BioTek Gen5发光酶标仪进行分析。
结果如下表8所示。如所示，除65B12C9外，所有小鼠抗硬骨抑素抗体的EC50值与罗莫单抗相当或更有利。三种人源化抗体hAb-1、hAb-2和hAb-3的EC50值均优于罗莫单抗。
表8.HEK293/TCF/LEF/Wnt1细胞中鼠和人源化抗体的硬骨抑素中和活性
抗体 EC50(nM)
93B1B7 57.9
94B12D3 62.8
71G6G8 67.41
56E5C10 64.2
91F6D10 60.58
51E8D4 63.35
97C11D7 55.36
81B2B6 59.61
84F2D5 59.42
65B12C9 152.5
hAb-1 13.89
hAb-2 14.9
hAb-3 15.13
罗莫单抗 42.31
实施例8.人源化抗硬骨抑素抗体的溶解度和稳定性
将本发明所述的人源化抗SOST抗体hAb-1和hAb-2以及参比抗体罗莫单抗以递增的浓度评估沉淀形成。在pH 7.4的PBS缓冲液中，起始浓度为10mg/ml。4℃下，将细胞置于超滤浓缩管(Millipore)中以4000rpm离心，每5-10分钟停止离心，取样抗体浓度，直至抗体浓度达到30mg/ml和90mg/ml。将样品在4℃下储存14天，目视观察沉淀。本发明中所述的抗体在高达90mg/ml时保持澄清溶液，而参比抗体罗莫单抗在此浓度下形成沉淀和发生浑浊，表明hAb-1和hAb-2在pH7.4的PBS缓冲液中比罗莫单抗更稳定、更易溶解。该结果表明，本发明中所述的抗体可以在高浓度制剂(如90mg/ml)中保持稳定。
实施例9.双特异性抗体的制备
本发明制备了靶向硬骨抑素和DKK1或RANKL的双特异性抗体。靶向DKK1或RANKL的示例性抗体的序列见表9和表10。
表9.示例性抗DKK1抗体的CDR序列
表10.示例性抗RANKL抗体的CDR序列
Denosumab(地舒单抗)
HC-CDR1 GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:66)
HC-CDR2 GITGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:67)
HC-CDR3 DPGTTVIMSWFDP(SEQ ID NO:68)
LC-CDR1 RASQSVRGRYLA(SEQ ID NO:69)
LC-CDR2 GASSRAT(SEQ ID NO:70)
LC-CDR3 QQYGSSPRT(SEQ ID NO:71)
具体来说，制备了由以下硬骨抑素/DKK1和硬骨抑素/RANKL配对的双特异性抗体：hAb-1×11H10-VH44VL32、hAb-2×11H10-VH44VL32、hAb-1×Denosumab、hAb-2×Denosumab。
在一个实施方式(参见图5(A))中，抗DKK1 11H10-VH44VL32(或抗RANKLDenosumab)Fv结构域转化为通过(GGGGS)4连接子连接的具有VH和VL两种不同取向的scFv，通过(GGGGS)4连接子连接。存在突变，如VH中G100C和VL中G44C，以促进scFvs的正确组装。两个抗DKK1(或抗RANKL)scFv分别通过一个GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：76)连接子分别与人源化抗硬骨抑素抗体的两个IgG重链的C端连接，形成双特异性IgG-scFv。
在另一个实施例(参见图5(B))中，抗硬骨抑素抗体和抗DKK1 11H10-VH44VL32(或抗RANKL Denosumab)转化为具有不对称IgG结构的“杵-臼结构”(‘Knob-into-Hole’)双特异性抗体。抗DKK1 11H10-VH44VL32(或抗RANKL Denosumab)的CL结构域含有S176C和C214S突变，CH1结构域含有F170C和C131S等突变，形成正交CH1-CK二硫键，使轻链能够正确配对。
下表11列出了各种抗硬骨抑素双特异性抗体的形式和序列。
表11.抗硬骨抑素双特异性抗体
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双特异性分子在96孔板中的HEK293 6E细胞中瞬时表达。在转染前24小时，将贴壁的HEK293 6E细胞以5E4个细胞/孔接种于25μg/ml和5％FBS的无血清KOP293培养基(珠海恺瑞生物科技#K03252)中的多聚-D-赖氨酸包被的96孔组织培养板中，并在37℃、5％CO2条件下过夜培养。在转染当天，将100ng(40ng/μl)各相应的结合分子重链和轻链DNA混合在一起。向DNA混合物中加入无血清培养基KOP293 25μl/孔。RT孵育15-30min后，将转染混合物加入前一天接种的培养板中，轻轻摇动混合。将培养板放回37℃、5％CO2培养箱中过夜。次日，吸出培养基和转染混合物，替换为130μl含0.5％胰蛋白胨的无血清培养基。将平板再孵育6天。转染后第7天收获条件培养基(CM)。将平板1000rpm离心5分钟，以沉淀任何细胞碎片。小心地将上清液转移至无菌聚丙烯块中。
通过蛋白A亲和层析纯化抗体，并在PBS(pH 7.2)中交换缓冲液。使用理论测定的该蛋白消光系数，通过读取280nm处的吸光度，确定纯化抗体的浓度。
实施例10.抗硬骨抑素×抗DKK1和抗硬骨抑素×抗RANKL双特异性抗体的结合动力学和亲和力
用Gator(Probe Life)生物膜层干涉技术(BLI)测定抗硬骨抑素×抗DKK1和抗硬骨抑素×抗RANKL双特异性抗体的结合动力学和亲和力。使用5μg/ml溶液将抗体固定在抗HFC生物传感器上。使用动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温-20，0.2％BSA)将硬骨抑素(1μg/ml)、DKK1(2μg/ml)或RANKL(4μg/ml)连续稀释2倍作为分析物。使用Gator软件，根据数据的全局拟合(1:1)计算亲和力(KD)和动力学参数(Kon和Koff)。结果汇总见表12。
表12.双特异性抗体对人硬骨抑素、DKK1和RANKL的结合动力学汇总
a超过检测限，表明脱落速率非常缓慢，超出Gator的定量检测限
b亲和力KD值通过Koff/Kon计算，在Koff为超过检测限的情况下，估算KD值约为10pM，即Gator的亲和力检测限
实施例11.证实双特异性抗体可以与人硬骨抑素和DKK1同时结合
使用BLI证实了人硬骨抑素和DKK1可以与双特异性抗体同时结合。将双特异性抗体构建体(5μg/ml)捕获到HFC探针上，然后在动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温-20，0.2％BSA)中依次加入人硬骨抑素(2μg/ml)和DKK1(2μg/ml)。如图6所示，在4种双特异性抗体中观察到两种抗原的增量结合反应，但在空白缓冲液或抗硬骨抑素单克隆抗体中未观察到，表明双特异性抗体可同时结合硬骨抑素和DKK1，并且一种靶蛋白的结合不会阻断另一个靶蛋白的结合。
实施例12.HEK293/TCF/LEF/Wnt1细胞上双特异性抗体的硬骨抑素/DKK1中和活性
如示例7所述进行WNT信号阻断试验，其中分别加入1μg/ml人硬骨抑素和DKK1。所有双特异性抗体均能够以剂量依赖性方式完全中和来自硬骨抑素和DKK1的WNT拮抗作用。EC50活性见表13。
表13.HEK293/TCF/LEF/Wnt1报告基因试验中抗硬骨抑素×抗DKK1双特异性抗体的硬骨抑素和DKK1中和活性
实施例13.双特异性抗体的药代动力学研究
未给药的雄性食蟹猴购自广州华珍实验动物有限公司。动物的体重在2.7kg～3.5kg之间，给药开始时3-5岁。将动物随机分配至4个剂量组(每组n＝3)。给药当天，皮下注射30mg/kg抗体。在第1天(给药前、给药后12和24小时)、给药后第2、3、5、7、10、14、18、21、28天采集血样。本研究中使用的PK采样方案基于其他人IgG治疗性单克隆抗体在食蟹猴中的已知PK特性设计。
测定食蟹猴血清中bsAb的方法采用经确认的适用的夹心ELISA方法。用人IgG重链和轻链特异性猴吸附抗体包被康宁96孔高结合力聚苯乙烯微孔板。将标准品、质控样品和未知样品上样至孔中，存在的任何人抗体均与固定化抗体结合。洗涤所有未结合物质后，向孔中加入ELISA所用的人IgG重链和轻链特异性猴吸附抗体偶联物HRP和TMB底物溶液。只有含有与捕获抗体和检测抗体结合的人双特异性的样品才会在450nm处产生吸收信号。产生的信号与人双特异性抗体的存在量成正比。样品中抗体的最低可定量浓度(LLOQ)为0.1μg/ml。
食蟹猴双特异性抗体的血清浓度见图7。数据以平均值±标准差表示，n＝3。计算所得半衰期范围为17-286小时。
实施例14.双特异性抗体的药效学研究
骨形成生物标志物I型前胶原N端前肽(P1NP)和骨吸收生物标志物I型胶原端肽C端肽(CTX-1)是两种广泛接受的特异性骨稳态指标。为检测双特异性抗体的药效学作用，正常雄性食蟹猴皮下注射上述不同的双特异性抗体，剂量为30mg/kg。在注射后第3天采集血样。然后离心分离血清样本。根据生产商的说明，分别使用P1NP试剂盒(PC-007，广州菲康生物技术有限公司，中国广州)和Serum CrossLaps ELISA试剂盒(AC-021F1R，Immunodiagnostic Systems，UK)测定血清P1NP和CTX-1水平。结果表明，双特异性抗体的施用仅在注射后3天就使血清P1NP水平显著升高。与给药前基线相比，不同双特异性抗体第3天的血清P1NP水平升高范围在104.50±8.5％至212.75±20.6％之间(表14)。此外，注射双特异性抗体第三天后，不同双特异性抗体的血清CTX-1水平较基线降低范围在46.73±2.5％至90.11±6.8％之间(表14)。结果表明，双特异性抗体能显著增加骨形成，同时降低骨吸收，表明其对治疗男性和女性骨量低下或骨质疏松、成骨不全、多发性骨髓瘤骨病等与骨量低或骨质差相关的疾病或病症具有深远的治疗效果。数据见表14。
表14.食蟹猴注射双特异性抗体后第3天血清中P1NP、CTX-1浓度
此外，当使用双特异性抗体治疗假手术(Sham)或长期卵巢切除(OVX)的雌性食蟹猴(一种经验证良好的绝经后骨质疏松症动物模型)时，单次注射10mg/kg双特异性抗体可诱导血清P1NP显著升高和血清CTX-1水平降低。与给药前基线值相比，给药后14天，分别地，OVX猴血清P1NP水平升高241.36±60.9％，假手术猴血清P1NP水平升高182.67±60.1％。同时，给药后14天，分别地，OVX猴血清CTX-1降低-52.12±5.9％，假手术猴血清CTX-1降低-17.43±8.5％。这些数据进一步证明了本发明中的抗体在年龄相关或绝经后骨质疏松症中增加骨形成和减少骨吸收的治疗效果。
实施例15.双特异性抗体能够预防成骨不全(OI)患者骨折
骨的多尺度层次结构是经过自然优化过的，所以能够抵抗骨折。增强骨形成和减少骨吸收是保持骨骼强度和健康的两个重要过程。在成骨不全(OI)或脆性骨病中，基因突变影响胶原的质量和/或数量，并显著增加骨折风险。临床上，该病的标志是低骨量和低强度、极度的骨脆性和骨骼畸形以及频繁的骨折。降低OI骨折发生率的治疗是临床改善的最终目标。因此，我们研究了成骨不全(OI)小鼠模型(oim/oim)中的双特异性抗体的药效，该模型中I型胶原蛋白前a2链的自发突变导致骨质变差和骨量变低，最终导致频繁的脆性骨折。4周龄时，纯合子oim/oim小鼠的长骨开始骨折。皮下注射单独的单克隆抗体或双特异性抗体(25mg/kg，每种抗体每周一次)6周后，10周龄时，抗体给药组动物新发生的骨折数量显著少于溶媒给药动物。在溶媒给药对照组中，从4周龄至10周龄(6周观察期)，根据X射线图像，组内每只小鼠的骨折数量平均增加2.27±0.7处。与溶媒给药对照组相比，硬骨抑素抗体或DKK1抗体单独给药导致每只小鼠的平均骨折数量减少(分别为0.75±0.2处和1.44±0.4处)。更值得注意的是，用双特异性抗体治疗的oim/oim小鼠可完全预防新发生的骨折(从4周龄到10周龄，每只小鼠0.00±0.5处新发骨折)，远优于任一单药治疗。这些结果表明，双特异性抗体通过同时中和硬骨抑素和DKK1防止进一步骨折，实现了协同骨合成代谢的效果。鉴于硬骨抑素和DKK1均与Wnt受体LRP5/6结合，并都作为拮抗剂阻断信号通路的合成代谢特性，值得注意的是，若用特异性抗体阻断其中一个结合位点将通过代偿机制引起其他拮抗剂的上调，如骨质疏松症患者经过抗硬骨抑素抗体治疗后观察到的DKK1上调(Holdsworth G,2018,Bone 107,93-103)所示。因此，当前研究的上述结果表明，通过对骨骼的协同作用可以防止进一步骨折。这一令人满意的结果清楚地表明，双特异性抗体能够减少OI患者未满足的需求，并减少重复骨折的负担。
