CN115261297B - 大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4‑二羟基苯乙醇的方法，大肠杆菌重组菌共表达四种酶，分别为酪氨酸酶、L‑氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶；利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4‑二羟基苯乙醇。本发明以酪氨酸为底物，酪氨酸廉价易得，且大多数为生物基来源，不依赖于石化产品，属于可再生资源，此外，由于它的天然属性，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域领域，具体而言，涉及一种大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法。
背景技术
3,4-二羟基苯乙醇，又名羟基酪醇，分子式C8H10O3，是天然多酚类化合物，主要来源于橄榄树及其叶子，具有很强的抗氧化性。有研究表明3,4-二羟基苯乙醇可以减缓皮肤衰老，提高机体免疫能力，恢复人体肺腑器官的健康状态；另外，3,4-二羟基苯乙醇在抗菌，抗病毒，抑制癌症发生等方面也有一定的积极作用。因此，3,4-二羟基苯乙醇的制备与生产具有一定的使用价值与经济效益。
3,4-二羟基苯乙醇制备的方法目前有植物提取、化学合成以及生物合成。3,4-二羟基苯乙醇的植物提取方法主要是从橄榄树或叶片中萃取出来。萃取过程中需要用到乙醇、正丁醇、石油醚等易燃易爆的有机试剂，并且收率很低，同时伴随着大量副产物的产生，导致3,4-二羟基苯乙醇纯度偏低；3,4-二羟基苯乙醇的化学合成方法主要是用化学原材料在有机溶剂中反应获得，例如，许超等公开了3,4-二羟基苯乙醇的合成方法，报道了以邻苯二酚为原料，经过保护邻二酚羟基，溴化制得3,4-亚甲二氧基溴苯,制备其格氏试剂,再用格氏试剂与环氧乙烷反应,最后脱掉保护基团，以5步反应总收率24％得到高纯度3,4-二羟基苯乙醇，但最终收率仍比较低，且成本比较高；3,4-二羟基苯乙醇的生物合成方法主要是利用重组大肠杆菌或基因组改造的酵母菌代谢合成3,4-二羟基苯乙醇，例如，中国专利CN114350717A公开的一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法，其中报道了利用诱导后产酶的重组大肠杆菌，以对羟基苯乙醇为底物生物合成3,4-二羟基苯乙醇的方法，3,4-二羟基苯乙醇产量达到13g/L，对羟基苯乙醇价格较为昂贵，限制其工业化生产；此外，对羟基苯乙醇来源于石化产品，相对于可再生的生物基材质，其在食品、保健品、化妆品等高端应用场景有一定的使用局限性。
综上，利用生物合成技术合成3,4-二羟基苯乙醇可以大量减少有机溶剂的使用，以及减小对环境的损害，但现有生物合成方法以来源于石化产品的对羟基苯乙醇为底物，使得产品3,4-二羟基苯乙醇在食品、保健品、化妆品等高端应用场景的应用有所局限，所以开发一种在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受的3,4-二羟基苯乙醇的加工方法、或可应用在该方法中的工程菌尤其必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法。能够以生物基来源的酪氨酸为底物生产3,4-二羟基苯乙醇，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受。
第一方面，本发明提供一种大肠杆菌重组菌，该菌同时共表达四种酶，分别为酪氨酸酶、L-氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
在可选的实施方式中，采用pETDuet-1和pCDFduet-1双质粒共表达四基因：pETduet-1装载酪氨酸酶和L-氨基酸氧化酶，pCDFduet-1装载酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因。
第二方面，本发明提供一种利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4-二羟基苯乙醇。
在可选的实施方式中，向培养基中加入大肠杆菌重组菌种子液，和IPTG，然后添加底物酪氨酸和碳源，发酵得到3,4-二羟基苯乙醇；所述酪氨酸的添加总量为10-50g/L，酪氨酸添加速率为1-10g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和碳源的添加速率比为0.5-3；
优选地，IPTG添加终浓度为0.4-0.6mM，碳源为葡萄糖。
优选地，所述底物酪氨酸添加总量为25-30g/L，底物酪氨酸添加速率为3-5g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1-1.2。
在可选的实施方式中，发酵过程中发酵液温度为25-32℃、pH为5.5-7.5，添加IPTG时发酵液中菌体OD600nm≥10。
在可选的实施方式中，发酵过程中发酵液温度为28-30℃、pH值为6.5～7.0。
在可选的实施方式中，当培养基中菌体OD600nm<10时，使培养基在35-40℃、pH6.5-7.5条件下培养大肠杆菌重组菌至菌体OD600nm≥10，然后向其中添加IPTG。
在可选的实施方式中，培养基包括蛋白胨10-15g/L、酵母粉20-25g/L、甘油9-11g/L、磷酸二氢钾2-2.5g/L、磷酸氢二钾12-13g/L和维生素C4.5-5.5g/L。
在可选的实施方式中，培养基是将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合灭菌后加入维生素C，并调节至pH6.5-7.5得到。
