TW202313674A - 抗硬骨抑素構建體及其用途 - Google Patents

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葆直 袁
李沐宇
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Abstract

本申請提供了與硬骨抑素結合的抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體，例如，雙特異性抗硬骨抑素抗體）、編碼抗硬骨抑素氨基酸序列的核酸分子、包含該核酸分子的載體、含有該載體的宿主細胞、抗硬骨抑素構建體的製備方法、含有抗硬骨抑素構建體的藥物組合物以及抗硬骨抑素構建體或組合物的使用方法。

Description

抗硬骨抑素構建體及其用途
相關專利申請的交叉引用
本申請要求於2021年9月26日提交的申請號為PCT/CN2021/120612的國際申請的優先權，其全部內容通過引用合併於此。 技術領域
本公開涉及抗硬骨抑素的構建體（例如抗硬骨抑素抗體）、組合物及其用途。 以 ASCII 文字檔提交序列表
以下提交的ASCII文字檔的全部內容通過引用合併於此：電腦可讀形式的（CRF）序列表（檔案名：PCT.CN2021.120612-SEQLIST.TXT，記錄日期：2021年9月20日，大小：384,463位元組）。
通過基因定位研究發現了 SOST基因產物硬骨抑素（sclerostin）作為人類骨形成抑制劑的功能，該研究將 SOST基因的功能缺失突變確定為高骨量骨硬化症（HBM）的致病因素（Balemans et al., 2001 Hum. Mol. Genet.10, 537-543; Brunkow et al., 2001 Am. J. Hum. Genet.68, 577-589)。在小鼠身上，由於骨形成增加， SOST基因的缺失導致骨量和骨強度增加，而人硬骨抑素轉基因的過表達則導致骨量減少和骨強度降低（Ke et al., 2012 Endocr. Rev.33, 747-783.).
本文中引用的所有公開說明、專利、專利申請和已發表專利申請的全部公開內容均通過引用合併於此。
以下內容僅為說明性內容，而不是以任何方式進行限制。即，以下內容是為了介紹本發明所述的抗硬骨抑素的新型分子的優勢、有益效果及其用途。因此，以下內容並不旨在限制要求保護的主體的基本技術特徵，也不用於確定要求保護的主體的範圍。
本申請一方面提供了抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素（例如人硬骨抑素）的抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），例如本文所述的任何抗硬骨抑素構建體。在一些實施方式中，所述抗體部分是一種抗體或其抗原結合片段，選自全長抗體、雙特異性抗體、單鏈Fv（scFv）片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、dsscFv、(dsFv) 2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、scFv-Fv融合、diabody、tribody和tetrabody。在一些實施方式中，該構建體是包含Fc片段的全長抗體。在一些實施方式中，所述抗體部分是scFv片段。
本申請另一方面提供了抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素（例如人硬骨抑素）的抗體部分和第二部分。在一些實施方式中，所述第二部分包括半衰期延長部分（例如Fc片段）。在一些實施方式中，所述第二部分包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、血管內皮生長因數（VEGF）、轉化生長因數-β（TGFβ）、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
在一些實施方式中，所述第二部分包括特異性識別抗原的第二抗體部分。在一些實施方式中，提供了抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分（包括但不限於本文所述的抗硬骨抑素抗體部分）以及特異性識別Dickkopf-1（DKK1）或核因數κβ受體活化因數配體（Receptor Activator of Buclear Factor Kappa beta Ligand, RANKL）的第二抗體部分。識別DKK1或RANKL的抗體部分可以是任何抗DKK1抗體部分或抗RANKL抗體部分（包括但不限於本文所述的抗體部分）。在一些實施方式中，第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈Fv（scFv）片段、scFv-scFv、微型抗體、diabody或sdAb。在一些實施方式中，所述第二抗體部分是包含Fc片段的全長抗體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分是單鏈Fv（scFv）片段。在一些實施方式中，所述第二抗體部分是scFv片段，其中所述抗硬骨抑素抗體部分是包含Fc片段的全長抗體。在一些實施方式中，所述scFv片段與全長抗體的重鏈和/或輕鏈（例如，N端和/或C端）（通過連接子或不通過連接子）融合。在一些實施方式中，該構建體包括：a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端至C端包括，i）V L，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）；b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第二多肽從N端至C端包括：i）V H，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”）和iii）第一Fc結構域；c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到C端包括，i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”）和iii）第二Fc結構域；以及d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包括：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”），其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。第一CH1或第二CH1以及/或者第一Fc結構域或第二Fc結構域可以在不脫離本發明的構思的前提下，進行若干變形或改進。
本申請另一方面提供了抗硬骨抑素構建體，可以與本文所述的任何一種抗硬骨抑素構建體與硬骨抑素競爭性地特異性結合。
本申請另一方面提供了藥物組合物，包括本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任何一種以及藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，該組合物還包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
本申請另一方面提供了編碼本文所述的任何一種抗硬骨抑素的構建體或所述抗硬骨抑素構建體的其中一部分（例如，其中一種或多種多肽）的分離的核酸分子。
本申請另一方面提供了包含本文所述任何一種分離的核酸分子的載體。
本申請另一方面提供了分離的宿主細胞，包括本文所述的分離的核酸分子和/或載體中的任何一種。
本申請另一方面提供了生成抗硬骨抑素構建體的方法，包括：a）在有效表達抗硬骨抑素構建體或其中一部分（例如，其中一種或多種多肽）的條件下培養本文所述的任何分離的宿主細胞；以及b）從宿主細胞中獲得所表達的抗硬骨抑素構建體或其中一部分。
本申請另一方面提供了治療個體疾病或病症的方法，包括讓個體使用有效量的抗硬骨抑素的構建體，諸如本文所述的任何一種抗硬骨抑素的構建體或本文所述的任何一種藥物組合物。在一些實施方式中，所述疾病或病症是指骨相關病症。在一些實施方式中，所述骨相關病症包括成骨不全、骨硬化、骨質疏鬆症（男性和/或女性）、老年性骨質疏鬆症、骨延遲癒合、骨折延遲癒合或不癒合、佩吉特病、不活動引起的骨質丟失、糖皮質激素誘導的骨質疏鬆症、炎症性骨丟失，包括關節炎引起的骨丟失，或者與a）骨量或骨質丟失或兩者丟失和/或b）骨結構和骨質異常相關的其他疾病或病症。在一些實施方式中，將抗硬骨抑素的分子或藥物組合物注射到個體體內。在一些實施方式中，該方法還包括使用第二種藥物或療法（例如，抗DKK1抗體或抗RANKL抗體）。在一些實施方式中，第二種藥物或療法包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。在一些實施方式中，個體是指人。
本申請提供了與硬骨抑素特異性結合的新型抗硬骨抑素分子（例如抗硬骨抑素單克隆抗體或多特異性抗體）、抗硬骨抑素分子的製備方法以及所述分子的使用方法（例如，治療疾病或病症的方法）。本文所述的示例性抗硬骨抑素分子獲得了有益效果。例如，與羅莫單抗相比，示例性抗硬骨抑素分子對硬骨抑素表現出更高的結合親和力。參見示例3、5和6（表5、表7和表8）。 I.     定義
術語“抗體”以其最廣泛的含義使用，並且涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）、全長抗體及其抗原結合片段，前提是只要它們表現出了所需的抗原結合活性。術語“抗體部分”是指全長抗體或其抗原結合片段。
全長抗體包括兩條重鏈和兩條輕鏈。所述輕鏈和重鏈的可變區負責抗原的結合。所述重鏈和輕鏈的可變區可以稱為“V H”和“V L”，兩條鏈中的可變區通常包含三個高變的環，稱為互補決定區（CDR）（輕鏈（LC）CDR包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重鏈（HC）CDR包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。本文公開的抗體和抗原結合片段的CDR區段可按Kabat、Chothia或Al-Lazikani的編號慣例（Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991）定義或鑒定。重鏈或輕鏈的三個CDR插入到被稱為框架區（FR）的側翼區段之間，所述框架區比CDR具有更高的保守性，並形成支撐高變環的支架。重鏈和輕鏈的恒定區不參與抗原結合，但表現出多種效應子功能。根據抗體重鏈恒定區的氨基酸序列將抗體歸類。抗體的五種主要類別或同種型為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特徵在於分別具有α、δ、ε、γ和μ重鏈，其中幾個主要抗體類別分為亞類，例如lgG1（γ1重鏈）、lgG2（γ2重鏈）、lgG3（γ3重鏈）、lgG4（γ4重鏈）、lgA1（α1重鏈）或IgGA2（α2重鏈）。
本文所用的術語“抗原結合片段”是指抗體片段，包括例如diabody、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、(dsFv) 2、雙特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定性diabody（ds diabody）、單鏈Fv（scFv）、scFv二聚體（二價diabody）、由包含一個或多個CDR的抗體的一部分形成的多特異性抗體、駱駝科單結構域抗體、納米抗體、結構域抗體、二價結構域抗體或與抗原結合但不包含完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠與親本抗體或親本抗體片段（例如，親本scFv）結合的相同抗原結合。在一些實施方式中，抗原結合片段可包含來自特定人抗體的一個或多個CDR，所述CDR被移植到來自一個或多個不同人抗體的框架區。
可變區“Fv”是最小的抗體片段，其包含完整的抗原識別位點和抗原結合位點。該片段由緊密非共價締合的一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。從這兩個結構域的折疊中形成六個高變環（重鏈和輕鏈各3個環），該高變環包含用於抗原結合的氨基酸殘基並賦予抗體與抗原結合特異性。然而，即使是單個可變結構域（或僅包含三個對抗原具有特異性的CDR的半個Fv）也具有識別並結合抗原的能力，儘管親和力低於完整可變區。
“單鏈Fv”也縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接到單個多肽鏈中的V H和V L抗體結構域的抗體片段。在一些實施方式中，scFv多肽還包含V H和V L結構域之間的多肽連接子，該多肽連接子使scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於scFv的綜述，參見Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。
本文所用的術語“CDR”或“互補決定區”意指在重鏈和輕鏈多肽的可變區內發現的非連續的抗原結合位點。這些特定區已經描述於：Kabat et al., J. Biol. Chem.252:6609-6616 (1977); Kabat et al.，美國衛生與公共服務部，“具有免疫學意義的蛋白質序列”（1991）；Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum et al., J. Mol.Biol.262:732-745 (1996); Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003); and Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)，其中定義包括彼此比較時的氨基酸殘基的重疊或子集。然而，應用任一定義指代抗體或移植抗體或其變體的CDR均落入本文定義和使用的術語的範圍內。下表1列出了包含上述各參考文獻定義的CDR的氨基酸殘基作為比較。CDR預測演算法和介面是本領域已知的，包括例如Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010); and Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438 (2015)。在本段中引用的參考文獻的內容通過引用整體併入本文，以用於本申請中並且可能包含在本文的一項或多項請求項中。在一些實施方式中，本文提供的CDR序列基於IMGT編號定義。例如，CDR序列可以通過VBASE2工具（http:///www.vbase2.org/vbase2.php，另見Retter I, Althaus HH, Münch R, Müller W: VBASE2，整合的V基因資料庫。《核酸研究》2005年1月1日；33（資料庫發佈）：D671-4，其全部內容通過引用合併於此）。
本文所用的術語“骨質疏鬆症”是指絕經前特發性骨質疏鬆症、絕經後骨質疏鬆症、絕經期骨質疏鬆症、卵巢切除術後骨質疏鬆症、廢用性骨質疏鬆症、藥物誘導的骨質疏鬆症、吸收不良引起的骨質疏鬆症、手術後吸收不良性骨質疏鬆症和/或老年性骨質疏鬆症。
本文所用的術語“骨質減少症”是指絕經前特發性骨質減少症、絕經後骨質減少症、老年性骨質減少症、藥物誘導的骨質減少症、廢用性骨質減少症、新生兒骨質減少症和/或失重引起的宇航員骨質減少症。
本文所用的術語“代謝性骨病”包括但不限於腎性骨營養不良、原發性和繼發性甲狀旁腺功能亢進症、家族性甲狀旁腺功能亢進綜合征、甲狀旁腺疾病、骨營養不良、骨軟骨病、高磷酸酯酶症。
本文所用的術語“骨壞死”是指骨的缺血性壞死、潛水引起的缺血性壞死、頜骨的骨壞死。
本文所用的術語“骨丟失”是指絕經後骨丟失、不活動引起的骨丟失、失重引起的骨丟失、疾病相關的面部骨丟失、疾病相關的顱骨丟失、疾病相關的頜骨骨丟失、疾病相關的顱骨骨丟失、空間旅行相關的骨丟失、糖皮質激素誘導的骨丟失、藥物誘導的骨丟失、器官移植相關的骨丟失、腎移植相關的骨丟失，HIV相關的骨丟失、生長激素丟失相關的骨丟失、囊性纖維化相關的骨丟失、化療相關的骨丟失、腫瘤誘導的骨丟失、癌症相關的骨丟失、激素消融性骨丟失、口腔骨丟失、肝素誘導的骨丟失、炎症性骨丟失，包括關節炎引起的骨丟失，或者與a）骨量或骨質丟失或兩者丟失和/或b）骨結構和骨質異常相關的其他疾病或病症，失重引起的骨丟失。
本文所用的術語“骨不連”或“骨延遲癒合”是指骨折延遲癒合或不癒合、髖部骨折、融合或關節融合後的假性關節炎、骨溶解、術後溶骨、脊柱融合後的骨不連、脊柱融合的增強/加速、關節成形術後的慢性疼痛。
本文所用的術語“骨軟化症”是指維生素D抵抗性骨軟化症、鈣缺乏症、肌肉減少症、癌症相關的肌肉減少症、腫瘤誘導性骨軟化症。
本文所用的術語“骨折”包括但不限於壓縮性骨折、脆性骨折、病理性骨折、應力性骨折、髖部骨折、股骨頸骨折、非典型髖部骨折、股骨粗隆間骨折、腫瘤疾病引起的骨骨折。
本文所用的術語“高鈣血症”包括惡性腫瘤的高鈣血症、高鈣血症引起的肌病、慢性腎臟疾病引起的高鈣血症。
本文所用的術語“多發性骨髓瘤相關骨病症”是指多發性骨髓瘤性骨病和多發性骨髓瘤病引起的骨質疏鬆症。
本文所用的術語“原發性骨腫瘤”包括骨肉瘤、骨軟骨瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨黏液瘤、破骨細胞瘤、骨樣骨瘤、軟骨肉瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨樣纖維瘤、粘液樣軟骨肉瘤、肉瘤、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨膜肉瘤、膠質瘤、巨細胞瘤、巨細胞肉瘤、巨細胞血管纖維瘤、血管內皮肉瘤、未分化肉瘤、纖維肉瘤、骨囊腫、動脈瘤、多發性內分泌腫瘤。
用於“惡性腫瘤骨轉移”的術語“惡性腫瘤”包括乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、結直腸癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胸腺癌。
本文所用的術語“炎性或感染性骨病”是指骨髓炎、化膿性骨髓炎、強直性脊柱炎。
本文所用的術語“骨髓或血液學疾病”是指白血病、惡性淋巴瘤、血液惡性腫瘤、血液病、骨髓疾病。
本文所用的術語“罕見的肌肉骨骼疾病”包括成骨不全、骨硬化病、脛骨先天性假關節、內生瘤病、纖維發育不良、戈謝病、馬凡綜合征、遺傳性多發外生骨疣、神經纖維瘤病、成骨不全、骨質疏鬆症、骨斑點症、硬化性病變、假關節病變、肢骨紋狀肥大、青少年關節炎、地中海貧血、粘多糖病、特納綜合征、Pown綜合征、克蘭費爾特綜合征、麻風病、佩特茲氏病、青少年特發性脊柱側凸、溫徹斯特綜合征、Menkes病、缺血性骨病（如兒童股骨頭缺血性壞死、局限性遊走性骨質疏鬆）、特發性嬰兒高鈣血症、肢端肥大症、性腺功能減退症、阿-麥-斯三氏綜合征、鋁骨病、進行性骨幹發育不良、骨硬化症及嬰兒神經軸突營養不良、異常骨硬化、緻密性成骨不全症、Gorham-Stout綜合征、囊性血管瘤病、佩吉特病、青少年佩吉特病、骨質疏鬆症-白眼病綜合征、典型或非典型囊性纖維化的骨質疏鬆症、脛骨-橈骨異常-骨折、X連鎖低磷酸鹽骨軟化症、家族性骨發育不良、骨斑點症、蠟淚樣骨病、顱骨幹骺端發育不良、神經膠質瘤綜合征、顱骨鎖骨發育不良、Hajdu-Cheney綜合征、Winchester-Torg綜合征、Cole-Carpenter綜合征、低磷酸鹽血症、遺傳性高磷酸化症、進行性骨化性纖維發育不良、家族性低鈣血症、假性甲狀旁腺功能減退症、肢端骨發育不良、艾肯綜合征、多發性軟骨瘤病、維生素D羥化缺陷性佝僂病、低磷酸鹽血症性佝僂病。
本文所用的術語“軟骨相關疾病”包括但不限於軟骨瘤病、軟骨發育不良、軟骨營養不良性肌強直、皮質旁軟骨瘤、膝關節軟骨撕裂、骨關節炎、骨軟骨營養不良。
本文所用的術語“肌肉相關疾病”包括肌肉減少症和癌症相關的肌肉減少症。
“促進骨骼或關節手術後的癒合”中使用的術語“手術”是指骨科手術、牙科手術、植入手術、關節置換、保留關節的手術、牽張成骨、骨延長、植骨、骨美容手術和骨修復，如骨折癒合、骨不連癒合、骨折延遲癒合和顱面復原。
表 1 ： CDR 定義
   Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3 IMGT 4 AHo 5
V HCDR1           31-35           26-32           30-35 27-38 25-40
V HCDR2           50-65           53-55           47-58 56-65 58-77
V HCDR3           95-102           96-101           93-101 105-117 109-137
V LCDR1           24-34           26-32           30-36 27-38 25-40
V LCDR2           50-56           50-52           46-55 56-65 58-77
V LCDR3           89-97           91-96           89-96 105-117 109-137
1殘基編號遵循Kabat等人的命名法，見上文 2殘基編號遵循Chothia等人的命名法，見上文 3殘基編號遵循MacCallum等人的命名法，見上文 4殘基編號遵循Lefranc等人的命名法，見上文 5殘基編號遵循Honegger和Plückthun的命名方法，見上文
“Kabat中的可變結構域殘基編號”或“如Kabat中的氨基酸位置編號”及其變體，是指用於Kabat等人的抗體彙編的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統，見上文。使用該編號系統，實際的線性氨基酸序列可包含與可變結構域的框架區(FR)或高變區（HVR）的縮短或插入相對應的較少或額外的氨基酸。例如，重鏈可變結構域可以包括H2的殘基52之後的單個氨基酸插入（根據Kabat的殘基52a）和重鏈FR殘基82之後的插入的殘基（例如，根據Kabat編號的殘基82a、82b和82c等）。可以通過在抗體序列的同源性區域與“標準”Kabat編號序列進行比對來確定給定抗體的Kabat殘基編號。
除非本文另有說明，否則免疫球蛋白重鏈中殘基的編號為Kabat等人的EU索引的編號，見上文。“Kabat的EU索引”是指人IgG1 EU抗體的殘基編號。
“框架”或“FR”殘基是除本文定義的CDR殘基之外的那些可變結構域殘基。
“人源化”形式的非人類（例如，齧齒類動物）抗體是包含源自非人抗體的最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體高變區（HVR）的殘基被來自非類種屬（供體抗體）的高變區的殘基所取代，例如具有理想的抗體特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。在某些情況下，人免疫球蛋白的框架區（FR）殘基被相應的非人類殘基所取代。此外，人源化抗體可包含不在受體抗體或供體抗體中的殘基。這些修飾是為了進一步改善抗體的性能。一般來說，人源化抗體將包括基本上所有，至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的高變環均與非人免疫球蛋白的高變環相對應，並且所有或基本上所有FR均是人免疫球蛋白序列。可選地，人源化抗體還將包括免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區（Fc）。更多詳細資訊見Jones et al., Nature321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)。
“人抗體”是具有與人產生的抗體的氨基酸序列相對應的氨基酸序列和/或已經使用本文公開的製備人抗體的任何技術製備的抗體。人抗體的這一定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。可使用本領域已知的各種技術（包括噬菌體展示文庫）生成人抗體。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。製備人單克隆抗體可以使用Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). See also van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)。人抗體可通過將抗原給予轉基因動物來製備，轉基因動物已被修飾以響應抗原激發產生此類抗體，但其內源性位點已被禁用，例如，免疫的異種小鼠（關於XENOMOUSE TM技術，例如，參見美國專利US 6,075,181和US 6,150,584）。關於通過人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體，另見，例如Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。
本文確定的相對於多肽和抗體序列的“氨基酸序列一致性百分比（%）”或“同源性”定義為在將任何保守置換作為序列一致性的一部分對序列進行比對之後，與所比較的多肽中的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸序列一致性百分比，可以通過本領域技術範圍內的各種方式進行比對，例如，使用公開可用的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign（DNASTAR）或MUSCLE軟體。本領域技術人員可以確定用於衡量比對的適當參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。然而，在本文中，使用序列比較電腦程式MUSCLE（Edgar, R.C., Nucleic Acids Research32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics5(1):113, 2004）生成氨基酸序列一致性百分比值。
“同源”是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列一致性。當兩個比較序列中的同一個位置被相同的堿基或氨基酸單體亞基佔據時，例如，如果兩個DNA分子中的相同位置被腺嘌呤佔據，則這兩個分子在該位置上是同源的。兩個序列之間的同源性百分比是兩個序列共用的匹配或同源位置數除以比較的位置數乘以100的函數。例如，如果兩個序列中10個位置中的6個匹配或同源，則這兩個序列的同源性為60%。舉例來說，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50%的同源性。通常，當兩個序列對齊以獲得最大同源性時進行比較。
術語“恒定結構域”是指相對於含有抗原結合位點的免疫球蛋白的另一部分（可變結構域）具有更保守氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定結構域包含重鏈的C H1、C H2和C H3結構域（統稱C H）和輕鏈的CHL（或C L）結構域。
任何哺乳動物物種的抗體（免疫球蛋白）的“輕鏈”可根據其恒定結構域的氨基酸序列歸屬為兩種明顯不同的類型之一，稱為“κ”和“λ”。
“C H1結構域”（也稱為“H1”結構域的“C1”）通常從約第118位氨基酸延伸至約第215位元氨基酸（EU編號系統）。
“鉸鏈區”通常定義為IgG中與人IgG1的Glu216至Pro230相對應的區域（Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)）.可以通過將形成重鏈間S-S鍵的第一個和最後一個半胱氨酸殘基置於相同的位置，將其他IgG同種型的鉸鏈區域與IgG1序列進行比對。
人IgG Fc區（也稱為“C2”結構域）的“C H2結構域”通常從約第231位氨基酸231延伸至約第340位氨基酸。C H2結構域的獨特之處在於它與另一個結構域不緊密配對。相反，在完整天然IgG分子的兩個C H2結構域之間插入兩條N-連接的支鏈碳水化合物鏈。據推測，碳水化合物可能為結構域-結構域配對提供替代物，並有助於穩定CH2結構域。Burton, Molec Immunol.22:161-206 (1985).