实施例16.双特异性抗体抑制RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的体外生长
本发明还在RPMI8226人多发性骨髓瘤(MM)细胞中评价了双特异性抗体抑制肿瘤细胞生长的活性。如很多科学报告所示，多发性骨髓瘤患者的DKK1表达水平升高，并与疾病的严重程度相关(Fulciniti M.et al.Blood,2009；114(2):371-379.,Feng Y etal.Cancer Biomarkers.2018；1:1-7).此外，研究表明，约80％-90％的MM患者发生了MM相关骨病(MMBD)。MMBD的主要临床表现是由于骨吸收活性增加和抑制骨形成而导致的溶骨性病变和骨折。因此，双特异性抗体的性质将通过提供抑制骨吸收和抑制DKK1的表达从而导致骨形成增加使MMBD患者获益。我们的初步研究表明，经该分子作用的MM细胞(RPMI 8226)的体外细胞培养显示细胞表面标志物CD138水平降低，表明细胞可能正在经历凋亡过程。此外，CCK8肿瘤生长分析表明，肿瘤细胞数量呈剂量依赖性减少。RPMI8226 MM细胞给予100μg/ml双特异性抗体48小时后，活细胞数下降约28％。这表明双特异性抗体可引起RPMI8226MM细胞凋亡，并且可以抑制肿瘤细胞的生长。结果表明，这种治疗应用不仅通过预防骨病症(如实施例14和15中的数据所示)还直接抑制肿瘤生长以达到治疗MMBD和肿瘤转移相关的骨病症。
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Phe Ser Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
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1 5 10 15
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Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
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100 105 110
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<220>
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<400> 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
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<223> 合成构建体
<400> 61
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
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1 5 10
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
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<210> 69
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 71
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1 5
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115 120
<210> 73
<211> 108
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
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<400> 75
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<211> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 77
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
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<223> 可以任何整数次的重复存在
<400> 78
Gly
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<220>
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<223> 可以任何整数次的重复存在 up to 8
<400> 80
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<400> 81
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<223> 合成构建体
<220>
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<222> (1)..(4)
<223> 可以任何整数次的重复存在 up to 8
<400> 82
Gly Gly Gly Ser
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<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<223> 可以任何整数次的重复存在 up to 3
<400> 84
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<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Gln Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
210 215 220
Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
260 265 270
His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290 295 300
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
305 310 315 320
Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro
340 345 350
Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gln
450 455 460
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr
465 470 475 480
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His
485 490 495
Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile
500 505 510
Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
515 520 525
Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu
530 535 540
Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ser Tyr
545 550 555 560
Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
565 570 575
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp Ser
595 600 605
Ile Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
610 615 620
Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg
625 630 635 640
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
645 650 655
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
660 665 670
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe Tyr Tyr
675 680 685
Cys Trp Gln Gly Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
690 695 700
Leu Glu Leu Lys
705
<210> 92
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
210 215 220
Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
260 265 270
His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290 295 300
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
305 310 315 320
Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro
340 345 350
Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val
450 455 460
Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp Ser Ile Thr Ile Gly Gln Pro Ala
465 470 475 480
Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Arg
485 490 495
Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg
500 505 510
Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
530 535 540
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Leu
545 550 555 560
Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
595 600 605
Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
610 615 620
Tyr Glu Ile His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp
625 630 635 640
Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys
645 650 655
Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala
660 665 670
Tyr Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
675 680 685
Cys Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
690 695 700
Thr Val Ser Ala
705
<210> 93
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile
130 135 140
Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu
145 150 155 160
Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 94
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Ala Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr
545 550 555 560
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
Leu Gly Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr
610 615 620
Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu
625 630 635 640
Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe
645 650 655
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu
660 665 670
Gln Ser Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr
675 680 685
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
690 695 700
<210> 95
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
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Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
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Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Ala Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
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Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
645 650 655
Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
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<211> 219
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
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<211> 219
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<220>
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<400> 102
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Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
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<211> 446
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
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Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
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Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
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Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
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Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
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435 440 445
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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<211> 476
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Arg Met
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Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr
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Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu
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Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
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Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
325 330 335
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe
340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu
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Cys
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<211> 481
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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50 55 60
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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130 135 140
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala
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Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
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Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
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Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe
340 345 350
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Ala Gly
355 360 365
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
370 375 380
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420 425 430
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Cys
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<223> 合成构建体
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His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
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Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
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Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
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<211> 476
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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165 170 175
Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met
355 360 365
Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp Ser Ile Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser
370 375 380
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420 425 430
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450 455 460
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465 470 475
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<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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1 5 10 15
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100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile
130 135 140
Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu
145 150 155 160
Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp
225 230 235 240
Ser Ile Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
245 250 255
Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln
260 265 270
Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu
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Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr
325 330 335
Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser
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Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys
370 375 380
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Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr
405 410 415
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420 425 430
Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr
435 440 445
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr
450 455 460
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
465 470 475
<210> 112
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
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340 345 350
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Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
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420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 113
<211> 481
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
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1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
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130 135 140
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys
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Lys
<210> 114
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp Ser Ile Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
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Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Arg Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Asn Ile Glu
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340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
370 375 380
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Ala
<210> 115
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
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Leu Pro His Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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705
<210> 117
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val
450 455 460
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg
465 470 475 480
Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly
485 490 495
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500 505 510
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545 550 555 560
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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610 615 620
Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu
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Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln
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Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr
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Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
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Val Thr Val Ser Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
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Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
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Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln
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<220>
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<400> 119
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<210> 120
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<223> 合成构建体
<400> 120
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<210> 121
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
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<210> 123
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu
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Asp Ile Tyr Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala
625 630 635 640
Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro
645 650 655
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
660 665 670
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
675 680 685
Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695 700
<210> 124
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
465 470 475 480
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
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Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln
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Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
515 520 525
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
530 535 540
Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
595 600 605
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala
610 615 620
Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser
625 630 635 640
Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
645 650 655
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr
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<211> 219
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
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Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
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1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450 455 460
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