在可选的实施方式中，选择氨水调节至培养基pH6.5-7.5。
在可选的实施方式中，所述大肠杆菌重组菌种子液是将大肠杆菌重组菌置于培养液中，并于35-40℃、pH6.5-7.5培养8-16h得到，所述培养液包括蛋白胨8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，NaCl9-11g/L，甘油4-6g/L。
本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例发酵过程中所用的底物为酪氨酸，酪氨酸廉价易得，且大多数为生物基来源，不依赖于石化产品，属于可再生资源，此外，由于它的天然属性，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的3,4-二羟基苯乙醇生物合成路线图；
图2为本发明的酪氨酸的标准曲线图；
图3为本发明的3,4-二羟基苯乙醇标准曲线图；
图4为本发明的3,4-二羟基苯丙酮酸标准曲线图；
图5为本发明实施例8获得的发酵液的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例中的特征可以相互结合。
本发明实施例一方面提供一种大肠杆菌重组菌，该菌同时共表达四种酶，分别为酪氨酸酶、L-氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
本发明实施例的大肠杆菌可以应用于3,4-二羟基苯乙醇的合成，尤其是应用于高纯度、高产量的3,4-二羟基苯乙醇的合成，发酵合成3,4-二羟基苯乙醇的机理如图1所示，具体为：在大肠杆菌体内酪氨酸酶将酪氨酸转化为左旋多巴，L-氨基酸氧化酶将左旋多巴氧化为3,4-二羟基苯丙酮酸，酮酸脱羧酶将3,4-二羟基苯丙酮酸脱羧为3,4-二羟基苯乙醛，醇脱氢酶将3,4-二羟基苯乙醛还原为3,4-二羟基苯乙醇。
进一步地，采用pETDuet-1和pCDFduet-1双质粒共表达四基因：pETduet-1装载酪氨酸酶和L-氨基酸氧化酶，pCDFduet-1装载酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因。
本发明实施例另一方面提供一种利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4-二羟基苯乙醇。
进一步地，向培养基中加入大肠杆菌重组菌种子液，和IPTG，然后添加底物酪氨酸和碳源，发酵得到3,4-二羟基苯乙醇；所述酪氨酸的添加总量为10-50g/L，酪氨酸添加速率为1-10g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和碳源的添加速率比为0.5-3；
优选地，IPTG添加终浓度为0.4-0.6mM，碳源为葡萄糖。
优选地，所述底物酪氨酸添加总量为25-30g/L，底物酪氨酸添加速率为3-5g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1-1.2。
在大肠杆菌体内通过多酶催化将酪氨酸转化为3,4-二羟基苯乙醇，反应过程中需要大量的辅酶参与反应，高浓度葡萄糖条件下，大量的辅酶用于菌体的自身代谢生长，用于3,4-二羟基苯乙醇生产的辅酶极少，3,4-二羟基苯乙醇的产量很低，中间产物积累；而极低葡萄糖条件下，菌体的代谢基本停滞，不能够进行菌体内辅酶的再生循环，由于缺少辅酶，3,4-二羟基苯乙醇的产量也很低，同时会中间产物积累。此外，通过控制酪氨酸的流加，可以减少中间产物的积累，提高菌体的活性，有利于3,4-二羟基苯乙醇的积累。通过控制酪氨酸和葡萄糖的比例及流加的速度，抑制发酵液中的副产物产生得到高纯度、高产量3,4-二羟基苯乙醇发酵液，可用于大规模工业化生产。
发酵过程中所用的底物为酪氨酸，酪氨酸廉价易得，且大多数为生物基来源，不依赖于石化产品，属于可再生资源，此外，由于它的天然属性，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受。
具体的，碳源可以选择蔗糖、果糖、葡萄糖等，优选的为葡萄糖。
具体的，上述酪氨酸的添加总量指每升培养基中酪氨酸的添加总量；酪氨酸添加速率指每小时每升培养基中酪氨酸的添加量。
进一步地，底物酪氨酸添加总量为25-30g/L，底物酪氨酸添加速率为3-5g/(L*h)，按重量计酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1-1.2。
具体的，本实施例中的酪氨酸和葡萄糖可以配置成混合液加入，也可以分别加入，加入方式优选的将酪氨酸和葡萄糖溶液以稳定速率泵入培养基中，以保持培养基中酪氨酸和葡萄糖含量的稳定。
进一步地，发酵过程中发酵液温度为25-32℃、pH为5.5-7.5，添加IPTG时发酵液中菌体OD600nm≥10。
进一步地，发酵过程中发酵液温度为28-30℃、pH值为6.5～7.0。
进一步地，当培养基中菌体OD600nm<10时，使培养基在35-40℃、pH6.5-7.5条件下培养大肠杆菌重组菌至菌体OD600nm≥10，然后向其中添加IPTG。
进一步地，培养基包括蛋白胨10-15g/L、酵母粉20-25g/L、甘油9-11g/L、磷酸二氢钾2-2.5g/L、磷酸氢二钾12-13g/L和维生素C4.5-5.5g/L。
进一步地，培养基是将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合灭菌后加入维生素C，并调节至pH6.5-7.5得到。
进一步地，选择氨水调节至培养基pH6.5-7.5。
进一步地，所述大肠杆菌重组菌种子液是将大肠杆菌重组菌置于培养液中，并于35-40℃、pH6.5-7.5培养8-16h得到，所述培养液包括蛋白胨8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，NaCl9-11g/L，甘油4-6g/L。
