CN115261449A - 全自动一体化超多重基因检测方法及试剂卡盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全自动一体化超多重基因检测方法及试剂卡盒，通过在试剂卡盒内设置裂解腔、清洗腔、第一轮扩增腔、多个第二轮扩增腔、多个隔离腔和微流控结构，在隔离腔内设置固相或液相的疏水物质，从而将试剂卡盒内的裂解液、清洗液、反应液隔离；将样品放入裂解液中混匀裂解,并利用纳米磁珠对样品中的核酸进行提取，利用外部磁体带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入清洗腔清洗，外部磁体继续带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入第一轮扩增腔进行第一次基因扩增，通过微流控结构将包含第一次扩增产物注入到第二轮扩增腔内进行第二次基因扩增，通过外部光学设备检测第二轮扩增腔内的扩增过程，从而实现全自动一体化超多重基因检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及一种全自动一体化超多重基因检测方法及试剂卡盒。
背景技术
磁珠法核酸提取原理是依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多个领域。
核酸扩增检测技术是通过为核酸片段提供体外扩增的条件，使之成指数大量扩增并在核酸扩增过程中加入荧光染料或荧光标记物，采用光学装置检测出荧光信号的强弱，通过对荧光信号的处理分析得出核酸扩增结果的过程。
多重PCR(multiplex PCR, mPCR)顾名思义，是在一个反应体系中进行两种及以上PCR片段特异性扩增的技术，由Chambehian于1988年提出，其反应原理、操作过程及仪器均与常规PCR相同，优势在于可以对不同的模板实现一次性同时扩增，检测通量有所提升，同时在引入定量内参的情况下，还可指征模板的数量情况。
现有的多重PCR技术从核酸提取到扩增检测中间包含裂解、清洗、洗脱、扩增等步骤，必须要求在标准实验室中分步进行，整个过程容易对样本核酸造成污染，操作难度大，对操作人员要求高。
此外伴随着测序技术，尤其是NGS技术的发展，对PCR产物进行高灵敏度及高分辨率的检测成为了可能，因此多重PCR可同步扩增的片段数量上限演变为多重PCR自身体系的限制。传统仅仅进行4-5重，至多30重的PCR反应体系。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种全自动一体化超多重基因检测方法及试剂卡盒，可实现从核酸的提取、清洗、洗脱、一次扩增、二次扩增检测全部自动完成，极大地简化了核酸从提取到扩增检测的操作难度，其中二次扩增可以在数十个第二轮扩增腔内进行，每个二次扩增反应体系可以进行多种基因片段特异性扩增，可以实现数百重的基因检测。
本发明的技术方案：全自动一体化超多重基因检测方法，通过在试剂卡盒内设置裂解腔、清洗腔、第一轮扩增腔、多个第二轮扩增腔、多个隔离腔和微流控结构，在隔离腔内设置固相或液相的疏水物质，从而将试剂卡盒内的裂解液、清洗液、反应液隔离；将样品放入裂解液中混匀裂解 ,并利用纳米磁珠对样品中的核酸进行提取，利用外部磁体带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入清洗腔清洗，外部磁体继续带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入第一轮扩增腔进行第一次基因扩增，通过微流控结构将包含第一次扩增产物的反应液注入到第二轮扩增腔内进行第二次基因扩增，其中每个第二轮扩增腔内封装不同的反应体系，每个反应体系进行多种基因片段特异性扩增，通过外部光学设备检测每个第二轮扩增腔内的扩增过程，从而实现全自动一体化超多重基因检测。
前述的全自动一体化超多重基因检测方法中，所述微流控结构包括一条或多条反应液注入通道、柱塞管体和磁性柱塞。
前述的全自动一体化超多重基因检测方法中，所述第一次基因扩增和第二次基因扩增反应所需生物试剂通过疏水物质密封保存，在扩增过程中通过高温融化疏水物质释放生物试剂。
全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，包括主管体、多个环形分布的管槽、柱塞管体、磁性柱塞；所述主管体内设置有裂解腔、第一隔离腔、清洗腔、第二隔离腔和第一轮扩增腔；所述磁性柱塞设置在柱塞管体内部；所述多个环形分布的管槽通过反应液注入通道连接。