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Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp
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Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
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Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp
485 490 495
Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
500 505 510
Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
530 535 540
Arg Val Gln Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr
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565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
595 600 605
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
660 665 670
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675 680 685
Tyr Tyr Cys Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
690 695 700
Thr Val Thr Val Ser Ala
705 710
<210> 129
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
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210 215
<210> 130
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
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465 470 475
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<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
275 280 285
Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
290 295 300
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
305 310 315 320
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
325 330 335
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln
340 345 350
Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
420 425 430
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
435 440 445
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Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
465 470 475
<210> 132
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser
245 250 255
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
290 295 300
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Ser Glu Asp Val Gly Val
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Cys Gly
325 330 335
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
355 360 365
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
370 375 380
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg
385 390 395 400
Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu
405 410 415
Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met
420 425 430
Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu
435 440 445
Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val
450 455 460
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
465 470 475
<210> 133
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
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210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 134
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ser Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
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180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
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210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
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Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 135
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Trp Ser Ile Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 136
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 138
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Cys Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 139
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
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Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Cys Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 140
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 141
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 142
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Cys
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Asn Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Cys
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<211> 214
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<220>
<223> 合成构建体
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
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<223> 合成构建体
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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355 360 365
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420 425 430
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435 440 445
<210> 149
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
35 40 45
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 150
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
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195 200 205
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210
<210> 152
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 153
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Cys
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 154
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
35 40 45
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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<220>
<223> 合成构建体
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成构建体
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210 215
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<211> 449
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