为了实现上述目的，以下结合实施案例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明采用如下具体实施方式：通过控制酪氨酸和葡萄糖的比例，及流加的速度，获得高纯度、高产量的3,4-二羟基苯乙醇的发酵方法，具体包括以下步骤：
1、本发明所涉及的菌株及质粒购自Novagen公司的pETduet-1质粒、pCDFduet-1质粒、EscherichiacoliBL21(DE3)、EscherichiacoliTOP10。
2、重组大肠杆菌基因工程菌的构建：本发明采用pETDuet-1和pCDFduet-1双质粒共表达四基因，pETduet-1装载酪氨酸酶基因(Streptomyces glaucescens SCO2700)和L-氨基酸氧化酶基因(Proteus mirabilis ATCC29906)，pCDFduet-1装载酮酸脱羧酶基因(Lactococcus lactis ATCC 19435)和醇脱氢酶基因(Saccharomyces cerevisiaeS288C)。将两种质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))，利用氨苄青霉素(Ampicillin)以及硫酸链霉素(Streptomycin)平板筛选阳性克隆，即获得重组大肠杆菌。
3、将重组大肠杆菌置于LBG培养基中，该LBG培养液包括蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，甘油5g，纯水定容至1.0L，在37℃、pH7.0的条件下进行过夜培养，得到重组大肠杆菌种子液。
4、向改良的TB培养基(12g/L蛋白胨、24g/L酵母粉、10g/L甘油、2.31g/L磷酸二氢钾、12.54g/L磷酸氢二钾121℃灭菌后加入5g/L过滤除菌的维生素C，用氨水调pH＝7.0)中加入重组大肠杆菌种子液，培养重组大肠杆菌，培养温度37℃，培养pH＝7.0，当菌体OD600nm＝10时，加入终浓度为0.5mM IPTG，得到发酵液，下述实施案例均是在该发酵液的基础上进行的,具体的，本申请发酵液所用培养基、培养液和培养参数还可以如表1。
表1发酵液所用培养基、培养液和培养参数
具体的可以降低发酵液温度至25-32℃，pH控制在5.5-7.5，并开始流加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液；在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为0.5-3，酪氨酸添加总量为10-50g/L，酪氨酸流加速率控制在1-10g/(L*h)。
5、采用HPLC检测分析发酵液中的酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产物以及利用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中残糖量。
实施案例1
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为10g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例2
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为50g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例3
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在1g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例4
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在10g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例5
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为0.5，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例6
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为3，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例7
(1)诱导温度控制在35℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例8
(1)诱导温度控制在20℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。发酵液的高效液相色谱图见图5。
实施案例9
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在5.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例10
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在8.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例11
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例12