“CH3結構域”（也稱為“C3”結構域）包括Fc區中C H2結構域C端殘基的延伸（即，約氨基酸殘基341至抗體序列的C端，通常在IgG的氨基酸殘基446或447處）。
本文中的術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可能不同，但人IgG重鏈Fc區通常被定義為從Cys226位的氨基酸殘基或Pro230延伸至其羧基端。Fc區的C端賴氨酸（根據EU編號系統的殘基447）可在例如抗體的生產或純化過程中去除，或通過重組工程化編碼抗體重鏈的核酸來去除。因此，完整抗體的組成可包括去除所有K447殘基的抗體群、未去除K447殘基的抗體群和具有含和不含K447殘基的抗體混合物的抗體群。本文所述的用於抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2（IgG2A、IgG2B）、IgG3和IgG4。
“Fc受體”或“FcR”描述了結合抗體Fc區的受體。首選FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體（γ受體）的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的選擇性剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA（一種“活化受體”）和FcγRIIB（一種“抑制性受體”），它們具有相似的氨基酸序列，主要在其胞漿結構域方面不同。活化受體FcγRIIA在其胞漿結構域中含有一個基於免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM）。抑制性受體FcγRIIB在其胞漿結構域中含有一個基於免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM）。（見M. Daëron, Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997)。FcR綜述見Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.126: 330-41 (1995)。其他FcR，包括將來將確定的FcR，包含在本文術語“FcR”中。
本文所用的術語“表位”是指抗體或抗體部分與之結合的抗原上的特定原子或氨基酸的基團。如果兩個抗體或抗體部分與抗原表現出競爭性結合，則可結合抗原內的相同表位。
如本文所用，存在等摩爾濃度的第一抗體或其片段時，當第一抗體或其片段抑制其片段的第二抗體的靶抗原結合至少約50%（例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中的至少約任何一個）時，第一抗體或其片段“競爭”與靶抗原結合，反之亦然。PCT公開說明WO 03/48731描述了基於其交叉競爭的“結合”抗體的高通量工藝。
這裡所用的術語“特異性結合”、“特異性識別”和“針對於”是指可衡量和可重現的相互作用，例如靶標與抗體或抗體部分之間的結合，其決定了存在包括生物分子在內的異質分子群時是否存在靶標。例如，特異性識別靶標（可以是表位）的抗體或抗體部分是以更大的親和力、親合力、更容易地以及/或者比其與其他靶標的結合更長的持續時間來結合該靶標的抗體或抗體部分。在一些實施方式中，抗體與不相關靶標的結合程度小於測量的抗體與靶標結合程度約10%，例如，通過放射免疫分析（RIA）。在一些實施方式中，特異性結合靶標的抗體具有≤10 -5M、≤10 -6M、≤10 -7M、≤10 -8M、≤10 -9M、≤10 -10M、≤10 -11M或≤10 -12M的解離常數（KD）。在一些實施方式中，抗體特異性結合在不同物種的蛋白質中保守的蛋白質上的表位。在一些實施方式中，特異性結合可包括但不需要排他性結合。抗體或抗原結合域的結合特異性可通過本領域已知的方法實驗測定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BLI、BIACORE TM檢測和肽掃描。
“分離”抗體（或構建體）是從其生產環境的組成部分中鑒定、分離和/或回收的抗體（例如，天然或重組）。優選地，分離的多肽不與來自其生產環境的所有其他組分結合。
編碼本文所述的構建體、抗體或其抗原結合片段的“分離的”核酸分子是一種核酸分子，是從至少一種污染核酸分子中鑒定並分離出來的，其通常與該污染核酸分子在其產生的環境中相關聯。優選地，分離的核酸不與生產環境相關聯的所有組分結合。編碼本文所述的多肽和抗體的分離的核酸分子的形式不同於其在自然界中發現的形式或環境。因此，分離的核酸分子與編碼本文所述天然存在於細胞中的多肽和抗體的核酸不同。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中包含的核酸分子，但核酸分子存在于染色體外或不同于其天然染色體位置的染色體位置。
當核酸與另一個核酸序列處於功能關聯時，它是“可操作地連接”的。例如，如果序列前導序列或分泌前導序列的DNA以參與多肽分泌的前蛋白表達，則可操作地與多肽的DNA連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則啟動子或增強子可操作地連接到編碼序列；或者核糖體結合位點如果被定位成便於翻譯，則可操作地連接到編碼序列。通常，“可操作地連接”是指連接的DNA序列是連續的，並且在存在分泌前導序列的情況下，是連續的且在閱讀框中。然而，增強子不一定是連續的。通過在方便的限制性位點結合完成連接。如果不存在此類位點，則按照常規操作規程使用合成的寡核苷酸適配子或連接子。
本文所用的術語“載體”是指能夠傳播與其連接的另一個核酸的核酸分子。該術語包括載體作為自複製核酸結構以及摻入其所引入的宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠指導與其操作連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。
本文所用的術語“轉染”或“轉化”或“轉導”是指將外源性核酸轉移或引入宿主細胞的過程。“轉染”或“轉化”或“轉導”細胞是用外源性核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括原代受試者細胞及其子代。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，是指引入外源性核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化子”和“轉化細胞”，包括原代轉化細胞和由此衍生的後代，不考慮傳代次數。子代的核酸含量可能與親代細胞不完全相同，可能含有突變。本文包括具有與在原始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物活性的突變子代。
本文所用的“治療”或“治療”是獲得有益或理想結果（包括臨床結果）的方法。在本申請中，有益或理想的臨床結果包括但不限於以下一個或多個：減輕由疾病引起的一個或多個症狀、減小疾病的程度、穩定疾病、防止或延遲疾病的傳播、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病的進展，改善疾病狀態、緩解疾病（部分或全部）、降低治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量、延遲疾病進展、提高或改善生活品質、增加體重和/或延長生存期。本申請的方法設想了這些治療方面中的任何一個或多個。
術語“抑制”是指任何表型特徵的減少或停止，或指該特徵的發生率、程度或可能性的降低或停止。“減少”或“抑制”是指與參考文獻相比降低、減少或停止活性、功能和/或量。在某些實施方式中，通過“減少”或“抑制”是指引起總體減少20%或更大的能力。在另一個實施方式中，通過“減少”或“抑制”是指引起總體減少50%或更大的能力。在又一個實施方式中，通過“減少”或“抑制”是指引起總體減少75%、85%、90%、95%或更大的能力。
本文所用的“參考”是指用於比較的任何樣品、對照品或水準。參考可以從健康和/或非患病樣品獲得。在一些示例中，參考可以從未經治療的樣品獲得。在一些示例中，參考來自個體的非患病或未經治療的樣品。在一些示例中，參考來自非個體或患者的一個或多個健康個體。
本文所用的“延緩疾病的發展”是指推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定、抑制和/或延遲疾病的發展。根據疾病史和/或正在接受治療的個體的情況，這種延遲可能具有不同的時間長度。對本領域技術人員而言，顯而易見的是，充分或顯著的延遲實際上可以包括預防，因為個體不會發生疾病。
本文所用的“預防”包括對可能易患該疾病但尚未被診斷為疾病的個體中的疾病的發生或復發提供預防。
如本文所用，為了“抑制”功能或活性是與除了所關注的條件或參數以外的其它相同條件相比或與另一種條件相比時降低功能或活性。例如，與不存在抗體的腫瘤生長速率相比，抑制腫瘤生長的抗體降低了腫瘤的生長速率。
術語“受試者”、“個體”和“患者”在本文可互換地用於指哺乳動物，包括但不限於人、牛、馬、貓、犬、齧齒類動物或靈長類動物。在一些實施方式中，個體是指人。
藥物的“有效量”是指在達到預期的治療或預防性結果所需的劑量和時間段內有效的量。具體劑量可根據以下一種或多種情況變化：所選的特定藥劑、待遵循的給藥方案、是否與其他化合物組合使用、給藥時間、待成像的組織和攜帶它的物理遞送系統。
術語“藥物製劑”和“藥物組合物”是指以允許活性成分的生物活性有效的形式存在並且不含有對將要使用製劑的個體產生不可接受的毒性的額外組分的製劑。此類製劑可以是無菌的。
“藥學上可接受的載體”是指本領域常規用於與治療藥物一起使用的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、封裝材料、製劑輔助劑或載體，與所述藥物共同包含供個體使用的“藥物組合物”。藥學上可接受的載體在所使用的劑量和濃度下對受體無毒，並且與製劑的其他成分相容。藥學上可接受的載體適用於所使用的製劑。藥學上可接受的載體或輔料優選地符合毒理學和生產試驗的要求標準和/或包含在美國食品藥品監督管理局編寫的非活性成分指南中。
“無菌”製劑為無菌的或基本無活微生物及其孢子。
與一種或多種進一步治療藥物“聯合”給藥包括以任何順序同時（合併）和連續給藥。
術語“同時”在本文中用於指兩種或多種治療藥物的使用，其中至少部分給藥在時間上重疊，或其中一種治療藥物的使用相對於另一種治療藥物的使用是在短時間內。例如，兩種或多種治療藥物以不超過約60分鐘的時間間隔使用，例如不超過約30、15、10、5或1分鐘。
術語“順序”在本文中用於指兩種或多種治療藥物的使用，其中一種或多種藥物在一種或多種其他藥物停藥之後繼續使用。例如，使用兩種或多種治療藥物的時間間隔超過約15分鐘，例如約20、30、40、50或60分鐘、1天、2天、3天、1周、2周或1個月或更長時間。
本文所用的“結合”是指除了另一種治療模式之外還使用一種治療方式。因此，“結合”是指在向個體施用一種治療方式之前、期間或之後施用另一種治療方式。
術語“藥品說明書”是指通常包含在治療產品商業包裝中的說明，其中包含關於此類治療產品使用的適應症、使用、劑量、給藥、綜合治療、禁忌症和/或警告的資訊。
“製品”是包含至少一種試劑的任何製品（例如，包裝或容器）或試劑盒，例如用於治療疾病或病症的藥物、或用於特異性檢測本文所述的生物標誌物的探針。在某些實施方式中，製品或試劑盒作為用於執行本文所述方法的單元被推廣、分銷或銷售。
應理解，本文所述的應用的實施方式包括“由”和/或“基本上由”實施方式組成。
本文中對“約”值或參數的引用包括（和描述）針對該值或參數本身的變化。例如，關於“約X”的描述包括“X”的描述。
本文所用的術語“約X-Y”具有與“約X至約Y”相同的含義。
如本文和所附請求項中使用，除非上下文明確另有說明，否則單數形式“一”、“或”和“所述”包括複數引用。 II.   抗硬骨抑素構建體
本申請提供了包含抗硬骨抑素抗體部分的抗硬骨抑素構建體，所述抗硬骨抑素抗體部分與本文所述的硬骨抑素（SOST基因表達的蛋白產物）特異性結合。
硬骨抑素是一種分泌型糖蛋白，具有C端半胱氨酸結樣（CTCK）結構域，與骨形態發生蛋白（BMP）拮抗劑的DAN（神經母細胞瘤差異篩選選擇基因畸變）家族具有序列相似性。該基因的功能缺失突變與常染色體隱性遺傳疾病硬化症有關，後者可導致進行性骨過度生長。該基因下游的缺失導致硬骨抑素表達減少，與一種稱為van Buchem病的較輕型疾病相關。
在一些實施方式中，提供了一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，所述抗體部分結合到硬骨抑素上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO: 186所示的氨基酸序列。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭硬骨抑素的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，所述V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1-4和12中任一項的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5-8和13中任一項的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO：9-11和14中任一項的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15-17中任一項的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18和19中任一項的氨基酸序列的LC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 20和21中任一項的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 88的氨基酸序列或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 36的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 31的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 35的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 39的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 40的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列同源一性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：i）包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18氨基酸序列的LC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 89的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。在一些實施方式中，V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：i）包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18氨基酸序列的LC-CDR2，和iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 90的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，提供了一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中： a）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 22所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 23所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； b）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 25所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； c）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 26所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 27所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； d）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 29所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； e）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 30所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； f）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 32所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 33所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； g）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 34所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 35所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； h）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 36所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 37所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； i）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 38所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 39所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； j）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 40所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 41所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； k）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 88所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； l）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 89所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或者 m）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 90所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
在一些實施方式中，該構建體包括或者是一種抗體或其抗原結合片段，選自全長抗體、雙特異性抗體、單鏈Fv（scFv）片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、dsscFv、(dsFv) 2、V HH、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、diabody、tribody和tetrabody。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分是全長抗體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分是scFv或dsscFv。
在一些實施方式中，上述抗硬骨抑素抗體部分包括選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其組合和雜交中的免疫球蛋白的Fc片段。在一些實施方式中，上述抗硬骨抑素抗體部分或全長抗體包括選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其組合和雜交中的免疫球蛋白的Fc片段。在一些實施方式中，所述Fc片段具有與相應野生型Fc片段相比降低的效應子功能。在一些實施方式中，所述Fc片段具有與相應野生型Fc片段相比增強的效應子功能。
在一些實施方式中，抗體部分包含本文所述任何一個抗體部分的人源化抗體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包含或者是抗硬骨抑素融合蛋白。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包含或者是多特異性抗硬骨抑素構建體（例如雙特異性抗體）。
在一些實施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。 a）抗體親和力
抗體部分的結合特異性可通過本領域已知的方法實驗測定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BLI、BIACORE TM檢測和肽掃描。
在一些實施方式中，抗體部分與硬骨抑素之間結合的K D為約10 -7M至約10 -12M、約10 -7M至約10 -8M、約10 -8M至約10 -9M、約10 -9M至約10 -10M，約10 -10M至約10 -11M、約10 -11M至約10 -12M、約10 -7M至約10 -12M、約10 -8M至約10 -12M、約10 -9M至約10 -12M、約10 -10M至約10 -12M，約10 -7M至約10 -11M、約10 -8M至約10 -11M、約10 -9M至約10 -11M、約10 -7M至約10 -10M、約10 -8M至約10 -10M或約10 -7M至約10 -9M。在一些實施方式中，抗體部分和硬骨抑素之間結合的K D高於約10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M或10 -12M中的任何一個。在一些實施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些實施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些實施方式中，抗體部分和硬骨抑素之間結合的K on為約10 3M -1s -1至約10 8M -1s -1、約10 3M -1s -1至約10 4M -1s -1、約10 4M -1s -1至約10 5M -1s -1，約10 5M -1s -1至約10 6M -1s -1、約10 6M -1s -1至約10 7M -1s -1，或約10 7M -1s -1至約10 8M -1s -1。在一些實施方式中，抗體部分與硬骨抑素之間結合的K on約為10 3M -1s -1至約10 5M -1s -1、約10 4M -1s -1至約10 6M -1s -1、約10 5M -1s -1至約10 7M -1s -1，約10 6M -1s -1至約10 8M -1s -1、約10 4M -1s -1至約10 7M -1s -1或約10 5M -1s -1至約10 8M -1s -1。在一些實施方式中，抗體部分與硬骨抑素之間結合的K on不超過10 3M -1s -1、10 4M -1s -1、10 5M -1s -1、10 6M -1s -1、10 7M -1s -1或10 8M -1s -1中的任何一個。在一些實施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些實施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些實施方式中，抗體部分和硬骨抑素之間結合的K off為約1s -1至約10 -6s -1、約1s -1至約10 -2s -1、約10 -2s -1至約10 -3s -1、約10 -3s -1至約10 -4s -1，約10 -4s -1至約10 -5s -1，約10 -5s -1至約10 -6s -1，約1s -1至約10 -5s -1，約10 -2s -1至約10 -6s -1，約10 -3s -1至約10 -6s -1，約10 -4s -1至約10 -6s -1、約10 -2s -1至約10 -5s -1或約10 -3s -1至約10 -5s -1。在一些實施方式中，抗體部分與硬骨抑素之間結合的K off為至少約1s -1、10 -2s -1、10 -3s -1、10 -4s -1、10 -5s -1或10 -6s -1中的任何一個。在一些實施方式中，硬骨抑素是人硬骨抑素。在一些實施方式中，硬骨抑素是食蟹猴硬骨抑素。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分或抗硬骨抑素構建體的結合親和力高於（例如，具有較小的K D值）現有的抗硬骨抑素抗體（例如，羅莫單抗）。 b）嵌合或人源化抗體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）是嵌合抗體。描述了某些嵌合抗體，例如，美國專利US 4,816,567；和Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)。在一些實施方式中，嵌合抗體包含非人可變區（例如，來源於小鼠的可變區）和人恒定區。在一些實施方式中，嵌合抗體是其中所述類別或亞類已經與親本抗體發生變化的“類別切換”抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）是人源化抗體。通常，對非人抗體進行人源化以降低對人體的免疫原性，同時保留親代非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包括一個或多個可變結構域，其中HVR，例如，CDR（或其部分）來源於非人抗體，FR（或其部分）來源於人抗體序列。可選地，人源化抗體還將包括人恒定區的至少一部分。在一些實施方式中，人源化抗體中的一些FR殘基由來自非人抗體的相應殘基置換（例如，衍生HVR殘基的抗體），例如，以恢復或提高抗體的特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法的綜述參見，例如，Almagro and Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633 (2008)，其進一步描述參見，例如，Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989); 美國專利US 5, 821,337、US 7,527,791、US 6,982,321以及US 7,087,409；Kashmiri et al., Methods36:25-34 (2005)（描述SDR (a-CDR)移植）；Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991)（描述“重新表面處理”）；Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（描述“FR改組”）；and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（描述FR改組的“引導選擇”方法）。
可用於人源化的人體框架區包括但不限於：使用“最佳擬合”方法選擇的框架區（參見例如，Sims et al. J. Immunol.151:2296 (1993)）；來源於輕鏈或重鏈可變區特定亞組的人抗體共有序列的框架區（參見，例如，Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); and Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)）；人類成熟（體細胞突變）框架區或人類生殖系框架區（參見，例如，Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)）；以及來源於篩選FR文庫的框架區（參見，例如， Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)）。
應當理解的是，小鼠衍生抗體的人源化是一種常見且常規使用的技術。因此，應當理解，序列表中公開的任何和所有抗硬骨抑素抗體的人源化形式都可用於臨床前或臨床環境。如果在這樣的臨床前或臨床環境中使用任何引用的抗硬骨抑素抗體或其抗原結合區域的人源化形式，則預計當時的人源化形式將具有與原始非人源化形式相同或相似的生物活性和特徵。 c）人抗體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）是人抗體（稱為人結構域抗體，或人dAb）。人抗體可使用本領域已知的各種技術生成。關於人抗體的描述，通常參見van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001), Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008), and Chen, Mol. Immunol.47(4):912-21 (2010)。能夠產生全人源單域抗體（或sdAb）的轉基因小鼠或大鼠是本領域已知的。參見，例如，US20090307787A1，美國專利US 8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794.
人抗體（例如，人dAbs）可通過向轉基因動物施用免疫原來製備，所述轉基因動物已經過修飾，以針對抗原激發產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。這些動物通常含有全部或部分人免疫球蛋白位元點，其取代內源性免疫球蛋白位點，或存在於染色體外或隨機整合到動物染色體中。在這種轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白位點通常被滅活。關於從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。另見，例如，描述XENOMOUSE TM技術的美國專利US 6,075,181和US 6,150,584；描述HuMab ®技術的美國專利US 5,770,429；描述K-M MOUSE ®技術的美國專利US 7,041,870，以及描述VelociMouse ®技術的美國專利申請公開說明US 2007/0061900）。可進一步修飾來自此類動物產生的完整抗體的人可變區，例如，通過與不同的人恒定區結合。
人抗體（例如，人dAbs）也可以通過基於雜交瘤的方法製備。已經描述了用於產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤細胞系（參見，例如，Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)）。通過人B細胞雜交瘤技術產生的人抗體的描述也可以參見Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。其他方法包括例如在美國專利US 7,189,826（描述利用雜交瘤細胞系產生人單克隆IgM抗體）和Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（描述人-人雜交瘤）中描述的那些方法。人雜交瘤技術（Trioma技術）的描述也可以參見Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。
人抗體（例如，人dAbs）也可以通過分離選自人源噬菌體顯示文庫的Fv克隆可變結構域序列來生成。然後可以將這種可變結構域序列與理想的人恒定結構域組合。從抗體文庫中選擇人抗體的技術如下所述。 d）文庫衍生抗體
本文所述的抗硬骨抑素抗體部分可以通過篩選組合文庫來分離具有所需活性或活性的抗體。例如，用於生成噬菌體展示文庫並篩選此類文庫以獲得具有理想結合特性的抗體的多種方法是本領域已知的。此類方法的綜述參見，例如，Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)，進一步描述參見，例如，McCafferty et al., Nature348:552-554; Clackson et al., Nature352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132(2004)。已經描述了構建單結構域抗體文庫的方法，例如，參見美國專利US 7371849.