前述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒中，所述柱塞管体的两端设置有反应液出口和隔离液入口。
前述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒中，所述第一隔离腔的顶部设置有隔离液注入口；所述清洗腔的顶部设置有清洗液注入口和排气口；所述第二隔离腔的顶部设置有第二隔离液注入口；所述第一轮扩增腔的顶部设置有反应液注入口。
前述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒中，所述反应液注入通道的两端与柱塞管体的反应液出口和隔离液入口连接。
前述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒中，所述裂解腔、第一隔离腔、清洗腔、第二隔离腔和第一轮扩增腔之间设置有磁珠通道。
与现有技术相比，本发明的增益效果为：本发明实现从核酸的提取、清洗、洗脱、一次扩增、二次扩增检测全部自动完成，极大地简化了核酸从提取到扩增检测的操作难度，其中二次扩增可以在数十个第二轮扩增腔内进行，每个二次反应体系可以进行多种基因片段特异性扩增，可以实现数百重的基因检测。
附图说明
图1为本发明的内部立体视图。
图2为本发明的剖视图。
图3为图2中A-A向的剖视图。
图4为图2中B-B向的剖视图。
附图中的标记为：1-主管体，2-管槽，3-柱塞管体，4-磁性柱塞，5-裂解腔，6-第一隔离腔，7-清洗腔，8-第二隔离腔，9-第一轮扩增腔，10-反应液注入通道，11-隔离液注入口，12-清洗液注入口，13-排气口，14-第二隔离液注入口，15-反应液注入口，16-反应液出口，17-隔离液入口，18-磁珠通道。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，将本发明的技术实施方案清楚、完整地描述。
实施例。全自动一体化超多重基因检测方法，通过在试剂卡盒内设置裂解腔、清洗腔、第一轮扩增腔、多个个第二轮扩增腔、多个隔离腔和微流控结构，在隔离腔内设置固相或液相的疏水物质，从而将试剂卡盒内的裂解液、清洗液、反应液隔离；将样品放入裂解液中混匀裂解 ,并利用纳米磁珠对样品中的核酸进行提取，利用外部磁体带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入清洗腔清洗，外部磁体继续带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入第一轮扩增腔进行第一次基因扩增，通过微流控结构将包含第一次扩增产物的反应液注入到第二轮扩增腔内进行第二次基因扩增，其中每个第二轮扩增腔内封装不同的反应体系，每个反应体系进行多种基因片段特异性扩增，通过外部光学设备检测每个第二轮扩增腔内的扩增过程，从而实现全自动一体化超多重基因检测。
所述微流控结构包括一条或多条反应液注入通道、柱塞管体和磁性柱塞。
所述第一次基因扩增和第二次基因扩增反应所需生物试剂通过疏水物质密封保存，在扩增过程中通过高温融化疏水物质释放生物试剂。
全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，如图1,2所示，包括：
主管体1、24个环形分布的管槽2、柱塞管体3、磁性柱塞4；所述主管体1内设置有裂解腔5、第一隔离腔6、清洗腔7、第二隔离腔8和第一轮扩增腔9；所述磁性柱塞4设置在柱塞管体3内部；所述24个环形分布的管槽2通过反应液注入通道10连接。
如图2所示，所述柱塞管体3的两端设置有反应液出口16和隔离液入口17。
如图3所示，所述第一隔离腔6的顶部设置有隔离液注入口11；所述清洗腔7的顶部设置有清洗液注入口12和排气口13；所述第二隔离腔8的顶部设置有第二隔离液注入口14；所述第一轮扩增腔9的顶部设置有反应液注入口15。
前如图4所示，所述反应液注入通道10的两端与柱塞管体3的反应液出口16和隔离液入口17连接。
如图3所示，所述裂解腔5、第一隔离腔6、清洗腔7、第二隔离腔8和第一轮扩增腔9之间设置有磁珠通道18。
本发明的试剂封装过程：
将24个不同的第二次基因扩增反应体系封装在24个环形分布的管槽2内，每个反应体系可以进行5中不同基因片段特异性扩增，用石蜡封装好反应所需生物试剂分别包埋至24个管槽2内。