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为28g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例13
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为25g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例14
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在3g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例15
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在5g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例16
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例17
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例18
(1)诱导温度控制在28℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例19
(1)诱导温度控制在28℃，pH控制在7.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例20
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在7.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例21
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在3g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例22
(1)诱导温度控制在28℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在3g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例23
(1)诱导温度控制在28℃，pH控制在7.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在4g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例24
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在7.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在5g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例25
(1)诱导温度控制在28℃，pH控制在7.0，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1，酪氨酸添加总量为30g/L，酪氨酸流加速率控制在3g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例26
(1)诱导温度控制在30℃，pH控制在6.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为28g/L，酪氨酸流加速率控制在5g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
实施案例27
(1)诱导温度控制在25℃，pH控制在5.5，并开始投加底物酪氨酸以及葡萄糖的混合液。
(2)在混合液中酪氨酸与葡萄糖总量比例为1.2，酪氨酸添加总量为28g/L，酪氨酸流加速率控制在5g/(L*h)。
(3)当底物流加结束后，继续发酵至3,4-二羟基苯乙醇产量不再变化，用HPLC检测底物酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯乙醇产量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量。用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中剩余糖浓度。
测定例
(1)酪氨酸的标准曲线绘制
称取酪氨酸标准样0.1g，移至50mL容量瓶中，用8％稀盐酸溶解定容，后取0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL分别移至5个10mL容量瓶中，用8％稀盐酸定容，分别获得浓度为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1g/L，分别通过HPLC进行检测，色谱条件：色谱柱为C18，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，流动相A：流动相B(v:v)＝40：60，流速：1mL/L，柱温：30℃，波长：276nm，进样体积：10μL，保留时间：11min，酪氨酸出峰时间约为3min，以浓度(g/L)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制酪氨酸标准曲线，结果如图2所示，y＝3×107x+1633.7，R2＝0.9999(R2是线性拟合常数)。
(2)3,4-二羟基苯乙醇的标椎曲线绘制