在某些噬菌體展示方法中，通過聚合酶鏈反應（PCR）分別克隆V H和V L基因庫，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後篩選抗原結合噬菌體，如Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)所述。噬菌體通常以scFv片段或Fab片段的形式展示抗體片段。免疫來源的文庫提供了免疫原的高親和力抗體，不需要構建雜交瘤。或者，可以克隆天然庫（例如，來自人）以提供針對廣泛範圍的非自身抗原和自身抗原的單一來源的抗體，而不進行任何免疫，如Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)所述。最後，還可以通過從幹細胞中克隆未重排的V基因片段，並使用含有隨機序列的PCR引物編碼高變的CDR3區域並在體外完成重排，來合成天然文庫，如Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所述。描述人抗體噬菌體庫的專利公開說明包括，例如：美國專利US 5,750,373和美國專利公開說明US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936和US2009/0002360。
從人抗體庫中分離出來的抗體或抗體片段被視為本文中的人抗體或人抗體片段。 e）置換、插入、缺失和變體
在一些實施方式中，提供了具有一個或多個氨基酸取代的抗體變體。需關注的替代突變位點包括HVR（或CDR）和FR。保守置換見表2“優選置換”一項。更實質性的變化在表2的“示例性置換”一項中提供，在下文中參考氨基酸側鏈類別進行進一步描述。可將氨基酸置換引入目標抗體中，並對產品進行理想活性篩選，例如，保留/改善抗原結合，降低免疫原性，或改善ADCC或CDC。
表 2. 氨基酸置換
原始氨基酸 示例性置換 優選置換
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
氨基酸可根據常見的側鏈性質進行分組：（1）疏水性：去甲亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）鹼性：His、Lys、Arg；（5）影響主鏈構象的殘基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守置換將需要將其中一個類的一個成員替換為另一個類。
一種類型的置換變體涉及置換親本抗體的一個或多個高變區殘基（例如，人源化抗體或人抗體）。通常，所選的用於進一步研究的所得變體將針對於親本抗體修飾（例如，改善）某些生物學特性（例如，親和力增加，免疫原性降低）並/或將基本上保留親本抗體的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟的抗體，其可以方便地生成，例如，使用諸如本文所述的基於噬菌體顯示的親和力成熟技術。簡言之，一個或多個HVR殘基發生突變，且是噬菌體上顯示的和針對特定生物學活性（例如，結合親和力）選擇的變體抗體。
修改（例如替換）可以在HVR中進行，例如，提高抗體親和力。此類修改可以在HVR“熱點”中進行，即，由體細胞成熟過程中以高頻率發生突變的密碼子編碼的殘基（參見，例如，Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)），和/或SDR（a-CDR），檢測所得變體V H或V L的結合親和力。通過構建和從二級文庫中重新選擇獲得親和力成熟的描述可以參見，例如，Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology178:1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)）。在親和力成熟的一些實施方式中，通過多種方法（例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變）中的任何一種將多樣性引入選擇用於成熟的可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選文庫，以鑒定具有理想親和力的任何抗體變體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定向方法，其中有幾個HVR殘基（例如，每次4-6個殘基）隨機分組。可以對參與抗原結合的HVR殘基進行特異性鑒定，例如，使用丙氨酸掃描誘變或建模。特別是CDR-H3和CDR-L3通常是靶向的。
在一些實施方式中，置換、插入或缺失可以發生在一個或多個HVR內，只要這種改變不會顯著降低抗體結合抗原的能力。例如，保守性修改（例如，如本文中提供的保守置換）不會顯著降低結合親和力，可以在HVR中進行。此類修改可能在HVR“熱點”或CDR之外。
一種鑒定可能靶向誘變的抗體殘基或區域的可用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述。在該方法中，一個殘基或一組目標殘基（例如，帶電殘基如Arg、Asp、His、Lys和Glu）被鑒定並被中性或帶負電荷的氨基酸（例如，丙氨酸或聚丙氨酸）取代，以確定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可在氨基酸位置引入進一步的置換，證明對初始置換具有功能敏感性。或者，或另外，抗原抗體複合物的晶體結構，以確定抗體和抗原之間的接觸點。這些接觸殘基和相鄰殘基可以作為置換的候選物被靶向或消除。可以篩選多個變體來確定它們是否含有理想的性質。
氨基酸序列插入包括長度從一個殘基到含有100個或多個殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的示例包括具有N端甲硫氨醯殘基的抗體。抗體分子的其他插入變體包括抗體與酶的N端或C端融合（例如，對於ADEPT）或增加抗體血清半衰期的多肽。 f）糖基化變體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）被改變以增加或降低結構糖基化的程度。可以通過改變氨基酸序列來創建或刪除一個或多個糖基化位點來方便完成抗體糖基化位點的添加或刪除。
當抗體部分包括Fc區時，可改變附著在其上的碳水化合物。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含一個分支的雙觸角寡糖，通常通過N-連接附著在Fc區C H2結構域的Asn297上。參見，例如，Wright et al. TIBTECH15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯氨基葡萄糖（GlcNAc）、半乳糖和唾液酸，以及附著在雙觸角寡糖結構的“莖”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些實施方式中，可以對抗體部分中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善性質的抗體變體。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）具有缺乏（直接或間接）附著在Fc區的岩藻糖的碳水化合物結構。例如，這種抗體中岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通過計算Asn297糖鏈內岩藻糖的平均量，相對於通過MALDI-TOF質譜法測量的附著在Asn 297上的所有糖結構的總和（例如，複合、雜合和高甘露糖結構）測定岩藻糖的量，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區約297位的天冬醯胺殘基（Fc區殘基的EU編號）；但是，Asn297也可能位於297位上游或下游約±3個氨基酸處，即，由於抗體的微小序列變異，在294位和300位之間。此類岩藻糖基化變體可能具有改善的ADCC功能。美國專利公開說明US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與“脫岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗體變體相關的公開說明的示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/0357778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004).能夠產生脫岩藻糖基化抗體的細胞系的示例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化的Lec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); 美國專利申請US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams et al.，特別是在示例11）中，和敲除細胞系，如α-1，6-岩藻糖基轉移酶基因，FUT8，敲除CHO細胞（參見，例如，Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); and WO2003/085107)。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）具有二分寡糖，例如，其中附著在抗體Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc平分。此類抗體變體可能具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此類抗體變示例的描述參見，例如，WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.)；美國專利 US 6,602,684(Umana et al.)和US 2005/0123546（Umana et al.).還提供了在附著在Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可能具有改善的CDC功能。此類抗體變體的描述參見，例如，WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); and WO 1999/22764 (Raju, S.)。 g）Fc區變體和輕鏈恒定區變體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素抗體部分）包括Fc片段。
術語“Fc區”、“Fc結構域”、“Fc片段”或“Fc”是指包含至少一部分恒定區的免疫球蛋白重鏈的C端非抗原結合區。該術語包括天然Fc區和變體Fc區。在一些實施方式中，人IgG重鏈Fc區從Cys226延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc區的C端賴氨酸（Lys447）可能存在也可能不存在，而不影響Fc區的結構或穩定性。除非本文另有說明，否則IgG或Fc區中的氨基酸殘基的編號是基於Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991所述的抗體的EU編號系統，也稱為EU索引。
在一些實施方式中，Fc片段來自免疫球蛋白，所述免疫球蛋白選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其組合和雜交中的一種。在一些實施方式中，Fc片段來自免疫球蛋白，所述免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其組合和雜交中的一種。
在一些實施方式中，所述Fc片段具有與相應野生型Fc片段相比降低的效應子功能。（例如通過抗體依賴性細胞毒性（ADCC）水準測量的至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的降低的效應子功能）。
在一些實施方式中，Fc片段是指IgG1Fc片段。在一些實施方式中，IgG1Fc片段包含L234A突變和/或L235A突變。在一些實施方式中，Fc片段是指IgG2或IgG4Fc片段。在一些實施方式中，Fc片段是指包含S228P、F234A和/或L235A突變的IgG4Fc片段。在一些實施方式中，Fc片段包含N297A突變。在一些實施方式中，Fc片段包含N297G突變。
在一些實施方式中，可以將一種或多種氨基酸修飾引入抗體部分的Fc區，從而產生Fc區變體。Fc區變體可以包括人Fc區序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區），其包含一個或多個氨基酸位置的一個氨基酸修飾（例如，置換）。在一些實施方式中，Fc片段衍生自來源於大鼠Fc區序列（例如、大鼠IgG2Fc）或小鼠Fc區序列（例如，小鼠IgG1 Fc）。
在一些實施方式中，Fc片段包含人IgG2 Fc區。
在一些實施方式中，Fc片段包含人IgG4 Fc區。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括選自S228P、T366W和任選H435R中的一個或多個（例如兩個、三個或四個）置換。除非另有說明，否則本文所述修飾的編號基於EU索引。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括S228P、T366W和可選的H435R。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括選自F126C、L128C、C131S、F170C、P161C、V173C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R中的一個或多個（例如兩個、三個、四個、五個或六個）置換。在一些實施方式中，所述Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括：a）C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V，b）選自F126C、L128C、F170C、P161C和V173C中的置換之一，和c）可選的H435R。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括選自F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R中的一個或多個（例如兩個、三個、四個、五個或六個）置換。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R。在一些實施方式中，所述Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括L128C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括C131S、F170C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R。在一些實施方式中，Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括C131S、V173C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R。在一些實施方式中，所述Fc片段包括修飾的人IgG4重鏈Fc區和可選的Y436F，所述修飾的人IgG4重鏈Fc區包括C131S、P171C、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）包含S228P、T366W的第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，以及可選的Y436F，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括：a）C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V以及可選的H435R，和b）選自F126C、L128C、F170C、P161C和V173C中的置換之一。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述第一修飾的人IgG4重鏈Fc區包含S228P、T366W，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括F126C、C131S、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述第一修飾的人IgG4重鏈Fc區包含S228P、T366W，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括L128C、C131S、228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述第一修飾的人IgG4重鏈Fc區包含S228P、T366W，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括 C131S、F170C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述第一修飾的人IgG4重鏈Fc區包含S228P、T366W，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括 C131S、V173C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括Fc片段，所述Fc片段包括：a）第一修飾的人IgG4重鏈Fc區，和b）第二修飾的人IgG4重鏈Fc區，所述第一修飾的人IgG4重鏈Fc區包含S228P、T366W，所述第二修飾的人IgG4重鏈Fc區包括 C131S、F171C、S228P、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括包含F118C、S121C、Q160C、S162C、S176C和/或C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括包含S121C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括包含F118C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括包含S176C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，所述抗硬骨抑素構建體包括包含Q160C和C214S修飾的人Igκ輕鏈恒定區。在一些實施方式中，所述抗硬骨抑素構建體包括包含S162C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，Fc片段具有一些但不是所有的效應子功能，這使得其成為某些應用的理想候選物，在這些應用中，抗體部分在體內的半衰期是重要的，但某些效應器功能（例如補體和ADCC）是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性試驗以確認CDC和/或ADCC活性的減少/耗竭。例如，可進行Fc受體（FcR）結合試驗，以確保抗體缺乏FcγR結合（因此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。介導ADCC的原代細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達匯總見表2（Ravetch and Kinet, Annu Rev. Immunol.9:457-492 (1991)第464頁。用於評估目標分子ADCC活性的體外試驗的非限制性示例描述，見美國專利US 5,500,362（參見，例如，Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986)）和Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985); 5,821,337（見Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)）。或者，可以採用非放射性試驗方法（例如，參見流式細胞術的ACTI TM非放射性細胞毒性試驗（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；和CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性試驗（Promega, Madison, WI）。用於此類試驗的有效效應細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和自然殺傷（NK）細胞。或者，或另外，可在體內評估目標分子的ADCC活性，例如在Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998)中公開的動物模型中。還可進行C1q結合試驗，以確認抗體不能結合C1q，因此缺乏CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體啟動，可進行CDC試驗（例如，參見Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood101:1045-1052 (2003); and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood103:2738-2743 (2004)）。FcRn結合和體內清除率/半衰期測定也可以使用本領域已知的方法進行（參見，例如，Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)）。
效應子功能降低的抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個被置換的抗體（美國專利US 6,737,056）。此類Fc突變體包括在氨基酸265位、269位、270位、297位和327位中的兩個或多個被置換的Fc突變體，包括被殘基265和297取代為丙氨酸的所謂“DANA”Fc突變體（美國專利US 7,332,581）。在一些實施方式中，Fc片段包括N297A突變。在一些實施方式中，Fc片段包含N297G突變。
描述了與FcR結合改善或減少的某些抗體變體。（參見，例如，美國專利6,737,056; WO 2004/056312, and Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).）
在一些實施方式中，Fc片段是指IgG1Fc片段。在一些實施方式中，IgG1Fc片段包含L234A突變和/或L235A突變。在一些實施方式中，Fc片段是指IgG2或IgG4Fc片段。在一些實施方式中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突變的IgG4Fc片段。
在一些實施方式中，抗體部分包括具有改善ADCC的一個或多個氨基酸取代的Fc區，例如，Fc區298位、333位和/或334位的置換（殘基的EU編號）。
在一些實施方式中，在Fc區中進行修改（即，改善或減少）C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性（CDC），例如，如美國專利US 6,194,551、WO 99/51642 and Idusogie et al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)所述。
在一些實施方式中，所述抗體部分變體包括變體Fc區，所述變體Fc區包括改變半衰期和/或改變與新生兒Fc受體（FcRn）的結合的氨基酸置換。半衰期增加且改善了與新生兒Fc受體（FcRn）結合的抗體的描述見US2005/0014934A1（Hinton et al.），所述新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)）。這些抗體包括其中具有一個或多個置換的Fc區，所述Fc區改變了Fc區與FcRn的結合。此類Fc變體包括在250位、252位、254位、256位、307位、308位、428位、434位（美國專利US 7,371,826）的一個或多個Fc區殘基處具有置換的變體，包括包含M428L和N434S的所謂“LS”Fc突變體（WO 2009/086320）以及包含M252Y、S254T和T256E的所謂“YTE”Fc突變體（WO 2002/060919）。
另見Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利US 5,648,260；美國專利US 5,624,821；以及涉及Fc區變體的其他示例的WO 94/29351。 h）半胱氨酸工程化抗體變體
在一些實施方式中，可能需要產生半胱氨酸工程化抗體部分，例如，“thioMAbs”，其中抗體的一個或多個殘基由半胱氨酸殘基置換。在具體實施方式中，置換的殘基位於抗體的可接近位點處。通過用半胱氨酸置換這些殘基，反應性巰基由此定位在抗體的可接近位點處，並且可以用於將抗體與其他部分（例如藥物部分或連接子藥物部分）偶聯，以產生抗體-藥物偶聯物，如本文進一步所述。在一些實施方式中，以下殘基中的任何一個或多個可由半胱氨酸置換：重鏈的A118（EU編號）；和重鏈Fc區的S400（EU編號）。半胱氨酸工程化抗體部分可以按照例如美國專利US 7,521,541中所述生成。 i）抗體衍生物
在一些實施方式中，本文所述的抗體部分可以進一步修飾，以便包括本領域已知且容易獲得的其他非蛋白部分。適合於抗體衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限於聚乙二醇（PEG）、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三氧六環、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或無規共聚物）、右旋糖酐或聚（n-乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、丙二醇/環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如，甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於在水中的穩定性而在生產中可能具有優勢。聚合物可以具有任何分子量，並且可以是支鏈的或非支鏈的。附著在抗體上的聚合物的數量可以變化，如果附著了多於一種聚合物，則可以是相同的或不同的分子。一般來說，用於衍生化的聚合物的數量和/或類型可以基於以下考量來確定，包括但不限於待改善的抗體的具體性質或功能、抗體衍生物是否將在規定條件下用於診斷等。
在一些實施方式中，抗體部分可以進一步修飾，以便包括一種或多種生物活性蛋白、多肽或其片段。本文中可互換地使用的“生物活性”或“生物活性的”是指在體內展示生物活性以執行具體功能。例如，它可以是指與特定生物分子如蛋白質、DNA等的組合，然後促進或抑制此類生物分子的活性。在一些實施方式中，生物活性蛋白或其片段包括作為活性原料藥用于患者以預防或治療疾病或病症的蛋白質和多肽，以及用於診斷的蛋白質和多肽，例如用於診斷檢查或體外檢測的酶，以及用於患者以預防疾病的蛋白質和多肽（如疫苗）。 多特異性抗硬骨抑素構建體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，其包括根據本文所述抗硬骨抑素抗體部分中任何一個的抗硬骨抑素抗體部分和特異性識別第二抗原的第二結合部分（例如第二抗體部分）。在一些實施方式中，所述多特異性抗硬骨抑素分子包括抗硬骨抑素抗體部分和特異性識別第二抗原的第二抗體部分。在一些實施方式中，第二抗原是免疫檢查點分子。在一些實施方式中，第二抗原是DKK1（Dickkopf Wnt信號通路抑制劑1）或RANKL（核因數-κB受體活化因數配體）。 靶向硬骨抑素和RANKL的多特異性構建體
本申請提供了靶向硬骨抑素和RANKL的多特異性構建體。在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分。在一些實施方式中，硬骨抑素是指人硬骨抑素。在一些實施方式中，RANKL是指人RANKL。
RANKL（核因數-κB受體活化因數配體），又稱腫瘤壞死因數配體超家族成員11（TNFSF11），是骨保護素的配體，作為破骨細胞分化和活化的關鍵因數。該蛋白被證明是一種樹突狀細胞存活因數，參與調節T細胞依賴性免疫應答。據報導，T細胞活化可誘導該基因的表達，並導致破骨細胞生成和骨丟失增加。該蛋白通過涉及SRC激酶和腫瘤壞死因數受體相關因數（TRAF6）的信號複合物啟動抗凋亡激酶AKT/PKB，表明該蛋白可以在細胞凋亡的調控中發揮作用。小鼠相關基因的靶向破壞導致嚴重的骨硬化和破骨細胞的缺乏。缺陷小鼠表現出T淋巴細胞和B淋巴細胞早期分化缺陷，妊娠期間未能形成小葉-肺泡乳腺結構。 示例性抗RANKL抗體部分
在一些實施方式中，本文所述的多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗RANKL抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭RANKL的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗RANKL抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中V H包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗RANKL部分包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H鏈區域內具有SEQ ID NO: 72所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L鏈區域內具有SEQ ID NO: 73所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括特異性識別RANKL的第一抗體部分和特異性識別硬骨抑素的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分包含抗RANKL單域抗體（sdAb）部分，其中所述第二抗體部分包括全長抗體，所述全長抗體包含重鏈可變區（V H）和第二輕鏈可變區（V L）以及Fc片段。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb與包含Fc片段的全長抗體的兩條重鏈融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb與全長抗體的兩條輕鏈融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb與全長抗體的重鏈或輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb與全長抗體的重鏈或輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb通過連接子（例如本文所述的任何連接子）與全長抗體融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb不通過連接子與全長抗體融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括特異性識別RANKL的第一抗體部分和特異性識別硬骨抑素的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分包括抗RANKL單域抗體（sdAb）部分，所述第二抗體部分包括重鏈可變區（V H）和第二輕鏈可變區（V L），所述構建體包括：a）兩條嵌合重鏈，每條嵌合重鏈從N端到C端包括：i）V H，ii）第一重鏈恒定結構域（“C H1結構域”），iii）抗RANKL sdAb，和iv）Fc結構域，其中所述兩個Fc結構域形成Fc片段；b）包含V L和輕鏈恒定結構域（“C L結構域”）的兩條輕鏈。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb通過第一連接子與Fc結構域融合。在一些實施方式中，抗RANKL sdAb通過第二連接子與V H融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括特異性識別RANKL的第一抗體部分和特異性識別硬骨抑素的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分包括抗RANKL單域抗體（sdAb）部分，所述第二抗體部分包括重鏈可變區（V H）和第二輕鏈可變區（V L），所述構建體包括：a）第一重鏈，所述第一重鏈從N端至C端包括：i）抗RANKL sdAb，和ii）第一Fc結構域；b）第二重鏈，所述第二重鏈從N端到C端包括：i）V H，ii）第一重鏈恒定結構域（“C H1結構域”）和iii）第二Fc結構域；以及c）包含V L和輕鏈恒定結構域（“C L結構域”）的輕鏈，其中所述第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。
在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域中的一個包括T366W突變和可選的S354C突變，另一個Fc結構域包括T366S突變、L368A突變、Y407V突變和可選的Y349C突變。
在一些實施方式中，所述第二抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的第三抗體部分競爭RANKL的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）根據本文所述抗硬骨抑素抗體部分中任何一個所述的抗硬骨抑素抗體部分；b）特異性識別RANKL的第二抗體部分（抗RANKL抗體部分，諸如本文所述的抗RANKL抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，所述抗硬骨抑素V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述抗硬骨抑素V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
在一些實施方式中，所述抗硬骨抑素V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述抗硬骨抑素V L包括：i）包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
在一些實施方式中，上述氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“示例性置換”。在一些實施方式中，氨基酸置換僅限於本申請表2中所示的“優選置換”。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異的（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗硬骨抑素全長抗體的至少兩條重鏈融合的抗RANKL抗體部分（如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗RANKL抗體部分與兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗RANKL抗體部分與兩條重鏈的C端融合。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）抗RANKL抗體部分，所述抗RANKL抗體部分包括包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗RANKL全長抗體的至少一條或兩條重鏈融合的抗硬骨抑素抗體部分（例如本文所述的抗硬骨抑素抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條重鏈的C端融合。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異的（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗硬骨抑素全長抗體的至少兩條輕鏈融合的抗RANKL抗體部分（例如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗RANKL抗體部分與兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗RANKL抗體部分與兩條輕鏈的C端融合。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異的（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗RANKL全長抗體的至少兩條輕鏈融合的抗硬骨抑素抗體部分（例如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條輕鏈的C端融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括：特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分包括單鏈Fv片段（scFv），所述單鏈Fv片段包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述第二抗體部分是包含第二重鏈可變區（V H-2）、第二輕鏈可變區（V L-2）和Fc片段的全長抗體。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分通過第一連接子（例如本文所述的任何連接子）與全長抗體融合。在一些實施方式中，第一抗體部分不通過連接子與全長抗體融合。在一些實施方式中，V H-1通過第二連接子（例如本文所述的任何連接子）與V L-1融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構建體，包括：特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分是包含第一重鏈可變區（V H-1）、第一輕鏈可變區（V L-1）和Fc片段的全長抗體，所述第二抗體部分包括單鏈Fv片段（scFv），所述單鏈Fv片段包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的重鏈或輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的重鏈或輕鏈兩者的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分通過第一連接子（例如本文所述的任何連接子）與全長抗體融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體融合。在一些實施方式中，V H-2通過第二連接子（例如本文所述的任何連接子）與V L-2融合，以便能夠正確地組裝scFv。在一些實施方式中，V H-2不通過連接子與V L-2融合。
在一些實施方式中，提供了特異性識別硬骨抑素和RANKL的多特異性構建體，包括：第一抗體部分和第二抗體部分，其中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述構建體包括：a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端至C端包含：i）V L-1，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）；b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H-1，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域；c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到C端包含：i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；和d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包含：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”），其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別硬骨抑素，第二抗體部分特異性識別RANKL。在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別RANKL，第二抗體部分特異性識別硬骨抑素。
在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域中的一個包含T366W突變和可選的S354C突變，另一個Fc結構域包括T366S突變、L368A突變、Y407V突變和可選的Y349C突變，其中編號基於EU索引。
在一些實施方式中，i）第一CH1結構域和第一CL結構域或ii）第二CH1結構域和第二CL結構域均選自：a）CH1結構域，其中141位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中116位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；b）CH1結構域，其中168位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中164位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；c）CH1結構域，其中126位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中121位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；d）CH1結構域，其中128位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中118位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；e）CH1結構域，其中170位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中176位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換非為半胱氨酸氨基酸；f）CH1結構域，其中171位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中162位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；g）CH1結構域，其中173位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中160位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換非半胱氨酸氨基酸；其中編號基於EU索引。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構構建體，包括：特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包含第一重鏈可變區（V H-1），每條輕鏈包含第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括抗RANKL單鏈Fv片段（scFv），所述抗RANKL單鏈Fv片段（scFv）包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述第二抗體部分與抗硬骨抑素全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，所述V H-1包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-2包括SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 73的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，提供了特異性識別硬骨抑素和RANKL的多特異性構建體，包括：第一抗體部分和第二抗體部分，其中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述構建體包括：a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端至C端包含：i）V L-1，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）；b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H-1，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域；c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到C端包含：i）V H-2，ii）第一重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；和d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包含：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”），其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段，第一抗體部分特異性識別硬骨抑素，第二抗體部分特異性識別RANKL。在一些實施方式中，所述V H-1包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-2包括SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-2包括SEQ ID NO: 73的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 156的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 157的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別RANKL的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 158的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 159的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包含特異性識別RANKL的第二抗體部分。在一些實施方式中，所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 160的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 161的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別RANKL的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 162的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別RANKL的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述第二抗體部分：包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 126的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 127的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 128的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 130的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 131的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 132的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別RANKL的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89或170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子/不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，抗RANKL抗體部分和抗硬骨抑素抗體部分通過連接子（例如本文所述的任何連接子中的任何一個）與允許結合部分發揮適當作用的任何可操作形式彼此融合。 靶向硬骨抑素和DKK1的多特異性構建體