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1 5 10 15
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<223> 合成构建体
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210 215
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
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Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 166
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> 合成构建体
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Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Ser Arg Val Gln Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
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35 40 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 172
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 173
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1 5 10 15
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
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Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 174
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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130 135 140
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
450
<210> 175
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 175
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
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<210> 176
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 176
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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<210> 177
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
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195 200 205
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370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
450 455 460
Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
465 470 475 480
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
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Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Val Ser Ala
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 178
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35 40 45
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165 170 175
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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405 410 415
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420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Glu Ile Lys
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<400> 179
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 180
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
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435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
450 455 460
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465 470 475 480
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp
485 490 495
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr
500 505 510
Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
595 600 605
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
610 615 620
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
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<400> 182
000
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 183
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 184
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 188
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1 5 10
<210> 189
<211> 190
<212> PRT
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<220>
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Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr
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<211> 188
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 190
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180 185
<210> 191
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 191
Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Ala Pro Arg Ser Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys
130 135 140
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly
145 150 155 160
Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala
165 170 175
Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr
180 185 190
<210> 192
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 192
Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Val Lys Trp Trp
1 5 10 15
Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg
20
<210> 193
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 193
Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg
1 5 10
<210> 194
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 194
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys
1 5 10
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg
1 5 10
<210> 196
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 196
Pro Asn Ala Ile Gly Arg Val Lys Trp Trp Arg
1 5 10
<210> 197
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 197
Ile Gly Arg Val Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro
1 5 10
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 198
Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg
1 5 10
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 199
Asp Phe Glu Ile His
1 5
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 200
Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ser Ala Asn Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ala

Claims (71)

1.一种抗硬骨抑素抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性识别硬骨抑素，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中：