用隔离液填充反应液注入通道10。
将第一次基因扩增反应体系封装进第一轮扩增腔9内，同时用石蜡包埋好反应所需生物试剂，用石蜡密封反应液注入口15。
将磁性柱塞4装入柱塞管体3。
将隔离液通过隔离液注入口11注入到第一隔离腔6，用石蜡密封隔离液注入口11；将隔离液通过第二隔离液注入口14注入第二隔离腔8，用石蜡密封第二隔离液注入口14。
将清洗液通过清洗液注入口12注入清洗腔7，内部空气通过排气口13排出。
最后将裂解液装入裂解腔5。
本发明的检测过程：将样本和纳米磁珠放入裂解液中混匀裂解，纳米磁珠对样品中的核酸进行提取，利用外部磁体带动纳米磁珠携带核酸通过第一隔离腔6进入清洗腔7清洗，外部磁体继续带动纳米磁珠携带核酸通过第二隔离腔8进入第一轮扩增腔9，外部温控装置对第一轮扩增腔9进行加热，石蜡受热融化并释放生物试剂进行第一次基因扩增，磁性柱塞4在外部磁场的作用下在柱塞管体3内移动，将包含第一次扩增产物的反应液通过反应液出口16注入到反应液注入通道10，将反应液注入通道10内的隔离液通过隔离液入口17抽出到柱塞管体3内，外部温控装置对24个环形分布的管槽2加热，石蜡受热融化并释放生物试剂进行第二次基因扩增，通过外部光学设备检测每个第二轮扩增腔内的扩增过程，其中24个环形分布的管槽2内封装了24种不同的反应体系，每个反应体系可以进行5中不同基因片段特异性扩增，从而实现全自动一体化超多重检测。
Claims (8)
1.全自动一体化超多重基因检测方法，其特征在于：通过在试剂卡盒内设置裂解腔、清洗腔、第一轮扩增腔、多个第二轮扩增腔、多个隔离腔和微流控结构，在隔离腔内设置固相或液相的疏水物质，从而将试剂卡盒内的裂解液、清洗液、反应液隔离；将样品放入裂解液中混匀裂解 ,并利用纳米磁珠对样品中的核酸进行提取，利用外部磁体带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入清洗腔清洗，外部磁体继续带动纳米磁珠携带核酸通过隔离腔进入第一轮扩增腔进行第一次基因扩增，通过微流控结构将包含第一次扩增产物的反应液注入到第二轮扩增腔内进行第二次基因扩增，其中每个第二轮扩增腔内封装不同的反应体系，每个反应体系进行多种基因片段特异性扩增，通过外部光学设备检测每个第二轮扩增腔内的扩增过程，从而实现全自动一体化超多重基因检测。
2.如权利要求1所述的全自动一体化超多重基因检测方法，其特征在于：所述微流控结构包括一条或多条反应液注入通道、柱塞管体和磁性柱塞。
3.如权利要求1所述的全自动一体化超多重基因检测方法，其特征在于：所述第一次基因扩增和第二次基因扩增反应所需生物试剂通过疏水物质密封保存，在扩增过程中通过高温融化疏水物质释放生物试剂。
4.实现权利要求1至3任意一项所述的全自动一体化超多重基因检测方法的试剂卡盒，其特征在于：包括主管体（1）、多个环形分布的管槽（2）、柱塞管体（3）、磁性柱塞（4）；所述主管体（1）内设置有裂解腔（5）、第一隔离腔（6）、清洗腔（7）、第二隔离腔（8）和第一轮扩增腔（9）；所述磁性柱塞（4）设置在柱塞管体（3）内部；所述多个环形分布的管槽（2）通过反应液注入通道（10）连接。
5.如权利要求4所述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，其特征在于：所述柱塞管体（3）的两端设置有反应液出口（16）和隔离液入口（17）。
6.如权利要求4所述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，其特征在于：所述第一隔离腔（6）的顶部设置有隔离液注入口（11）；所述清洗腔（7）的顶部设置有清洗液注入口（12）和排气口（13）；所述第二隔离腔（8）的顶部设置有第二隔离液注入口（14）；所述第一轮扩增腔（9）的顶部设置有反应液注入口（15）。
7.如权利要求4所述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，其特征在于：所述反应液注入通道（10）的两端与柱塞管体（3）的反应液出口（16）和隔离液入口（17）连接。
8.如权利要求4所述的全自动一体化超多重基因检测试剂卡盒，其特征在于：所述裂解腔（5）、第一隔离腔（6）、清洗腔（7）、第二隔离腔（8）和第一轮扩增腔（9）之间设置有磁珠通道（18）。
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