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）根據本文所述的抗硬骨抑素抗體部分中的任何一個的抗硬骨抑素抗體部分；b）特異性識別DKK1的第二抗體部分（抗DKK1抗體部分）。
DKK1（Dickkopf相關蛋白1）是dickkopf蛋白家族的一員。該家族的成員是分泌蛋白，其特徵為兩個富含半胱氨酸的結構域，介導蛋白-蛋白質相互作用。DKK1與LRP6共受體結合，抑制β-連環蛋白依賴性Wnt信號傳遞。該基因在胚胎發育中發揮作用，可能在成人骨形成中起重要作用。 示例性抗DKK1抗體部分
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭DKK1的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭DKK1的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中抗體部分與包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2）的抗體或抗體片段競爭DKK1的結合表位，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中V H包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 60的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 61的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中V H包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 62的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 63的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，多特異性抗硬骨抑素構建體中使用的抗DKK1抗體部分（諸如scFv）包括包含重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L）的抗體部分，其中V H包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，V L包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H包括SEQ ID NO: 64的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 65的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，抗DKK1部分包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H鏈區域內具有SEQ ID NO: 60、62或64所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L鏈區域內具有SEQ ID NO: 61、63或65所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗硬骨抑素全長抗體的至少兩條重鏈融合的抗DKK1抗體部分（如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗DKK1抗體部分與兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗DKK1抗體部分與兩條重鏈的C端融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）抗DKK1抗體部分，所述抗DKK1抗體部分包括包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗DKK1全長抗體的至少一條或兩條重鏈融合的抗硬骨抑素抗體部分（例如本文所述的抗硬骨抑素抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條重鏈的C端融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗硬骨抑素全長抗體的至少兩條重輕鏈融合的抗DKK1抗體部分（如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗DKK1抗體部分與兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗DKK1抗體部分與兩條輕鏈的C端融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）抗DKK1抗體部分，所述抗DKK1抗體部分包括包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，其中每條重鏈包括重鏈可變區（V H），每條輕鏈包括輕鏈可變區（V L），b）與抗DKK1全長抗體的至少一條或兩條輕鏈融合的抗硬骨抑素抗體部分（例如本文所述的抗體部分中的任何一個）。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與兩條輕鏈的C端融合。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分和抗DKK1抗體部分通過連接子（例如本文所述的任何連接子）與允許結合部分發揮適當作用的任何可操作形式彼此融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分與抗DKK1抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，V H-1包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，V L-1包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 60、164或166的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 61、165或167的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 164的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 165的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 166的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 167的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 167的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2與所述V L-2的C端融合。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 95的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 98的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 104的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 105的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 107的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 111的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 113的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 114的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 117的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 123的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 124的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，V L-1包括SEQ ID NO: 89或170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 60、164或166的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 61、165或167的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 164的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 165的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 166的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 167的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 167的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-1上的G44C突變和V L-1上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 115的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 120的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述多特異性構建體包括兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈包含SEQ ID NO: 121的氨基酸序列，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，V L-1包括SEQ ID NO: 89或170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 62的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，V H-1和V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89或170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 64的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 62的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）抗硬骨抑素構建體，包括：a）特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，所述第一抗體部分包含第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，和b）特異性識別DKK1的第二抗體部分，所述第二抗體部分包含第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 64的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。在一些實施方式中，第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv。在一些實施方式中，所述V H-2融合到所述V L-2的N端。在一些實施方式中，所述V H-2可選地與附接到V H-2的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-2的C端。在一些實施方式中，所述V H-2和所述V L-2通過連接子（例如，GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，所述scFv是dsscFv，可選地包含：a）根據SEQ ID NO: 60編號的V H或V H-2中的G44C突變，以及b）根據SEQ ID NO: 61編號的V L或V L-2中的G100C突變。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第二抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的全長抗體，第一抗體部分是包含V H-1和V L-1的scFv。在一些實施方式中，所述V H-1與所述V L-1的N端融合。在一些實施方式中，所述V H-1可選地與附接到V H-1的C端的單個丙氨酸氨基酸融合到V L-1的C端。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，所述V H-1和所述V L-1不通過連接子融合。在一些實施方式中，scFv轉化為具有由V H-2上的G44C突變和V L-2上的G100C突變形成的H44-L100二硫鍵的dsscFv。在一些實施方式中，第二抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的N端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分與全長抗體的一條或兩條輕鏈的C端融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分通過連接子（例如GS連接子，例如(GGGGS) 4）融合。在一些實施方式中，第一抗體部分和第二抗體部分不通過連接子融合。
在一些實施方式中，提供了特異性識別硬骨抑素和DKK1的多特異性構建體，包括：第一抗體部分和第二抗體部分，其中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述構建體包括：a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端至C端包含：i）V L-1，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）；b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H-1，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域；c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到c端包含：i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；和d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包含：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”），其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別硬骨抑素，第二抗體部分特異性識別DKK1。在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別DKK1，第二抗體部分特異性識別硬骨抑素。
在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域中的一個包含T366W突變和可選的S354C突變，另一個Fc結構域包括T366S突變、L368A突變、Y407V突變和可選的Y349C突變，其中編號基於EU索引。
在一些實施方式中，i）第一CH1結構域和第一CL結構域或ii）第二CH1結構域和第二CL結構域均選自：a）CH1結構域，其中141位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中116位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；b）CH1結構域，其中168位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中164位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；c）CH1結構域，其中126位元的氨基酸置換為半胱氨酸，220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中121位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；d）CH1結構域，其中128位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中118位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；e）CH1結構域，其中170位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中176位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；f）CH1結構域，其中171位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中162位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；g）CH1結構域，其中173位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中160位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；其中編號基於EU索引。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366W、H435R和Y436F的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含F126C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含S121C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含F126C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含S121C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366W、H435R和Y436F的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含L128C、C131S、S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含F118C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含L128C、C131S、S228P、T366W和H435R的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含F118C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含F170C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含S176C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一重鏈包括包含S228P、T366S、L368A和Y407V的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二重鏈包括包含V173C、C131S、S228P、T366W、H435R和Y436F的修飾的人IgG4重鏈Fc區；第二輕鏈包括包含Q160C和C214S的修飾的人Igκ輕鏈恒定區。
在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別硬骨抑素，第二抗體部分特異性識別DKK1。在一些實施方式中，所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 88或160的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-1包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-1包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，a）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3；b）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1，包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，第一抗體部分特異性識別DKK1，第二抗體部分特異性識別硬骨抑素。在一些實施方式中，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 87或168的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 88或169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 169的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 87或169的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 89或170的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 89的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述V H-2包含SEQ ID NO: 168的氨基酸序列，所述V L-2包含SEQ ID NO: 170的氨基酸序列。在一些實施方式中，a）所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3；b）所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1，包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c）所述V H-1包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-1包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性構構建體，包括：特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分，其中所述第一抗體部分是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗硬骨抑素全長抗體，其中每條重鏈包含第一重鏈可變區（V H-1），每條輕鏈包含第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括抗RANKL單鏈Fv片段（scFv），所述抗DKK1單鏈Fv片段（scFv）包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述第二抗體部分與抗硬骨抑素全長抗體的兩條重鏈的C端融合。在一些實施方式中，所述V H-1包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:46氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-2包括SEQ ID NO: 60的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 61的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，提供了特異性識別硬骨抑素和DKK1的多特異性構建體，包括：第一抗體部分和第二抗體部分，其中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），所述構建體包括：a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端至C端包含：i）V L-1，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）；b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H-1，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域；c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到C端包含：i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；和d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包含：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”），其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段，第一抗體部分特異性識別硬骨抑素，第二抗體部分特異性識別DKK1。在一些實施方式中，所述V H-1包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。在一些實施方式中，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些實施方式中，所述V H-2包括SEQ ID NO: 60的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L-1包括SEQ ID NO: 61的氨基酸序列，或包含具有至少約80%（例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的至少約任何一個）序列一致性的氨基酸序列的變體。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 136的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 137的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 138的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 139的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 140的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 141的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 142的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 143的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 144的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 145的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 148的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 149的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 150的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 151的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 152的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 153的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 154的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 155的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 156的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 157的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 158的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 159的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 160的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 161的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。
在一些實施方式中，提供了一種多特異性（例如，雙特異性）構建體，包括：a）包含第一可變重鏈可變區（V H-1）和第一重鏈恒定區的第一重鏈，其中所述第一重鏈包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列；b）包含第一輕鏈可變區（V L-1）和第一輕鏈恒定區的第一輕鏈，其中所述第一輕鏈包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列；c）包含第二可變重鏈可變區（V H-2）和第二重鏈恒定區的第二重鏈，其中所述第二重鏈包含SEQ ID NO: 162的氨基酸序列；和d）包含第二輕鏈可變區（V L-2）和第二輕鏈恒定區的第二輕鏈，其中第二輕鏈包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列，V H-1和V L-1包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分，V H-2和V L-2包括特異性識別DKK1的第二抗體部分。 抗硬骨抑素融合蛋白或抗體藥物偶聯物
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體是包含抗硬骨抑素抗體部分（例如，抗硬骨抑素scFv）和第二部分的融合蛋白或抗體藥物偶聯物。
在一些實施方式中，第二部分包括半衰期延長部分。在一些實施方式中，半衰期延長部分是白蛋白結合部分（例如，白蛋白結合抗體部分）。
在一些實施方式中，第二部分包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分和第二部分通過連接子（例如“連接子”部分中描述的任何連接子）融合。在一些實施方式中，抗硬骨抑素抗體部分和第二部分不通過連接子融合。 連接子
在一些實施方式中，本文所述的抗硬骨抑素構建體包括兩個部分（例如，在上述多特異性構建體中，抗硬骨抑素抗體部分和半衰期延長部分、抗硬骨抑素抗體部分和第二結合部分）之間的一個或多個連接子。抗硬骨抑素構建體中使用的連接子的長度、柔韌性程度和/或其他性質可能對性質有一些影響，包括但不限於親和力，一種或多種特定抗原或表位的特異性或親和力。例如，可以選擇較長的連接子來確保兩個相鄰結構域不會在空間上相互干擾。在一些實施方式中，連接子（諸如肽連接子）包括柔性殘基（例如甘氨酸和絲氨酸），這樣相鄰結構域彼此之間可以自由移動。例如，甘氨酸-絲氨酸雙聯物可以是合適的肽連接子。在一些實施方式中，連接子是非肽連接子。在一些實施方式中，連接子是肽連接子。在一些實施方式中，連接子是不可裂解連接子。在一些實施方式中，連接子是可裂解連接子。
連接子其他考慮因素包括對所得化合物物理或藥代動力學特性的影響，例如溶解度、親脂性、親水性、疏水性、穩定性（或多或少穩定以及計畫降解）、剛性、柔性、免疫原性、抗體結合的調節、摻入膠束或脂質體的能力等。 肽連接子
肽連接子可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，可以使用來源於僅重鏈抗體的鉸鏈區的序列作為連接子，例如參見WO1996/34103。
肽連接子可以具有任何合適的長度。在一些實施方式中，肽連接子的長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多氨基酸。在一些實施方式中，肽連接子的長度不超過100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少氨基酸。在一些實施方式中，肽連接子的長度為約1個氨基酸至約10個氨基酸、約1個氨基酸至約20個氨基酸、約1個氨基酸至約30個氨基酸、約5個氨基酸至約15個氨基酸、約10個氨基酸至約25個氨基酸中、約5個氨基酸至約30個氨基酸、約10個氨基酸至約30個氨基酸、約30個氨基酸至約50個氨基酸、約50個氨基酸至約100個氨基酸和約1個氨基酸至約100個氨基酸中的任何一個。
這種肽連接子的一個基本技術特徵是，所述肽連接子不包含任何聚合活性。肽連接子的特徵，包括不促進二級結構，在本領域是已知的，並且如Dall’Acqua et al.(Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al.(Mol Immunol (1992) 29, 21-30) and Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)中所述。在“肽連接子”中，特別優選的氨基酸是Gly。此外，優選也不促進任何二級結構的肽連接子。域之間的相互連接可以由例如，基因工程提供。製備融合的和操作連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表達它們的方法是本領域眾所周知的（例如，WO 99/54440, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989 and 1994 or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001)。
肽連接子是一種穩定的連接子，不能被蛋白酶特別是基質金屬蛋白酶（MMPs）裂解。
連接子也可以是柔性連接子。示例性柔性連接子包括甘氨酸聚合物(G) n（SEQ ID NO: 78）、甘氨酸-絲氨酸聚合物（包括例如(GS) n（SEQ ID NO: 79）、(GSGGS) n（SEQ ID NO: 80）、(GGGGS) n（SEQ ID NO: 81）和(GGGS) n（SEQ ID NO: 82），其中n是至少為1的整數）、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和本領域已知的其他柔性連接子。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物是相對非結構化的，因此可能能夠作為組分之間的中性拴系。甘氨酸能比丙氨酸進入更多的phi-psi空間，並且比側鏈長的殘基限制小得多（參見Scheraga, Rev. Computational Chem.11 173-142 (1992)）。本領域技術人員知道，抗體融合蛋白的設計可包括全部或部分柔性的連接子，使得連接子可以包括柔性連接子部分以及賦予較弱柔性結構以提供所需抗體融合蛋白結構的一個或多個部分。
此外，示例性連接子還包括諸如(GGGGS) n（SEQ ID NO: 81）的氨基酸序列，其中n是1至8之間的整數，例如，(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 76）、(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 77）或(GGGGS) 6（SEQ ID NO: 83）。在一些實施方式中，肽連接子包含(STSGSGKPGSGEGS) n（SEQ ID NO: 84）的氨基酸序列，其中n是1至3之間的整數。 非肽連接子
兩個部分的偶聯可以通過將結合兩個分子的任何化學反應來完成，只要兩個部分保留各自的活性，即，該抗硬骨抑素多特異性抗體的兩個部分能夠分別與硬骨抑素和第二種抗原結合。該連接子可以包括許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、插層、配位結合和絡合。在一些實施方式中，結合是指共價結合。共價結合可以通過現有側鏈的直接縮合或通過摻入外部橋接分子來實現。在這種情況下，許多二價或多價連接劑可用於偶聯蛋白質分子。例如，代表性偶聯劑可以包括有機化合物，如硫酯、碳二亞胺、琥珀醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亞甲基二胺。該列表並不旨在詳盡地描述本領域已知的各種類型的偶聯劑，而是代表更常見的偶聯劑（參見Killen and Lindstrom, Jour.Immun.133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); and Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)）。
可應用於本申請的連接子如參考文獻所述（參見，例如Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res.44:201-208 (1984)，描述了MBS（M-馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯的用途）。在一些實施方式中，本文使用的非肽連接子包括：（i）EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；（ii）SMPT（4-琥珀醯亞胺氧基-α-甲基-α-(2-嘧啶基-二硫代)-甲苯（Pierce Chem. Co., Cat.(21558G)；（iii）SPDP（琥珀醯亞胺基-6[3-（2-吡啶基二硫代）丙醯胺基]己酸酯（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；（iv）磺基-LC-SPDP（磺基琥珀醯亞胺6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙醯胺基]己酸酯（Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G）和（v）與EDC偶聯的磺基-NHS（N-羥基磺基-琥珀醯亞胺：Pierce Chem. Co., Cat. #24510）。
上述連接子含有具有不同屬性的組分，因此可能生成具有不同理化性質的雙特異性抗體。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳香族羧酸酯的磺基-NHS酯更穩定。含NHS酯的連接子的溶解度低於磺基NHS酯。此外，連接子SMPT含有空間位阻二硫鍵，可以形成穩定性更高的抗體融合蛋白。二硫鍵通常不如其他連接穩定，因為二硫鍵在體外被裂解，導致可用的抗體融合蛋白較少。特別是磺基-NHS可以提高碳化亞胺偶聯的穩定性。碳二亞胺偶聯（如EDC）與磺基-NHS結合使用時，形成的酯比單獨的碳二亞胺偶聯反應更耐水解。 III. 製備方法
在一些實施方式中，提供了一種與硬骨抑素特異性結合的抗硬骨抑素構建體或抗體部分以及在製備抗硬骨抑素構建體或抗體部分時生成的組合物例如多核苷酸、核酸構建體、載體、宿主細胞或培養基的製備方法。本文所述的抗硬骨抑素構建體或抗體部分或組合物可通過如下一般描述且在示例中更具體描述的許多方法製備。 抗體表達和產生
本文所述的抗體（包括抗硬骨抑素單克隆抗體、抗硬骨抑素雙特異性抗體和抗硬骨抑素抗體部分）可使用本領域中任何已知的方法製備，包括下文和示例中描述的方法。 單克隆抗體
單克隆抗體從基本上同源的抗體群中獲得，即，組成抗體群的個體抗體是相同的，除了少量存在的可能自然發生的突變和/或翻譯後修飾（例如，異構化、醯胺化）。因此，修飾語“單克隆”表明抗體的特性不是離散抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以使用首次由Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) 描述的雜交瘤方法製備，也可以可通過重組DNA方法製備（美國專利US 4,816,567）。在雜交瘤方法中，如上所述，免疫小鼠或其他適當的宿主動物，如倉鼠或駱駝，以誘導產生或能夠產生將特異性結合用於免疫的蛋白質的抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可以在體外免疫。然後使用合適的融合劑（如聚乙二醇）將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。關於駱駝免疫，另參見示例1。