所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 200的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述VL包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
2.一种抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合部分特异性识别硬骨抑素，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中：
a）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 22所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 23所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
b）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 24所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 25所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
c）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 26所示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 27所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
d）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 30示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 31所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
e）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 32示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 33所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
f）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 34示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 35所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
g）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 36示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 37所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
h）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 38示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 39所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
i）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 87示序列的VHCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 88所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
j）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 87示序列的VHCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 89所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
k）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 87示序列的VH内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别为SEQ ID NO: 90所示序列的VL内CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中：
a）所述VH包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
b）所述VH包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
c）所述VH包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
d）所述VH包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 31的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
e）所述VH包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
f）所述VH包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 35的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
g）所述VH包含SEQ ID NO: 36的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
h）所述VH包含SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
i）所述VH包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
j）所述VH包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；或
k）所述VH包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体；所述VL包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列，或包含至少80%序列同一性的氨基酸序列的变体。
4.一种抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合部分特异性识别硬骨抑素，其中所述抗体或其抗原结合片段是来源于包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗硬骨抑素抗体的人源化抗体部分，其中：
a）所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
b）所述VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
c）所述VH包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
d）所述VH包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或
e）所述VH包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 200的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其选自全长抗体、双特异性抗体、单链Fv（scFv）片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段（dsFv）、二硫键稳定性scFv（dsscFv）、(dsFv)2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、双体抗体（diabody）、三体抗体（tribody）和四体抗体（tetrabody）。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是包含Fc片段的全长抗体。
7.根据权利要求5所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原片段是scFv片段。
8.根据权利要求1-4或7中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述硬骨抑素是人硬骨抑素。
9.根据权利要求1-4或7中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段还包含第二部分。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二部分包含特异性识别抗原的第二抗体部分。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分包含第二重链可变区VH-2和第二轻链可变区VL-2。
12.根据权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原是DKK1。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述DKK1是人DKK1。
14.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体部分与包含第三重链可变区VH-3和第三轻链可变区VL-3的第三抗体部分竞争DKK1的结合表位，其中：
所述VH-3包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分中VH-2包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述第二抗体部分中VL-2包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。
16.根据权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原是RANKL。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原是人RANKL。
18.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分与包含第三重链可变区VH-3和第三轻链可变区VL-3的第三抗体部分竞争RANKL的结合表位，其中所述VH-3包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述VL-3包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
19.根据权利要求10或11所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分中VH-2包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述第二抗体部分中VL-2包含SEQID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR3。
20.根据权利要求10或11所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链Fv（scFv）片段、scFv-scFv、微型抗体、双体抗体（diabody）或sdAb。
21.根据权利要求20所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是包含两条重链、两条轻链和Fc片段的全长抗体，其中所述抗硬骨抑素抗体部分是包含与VL融合的VH的单链Fv（scFv）片段。