免疫劑通常包括抗原蛋白或其融合變體。免疫劑可由純化的全長或截短的硬骨抑素多肽或其變體或片段（即，肽）組成。此類肽可通過較大多肽的蛋白水解切割、通過重組分子方法產生，或者可以通過本文所述和本領域已知的方法化學合成。基於人硬骨抑素與LRP6複合物的晶體結構（Kim, J. 2020, Nat Commun11: 5357-5357），發現含有“IGRGKWWR”基序（SEQ ID NO: 186）的第二環尖端是硬骨抑素與LRP6的第一螺旋槳結構域結合的主要結合決定簇。用作免疫劑的肽通常可以具有來自覆蓋第二環上的“IGRGKWWR”基序的硬骨抑素氨基酸序列的至少7個連續氨基酸的氨基酸序列，如本文所述，而且，優選地具有至少8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、20、21、22、23或24個連續氨基酸，所述連續氨基酸包含“IGRGKWWR”基序。某些其他優選的肽製劑包含覆蓋“IGRGKWWR”基序的硬骨抑素序列的至少8個但不超過12個或更多個連續氨基酸，並且其他優選的肽製劑包括第二環硬骨抑素多肽的24個連續氨基酸。其他優選的肽製劑包括在其第二環中覆蓋“IGRGKWWR”基序的8至24個連續氨基酸之間的任何整數氨基酸，或包含全長硬骨抑素序列的多肽。在一個實施方式中，免疫劑是全長人硬骨抑素，或者優選地，是其第二環的一部分，例如，如本文所述，在第二環內合成肽，覆蓋氨基酸110-133，或者優選地，119-130，或者更優選地，116-126，或者更優選地，118-125，以產生特異性識別硬骨抑素上第二環的“IGRGKWWR”基序的抗體。一般來說，如果需要人源性細胞，則使用外周血淋巴細胞（“PBL”），如果需要非人源哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然後使用合適的融合劑（如聚乙二醇）將淋巴細胞與永生化細胞系融合，形成雜交瘤細胞。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103。
永生化細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是齧齒類動物、牛和人源的骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。將如此製備的雜交瘤細胞接種並生長在合適的培養基中，所述培養基優選含有一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT），則雜交瘤的培養基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（HAT培養基），它們是阻止HGPRT缺陷細胞生長的物質。
優選的永生化骨髓瘤細胞是能夠有效融合、支持所選擇的抗體生成細胞穩定高水準地產生抗體並且對培養基（如HAT培養基）敏感的細胞。其中，優選鼠骨髓瘤細胞系，如來源於MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的細胞系，可從美國加州聖地牙哥索爾克生物研究所的細胞分配中心獲得，以及SP-2細胞（及其衍生物，例如，X63-Ag8-653），可以從美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心獲得。人骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤細胞系也已被描述用於生成人單克隆抗體（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
對雜交瘤細胞生長的培養基進行分析，以生成直接針對該抗原的單克隆抗體。優選地，通過免疫沉澱或體外結合試驗（如放射免疫分析（RIA）或酶聯免疫吸附試驗（ELISA））測定雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。
可以分析培養雜交瘤細胞的培養基中是否存在針對所需抗原的單克隆抗體。優選地，單克隆抗體的結合親和力和特異性可通過免疫沉澱或體外結合試驗（如放射免疫分析（RIA）或酶聯試驗（ELISA））測定。此類技術和試驗在本領域中是已知的。例如，結合親和力可以通過Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)的Scatchard分析來測定。為了選擇特異性中和硬骨抑素抑制Wnt活性能力的單克隆抗體，可以篩選所得雜交瘤，從而使用ELISA或BLI方法確定是否存在與全長人硬骨抑素和含有“IGRGKWWR”基序的第二環的多肽反應的抗體。優選產生特異性結合全長硬骨抑素和含有其“IGRGKWWR”基序的肽的單克隆抗體的雜交瘤，如示例3和4所述。使用HEK293/TCF/LEF/Wnt1報告基因分析（Hannoush RN., 2008, PLoS ONE, 3: e3498）選擇能夠阻斷、損害或抑制全長人硬骨抑素與低密度脂蛋白受體相關蛋白家族成員例如LRP5或LRP6結合的單克隆抗體，如示例7所述。
在鑒定出產生所需特異性、親和力和/或活性抗體的雜交瘤細胞後，克隆體可通過有限稀釋方法亞克隆，並通過標準方法生長（Goding，見上文）。為此，適用的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可作為腫瘤在哺乳動物體內生長。
通過常規免疫球蛋白純化程式，例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分離。
單克隆抗體也可通過重組DNA方法製備，如美國專利 US 4,816,567中所述的方法，如上所述。使用常規程式很容易分離編碼單克隆抗體的DNA（例如，通過使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）。雜交瘤細胞作為此類DNA的優選來源。一旦分離，可將DNA放入表達載體中，然後轉染到宿主細胞中，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞或骨髓瘤細胞，這些細胞不會以其他方式產生免疫球蛋白，從而在此類重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關於編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述包括Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Revs.130:151-188 (1992)。
在另一個實施方式中，可以使用McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)中所述的技術將抗體從生成的抗體噬菌體文庫中分離。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)和Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)描述了使用噬菌體文庫分別分離鼠抗體和人抗體。後續公開說明描述了通過鏈重排生成高親和力（nM範圍）人抗體（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)），以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略（Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)）。因此，這些技術是分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。
DNA也可以例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列代替同源鼠序列來修飾（美國專利US 4,816,567；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)），或通過共價連接到免疫球蛋白編碼序列上非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列來修飾。通常，此類非免疫球蛋白多肽置換抗體的恒定結構域，或者置換抗體的一個抗原結合位元點的可變結構域，以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包含一個對抗原具有特異性的抗原結合位點和另一個對不同抗原具有特異性的抗原結合位點。
本文所述的單克隆抗體可以是單價的，其製備方法在本領域中是眾所周知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達。重鏈通常在Fc區的任何點截短，以防止重鏈交聯。或者，相關的半胱氨酸殘基可以用另一個氨基酸殘基置換或被刪除以防止交聯。體外方法也適用於製備單價抗體。抗體的消化以產生其片段，特別是Fab片段，可以使用本領域已知的常規技術來完成。
嵌合或雜交抗體也可在體外使用合成蛋白質化學中的已知方法製備，包括使用交聯劑的方法，例如，免疫毒素可以使用二硫鍵交換反應或通過形成硫醚鍵構建。用於此目的的合適試劑的示例包括亞氨基硫醇鹽和4-巰基丁嘧啶甲酯。 編碼抗體部分的核酸分子
在一些實施方式中，提供了編碼本文所述的抗硬骨抑素構建體或抗體部分中的任何一種的多核苷酸。在一些實施方式中，提供了使用本文所述方法中的任何一種製備的多核苷酸。在一些實施方式中，核酸分子包括編碼抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）的重鏈或輕鏈的多核苷酸。在一些實施方式中，核酸分子包括編碼抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）的重鏈的多核苷酸和輕鏈的多核苷酸。在一些實施方式中，第一核酸分子包括編碼重鏈的第一多核苷酸，第二核酸分子包括編碼輕鏈的第二多核苷酸。
在一些這樣的實施方式中，重鏈和輕鏈由一個核酸分子或兩個單獨的核酸分子表達為兩種單獨的多肽。在一些實施方式中，例如當抗體是scFv時，單個多核苷酸編碼包含連接在一起的重鏈和輕鏈的單個多肽。
在一些實施方式中，編碼抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）的重鏈或輕鏈的多核苷酸包括編碼前導序列的核苷酸序列，翻譯時，前導序列位於重鏈或輕鏈的N端。如上所述，前導序列可以是天然重鏈或輕鏈的前導序列，或可以是另一個異源前導序列。
在一些實施方式中，多核苷酸是指DNA。在一些實施方式中，多核苷酸是指RNA。在一些實施方式中，RNA是指mRNA。
可以使用本領域常規的重組DNA技術構建核酸分子。在一些實施方式中，核酸分子是適於在選定宿主細胞中表達的表達載體。 核酸構建體
在一些實施方式中，提供了包含本文所述的多核苷酸中的任何一種的核酸構建體。在一些實施方式中，提供了使用本文所述的任何方法製備的核酸構建體。
在一些實施方式中，所述核酸構建體還包含可操作地連接到所述多核苷酸的啟動子。在一些實施方式中，所述多核苷酸對應于基因，其中所述啟動子是所述基因的野生型啟動子。 載體
在一些實施方式中，提供了一種載體，包括編碼本文所述抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）中任何一個的重鏈和/或輕鏈的任何多核苷酸或本文所述的核酸構建體。在一些實施方式中，提供了使用本文所述的任何方法製備的載體。載體包括編碼抗硬骨抑素構建體中的任何一種的多核苷酸，例如抗體、scFvs、融合蛋白或本文所述的其它形式的構建體（例如，抗硬骨抑素scFv）。此類載體包括但不限於DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。在一些實施方式中，載體包括編碼重鏈的第一多核苷酸序列和編碼輕鏈的第二多核苷酸序列。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈從載體表達為兩種單獨的多肽。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈表達為單個多肽的一部分，例如，當抗體是scFv時。
在一些實施方式中，第一載體包括編碼重鏈的多核苷酸，第二載體包括編碼輕鏈的多核苷酸。在一些實施方式中，將第一載體和第二載體以相似的量（例如相似的摩爾量或相似的品質）轉染到宿主細胞中。在一些實施方式中，將摩爾比或品質比在5:1至1:5之間的第一載體和第二載體轉染到宿主細胞中。在一些實施方式中，對於編碼重鏈的載體和編碼輕鏈的載體，使用1:1至1:5的品質比。在一些實施方式中，對於編碼重鏈的載體和編碼輕鏈的載體，使用1:2的品質比。
在一些實施方式中，選擇優化用於在CHO或CHO衍生細胞或NS0細胞中表達多肽的載體。描述了示例性的此類載體，例如，參見Running Deer et al., Biotechnol.Prog.20:880-889 (2004). 宿主細胞
在一些實施方式中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸構建體和/或載體的宿主細胞。在一些實施方式中，提供了使用本文所述的任何方法製備的宿主細胞。在一些實施方式中，宿主細胞能夠在發酵條件下產生本文所述的抗體部分中的任何一種。
在一些實施方式中，本文所述的抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）可在原核細胞（如細菌細胞）中表達；或在真核細胞中表達，如真菌細胞（如酵母）、植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。這種表達可以根據本領域已知的程式進行。可用於表達多肽的示例性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO細胞和FUT8 CHO細胞；PER.C6 ®細胞（Crucell）；以及NS0細胞。在一些實施方式中，本文所述的抗體部分（例如，抗硬骨抑素抗體部分）可以在酵母中表達。參見，例如，美國公開說明US 2006/0270045 A1。在一些實施方式中，基於其對抗體部分的重鏈和/或輕鏈進行所需翻譯後修飾的能力來選擇具體的真核宿主細胞。例如，在一些實施方式中，CHO細胞產生的多肽具有比在293細胞中產生的相同多肽更高水準的唾液酸化。
可以通過任何方法將一種或多種核酸引入所需的宿主細胞中，包括但不限於磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖酐介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性示例性方法的描述參見，例如，Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 rded. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)。根據任何合適的方法，核酸可以暫態或穩定地轉染到所需的宿主細胞中。
本申請還提供了包含本文所述的多核苷酸或載體中的任何一種的宿主細胞。在一些實施方式中，本發明提供了包含抗硬骨抑素抗體的宿主細胞。能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可用於分離編碼目標抗體、多肽或蛋白的基因。哺乳動物宿主細胞的非限制性示例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。另見PCT公開說明WO 87/04462。合適的非哺乳動物宿主細胞包括原核生物（如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌）和酵母（如釀酒酵母、粟酒酵母或乳酸桿菌）。
在一些實施方式中，抗體部分在無細胞系統中產生。非限制性示例性無細胞系統的描述參見，例如，Sitaraman et al., Methods Mol. Biol.498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol.22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol.Adv.21: 695-713 (2003). 培養基
在一些實施方式中，提供了包含本文所述的任何抗體部分、多核苷酸、核酸構建體、載體和/或宿主細胞的培養基。在一些實施方式中，提供了使用本文所述的任何方法製備的培養基。
在一些實施方式中，培養基包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷（例如，HAT培養基）。在一些實施方式中，培養基不包括血清。在一些實施方式中，培養基包括血清。在一些實施方式中，培養基是指D-MEM或RPMI-1640培養基。 抗體部分的純化
抗硬骨抑素構建體（例如，抗硬骨抑素單克隆抗體或多特異性抗體）可以通過任何合適的方法純化。此類方法包括但不限於使用親和力基質或疏水相互作用層析。合適的親和力配體包括ROR1胞外結構域和結合抗體恒定區的配體。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗體親和柱可用于結合恒定區並純化包含Fc片段的抗硬骨抑素構建體。疏水相互作用層析，例如丁基柱或苯基柱，也可適用於純化一些多肽，如抗體。離子交換層析（例如陰離子交換層析和/或陽離子交換層析）也適用於純化一些多肽，如抗體。混合模式層析（例如反相/陰離子交換、反相/陽離子交換、親水相互作用/陰離子交換、親水相互作用/陽離子交換等）也可適用於純化一些多肽，如抗體。許多純化多肽的方法是本領域已知的。 IV. 治療方法
在一些實施方式中，提供了一種治療個體的疾病或病症的方法，所述方法包括向個體施用有效量的本文所述的抗硬骨抑素構建體或藥物組合物。在一些實施方式中，所述疾病或病症是骨相關疾病或軟骨相關疾病、骨髓或血液學疾病、骨骼肌肉系統罕見病、肌肉相關疾病或癌症。
本文所述的方法適用於任何骨相關疾病或病症。在一些實施方式中，骨相關疾病包括成骨不全、骨質疏鬆症或骨質減少症（男性和/或女性）、骨壞死、骨延遲癒合、骨折不癒合、多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤相關骨病症、原發性骨腫瘤、惡性腫瘤的骨轉移、炎性或感染性骨病、骨軟化症、高鈣血症、佩吉特病、不活動引起的骨丟失、糖皮質激素誘導的骨丟失、炎症性骨丟失，包括關節炎誘導的骨丟失、宇航員骨質疏鬆症/骨質減少症和失重引起的骨丟失，或者與a）骨量或骨質丟失或兩者丟失和/或b）骨結構和骨質異常相關的其他疾病或病症。在一些實施方式中，骨相關疾病是指骨質疏鬆症或骨質減少症。在一些實施方式中，骨相關病症是指成骨不全。在一些實施方式中，骨相關病症是指多發性骨髓瘤和多發性骨髓瘤相關骨病症。
在一些實施方式中，疾病或病症是指軟骨病症。在一些實施方式中，軟骨病症包括軟骨瘤病、軟骨發育不良、軟骨發育不全、骨骺發育不良、軟骨營養不良性肌強直、皮質旁軟骨瘤、膝關節軟骨撕裂、骨纖維發育不良、骨關節炎、成骨不全、低磷酸鹽性佝僂病或骨軟骨營養不良。
在一些實施方式中，疾病或病症是指肌肉相關疾病。在一些實施方式中，肌肉相關疾病是指肌肉減少症和癌症相關的肌肉減少症。
在一些實施方式中，疾病或病症是指癌症（例如，血液惡性腫瘤，例如，多發性骨髓瘤）。
在一些實施方式中，提供了一種促進個體骨骼或關節手術後癒合的方法，所述方法包括向個體施用有效量的抗硬骨抑素構建體（例如本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任何一種）。
在一些實施方式中，提供了治療個體疾病或病症（例如，骨相關疾病）的方法，包括向所述個體施用有效安裝的抗硬骨抑素構建體，所述抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
在一些實施方式中，提供了治療個體疾病或病症（例如骨相關疾病），包括向所述個體施用有效量的多特異性構建體，所述多特異性構建體包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別RANKL的第二抗體部分。在一些實施方式中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中V H-1包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L-1包括：i）包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，提供了治療個體疾病或病症（例如骨相關疾病），包括向所述個體施用有效量的多特異性構建體，所述多特異性構建體包括特異性識別硬骨抑素的第一抗體部分和特異性識別DKK1的第二抗體部分。在一些實施方式中，所述第一抗體部分包括第一重鏈可變區（V H-1）和第一輕鏈可變區（V L-1），其中V H-1包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L-1包括：i）包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V- H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中：a）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3；b）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1，包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，受試者是哺乳動物（例如人類）。 抗硬骨抑素構建體的給藥劑量和給藥方法
用於治療如本文所述的疾病或病症的抗硬骨抑素構建體施用至個體的給藥方案（例如特定劑量和頻率）可以根據具體的抗硬骨抑素構建體（例如抗硬骨抑素單克隆抗體或多特異性抗體，如抗硬骨抑素融合蛋白）、給藥方式以及正在治療的疾病或病症的類型而變化。
在上述任何方面的一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體（例如抗硬骨抑素單克隆抗體或多特異性抗體）的有效量在約0.001μg/kg至約500mg/kg總體重的範圍內，例如約0.005μg/kg至約100mg/kg、約0.01μg/kg至約50mg/kg或約0.01μg/kg至約5mg/kg。
在一些實施方式中，治療包括多次施用抗硬骨抑素構建體（例如約2、3、4、5、6、7、8、9或10次施用抗硬骨抑素構建體）。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體以約每天、每週、每週兩次、每月一次、每三個月一次、每六個月或每年一次的頻率施用。
抗硬骨抑素構建體可通過各種途徑施用至個體（例如人），包括例如靜脈內、關節內、動脈內、腹腔內、肺內、口服、吸入、囊內、肌內、氣管內、皮下、眼內、鞘內、透粘膜和經皮。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包含在藥物組合物中，同時施用到個體中。在一些實施方式中，可以使用組合物的持續釋放製劑。在一些實施方式中，所述組合物經靜脈注射。在一些實施方式中，所述組合物經腹腔注射。在一些實施方式中，所述組合物經靜脈注射。在一些實施方式中，所述組合物經腹腔注射。在一些實施方式中，所述組合物經肌肉注射。在一些實施方式中，所述組合物經皮下注射。在一些實施方式中，所述組合物經靜脈注射。在一些實施方式中，所述組合物口服。 聯合治療
本申請還提供了向個體施用抗硬骨抑素構建體以治療疾病或病症（例如骨相關疾病）的方法，其中所述方法還包括施用第二種藥物或療法。在一些實施方式中，第二中藥物或療法是用於治療疾病或病症的標準或常用的藥物或療法。
在一些實施方式中，提供了治療個體疾病或病症（例如，骨相關疾病），包括向個體施用a）有效量的抗硬骨抑素構建體（例如本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任何一種）；和b）第二種療法或藥物。在一些實施方式中，第二中療法或藥物是抗DKK1抗體或抗RANKL抗體。在一些實施方式中，第二種藥物或療法包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
在一些實施方式中，提供了治療個體疾病或病症（例如，骨相關疾病），包括向個體施用a）有效量的抗硬骨抑素構建體（例如本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任何一種）；和b）抗DKK1抗體。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，所述抗DKK1抗體包括第二重鏈可變區（V H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3，V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，提供了個體治療疾病或病症（例如，骨相關疾病），包括向個體施用a）有效量的抗硬骨抑素構建體（例如本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任何一種）；和b）抗RANKL抗體。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體包括抗體部分，所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中V H包括：i）包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；V L包括：i）包含SEQ ID NO: 15或85的氨基酸序列的LC-CDR1，ii）包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2，iii）包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。在一些實施方式中，所述抗RANKL抗體包括第二重鏈可變區（V- H-2）和第二輕鏈可變區（V L-2），其中：a）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3；b）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1，包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或c）所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1，包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體和第二種藥物或療法同時施用。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體和第二種藥物或療法同時施用。在一些實施方式中，抗硬骨抑素構建體和第二種藥物或療法依次施用。 V. 組成、試劑盒和製品
本文還提供了包含本文所述的抗硬骨抑素構建體或抗硬骨抑素抗體部分、編碼抗體部分的核酸、包含編碼抗體部分的核酸的載體或包含核酸或載體的宿主細胞的組合物（例如製劑，如藥物組合物）。
在一些實施方式中，提供了包含抗硬骨抑素構建體（例如本文所述的抗硬骨抑素構建體中的任一種）和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一些實施方式中，該組合物還包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
本文所述的抗硬骨抑素構建體的合適製劑可通過將具有所需純度的抗硬骨抑素構建體或抗硬骨抑素抗體部分與可選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合來獲得（ Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed.(1980)），以凍幹製劑或水溶液的形式存在。可接受的載體、輔料或穩定劑在所用劑量和濃度下對受體無毒，包括緩衝液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑（如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨、苄基氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸甲酯，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚）；低分子量（小於約10個殘基）多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如烯丙基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬配合物（例如Zn-蛋白複合物）；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN TM、PLURONICS TM或聚乙二醇（PEG）。適用于皮下給藥的凍幹製劑如WO97/04801所述。此類凍幹製劑可以用合適的稀釋劑複溶至高蛋白濃度，並且複溶製劑可皮下注射給本文將成像、診斷或治療的個體。
用於體內給藥的製劑必須是無菌的。這很容易通過以下方式實現，例如，通過除菌過濾膜過濾。
還提供了包含本文所述的抗硬骨抑素構建體或抗硬骨抑素抗體部分中的任何一者的試劑盒。該試劑盒可用于本文所述的調節細胞組合物或治療的任何方法。
在一些實施方式中，提供了包含特異性結合到硬骨抑素的抗硬骨抑素構建體的試劑盒。
在一些實施方式中，該試劑盒還包括能夠將抗硬骨抑素構建體遞送到個體體內的裝置。用於諸如胃腸外遞送的應用的一類裝置是用於將組合物注射到受試者體內的注射器。吸入裝置也可用于某些應用。
在一些實施方式中，該試劑盒還包括用於治療疾病或病症的治療藥物，例如，骨相關疾病，例如，成骨不全、骨硬化或與骨丟失相關的疾病或病症。
本申請的試劑盒採用合適的包裝。適用的包裝包括但不限於西林瓶、一般瓶子、罐子、柔性包裝（例如，密封的Mylar或塑膠袋）等。試劑盒可以選擇提供其他元件，如緩衝液，以及解釋性資訊。
因此，本申請還提供了製品。所述製品可以包括容器和容器上或與容器相關聯的標籤或藥品說明書。適用的容器包括西林瓶（如密封西林瓶）、一般瓶子、罐子、柔性包裝等。通常，容器盛裝組合物，並且可以具有無菌入口（例如，容器可以是靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的西林瓶）。標籤或藥品說明書表明組合物用於對個體的具體病症進行成像、診斷或治療。標籤或藥品說明書還將包括用於個體適用組合物和用於對個體成像的說明。標籤可以包括複溶和/或使用的說明。盛裝組合物的容器可以是多用途西林瓶，允許複溶製劑重複給藥（例如，給藥2-6次）。藥品說明書是指通常包含在商業化診斷產品包裝中的說明書，其中包含關於此類診斷產品使用的適應症、用法、用量、給藥、禁忌症和/或警告資訊。此外，所述製品還可以包括包含藥學上可接受的緩衝液（例如無菌注射用水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液）的第二容器。還可以包括從商業和用戶角度期望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、篩檢程式、針頭和注射器。
所述試劑盒或製品可以包括組合物的多種單位劑量和使用說明書，其包裝量足以在藥房（例如，醫院藥房和配製藥房）中儲存和使用。
本領域技術人員知道，在本發明的發明構思範圍內可能有多個實施方式。現將參考以下非限制性示例對本發明進行更詳細的描述。以下具體實施方式及實施例進一步說明了本發明，但應理解地，不應被解釋為以任何方式限制其範圍。 實施方式
實施方式1。一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，其中所述抗體部分結合到硬骨抑素上的表位，所述表位包含SEQ ID NO: 186所示的氨基酸序列。
實施方式2。 一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，其中所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中： 所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1-4和12中任一項的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5-8和13中任一項的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9-11和14中任一項的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；以及 所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15-17、85和86中任一項的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18和19中任一項的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20和21中任一項的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
實施方式3實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中： a）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15或16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或者 b）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式4。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式5。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式6。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式7。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式8。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式9。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式10。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式11。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式12。實施方式1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式13。一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，其中所述抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中： a）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 22所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 23所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； b）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 25所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； c）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 26所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 27所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； d）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 29所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； e）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 30所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； f）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 32所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 33所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； g）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 34所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 35所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； h）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 36所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 37所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； i）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 38所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 39所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； j）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 40所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 41所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； k）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 88所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； l）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 89所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或者 m）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 90所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
實施方式14。實施方式1-13中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H包括SEQ ID NO: 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和87中任一項的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；以及/或者，所述V L包括SEQ ID NO: 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和88-90中任一項的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體。
實施方式15。實施方式14所述的抗硬骨抑素構建體，其中： a）所述V H包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； b）所述V H包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； c）所述V H包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 27的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； d）所述V H包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； e）所述V H包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 31的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； f）所述V H包括SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； g）所述V H包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 35的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； h）所述V H包括SEQ ID NO: 36的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； i）所述V H包括SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 39的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； j）所述V H包括SEQ ID NO: 40的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； k）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 88的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； l）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 89的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；或者 m）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 90的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體。
實施方式16。一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，所述抗體部分是人源化抗體部分，來源於包含重鏈可變區（V H）和第二輕鏈可變區（V L）的抗硬骨抑素抗體，其中： a）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； b）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； c）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； d）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； e）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； f）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 200的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； g）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；或者 h）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。 實施方式17。實施方式1-16中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗體部分是一種抗體或其抗原結合片段，選自全長抗體、雙特異性抗體、單鏈Fv（scFv）片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、二硫鍵穩定性scFv（dsscFv）、(dsFv) 2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、diabody、tribody和tetrabody。
實施方式18。實施方式1-17中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述構建體是包含Fc片段的全長抗體。
實施方式19。實施方式17所述的抗硬骨抑素構建體，其中抗體部分是scFv片段。
實施方式20。實施方式1-19中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述硬骨抑素是人硬骨抑素。
實施方式21。實施方式1-17和19-20中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素構建體還包括第二部分。
實施方式22。實施方式21所述的抗硬骨抑素構建體，其中第二部分包括特異性識別抗原的第二抗體部分。
實施方式23。實施方式22所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和輕鏈可變區（V L-2）。
實施方式24。實施方式22或23所述的抗硬骨抑素構建體，其中抗原是DKK1。
實施方式25。實施方式24所述的抗硬骨抑素構建體，其中DKK1是人DKK1。
實施方式26。實施方式24或25所述的抗硬骨抑素構建體，其中第二抗體部分與包含第三重鏈可變區（V H-3）和第三輕鏈可變區（V L-3）的第三抗體部分競爭DKK1的結合表位，其中： a）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3； b）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或者 c）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式27。實施方式26所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式28。實施方式26所述的抗硬骨抑素構建體，其中V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式29。實施方式26所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式30。實施方式22或23所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗原是RANKL。
實施方式31。實施方式30所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗原是人RANKL。
實施方式32。實施方式30或31所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分與包含第三重鏈可變區（V H-3）和第三輕鏈可變區（V L-3）的第三抗體部分競爭RANKL的結合表位，其中所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式33。實施方式31所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
實施方式34。實施方式22-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、單鏈Fv（scFv）片段、scFv-scFv、微型抗體、diabody或sdAb。
實施方式35。實施方式34所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分是包含兩條重鏈、兩條輕鏈和Fc片段的全長抗體，所述抗硬骨抑素抗體部分是包含與V L融合的V H的單鏈Fv（scFv）片段。
實施方式36。實施方式35所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條重鏈融合。
實施方式37。實施方式34-36中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條輕鏈融合。
實施方式38。實施方式36或37所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的N端融合。
實施方式39。實施方式36-38中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的C端融合。
實施方式40。實施方式36-39中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分通過第一連接子與所述全長抗體融合。
實施方式41。實施方式36-39中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗硬骨抑素抗體部分不通過連接子與所述全長抗體融合。
實施方式42。實施方式40所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第一連接子是選自SEQ ID NO: 74-84的GS連接子。
實施方式43。實施方式35-42中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H通過第二連接子與所述V L融合。
實施方式44。實施方式43所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述scFv片段從N端到C端包括：V H、第二連接子和V L。
實施方式45。實施方式43所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述scFv片段N端到C端包括：V L、第二連接子和V H以及可選的C端丙氨酸殘基。
實施方式46。實施方式43-45中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二連接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
實施方式47。實施方式23-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv片段，所述抗硬骨抑素抗體部分是包含兩條重鏈、兩條輕鏈和Fc片段的全長抗體。
實施方式48。實施方式46所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈融合。
實施方式49。實施方式47或48所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二抗體部分與所述全長抗體的兩條輕鏈融合。
實施方式50。實施方式48或49所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈或輕鏈的N端融合。
實施方式51。實施方式47-50中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈或輕鏈的C端融合。
實施方式52。實施方式47-51中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗體部分通過第一連接子與所述全長抗體融合。
實施方式53。實施方式47-51中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述抗體部分不通過連接子與所述全長抗體融合。
實施方式54。實施方式52所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第一連接子是選自SEQ ID NO: 74-84的GS第一連接子。
實施方式55。實施方式47-54中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述V H-2通過第二連接子與所述V L-2融合。
實施方式56。實施方式47-54中任一項所述的抗硬骨抑素構建，其中所述V H-2不通過連接子與所述V L-2融合。
實施方式57。實施方式55所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述scFv片段從N端到C端包括：V H-2、第二連接子和V L-2。
實施方式58。實施方式55所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述scFv片段從N端到C端包括：V L-2 、第二連接子和V H-2，以及可選的C端丙氨酸殘基。
實施方式59。實施方式55和57-58中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述第二連接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
實施方式60。實施方式35-59中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述scFv是二硫鍵穩定性scFv（“dsscFv”）。
實施方式61。實施方式60所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述dsscFv包括：a）根據SEQ ID NO: 60的編號的V H或V H-2中的G44C突變，和b）根據SEQ ID NO: 61的編號的V L或V L-2中的G100C突變。
實施方式62。實施方式35-61中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述構建體包括： 1）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列； 2）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列； 3）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列； 4）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 95的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列； 5）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列； 6）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 98的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列； 7）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列； 8）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列； 9）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 104的氨基酸序列； 10）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 105的氨基酸序列； 11）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 107的氨基酸序列； 12）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列； 13）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列； 14）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 111的氨基酸序列； 15）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 113的氨基酸序列； 16）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 114的氨基酸序列； 17）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 115的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 18）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 19）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 117的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 20）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 21）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 120的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 22）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 121的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 23）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 123的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 24）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 124的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 25）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 126的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 26）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 127的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 27）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 128的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 28）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 130的氨基酸序列； 29）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 131的氨基酸序列； 30）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 132的氨基酸序列； 31）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 177的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 32）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 178的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 33）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 178的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 34）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 179的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列；或者 35）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 180的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列。
實施方式63。實施方式23-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述構建體包括： a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端到C端包括：i）V L，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）； b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域； c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到c端包括：i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；以及 d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包括：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”）； 其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。
實施方式64。實施方式63所述的抗硬骨抑素構建體，其中第一Fc結構域和第二Fc結構域中的一個包含T366W突變和可選的S354C突變，另一個Fc結構域包括T366S突變、L368A突變、Y407V突變和可選的Y349C突變，其中編號基於EU索引。
實施方式65。實施方式63或64所述的抗硬骨抑素構建體，其中：i）第一CH1結構域和第一CL結構域，或ii）第二CH1結構域和第二CL結構域均選自： a）CH1結構域，其中141位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中116位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； b）CH1結構域，其中168位元的氨基酸置為換半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中164位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； c）CH1結構域，其中126位元的氨基酸置為換半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中121位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； d）CH1結構域，其中128位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中118位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； e）CH1結構域，其中170位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中176位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； f）CH1結構域，其中171位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中162位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； g）CH1結構域，其中173位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位（例如，在IgG2或IgG4中）或220位（例如，在IgG1中）的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中160位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； 其中編號基於EU索引。
實施方式66。實施方式63-65中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，包括： 1）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 136的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 137的氨基酸序列； 2）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 138的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 139的氨基酸序列； 3）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 140的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 141的氨基酸序列； 4）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 142的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 143的氨基酸序列； 5）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 144的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 145的氨基酸序列； 6）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 148的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 149的氨基酸序列； 7）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 150的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 151的氨基酸序列； 8）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 152的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 153的氨基酸序列； 9）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 154的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 155的氨基酸序列； 10）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 156的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 157的氨基酸序列； 11）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 158的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 159的氨基酸序列； 12）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 160的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 161的氨基酸序列； 13）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 162的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 14）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 171的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 172的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 15）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 173的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 174的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 16）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 175的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 176的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列。 實施方式67。實施方式21所述的抗硬骨抑素構建體，其中第二部分包括半衰期延長部分。
實施方式68。實施方式67所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述半衰期延長部分是指Fc片段。
實施方式69。實施方式18、35-66和68中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述Fc片段選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段及其組合和雜交中的一種。
實施方式70。實施方式69所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述Fc片段選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段及其組合和雜交中的一種。
實施方式71。實施方式69或70所述的抗硬骨抑素構建體，其中Fc片段包括H435R突變和Y436F突變。
實施方式72。實施方式69-71中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中，所述Fc片段具有與相應野生型Fc片段相比降低的效應子功能。
實施方式73。實施方式69-71中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述Fc片段具有：a）與相應野生型Fc片段相比增強的效應子功能，和/或b）與相應野生型Fc片段相比增強的FcRn結合親和力。
實施方式74。實施方式21所述的抗硬骨抑素構建體，其中所述構建體是抗體-藥物偶聯物或抗體融合蛋白。
實施方式75。實施方式74所述的抗硬骨抑素構建體，其中第二部分包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）、降鈣素及其組合中的一種或幾種。
實施方式76。一種抗硬骨抑素構建體，與實施方式1-75中任一項所述的抗硬骨抑素構建體競爭性地與硬骨抑素特異性結合。
實施方式77。一種藥物組合物，包括實施方式1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體和藥學上可接受的載體。
實施方式78。實施方式77所述的藥物組合物，所述組合物還包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）、降鈣素及其組合中的一種或幾種。
實施方式79。一種分離核酸，編碼實施方式1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體。
實施方式80。一種載體，包括實施方式79所述的分離的核酸分子。
實施方式81。一種分離宿主細胞，包括實施方式79所述的分離的核酸分子或實施方式80所述的載體。
實施方式82。一種製備抗硬骨抑素構建體的方法，包括： a）在有效表達抗硬骨抑素構建體或其一部分的條件下培養實施方式81所述的分離宿主細胞；以及 b）從宿主細胞獲得表達的抗硬骨抑素構建體或其一部分。
實施方式83。一種治療和/或預防個體的疾病或病症的方法，包括向個體施用有效量的實施方式1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體或實施方式77或78所述的藥物組合物。
實施方式84。實施方式83所述的方法，其中所述疾病或病症是骨相關疾病或軟骨相關病症、骨髓或血液學疾病、骨骼肌肉系統罕見病、肌肉相關疾病或癌症。
實施方式85。實施方式84所述的方法，其中所述骨相關疾病包括成骨不全、骨質疏鬆症或骨質減少症（男性和/或女性）、骨壞死、骨延遲癒合、骨折不癒合、多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤相關骨病症、原發性骨腫瘤、惡性腫瘤的骨轉移、炎性或感染性骨病、骨軟化症、高鈣血症、佩吉特病、不活動引起的骨丟失、糖皮質激素誘導的骨丟失、炎症性骨丟失，包括關節炎誘導的骨丟失、宇航員骨質疏鬆症/骨質減少症和失重引起的骨丟失，或者與a）骨量或骨質丟失或兩者丟失和/或b）骨結構和骨質異常相關的其他疾病或病症。
實施方式86。實施方式85所述的方法，其中所述骨相關疾病是指骨質疏鬆症或骨質減少症。
實施方式87。實施方式85所述的方法，其中所述骨相關疾病是指成骨不全。
實施方式88。實施方式85所述的方法，其中所述骨相關疾病是指多發性骨髓瘤和多發性骨髓瘤相關骨病症。
實施方式89。實施方式84所述的方法，其中所述軟骨疾病包括軟骨瘤病、軟骨發育不良、軟骨發育不全、骨骺發育不良、軟骨營養不良性肌強直、皮質旁軟骨瘤、膝關節軟骨撕裂、骨纖維發育不良、骨關節炎、成骨不全、低磷酸鹽性佝僂病或骨軟骨營養不良。
實施方式90。實施方式84所述的方法，其中所述肌肉相關疾病指是肌肉減少症和癌症相關的肌肉減少症。
實施方式91。一種促進個體骨骼或關節手術後癒合的方法，包括向個體施用有效量的實施方式1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體和/或實施方式77或78所述的藥物組合物。
實施方式92。實施方式83-91中任一項所述的方法，其中所述抗硬骨抑素構建體通過皮下注射、靜脈注射、肌內注射、口服或腸外給藥的方式施用到所述個體中。
實施方式93。實施方式83-92中任一項所述的方法，其中所述方法還包括施用第二種藥物或療法。
實施方式94。實施方式93所述的方法，其中所述第二種藥物或療法包括抗DKK1抗體。
實施方式95。實施方式93所述的方法，其中所述第二種藥物或療法包括抗RANKL抗體。
實施方式96。實施方式93所述的方法，其中第二種藥物或療法包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
實施方式97。實施方式83-96中任一項所述的方法，其中所述個體是指人。 實施例
以下實施例完全是應用的示例，因此不應被認為以任何方式限制應用。以下實施例和詳細描述是為了說明，而不是進行限制。
實施例 1. 抗硬骨抑素單克隆抗體的製備
抗人SOST單克隆抗體是通過免疫小鼠產生的。使用的是實驗用BALB/c小鼠（18-20g，7-8周齡）和C57小鼠（18-20g，7-8周齡）。這些動物在SPF級實驗室飼養1周，12/12小時光照/黑暗週期，溫度20-25°C，濕度40%-60%。
將帶有His標籤（HST-H5245，Acro Biosystems）的人SOST重組蛋白作為免疫原。使用專有佐劑（批號20200120）進行乳化，然後向抗原中加入等體積的佐劑，使總體積達到300μL。將抗原/佐劑溶液用電混合機乳化，並且用多維旋轉器混合。用75%乙醇消毒後，皮下注射抗原/佐劑溶液。將抗原乳化，並在第0、14、28天接種。在脾細胞融合前3天，向每只小鼠腹腔（IP）注射50μg生理鹽水配製的抗原溶液進行加強免疫。在第22、36和45天進行血液滴度檢測。第3次免疫後，選擇血滴度最高的2只趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。採用常規的電細胞操作器（BTX，ECM2001）融合程式，將脾細胞與骨髓瘤Sp2/0細胞融合，獲得雜交瘤細胞。用實施例3所述的ELISA方法測定小鼠血清與人硬骨抑素的結合活性，並選擇體外結合活性良好的單克隆雜交瘤細胞株。結果如表5所示。
實施例 2. 抗硬骨抑素單克隆抗體的克隆和測序
雜交瘤測序過程如下。根據TRIzol ®試劑技術手冊，從雜交瘤細胞中分離總RNA。然後根據PrimeScript TM第1鏈cDNA合成試劑盒的技術手冊，使用同型特異性反義引物或通用引物將總RNA逆轉錄為cDNA。根據cDNA末端快速擴增（RACE）標準操作規程（SOP）擴增重鏈和輕鏈抗體片段。將擴增的抗體片段分別克隆至標準克隆載體中。進行菌落PCR，以篩選處大小合適的插入片段的克隆體。最終提供了一致序列。
序列分析
分析所有構建體的DNA序列資料，並確定重鏈和輕鏈的一致序列。表3和表4列出了各種抗體的V H和V LCDR和一致序列。
表 3. 各種抗體的 V HCDR 和一致序列。
   HC-CDR1 HC-CDR2 HC-CDR3
93B1B7 DYEIH (SEQ ID NO: 1) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) YDYVTY (SEQ ID NO: 9)
94B12D3 DYEIH (SEQ ID NO: 1) AIDPETGGTAYNQKFKA (SEQ ID NO: 6) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
71G6G8 DYEIH (SEQ ID NO: 1) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) YDYVTY (SEQ ID NO: 9)
56E5C10 DFEMH (SEQ ID NO: 2) AIDPETGGTAYNQKFTA (SEQ ID NO: 7) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
91F6D10 DYEMH (SEQ ID NO: 3) AIDPETGGTAYNQKFKA (SEQ ID NO: 6) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
51E8D4 DFEIH (SEQ ID NO: 199) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
97C11D7 DYEMH (SEQ ID NO: 3) AIDPETGGSANNQKFKA (SEQ ID NO:200) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
81B2B6 DYEMH (SEQ ID NO: 3) AIDPETGGTAYNQKFKA (SEQ ID NO: 6) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
84F2D5 DFEIH (SEQ ID NO: 199) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) YDYVSY (SEQ ID NO: 10)
65B12C9 SYWMH (SEQ ID NO: 4) MIHPNSGSSNYNEKFKS (SEQ ID NO: 8) DYDDEGFAY (SEQ ID NO: 11)
一致性序列 DX 1EX 2H X 1= Y or F, X 2= M or I. (SEQ ID NO: 12) AIDPETGGX 3AX 4NQKFX 5X 6X 3= T or S, X 4= Y or N, X 5= K or T, X 6= A, G, or S. (SEQ ID NO: 13) YDYVX 7Y X 7= T or S (SEQ ID NO: 14)
表 4. 各種抗體的 VL CDR
   LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
93B1B7 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
94B12D3 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
71G6G8 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
56E5C10 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
91F6D10 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
51E8D4 KSSQSLLYSDGKTYLN (SEQ ID NO: 16) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
97C11D7 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
81B2B6 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
84F2D5 KSSQSLLYSDGKTYLN (SEQ ID NO: 16) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
65B12C9 KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 17) YASNRCT (SEQ ID NO: 19) QQDYSSPWT (SEQ ID NO: 21)
實施例 3.ELISA 法測定抗硬骨抑素抗體與硬骨抑素的結合
通過ELISA捕獲試驗測定抗體特異性結合硬骨抑素的能力。用100μL/孔的小鼠His標記的人硬骨抑素（NCBI參考編號為NP_079513.1）[0.5μg/mg]，在包被緩衝液（PBS，pH 7.4）中以100μL/孔的半面積包被平板，並在室溫下培養1小時或4°C下過夜培養。用100μL/孔的洗滌液（含0.2%吐溫20的PBS，BIO-RAD）洗滌平板一次。然後將平板在封閉液（含1%BSA、1%山羊血清和0.5%吐溫20的PBS；100μL/孔）中於室溫（RT）下培養1小時。然後將不同濃度（1000、333.3、111.1、37.0、12.3、4.1、1.4、0.5、0.15、0.05 ng/ml）的抗硬骨抑素抗體、陽性對照抗體羅莫單抗或非硬骨抑素相關IgG（人或小鼠IgG，陰性對照）以20μL/孔的封閉液加入到各孔中，將平板在室溫下培養1小時。向每個孔（20 ml/孔）中加入用封閉液稀釋（1: 50,000稀釋）的NeutrAvidin HRP（Pierce，目錄號31001），將平板在室溫下培養1小時，然後用100 ml/孔的洗滌液洗滌3次。向平板中加入SuperSignal ELISA Femto（ThermoFisher Scientific，目錄號37074）工作溶液（20 ml/孔）。使用光度計在425 nm處讀取信號。
如下表5所示，與羅莫單抗相比，所檢測的抗硬骨抑素抗體表現出相當或更有利的EC 50值。具體來說，與羅莫單抗相比，93B1B7表現出了更有利的EC 50值。
表 5. 抗硬骨抑素鼠抗體的 ELISA 活性
抗體 EC 50(nM)
93B1B7 0.04
94B12D3 0.04
71G6G8 0.04
56E5C10 0.09
91F6D10 0.06
51E8D4 0.07
97C11D7 0.04
81B2B6 0.01
84F2D5 0.02
65B12C9 0.04
Romosozumab 0.11
實施例 4. 抗硬骨抑素抗體結合表位的鑒定
靶向正確的表位是選擇單克隆抗體以實現預期作用機制的關鍵步驟（Wilson, PC, 2012, Nat. Rev. Immunol.12, 709-719）。針對合成的基於肽的抗B細胞表位的抗體生產已廣泛用於開發已知領域各種疾病的治療性抗體和疫苗（Ben-Yedidia T., 1997, Curr Opin Bio technol8:442-448; Bijker MS, 2007, Expert Rev Vaccines6:591-603），所獲得的抗體的特異性優勢僅限於確定的表位。NMR和晶體學結構證明硬骨抑素上的第二環可直接與低密度脂蛋白受體相關蛋白家族成員（如LRP5或LRP6）相互作用，並阻斷LRPs和Wnt家族成員之間的相互作用。根據人硬骨抑素與LRP6複合物的晶體結構（Kim, J. 2020, Nat. Commun.11: 5357-5357），發現包含圖1所示的“IGRGKWWR”基序（SEQ ID NO: 186）的環尖端是硬骨抑素與LRP6的第一螺旋槳結構域結合的主要結合決定簇。
用生物膜層干涉技術（Gator, Probe Life）檢測抗體93B1B7與化學合成的肽的結合，所述肽包含來自圖2所示人和小鼠硬骨抑素第二環的序列。將肽生物素化（NHS-生物素試劑，Thermo，#21343），並使用0.5μg/ml溶液固定在鏈黴親和素生物感測器上。使用5μg/ml mAb 93B1B7的動力學緩衝液（PBS，pH 7.4，0.05%吐溫-20，0.2%BSA）作為分析物，結合傳感圖見圖2。93B1B7以高親和力識別人硬骨抑素上具有相同“IGRGKWWR”（SEQ ID NO: 186）基序的pep1（SEQ ID NO: 185）、pep5（SEQ ID NO: 187）和pep6（SEQ ID NO: 188）。相反，羅莫單抗不能識別這些肽，如圖3所示。
為了進一步證明93B1B7的結合表位與羅莫單抗的結合表位完全不同，將5μg/ml的羅莫單抗固定在抗HFC探針上，並依次加入2μg/ml的人硬骨抑素和5μg/ml的93B1B7的動力學緩衝液（PBS，pH 7.4，0.05%的吐溫-20，0.2%的BSA）作為分析物。結合傳感圖見圖4，表明羅莫單抗和93B1B7可以通過佔據不同的結合位點同時結合硬骨抑素，從而不相互交叉阻斷。因此該結合表位（“IGRGKWWR”基序，SEQ ID NO: 186）是本文抗體特有的，不與羅莫單抗的結合表位重疊。
這裡發現的大多數抗硬骨抑素抗體都具有非常相似的結合活性和CDR序列（見表3和表4），因此我們認為它們具有相同的特異性和結合表位。因此，本文發現的這些抗體進一步證實它們與具有“IGRGKWWR”基序（SEQ ID NO: 186）的硬骨抑素上的特異性表位結合。這使得它們能夠完全阻止硬骨抑素和LRP6之間的結合，從而導致硬骨抑素中和比其他抗硬骨抑素抗體（如羅莫單抗）更強。這與觀察結果一致，即本文公開的抗體在硬骨抑素結合和中和活性方面比羅莫單抗更有利，如以下示例所述。
實施例 5. 抗硬骨抑素抗體的人源化
抗體93B1B7通過將互補決定區（CDR）移植到人種系框架上進行人源化。所選擇的輕鏈種系受體序列為人VK2 A19V區和VK1 O12V區加JK4 J區（V-BASE，https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php）。所選擇的重鏈種系受體序列為人VH1 1-18 V區加JH4 J區（V BASE，https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php）。CDR從供體移植到受體序列符合Kabat（Kabat et al.1987）的定義，但使用Chothia/Kabat聯合定義的CDR-H1和H2除外。通過自動合成方法（Vanzyme lnc.）構建編碼包含初始V區序列的全長IgG4P抗體的基因，並通過寡核苷酸定向誘變修飾生成最終移植版本。為了保持完全活性並保持高熱穩定性，保留了人源化重鏈（Kabat編號）93位（酪氨酸）和94位（絲氨酸）的供體殘基，並將43位的受體殘基（穀氨醯胺）變更為賴氨酸，因為該位置的賴氨酸出現的次數更多。同樣，保留人源化輕鏈（Kabat編號）46位（精氨酸）的供體殘基。此外，通過將30位的甘氨酸殘基突變為絲氨酸以去除輕鏈CDR L1中的一個潛在天冬氨酸異構化位點。生成人源化抗硬骨抑素抗體hAb-1、hAb-2和hAb-3，其CDR、V H和V L序列見表6。
表 6. 示例性人源化抗硬骨抑素抗體的 CDR 、 V H 和 V L 序列
   hAb-1 hAb-2 hAb-3
HC-CDR1 DYEIH (SEQ ID NO: 1) DYEIH (SEQ ID NO: 1) DYEIH (SEQ ID NO: 1)
HC-CDR2 AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5) AIDPETGGTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 5)
HC-CDR3 YDYVTY (SEQ ID NO: 9) YDYVTY (SEQ ID NO: 9) YDYVTY (SEQ ID NO: 9)
LC-CDR1 KSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 15) RSSQSLLYSDGRTYLN (SEQ ID NO: 85) RSSQSLLYSDSRTYLN (SEQ ID NO: 86)
LC-CDR2 LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18) LVSKLDS (SEQ ID NO: 18)
LC-CDR3 WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20) WQGTHLPHT (SEQ ID NO: 20)
V H SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 87
V L SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90
實施例 6. 生物膜層干涉技術檢測人源化抗硬骨抑素抗體與人和食蟹猴硬骨抑素的結合動力學
使用Gator儀器（Probe Life），採用生物膜層干涉技術測定人源化抗硬骨抑素抗體與人和食蟹猴硬骨抑素的結合親和力。使用5μg溶液將抗體固定在抗HFC生物感測器上。使用動力學緩衝液（PBS，pH 7.4，0.05%吐溫-20，0.2%BSA，10μM生物素）將人硬骨抑素和食蟹猴硬骨抑素以4μg/ml連續稀釋2倍作為分析物。使用Gator軟體，根據資料的全域擬合（1:1）計算親和力（K D ）和動力學參數（K on 和K off ）。