22.根据权利要求21所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗硬骨抑素的抗体或其抗原结合片段与所述全长抗体的一条或两条重链融合，或者，其中所述抗硬骨抑素的抗体部分与所述全长抗体的一条或两条轻链融合。
23.根据权利要求22所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗硬骨抑素的抗体或其抗原结合片段与全长抗体的一条或两条重链或轻链的N端融合，或者，其中所述抗硬骨抑素的抗体部分与所述全长抗体的一条或两条重链或轻链的C端融合。
24.根据权利要求22或23所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗硬骨抑素的抗体或其抗原结合片段通过第一连接子或不通过连接子与所述全长抗体融合。
25.根据权利要求24所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第一连接子是选自SEQ ID NO: 74-84的GS连接子。
26.根据权利要求21-23或25中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述VH通过第二连接子与所述VL融合。
27.根据权利要求26所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VH、第二连接子和VL。
28.根据权利要求26所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv片段N端到C端包含：VL、第二连接子和VH以及可选的C端丙氨酸残基。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二连接子为SEQ ID NO: 76或77所示的氨基酸序列。
30.根据权利要求11所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是包含VH-2和VL-2的scFv片段，其中所述抗硬骨抑素的抗体或其抗原结合片段是包含两条重链、两条轻链和Fc片段的全长抗体。
31.根据权利要求30所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分与所述全长抗体的两条重链融合，或者，其中所述第二抗体部分与所述全长抗体的两条轻链融合。
32.根据权利要求31所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述全长抗体的两条重链或轻链的N端融合，或者，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述全长抗体的两条重链或轻链的C端融合。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段通过或不通过第一连接子与所述全长抗体融合。
34.根据权利要求31或32所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段通过或不通过第一连接子与所述全长抗体融合。
35.根据权利要求33所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第一连接子是选自SEQ ID NO: 74-84的GS第一连接子。
36.根据权利要求34所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第一连接子是选自SEQ ID NO: 74-84的GS第一连接子。
37.根据权利要求30-32中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述VH-2通过第二连接子与所述VL-2融合。
38.根据权利要求30-32中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述VH-2不通过连接子与所述VL-2融合。
39.根据权利要求37所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VH-2、第二连接子和VL-2。
40.根据权利要求37所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv片段从N端到C端包含：VL-2、第二连接子和VH-2，以及可选的C端丙氨酸残基。
41.根据权利要求37所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二连接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
42.根据权利要求39-40中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二连接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
43.根据权利要求20所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv是二硫键稳定性scFv（“dsscFv”）。
44.根据权利要求43所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述dsscFv包含：a）根据SEQ ID NO: 60的编号的VH或VH-2中的G44C突变，和b）根据SEQ ID NO: 61的编号的VL或VL-2中的G100C突变。
45.根据权利要求11所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a）包含第一轻链的第一多肽，所述第一轻链从N端到C端包含：i）VL，ii）第一轻链恒定结构域（“第一CL结构域”）；
b）包含第一重链的第二多肽，所述第一重链从N端到C端包含：i）VH，ii）第一重链恒定结构域（“第一CH1结构域”），和iii）第一Fc结构域；
c）包含第二重链的第三多肽，所述第二重链从N端到c端包含：i）VH-2，ii）第二重链恒定结构域（“第二CH1结构域”），和iii）第二Fc结构域；以及
d）包含第二轻链的第四多肽，所述第二轻链从N端到C端包含：i）VL-2，ii）第二轻链恒定结构域（“第二CL结构域”），
其中第一Fc结构域和第二Fc结构域形成Fc片段。
46.根据权利要求45所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个包含T366W突变和可选的S354C突变，其中另一个Fc结构域包含T366S突变、L368A突变、Y407V突变和可选的Y349C突变，其中编号基于EU索引。
47.根据权利要求9所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述第二部分包含半衰期延长部分。
48.根据权利要求47所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述半衰期延长部分是Fc片段。
49.根据权利要求6所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段及其组合和杂交中的一种。
50.根据权利要求49所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段及其组合和杂交中的一种。
51.根据权利要求49或50所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc片段包含H435R突变和Y436F突变。
52.根据权利要求49所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc片段具有与相应野生型Fc片段相比减弱的效应子功能。
53.根据权利要求49所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc片段具有：
a）与相应野生型Fc片段相比增强的效应子功能，和/或
b）与相应野生型Fc片段相比增强的FcRn结合亲和力。
54.一种抗体-药物偶联物，其中，所述抗体药物偶联物包含权利要求9所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段，所述抗体-药物偶联物中的药物选自选择性雌激素受体调节剂SERM、双膦酸盐、前列腺素E受体激动剂、及其组合中的一种或几种。
55.一种药物组合物，包含权利要求1-53中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段或权利要求54所述的抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述组合物还包含药物，所述药物选自甲状旁腺激素、选择性雌激素受体调节剂、VEGF、TGFβ、肌生长抑制素、降钙素及其组合中的一种或几种。
57.一种分离的核酸分子，编码权利要求1-53中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段。
58.一种载体，包含权利要求57所述的分离的核酸分子。
59.一种分离的宿主细胞，包含权利要求57所述的分离的核酸分子或权利要求58所述的载体。
60.一种制备抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
a）在有效表达抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段或其一部分的条件下培养权利要求59所述的分离的宿主细胞；以及
b）从所述宿主细胞获得表达的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段或其一部分。
61.权利要求1-53中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段或权利要求54所述的抗体-药物偶联物或权利要求55或56所述的药物组合物制备用于治疗和/或预防个体的疾病或病症的药物中的用途，其中，所述药物被施用有效量到个体中，所述疾病或病症是骨疾病或软骨病症，其中所述骨疾病为成骨不全、骨质疏松症或骨质减少症、骨坏死、骨延迟愈合、骨折不愈合、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤骨病、原发性骨肿瘤、恶性肿瘤的骨转移、炎性或感染性骨病、骨软化症、佩吉特病、不活动引起的骨丢失、糖皮质激素诱导的骨丢失、炎症诱导的骨丢失、宇航员骨质疏松症/骨质减少症和失重引起的骨丢失；所述软骨病症为成骨不全、低磷酸盐性佝偻病。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述骨疾病是指骨质疏松症或骨质减少症。
63.根据权利要求61所述的用途，其中所述骨疾病是指成骨不全。
64.根据权利要求61所述的用途，其中所述骨疾病是指多发性骨髓瘤和多发性骨髓瘤骨病。
65.权利要求1-53中任一项所述的抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段或权利要求54所述的抗体-药物偶联物或权利要求55或56所述的药物组合物制备用于促进个体骨骼或关节手术后愈合的药物中的用途，其中，所述药物被施用有效量到个体中。
66.根据权利要求61或65中任一项所述的用途，其中所述抗硬骨抑素抗体或其抗原结合片段通过皮下注射、静脉注射、肌内注射、口服或肠外给药的方式施用到所述个体中。
67.根据权利要求61或65中任一项所述的用途，其中所述用途还包括施用第二种药物或疗法。
68.根据权利要求67所述的用途，其中所述第二种药物或疗法包括抗DKK1抗体。
69.根据权利要求67的用途，其中所述第二种药物或疗法包括抗RANKL抗体。
70.根据权利要求67所述的用途，其中所述第二种药物或疗法包括药物，选自甲状旁腺激素（PTH）、选择性雌激素受体调节剂（SERM）、双膦酸盐、前列腺素E（PGE）受体激动剂、VEGF、TGFβ、生长因子（肌生长抑制素）和降钙素中的一种。
71.根据权利要求61或65中任一项所述的用途，其中所述个体是指人。
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