結果如下表7所示。與參比品羅莫單抗相比，人源化抗體hAb-1和hAb-2對人和食蟹猴硬骨抑素的親和力更高。
表 7. 不同種屬抗硬骨抑素人源化抗體的結合動力學
抗體 人 食蟹猴
K on (1/Ms) K off  (1/s) K D (M) K on (1/Ms) K off (1/s) K D (M)
93B1B7 1.0×10 6 8.4×10 -5 5.1×10 -11 2.2×10 6 6.5×10 -5 1.8×10 -11
hAb-1 7.3×10 5 3.0×10 -4 4.1×10 -10 1.28×10 6 2.29×10 -4 1.8×10 -10
hAb-2 7.8×10 5 2.0×10 -4 2.4×10 -10 1.54×10 6 8.06×10 -5 5.5×10 -11
羅莫單抗 1.4×10 6 2.8×10 -4 7.8×10 -10 7.55×10 5 2.39×10 -4 3.5×10 -10
實施例 7. HEK293/TCF/LEF/Wnt1 細胞中抗硬骨抑素抗體的硬骨抑素中和活性
根據基於HEK293的試驗測定，抗體能夠中和硬骨抑素並阻斷Wnt1誘導的TCF/LEF螢光素酶活性。
Wnt蛋白是一個分泌型糖蛋白家族，是小鼠和人類成骨細胞分化和活性的關鍵調節因數。Wnt信號由捲曲（Fzd）家族的七通道跨膜G蛋白偶聯受體家族和箭頭/LRP家族的共受體，如LRP5和LRP6，或RYK或ROR跨膜酪氨酸激酶。已知的Wnt與Fzd受體和輔助受體的結合啟動了多個不同的細胞內信號級聯反應，歷史上分為經典的β-連環蛋白依賴性途徑和非經典的β-連環蛋白非依賴性途徑。β-連環蛋白是一種重要的轉錄共啟動因數，可調節Wnt信號傳遞過程中的基因轉錄。Wnt與Fzd受體複合物的結合導致LRP5/6複合物磷酸化，隨後穩定細胞質中的β-連環蛋白。然後將穩定的β-連環蛋白轉位到細胞核中，並與高遷移率族（HMG）型轉錄因數的淋巴增強因數/T細胞因數（LEF/TCF）家族相互作用，刺激靶基因的表達。
在Wnt信號通路拮抗劑及其抗體阻斷劑的研究中，細胞系HEK293/TCF/LEF/Wnt1來源於Askgene（Askgene, CA）。使用表達TCF/LEF螢火蟲螢光素酶報告基因的HEK293細胞系分析Wnt信號拮抗劑（如硬骨抑素和DKK1）的抑制活性。加入硬骨抑素或DKK1可拮抗Wnt1信號，使螢光素酶活性降低。相反，加入硬骨抑素或DKK1抗體可阻斷信號減弱並恢復螢光素酶活性。到達後，細胞用含10%胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、2-美西普乙醇、1%青黴素/鏈黴素、400μg/ml G418和2μg/ml嘌呤黴素的L-穀氨醯胺（Life Technologies, CA）在RPMI1640培養基中培養。收穫細胞，以30,000個細胞/孔的濃度接種至白色96孔板中。
當檢測拮抗劑的抑制作用時，去除培養基，向每個孔中加入50μl含10 mM LiCl的試驗培養基（不含G418和嘌呤黴素的培養基）。將檢測的硬骨抑素和DKK1蛋白連續稀釋，向試驗平板中加入等量拮抗劑，在37°C、5% CO2條件下培養6小時。然後加入100μL/孔的One-Step螢火蟲螢光素酶（Pierce, CA）試劑，使用BioTek Gen5發光酶標儀（Winooski, VT）測定螢光素酶活性。檢測抗體的中和活性時，在試驗培養基中連續稀釋待測抗體和對照抗體。加入固定量的硬骨抑素或DKK1蛋白，培養15分鐘。然後，將50μl的培養基轉移至試驗板中，在37°C、5%CO 2條件下培養6小時，並使用BioTek Gen5發光酶標儀進行分析。
結果如下表8所示。如所示，除65B12C9外，所有小鼠抗硬骨抑素抗體的EC 50值與羅莫單抗相當或更有利。三種人源化抗體hAb-1、hAb-2和hAb-3的EC 50值均優於羅莫單抗。
表 8.HEK293/TCF/LEF/Wnt1 細胞中鼠和人源化抗體的硬骨抑素中和活性
抗體 EC 50(nM)
93B1B7 57.9
94B12D3 62.8
71G6G8 67.41
56E5C10 64.2
91F6D10 60.58
51E8D4 63.35
97C11D7 55.36
81B2B6 59.61
84F2D5 59.42
65B12C9 152.5
hAb-1 13.89
hAb-2 14.9
hAb-3 15.13
羅莫單抗 42.31
實施例 8. 人源化抗硬骨抑素抗體的溶解度和穩定性
將本發明所述的人源化抗SOST抗體hAb-1和hAb-2以及參比抗體羅莫單抗以遞增的濃度進行沉澱形成考察。在pH 7.4的PBS緩衝液中，起始濃度為10mg/ml。4°C下，將細胞置於超濾濃縮管（Millipore）中以4000 rpm離心，每5-10分鐘停止離心，取樣抗體濃度，直至抗體濃度達到30mg/ml和90mg/ml。將樣品在4°C下儲存14天，目視觀察沉澱。本發明中所述的抗體在高達90mg/ml時保持澄清溶液，而參比抗體羅莫單抗在此濃度下形成沉澱和發生渾濁，表明hAb-1和hAb-2在pH7.4的PBS緩衝液中比羅莫單抗更穩定、更易溶解。該結果表明，本發明中所述的抗體可以在高濃度製劑（如90mg/ml）中保持穩定。
抗體 濃度（mg/mL ） 第14 天
hAb-1 10 澄清溶液
30 澄清溶液
90 澄清溶液
hAb-2 10 澄清溶液
30 澄清溶液
90 澄清溶液
羅莫單抗 10 澄清溶液
30 澄清溶液
90 沉澱和溶液渾濁
實施例 9. 雙特異性抗體的製備
本發明製備了靶向硬骨抑素和DKK1或RANKL的雙特異性抗體。靶向DKK1或RANKL的示例性抗體的序列見表9和表10。
表 9. 示例性抗 DKK1 抗體的 CDR 序列
   11H10-V H44V L32 (11H10) RH2-18 71G6G8
HC-CDR1 GFTFSDYAMA (SEQ ID NO: 42) GYTFTDYYIH (SEQ ID NO: 48) GFTFSSYAIS (SEQ ID NO: 54)
HC-CDR2 TIIYDGSSTYYRDSVKG (SEQ ID NO: 43) WIHSNSGATTYAQKFQA (SEQ ID NO: 49) SVSGTGLGFQTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 55)
HC-CDR3 GLGIATDYFDY (SEQ ID NO: 44) EDY (SEQ ID NO: 50) SLENYAFDY (SEQ ID NO: 56)
LC-CDR1 LASEDIYSDLA (SEQ ID NO: 45) TGSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 51) RASESVDDFGISFIN (SEQ ID NO: 57)
LC-CDR2 NANSLQN (SEQ ID NO: 46) GYSNRPS (SEQ ID NO: 52) AGSKQGS (SEQ ID NO: 58)
LC-CDR3 QQYNNYPPT (SEQ ID NO: 47) AGSKQGS (SEQ ID NO: 58) QQLKEVPPT (SEQ ID NO: 59)
表 10. 示例性抗 RANKL 抗體的 CDR 序列
   地諾單抗
HC-CDR1 GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 66)
HC-CDR2 GITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 67)
HC-CDR3 DPGTTVIMSWFDP (SEQ ID NO: 68)
LC-CDR1 RASQSVRGRYLA (SEQ ID NO: 69)
LC-CDR2 GASSRAT (SEQ ID NO: 70)
LC-CDR3 QQYGSSPRT (SEQ ID NO: 71)
具體來說，製備了由以下硬骨抑素/DKK1和硬骨抑素/RANKL配對的雙特異性抗體：hAb-1×11H10-V H44V L32、hAb-2×11H10-V H44V L32、hAb-1×地諾單抗、hAb-2×地諾單抗。
在一個實施方式（見圖5(A)）中，抗DKK1 11H10-V H44V L32（或抗RANKL Denosumab）Fv結構域轉化為具有V H和V L兩種不同取向的scFv，通過(GGGGS) 4連接子連接。存在突變，如V H中G100C和V L中G44C，以促進scFvs的正確組裝。兩個抗DKK1（或抗RANKL）scFv分別通過一個GGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO：76）連接子分別與人源化抗硬骨抑素抗體的兩個IgG重鏈的C端連接，形成雙特異性IgG-scFv。
在另一個實施例（見圖5(B)）中，抗硬骨抑素抗體和抗DKK1 11H10-V H44V L32（或抗RANKL Denosumab）轉化為具有不對稱IgG結構的“ 杵-臼結構”雙特異性抗體。抗DKK1 11H10-V H44V L32（或抗RANKL Denosumab）的CL結構域含有S176C和C214S突變，CH1結構域含有F170C和C131S等突變，形成正交CH 1-CK二硫鍵，使輕鏈能夠正確解析。
下表11列出了各種抗硬骨抑素雙特異性抗體的形式和序列。
表 11. 抗硬骨抑素雙特異性抗體
雙特異性抗體 結構 重鏈 (從N端至 C端) 輕鏈 (從N端至 C端)
BAP0017 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3-L1-93B1B7 V H-L2-93B1B7 V L(SEQ ID NO: 91) 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 93)
BAP0018 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3-L1-93B1B7 V L-L2-93B1B7 V H(SEQ ID NO: 92) 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 93)
BAP0019 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V H2-L2-11H10 V L2 (SEQ ID NO: 94) 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 96)
BAP0020 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V L2-L2-11H10 V H2 (SEQ ID NO: 95) 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 96)
BAP0021 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體重鏈N端融合 93B1B7 V H-L1-93B1B7 V L-L2-11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 97) 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 99)
BAP0022 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體重鏈N端融合 93B1B7 V L-L1-93B1B7 V H-L2-11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 98) 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 99)
BAP0023 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈N端融合 11H10 V H2-L1- 11H10 V L2-L2-93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 100) 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 102)
BAP0024 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈N端融合 11H10 V L2-L1- 11H10 V H2-L2-93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 101) 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 102)
BAP0025 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體輕鏈N端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 103) 93B1B7 V H-L1-93B1B7 V L-L2- 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 104)
BAP0026 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體輕鏈N端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 103) 93B1B7 V L-L1-93B1B7 V H-L2- 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 105)
BAP0027 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體輕鏈N端融合 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 106) 11H10 V H2-L1- 11H10  V L2-L2-93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 107)
BAP0028 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體輕鏈N端融合 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 106) 11H10 V L2-L1- 11H10 V H2-L2-93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 108)
BAP0029 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體輕鏈C端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 109) 11H10 V L2-CL-L1-93B1B7 V H-L2-93B1B7 V L(SEQ ID NO:110)
BAP0030 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體輕鏈C端融合 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 109) 11H10 V L2-CL-L1-93B1B7 V L-L2-93B1B7 V H(SEQ ID NO:111)
BAP0031 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體輕鏈C端融合 93B1B7 V H- CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO:112) 93B1B7 V L-CL-L1- 11H10  V H2-L2- 11H10 V L2 (SEQ ID NO: 113)
BAP0032 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體輕鏈C端融合 93B1B7 V H- CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO:112) 93B1B7 V L-CL-L1- 11H10 V L2-L2- 11H10 V H2 (SEQ ID NO: 114)
BAP0033 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H-CH1-CH2-CH3-L1-hAb2 V L2-L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 115) 11H10 V L-CL (SEQ ID NO: 119)
BAP0034 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H-CH1-CH2-CH3-L1-hAb V H2-L2-hAb2 V L2 (SEQ ID NO: 116) 11H10 V L3-CL (SEQ ID NO: 119)
BAP0035 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H-CH1-CH2-CH3-L1-hAb1 V L2-L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 117) 11H10 V L3-CL (SEQ ID NO: 119)
BAP0036 抗硬骨抑素scFv（V H-V L）與抗DKK1全長抗體重鏈C端融合 11H10 V H-CH1-CH2-CH3-L1-hAb V H2-L2-hAb1 V L2 (SEQ ID NO: 118) 11H10 V L3-CL (SEQ ID NO: 119)
BAP0037 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V H3-L2-11H10 V L3 (SEQ ID NO: 120) hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 122)
BAP0038 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V L3-L2-11H10 V H3 (SEQ ID NO: 121) hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 122)
BAP0039 抗DKK1 scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V H3-L2-11H10 V L3 (SEQ ID NO: 123) hAb-1 V L-CL (SEQ ID NO: 125)
BAP0040 抗DKK1 scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1-11H10 V L3-L2-11H10 V H3 (SEQ ID NO: 124) hAb-1 V L-CL (SEQ ID NO: 125)
BAP0050 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體重鏈C端融合 Denosumab V H-CH1-CH2-CH3-L1- hAb-2 V L2 -L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 126) Denosumab V L-CL (SEQ ID NO: 129)
BAP0051 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體重鏈N端融合 hAb-2 V L2 -L1-hAb V H2-L2-Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 127) Denosumab V L-CL (SEQ ID NO: 129)
BAP0052 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體重鏈C端融合 Denosumab V H-CH1-CH2-CH3-L1- hAb-2 V L2 -L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 128) Denosumab V L-CL (SEQ ID NO: 129)
BAP0053 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體輕鏈C端融合 Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 133) Denosumab V L-CL-L1- hAb-2 V L2 -L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 130)
BAP0054 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體輕鏈N端融合 Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 133) hAb-2 V L2 -L1-hAb V H2-L2- Denosumab V L-CL (SEQ ID NO: 131)
BAP0055 抗硬骨抑素scFv（V L-V H）與抗RANKL全長抗體輕鏈C端融合 Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 133) Denosumab V L-CL-L1- hAb-1 V L2 -L2-hAb V H2 (SEQ ID NO: 132)
BAP0041 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 134) 2 nd重鏈: 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 136) 1 st輕鏈: 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 135) 2 nd輕鏈: 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 137)
BAP0042 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 134) 2 nd重鏈: 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 138) 1 st輕鏈: 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 135) 2 nd輕鏈: 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 139)
BAP0043 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 134) 2 nd重鏈: 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 140) 1 st輕鏈: 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 135) 2 nd輕鏈: 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 141)
BAP0044 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 134) 2 nd重鏈: 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 142) 1 st輕鏈: 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 135) 2 nd輕鏈: 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 143)
BAP0045 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: 93B1B7 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 134) 2 nd重鏈: 11H10 V H2-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 144)    1 st輕鏈: 93B1B7 V L-CL (SEQ ID NO: 135) 2 nd輕鏈: 11H10 V L2-CL (SEQ ID NO: 145)
BAP0061 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: 11H10 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 148) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: 11H10 V L-CL SEQ ID NO: 149)   
BAP0062 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: 11H10 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 150) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: 11H10 V L-CL SEQ ID NO: 151)
BAP0063 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: 11H10 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 152) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: 11H10 V L-CL SEQ ID NO: 153)
BAP0064 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別DKK1的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: 11H10 V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 154) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: 11H10 V L-CL SEQ ID NO: 155)
BAP0065 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 156) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 157)   
BAP0066 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 158) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 159)
BAP0067 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 162) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 163)
BAP0068 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 146) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 160) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 161)
BAP0069 抗RANKL scFv（V L-V H）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1- Denosumab V L-L2-Denosumab V H(SEQ ID NO: 177) hAb-1 V L-CL (SEQ ID NO: 125)
BAP0070 抗RANKL scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1- Denosumab V H-L2-Denosumab V L(SEQ ID NO: 178) hAb-1 V L-CL (SEQ ID NO: 125)
BAP0071 抗RANKL scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1- Denosumab V H-L2-Denosumab V L(SEQ ID NO: 178) hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 122)
BAP0072 抗RANKL scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1- Denosumab V H-L2-Denosumab V L(SEQ ID NO: 179) hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 122)
BAP0073 抗RANKL scFv（V H-V L）與抗硬骨抑素全長抗體重鏈C端融合 hAb V H-CH1-CH2-CH3-L1- Denosumab V H-L2-Denosumab V L(SEQ ID NO: 180) hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 122)
BAP0074 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 171) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 172) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 163)
BAP0075 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 173) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 174) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 163)
BAP0076 全長抗體，具有：a）識別硬骨抑素的第一對V H-V L（第一Fab）和b）識別RANKL的第二對V H-V L（第二Fab） 1 st重鏈: hAb V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 175) 2 nd重鏈: Denosumab V H-CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 176) 1 st輕鏈: hAb-2 V L-CL (SEQ ID NO: 147) 2 nd輕鏈: Denosumab V L-CL SEQ ID NO: 163)
雙特異性分子在96孔板中的HEK293 6E細胞中暫態表達。在轉染前24小時，將貼壁的HEK293 6E細胞以5×10 4個細胞/孔接種於無血清KOP293培養基（珠海愷瑞生物科技#K03252）中的多聚-D-賴氨酸包被的96孔組織培養板中，濃度為25μg/ml和5%FBS，並在37°C、5% CO 2條件下過夜培養。將100ng（40 ng/μl）各相應的結合分子重鏈和輕鏈DNA混合在一起。向DNA混合物中加入無血清培養基KOP293 25μL/孔。RT培養15-30min後，將轉染混合物加入前一天接種的培養板中，輕輕搖動混合。將培養板放回37°C、5% CO 2培養箱中過夜。次日，吸出培養基和轉染混合物，替換為130μl含0.5%胰蛋白腖的無血清培養基。將平板再培養6天。轉染後第7天收穫條件培養基（CM）。將平板1000rpm離心5分鐘，以沉澱任何細胞碎片。小心地將上清液轉移至無菌聚丙烯塊中。
通過蛋白A親和層析純化抗體，並在PBS（pH 7.2）中交換緩衝液。使用理論測定的該蛋白消光係數，通過讀取280nm處的吸光度，確定純化抗體的濃度。
實施例 10. 抗硬骨抑素 × 抗 DKK1 和抗硬骨抑素 × 抗 RANKL 雙特異性抗體的結合動力學和親和力
用Gator（Probe Life）生物膜層干涉技術（BLI）測定抗硬骨抑素x抗DKK1和抗硬骨抑素x抗RANKL雙特異性抗體的結合動力學和親和力。使用5μg/ml溶液將抗體固定在抗HFC生物感測器上。使用動力學緩衝液（PBS，pH 7.4，0.05%吐溫-20，0.2%BSA）將硬骨抑素（1μg/ml）、DKK1（2μg/ml）或RANKL（4μg/ml）連續稀釋2倍作為分析物。使用Gator軟體，根據資料的全域擬合（1:1）計算親和力（K D ）和動力學參數（K on 和K off ）。結果匯總見表12。
表 12. 人硬骨抑素、 DKK1 和 RANKL 雙特異性抗體的結合動力學匯總
抗體 抗原 k off(1/s) k on(1/Ms) K D (M) b
BAP0037 人硬骨抑素 LOD a 1.88×10 6 約10 -11
人DKK1 3.01×10 -4 2.97×10 5 1.01×10 -9
BAP0039 人硬骨抑素 9.74×10 -5 1.88×10 6 5.2×10 -11
人DKK1 4.32×10 -5 3.09×10 5 1.4×10 -10
BAP0061 人硬骨抑素 LOD 2.62×10 6 約10 -11
人DKK1 LOD 3.30×10 5 約10 -11
BAP0063 人硬骨抑素 LOD 2.59×10 6 約10 -11
人DKK1 LOD 1.29×10 5 約10 -11
BAP0069 人硬骨抑素 LOD 7.57×10 5 約10 -11
人RANKL LOD 8.67×10 4 約10 -11
BAP0075 人硬骨抑素 LOD 5.78×10 5 約10 -11
人RANKL LOD 1.45×10 5 Estimated 約10 -11
a. 超過檢測限，表明脫落速率非常緩慢，超出Gator的定量檢測限 b 親和力K D 值通過K of f/K on 計算，在K off 為超過檢測限的情況下，估算K D 值約為10pM，即Gator的親和力檢測限
實施例 11. 證實雙特異性抗體可以與人硬骨抑素和 DKK1 同時結合
使用BLI證實了人硬骨抑素和DKK1可以與雙特異性抗體同時結合。將雙特異性抗體b構建體（5μg/ml）捕獲到HFC探針上，然後在動力學緩衝液（PBS，pH 7.4，0.05%吐溫-20，0.2%BSA）中依次加入人硬骨抑素（2μg/ml）和DKK1（2μg/ml）。如圖6所示，在4種雙特異性抗體中觀察到兩種抗原的增量結合反應，但在空白緩衝液或抗硬骨抑素單克隆抗體中未觀察到，表明雙特異性抗體可同時結合硬骨抑素和DKK1，並且一種靶蛋白的結合不會阻斷另一個靶蛋白的結合。
實施例 12. HEK293/TCF/LEF/Wnt1 細胞上雙特異性抗體的硬骨抑素 /DKK1 中和活性
如示例7所述進行WNT信號阻斷試驗，其中分別加入1μg/ml人硬骨抑素和DKK1。所有雙特異性抗體均能夠以劑量依賴性方式完全中和來自硬骨抑素和DKK1的WNT拮抗作用。EC50活性見表13。
表 13. HEK293/TCF/LEF/Wnt1 報告基因試驗中抗硬骨抑素 x 抗 DKK1 雙特異性抗體的硬骨抑素和 DKK1 中和活性
抗體 EC 50(nM)
硬骨抑素 DKK1
BAP0037 23.63 24.13
BAP0039 26.66 20.87
BAP0061 63.83 41.39
BAP0063 65.44 44.72
實施例 13. 雙特異性抗體的藥代動力學研究
未給藥的雄性食蟹猴，體重在2.7kg~3.5kg之間，給藥開始時3-5歲。將動物隨機分配至4個劑量組（每組n=3）。給藥當天，皮下注射30mg/kg抗體。在第1天（給藥前、給藥後12和24小時）、給藥後2、3、5、7、10、14、18、21、28天採集血樣。本研究中使用的PK採樣方案基於其他人IgG治療性單克隆抗體在食蟹猴中的已知PK特性設計。
測定食蟹猴血清中bsAb的方法採用經確認的適用的夾心ELISA方法。用人IgG重鏈和輕鏈特異性猴吸附抗體包被康寧96孔高結合力 聚苯乙烯微孔板。將標準品、質控樣品和未知樣品上樣至孔中，存在的任何人抗體均與固定化抗體結合。洗滌所有未結合物質後，向孔中加入ELISA所用的人IgG重鏈和輕鏈特異性猴吸附抗體偶聯物HRP和TMB底物溶液。只有含有與捕獲抗體和檢測抗體結合的人雙特異性的樣品才會在450nm處產生吸收信號。產生的信號與人雙特異性抗體的存在量成正比。樣品中抗體的最低可定量濃度（LLOQ）為0.1μg/ml。
食蟹猴雙特異性抗體的血清濃度見圖7。資料以平均值±標準差表示，n=3。計算所得半衰期範圍為17-286小時。
實施例 14. 雙特異性抗體的藥效學研究
骨形成生物標誌物I型前膠原N端前肽（P1NP）和骨吸收生物標誌物I型膠原端肽C端肽（CTX-1）是兩種廣泛接受的特異性骨穩態指標。為檢測雙特異性抗體的藥效學作用，正常雄性食蟹猴皮下注射上述不同的雙特異性抗體，劑量為30mg/kg。在注射後第3天採集血樣。然後離心分離血清樣本。根據生產商的說明，分別使用P1NP試劑盒（PC-007）和Serum CrossLaps ELISA試劑盒（AC-021F1R）測定血清P1NP和CTX-1水準。結果表明，雙特異性抗體僅在注射後3天就使血清P1NP水準顯著升高。與給藥前基線相比，不同雙特異性抗體第3天的血清P1NP水準升高範圍在104.50±8.5%至212.75±20.6%之間（表14）。此外，注射雙特異性抗體第三天后，不同雙特異性抗體的血清CTX-1水準較基線降低範圍在46.73±2.5%至90.11±6.8%之間（表14）。結果表明，雙特異性抗體能顯著增加骨形成，同時降低骨吸收，表明其對治療男性和女性骨量低下或骨質疏鬆、成骨不全、多發性骨髓瘤骨病等與骨量低或骨質差相關的疾病或病症具有深遠的治療效果。數據見表14。
表 14. 食蟹猴注射雙特異性抗體後第 3 天血清中 P1NP 、 CTX-1 濃度
抗體 較給藥前基線相比的百分比變化 ( 平均值 ± 標準差 n = 3)
血清P1NP 血清CTX-1
BAP0037 212.75 ± 20.6 -90.11 ± 6.8
BAP0039 127.92 ± 18.8 -75.03 ± 10.1
BAP0061 180.39 ± 23.8 -46.73 ± 2.5
BAP0063 117.12 ± 16.0 -68.81 ± 12.5
BAP0069 104.50 ± 8.5 -75.07 ± 2.9
此外，當使用雙特異性抗體治療假手術（Sham）或長期卵巢切除（OVX）的雌性食蟹猴（一種經驗證良好的絕經後骨質疏鬆症動物模型）時，單次注射10mg/kg雙特異性抗體可誘導血清P1NP顯著升高和血清CTX-1水準降低。與給藥前基線值相比，給藥後14天，OVX食蟹猴血清P1NP水準升高241.36±60.9%，假手術食蟹猴血清P1NP水準升高182.67±60.1%。同時，給藥後14天，OVX食蟹猴血清CTX-1降低-52.12±5.9%，假手術食蟹猴血清CTX-1降低-17.43±8.5%。這些資料進一步證明了本發明中的抗體在年齡相關或絕經後骨質疏鬆症中增加骨形成和減少骨吸收的治療效果。
實施例 15. 雙特異性抗體能夠預防成骨不全（ OI ）患者骨折
骨的多尺度層次結構是經過自然優化過的，所以能夠抵抗骨折。增強骨形成和減少骨吸收是保持骨骼強度和健康的兩個重要過程。在成骨不全（OI）或脆性骨病中，基因突變影響膠原的質量和/或數量，並顯著增加骨折風險。臨床上，該病的標誌是低骨量和低強度、極度的骨脆性和骨骼畸形以及頻繁的骨折。降低OI骨折發生率的治療是臨床改善的最終目標。因此，我們研究了成骨不全（OI）小鼠模型（oim/oim）中的雙特異性抗體的藥效，該模型中I型膠原蛋白前a2鏈的自發突變導致骨質變差和骨量變低，最終導致頻繁的脆性骨折。4周齡時，純合子oim/oim小鼠的長骨開始骨折。皮下注射單獨的單克隆抗體或雙特異性抗體（25 mg/kg，每種抗體每週一次）6周後，10周齡時，抗體給藥組動物新發生的骨折數量顯著少於溶媒給藥動物。在溶媒給藥對照組中，從4周齡至10周齡（6周觀察期），根據X射線圖像，組內每只小鼠的骨折數量平均增加2.27±0.7處。與溶媒給藥對照組相比，硬骨抑素抗體或DKK1抗體單獨給藥導致每只小鼠的平均骨折數量減少（分別為0.75±0.2處和1.44±0.4處）。更值得注意的是，用雙特異性抗體治療的oim/oim小鼠可完全預防新發生的骨折（從4周齡到10周齡，每只小鼠0.00±0.5處新發骨折），遠優於任一單藥治療。這些結果表明，當同時中和硬骨抑素和DKK1時，雙特異性抗體通過協同骨合成效應，達到了防止進一步骨折的效果。鑒於硬骨抑素和DKK1均與Wnt受體LRP5/6結合，並都作為拮抗劑阻斷信號通路的合成代謝特性，值得注意的是，若用特異性抗體阻斷其中一個結合位點將通過代償機制引起其他拮抗劑的上調，如骨質疏鬆症患者經過抗硬骨抑素抗體治療後觀察到的DKK1上調（Holdsworth G, 2018, Bone 107, 93-103）所示。因此，當前研究的上述結果表明，通過對骨骼的協同作用可以防止進一步骨折。這一令人滿意的結果清楚地表明，雙特異性抗體能夠減少OI患者未滿足的需求，並減少重複骨折的負擔。
實施例 16. 雙特異性抗體抑制 RPMI8226 多發性骨髓瘤細胞的體外生長
本發明還在RPMI8226人多發性骨髓瘤（MM）細胞中評價了雙特異性抗體抑制腫瘤細胞生長的活性。如很多科學報告所示，多發性骨髓瘤患者的DKK1表達水準升高，並與疾病的嚴重程度相關（Fulciniti M. et al. Blood, 2009; 114(2): 371-379., Feng Y et al. Cancer Biomarkers.2018; 1: 1-7).此外，研究表明，約80%-90%的MM患者發生了MM相關骨病（MMBD）。MMBD的主要臨床表現是由於骨吸收活性增加和抑制骨形成而導致的溶骨性病變和骨折。因此，雙特異性抗體的性質將通過提供抑制骨吸收和抑制DKK1的表達從而導致骨形成增加使MMBD患者獲益。我們的初步研究表明，經該分子作用的MM細胞（RPMI8226）的體外細胞培養顯示細胞表面標誌物CD138水準降低，表明細胞可能正在經歷凋亡過程。此外，CCK8腫瘤生長分析表明，腫瘤細胞數量呈劑量依賴性減少。RPMI8226 MM細胞給予100μg/ml雙特異性抗體48小時後，活細胞數下降約28%。這表明雙特異性抗體可引起RPMI8226MM細胞凋亡，並且可以抑制腫瘤細胞的生長。結果表明，這種治療應用通過預防骨病症（如示例14和15中的資料所示）和直接抑制腫瘤生長以達到治療MMBD和腫瘤轉移相關的骨病症。
無
圖1示出了硬骨抑素上第二個環上的“IGRGKWWR”基序的序列和構象，以說明硬骨抑素和LDL受體相關蛋白6（LRP6）之間的相互作用。 圖 2 顯示了使用硬骨抑素第二個環上的合成肽片段對單克隆抗體93B1B7的硬骨抑素表位作圖。 圖3表明了羅莫單抗(Romosozumab)不識別來自單克隆抗體93B1B7結合的第二環人硬骨抑素的肽。 圖4表明了單克隆抗體93B1B7和羅莫單抗佔據不同的硬骨抑素表位，並且沒有交叉阻斷彼此與硬骨抑素的結合。 圖5為示例性雙特異性抗體結構的示意圖。 圖6示出了來自生物層干涉（BLI）傳感圖的結果，證明了人硬骨抑素和DKK1與雙特異性抗體的增量結合； 圖7顯示了食蟹猴接受30 mg/kg皮下給藥後雙特異性抗體的血清濃度。
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Claims (97)

  1. 一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分結合到硬骨抑素上的表位，所述表位包含SEQ ID NO: 186所示的氨基酸序列。
  2. 一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中： 所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1-4和SEQ ID NO: 12中任一項的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5-8和SEQ ID NO: 13中任一項的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9-11和SEQ ID NO: 14中任一項的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；以及 所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15-17、SEQ ID NO: 85和SEQ ID NO: 86中任一項的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19中任一項的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21中任一項的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
  3. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於： a）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15或16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3；或者 b）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  4. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  5. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  6. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  7. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  8. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  9. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  10. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3。
  11. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  12. 根據請求項1或2所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，所述V L包括：包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3。
  13. 一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，其中所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分包括重鏈可變區（V H）和輕鏈可變區（V L），其中： a）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 22所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 23所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； b）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 25所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； c）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 26所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 27所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； d）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 28示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 29所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； e）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 30示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； f）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 32示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 33所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； g）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 34示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 35所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； h）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 36示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 37所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； i）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 38示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 39所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； j）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 40示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 41所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； k）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 88所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列； l）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 89所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或者 m）HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，分別包含V H內具有SEQ ID NO: 87示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分別包含V L內具有SEQ ID NO: 90所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
  14. 根據請求項1-13中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H包括SEQ ID NO: 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和87中任一項的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；以及/或者，所述V L包括SEQ ID NO: 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和88-90中任一項的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體。
  15. 根據請求項14所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於： a）所述V H包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； b）所述V H包括SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； c）所述V H包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 27的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； d）所述V H包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； e）所述V H包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 31的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； f）所述V H包括SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； g）所述V H包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 35的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； h）所述V H包括SEQ ID NO: 36的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； i）所述V H包括SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 39的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； j）所述V H包括SEQ ID NO: 40的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； k）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 88的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體； l）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 89的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；或者 m）所述V H包括SEQ ID NO: 87的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體；所述V L包括SEQ ID NO: 90的氨基酸序列，或包含具有至少約80%序列一致性的氨基酸序列的變體。
  16. 一種抗硬骨抑素構建體，包括特異性識別硬骨抑素的抗體部分，其中所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分是來源於包含重鏈可變區（V H）和第二輕鏈可變區（V L）的抗硬骨抑素抗體的人源化抗體部分，其中： a）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； b）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； c）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； d）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； e）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； f）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 200的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體； g）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；或者 h）所述V H包括：包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含HC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體；所述V L包括：包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含LC-CDR中最多5、4、3、2或1個氨基酸置換的變體。
  17. 根據請求項1-16中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分是一種抗體或其抗原結合片段，選自全長抗體、雙特異性抗體、單鏈Fv（scFv）片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、二硫鍵穩定性scFv（dsscFv）、(dsFv) 2、Fv-Fc融合、scFv-Fc融合、scFv-Fv融合、diabody、tribody和tetrabody。
  18. 根據請求項1-17中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗硬骨抑素構建體是包含Fc片段的全長抗體。
  19. 根據請求項17所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分是scFv片段。
  20. 根據請求項1-19中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述硬骨抑素是人硬骨抑素。
  21. 根據請求項1-17和19-20中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗硬骨抑素構建體還包括第二部分。
  22. 根據請求項21所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二部分包括特異性識別抗原的第二抗體部分。
  23. 根據請求項22所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分包括第二重鏈可變區（V H-2）和輕鏈可變區（V L-2）。
  24. 根據請求項22或23所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗原是DKK1。
  25. 根據請求項24所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述DKK1是人DKK1。
  26. 根據請求項24或25所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，第二抗體部分與包含第三重鏈可變區（V H-3）和第三輕鏈可變區（V L-3）的第三抗體部分競爭DKK1的結合表位，其中： a）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3； b）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3；或者 c）所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
  27. 根據請求項26所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的LC-CDR3。
  28. 根據請求項26所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR3。
  29. 根據請求項26所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的LC-CDR3。
  30. 根據請求項22或23所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗原是RANKL。
  31. 根據請求項30所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗原是人RANKL。
  32. 根據請求項30或31所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分與包含第三重鏈可變區（V H-3）和第三輕鏈可變區（V L-3）的第三抗體部分競爭RANKL的結合表位，其中所述V H-3包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-3包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
  33. 根據請求項31所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2包括：包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的HC-CDR3；所述V L-2包括：包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的LC-CDR3。
  34. 根據請求項22-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈Fv（scFv）片段、scFv-scFv、微型抗體、diabody或sdAb。
  35. 根據請求項34所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分是包含兩條重鏈、兩條輕鏈和Fc片段的全長抗體，所述抗硬骨抑素抗體部分是包含與V L融合的V H的單鏈Fv（scFv）片段。
  36. 根據請求項35所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條重鏈融合。
  37. 根據請求項34-36中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條輕鏈融合。
  38. 根據請求項36或37所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分與全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的N端融合。
  39. 根據請求項36-38中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分與所述全長抗體的一條或兩條重鏈或輕鏈的C端融合。
  40. 根據請求項36-39中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分通過第一連接子與所述全長抗體融合。
  41. 根據請求項36-39中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分不通過連接子與所述全長抗體融合。
  42. 根據請求項40所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第一連接子是選自SEQ ID NO: 74-84的GS連接子。
  43. 根據請求項35-42中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H通過第二連接子與所述V L融合。
  44. 根據請求項43所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述scFv片段從N端到C端包括：V H、第二連接子和V L。
  45. 根據請求項43所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述scFv片段N端到C端包括：V L、第二連接子和V H以及可選的C端丙氨酸殘基。
  46. 根據請求項43-45中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二連接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
  47. 根據請求項23-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分是包含V H-2和V L-2的scFv片段，所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分是包含兩條重鏈、兩條輕鏈和Fc片段的全長抗體。
  48. 根據請求項46所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈融合。
  49. 根據請求項47或48所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二抗體部分與所述全長抗體的兩條輕鏈融合。
  50. 根據請求項48或49所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈或輕鏈的N端融合。
  51. 根據請求項47-50中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗體部分與所述全長抗體的兩條重鏈或輕鏈的C端融合。
  52. 根據請求項47-51中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗體部分通過第一連接子與所述全長抗體融合。
  53. 根據請求項47-51中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述抗體部分不通過連接子與所述全長抗體融合。
  54. 根據請求項52所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第一連接子是選自SEQ ID NO: 74-84的GS第一連接子。
  55. 根據請求項47-54中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2通過第二連接子與所述V L-2融合。
  56. 根據請求項47-54中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述V H-2不通過連接子與所述V L-2融合。
  57. 根據請求項55所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述scFv片段從N端到C端包括：V H-2、第二連接子和V L-2。
  58. 根據請求項55所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述scFv片段從N端到C端包括：V L-2、第二連接子和V H-2，以及可選的C端丙氨酸殘基。
  59. 根據請求項55和57-58中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二連接子包含SEQ ID NO: 76或77的氨基酸序列。
  60. 根據請求項35-59中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述scFv是二硫鍵穩定性scFv（“dsscFv”）。
  61. 根據請求項60所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述dsscFv包括：a）根據SEQ ID NO: 60的編號的V H或V H-2中的G44C突變，和b）根據SEQ ID NO: 61的編號的V L或V L-2中的G100C突變。
  62. 根據請求項35-61中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述分子包括： 1）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列； 2）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 93的氨基酸序列； 3）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列； 4）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 95的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列； 5）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 97的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列； 6）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 98的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 99的氨基酸序列； 7）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列； 8）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列； 9）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 104的氨基酸序列； 10）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 105的氨基酸序列； 11）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 107的氨基酸序列； 12）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列； 13）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列； 14）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 111的氨基酸序列； 15）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 113的氨基酸序列； 16）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 114的氨基酸序列； 17）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 115的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 18）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 19）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 117的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 20）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 119的氨基酸序列； 21）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 120的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 22）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 121的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 23）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 123的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 24）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 124的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 25）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 126的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 26）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 127的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 27）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 128的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 129的氨基酸序列； 28）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 130的氨基酸序列； 29）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 131的氨基酸序列； 30）兩條重鏈，每條重鏈包含SEQ ID NO: 133的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 132的氨基酸序列； 31）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 177的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 32）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 178的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列； 33）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 178的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列； 34）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 179的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列；或者 35）兩條重鏈，融合了所述特異性識別硬骨抑素的抗體部分或第二抗體部分，每條重鏈包含SEQ ID NO: 180的氨基酸序列；以及兩條輕鏈，每條輕鏈包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列。
  63. 根據請求項23-33中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述分子包括： a）包含第一輕鏈的第一多肽，所述第一輕鏈從N端到C端包括：i）V L，ii）第一輕鏈恒定結構域（“第一CL結構域”）； b）包含第一重鏈的第二多肽，所述第一重鏈從N端到C端包括：i）V H，ii）第一重鏈恒定結構域（“第一CH1結構域”），和iii）第一Fc結構域； c）包含第二重鏈的第三多肽，所述第二重鏈從N端到c端包括：i）V H-2，ii）第二重鏈恒定結構域（“第二CH1結構域”），和iii）第二Fc結構域；以及 d）包含第二輕鏈的第四多肽，所述第二輕鏈從N端到C端包括：i）V L-2，ii）第二輕鏈恒定結構域（“第二CL結構域”）， 其中第一Fc結構域和第二Fc結構域形成Fc片段。
  64. 根據請求項63所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，第一Fc結構域和第二Fc結構域中的一個包含T366W突變和可選的S354C突變，另一個Fc結構域包括T366S突變、L368A突變、Y407V突變和可選的Y349C突變，其中編號基於EU索引。
  65. 根據請求項63或64所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於：i）第一CH1結構域和第一CL結構域，或ii）第二CH1結構域和第二CL結構域均選自： a）CH1結構域，其中141位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中116位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； b）CH1結構域，其中168位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中164位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； c）CH1結構域，其中126位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中121位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； d）CH1結構域，其中128位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中118位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； e）CH1結構域，其中170位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換非為半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中176位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； f）CH1結構域，其中171位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中162位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； g）CH1結構域，其中173位元的氨基酸置換為半胱氨酸，131位或220位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸；以及CL結構域，其中160位元的氨基酸置換為半胱氨酸，214位的半胱氨酸置換為非半胱氨酸氨基酸； 其中編號基於EU索引。
  66. 根據請求項63-65中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，包括： 1）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 136的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 137的氨基酸序列； 2）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 138的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 139的氨基酸序列； 3）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 140的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 141的氨基酸序列； 4）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 142的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 143的氨基酸序列； 5）第一多肽包含SEQ ID NO: 135的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 144的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 145的氨基酸序列； 6）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 148的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 149的氨基酸序列； 7）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 150的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 151的氨基酸序列； 8）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 152的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 153的氨基酸序列； 9）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 154的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 155的氨基酸序列； 10）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 156的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 157的氨基酸序列； 11）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 158的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 159的氨基酸序列； 12）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 160的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 161的氨基酸序列； 13）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 146的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 162的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 14）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 171的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 172的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 15）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 173的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 174的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列； 16）第一多肽包含SEQ ID NO: 147的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO: 175的氨基酸序列，第三多肽包含SEQ ID NO: 176的氨基酸序列，第四多肽包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列。
  67. 根據請求項21所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二部分包括半衰期延長部分。
  68. 根據請求項67所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述半衰期延長部分是Fc片段。
  69. 根據請求項18、35-66和68中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述Fc片段選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段及其組合和雜交中的一種。
  70. 根據請求項69所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述Fc片段選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段及其組合和雜交中的一種。
  71. 根據請求項69或70所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述Fc片段包括H435R突變和Y436F突變。
  72. 根據請求項69-71中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述Fc片段具有與相應野生型Fc片段相比增強的效應子功能。
  73. 根據請求項69-71中任一項所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述Fc片段具有： a）與相應野生型Fc片段相比增強的效應子功能，以及/或者 b）與相應野生型Fc片段相比增強的FcRn結合親和力。
  74. 根據請求項21所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述分子是抗體藥物偶聯物或抗體融合蛋白。
  75. 根據請求項74所述的抗硬骨抑素構建體，其特徵在於，所述第二部分包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）、降鈣素及其組合中的一種或幾種。
  76. 一種抗硬骨抑素構建體，與請求項1-75中任一項所述的抗硬骨抑素構建體競爭性地與硬骨抑素特異性結合。
  77. 一種藥物組合物，包括請求項1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體和藥學上可接受的載體。
  78. 根據請求項77所述的藥物組合物，其特徵在於，所述組合物還包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）、降鈣素及其組合中的一種或幾種。
  79. 一種分離的核酸分子，編碼請求項1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體。
  80. 一種載體，包括請求項79所述的分離的核酸分子。
  81. 一種分離宿主細胞，包括請求項79所述的分離的核酸分子或請求項80所述的載體。
  82. 一種製備抗硬骨抑素構建體的方法，包括： a）在有效表達抗硬骨抑素構建體或其一部分的條件下培養請求項81所述的分離宿主細胞；以及 b）從宿主細胞獲得表達的抗硬骨抑素構建體或其一部分。
  83. 一種治療和/或預防個體的疾病或病症的方法，包括向個體施用有效量的請求項1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體和/或請求項77或78所述的藥物組合物。
  84. 根據請求項83所述的方法，其特徵在於，所述疾病或病症是骨相關疾病或軟骨相關病症、骨髓或血液學疾病、骨骼肌肉系統罕見病、肌肉相關疾病或癌症。
  85. 根據請求項84所述的方法，其特徵在於，所述骨相關疾病包括成骨不全、骨質疏鬆症或骨質減少症（男性和/或女性）、骨壞死、骨延遲癒合、骨折不癒合、多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤相關骨病症、原發性骨腫瘤、惡性腫瘤的骨轉移、炎性或感染性骨病、骨軟化症、高鈣血症、佩吉特病、不活動引起的骨丟失、糖皮質激素誘導的骨丟失、炎症性骨丟失，包括關節炎誘導的骨丟失、宇航員骨質疏鬆症/骨質減少症和失重引起的骨丟失，或者與a）骨量或骨質丟失或兩者丟失和/或b）骨結構和骨質異常相關的其他疾病或病症。
  86. 根據請求項85所述的方法，其特徵在於，所述骨相關疾病是指骨質疏鬆症或骨質減少症。
  87. 根據請求項85所述的方法，其特徵在於，所述骨相關疾病是指成骨不全。
  88. 根據請求項85所述的方法，其特徵在於，所述骨相關疾病是指多發性骨髓瘤和多發性骨髓瘤相關骨病症。
  89. 根據請求項84所述的方法，其特徵在於，所述軟骨疾病包括軟骨瘤病、軟骨發育不良、軟骨發育不全、骨骺發育不良、軟骨營養不良性肌強直、皮質旁軟骨瘤、膝關節軟骨撕裂、骨纖維發育不良、骨關節炎、成骨不全、低磷酸鹽性佝僂病或骨軟骨營養不良。
  90. 根據請求項84所述的方法，其特徵在於，所述肌肉相關疾病是指肌肉減少症和癌症相關的肌肉減少症。
  91. 一種促進個體骨骼或關節手術後癒合的方法，包括向個體施用有效量的請求項1-76中任一項所述的抗硬骨抑素構建體和/或請求項77或78所述的藥物組合物。
  92. 根據請求項83-91中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗硬骨抑素構建體通過皮下注射、靜脈注射、肌內注射、口服或腸外給藥的方式施用到所述個體中。
  93. 根據請求項83-92中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括施用第二種藥物或療法。
  94. 根據請求項93所述的方法，其特徵在於，所述第二種藥物或療法包括抗DKK1抗體。
  95. 根據請求項93的方法，其特徵在於，所述第二種藥物或療法包括抗RANKL抗體。
  96. 根據請求項93所述的方法，其特徵在於，所述第二種藥物或療法包含藥劑，選自甲狀旁腺激素（PTH）、選擇性雌激素受體調節劑（SERM）、雙膦酸鹽、前列腺素E（PGE）受體激動劑、VEGF、TGFβ、生長因數（肌生長抑制素）和降鈣素中的一種。
  97. 根據請求項83-96中任一項所述的方法，其特徵在於，所述個體是指人。
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