称取3,4-二羟基苯乙醇标准样0.1g，移至50mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，取0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL分别移至6个10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分别获得浓度为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1g/L的标准样品，分别通过HPLC进行检测，色谱条件与本测定例中上述(1)中的色谱条件一致，3,4-二羟基苯乙醇出峰时间约为4.8min，以浓度(g/L)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制3,4-二羟基苯乙醇标准曲线，结果如图3所示，y＝1×107x-260094，R2＝0.9999(R2是线性拟合常数)。
(3)3,4-二羟基苯丙酮酸的标椎曲线绘制
称取3,4-二羟基苯丙酮酸标准样0.1g，移至50mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，取0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL分别移至6个10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分别获得浓度为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1g/L的标准样品，分别通过HPLC进行检测，色谱条件与本测定例中上述(1)中的色谱条件一致，3,4-二羟基苯丙酮酸出峰时间约为3.8min，以浓度(g/L)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制3,4-二羟基苯丙酮酸标准曲线，结果如图4所示，y＝1×107x-338428，R2＝0.9999(R2是线性拟合常数)。
(4)实施案例1至实施案例27发酵液中残糖量的测定
分别取2mL实施案例1至实施案例27获得的发酵液，离心后，取1mL上清液分别移至27个50ml容量瓶中，用水稀释定容，再经SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中残糖量。
(5)实施案例1至实施案例27发酵液中3,4-二羟基苯乙醇、酪氨酸、3,4-二羟基苯丙酮酸浓度的测定分别取2mL实施案例1至实施案例27获得的发酵液，加入2mL8％盐酸充分混匀，离心后，取2mL上清液分别移至27个30ml容量瓶中，用水稀释定容，再经HPLC检测分析，色谱条件与本测定例中上述(1)中的色谱条件一致，酪氨酸出峰时间约为3min，3,4-二羟基苯丙酮酸出峰时间约为3.8min，3,4-二羟基苯乙醇出峰时间约为4.8min，色谱图如图5所示，且该图5是实施案例8获得的发酵液的色谱图。
表2所示的3,4-二羟基苯乙醇的产量、酪氨酸剩余量、3,4-二羟基苯丙酮酸剩余量都是根据相对应的标准曲线获得；酪氨酸利用率＝(3,4-二羟基苯乙醇产量*酪氨酸相对分子质量)/(酪氨酸添加量*3,4-二羟基苯乙醇相对分子质量)。
(6)实施案例1至实施案例27发酵过程中，L-氨基酸氧化酶以及醇脱氢酶酶活极高，它们相对应的底物不会积累，在高效液相色谱中不会显示出相对应的峰。因此，发酵过程中不再考虑中间产物左旋多巴以及3,4-二羟基苯乙醛的积累。
表2实施例1-27相关数据汇总表
本发明以酪氨酸为底物，在发酵过程中控制酪氨酸以及葡萄糖流加速率，发酵温度以及发酵pH，3,4-二羟基苯乙醇最终产量达到25g/L以上，酪氨酸利用率达到99％以上；底物酪氨酸廉价易得，且大多数为生物基来源，不依赖于石化产品，属于可再生资源，此外，由于它的天然属性，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受；本发明通过控制酪氨酸和葡萄糖的比例及流加的速度，抑制发酵液中的副产物产生，获得高纯度、高产量的3,4-二羟基苯乙醇发酵液，减少后端的纯化成本，同时最终发酵液中残糖量小于0.1g/L，节约发酵成本，避免资源浪费，可应用于大规模工业化生产，满足市场需求。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4-二羟基苯乙醇，包括以下步骤：
向培养基中加入大肠杆菌重组菌种子液和IPTG，然后添加酪氨酸和碳源，所述碳源为葡萄糖，发酵得到3,4-二羟基苯乙醇；
其中，所述酪氨酸添加总量为25-30g/L，酪氨酸添加速率为3-5g/（L*h），按重量计所述酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1-1.2，发酵过程中发酵液温度为28-30℃、pH值为6.5～7.0；所述大肠杆菌重组菌共表达四种酶，分别为酪氨酸酶、L-氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，其中，采用pETDuet-1和pCDFduet-1双质粒共表达四基因，pETduet-1装载来自Streptomyces glaucescens 的酪氨酸酶基因SCO2700和来自Proteus mirabilisATCC29906的L-氨基酸氧化酶基因，pCDFduet-1装载来自Lactococcus lactis ATCC 19435的酮酸脱羧酶基因和来自Saccharomyces cerevisiae S288C的醇脱氢酶基因，将两种质粒转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，利用氨苄青霉素以及硫酸链霉素平板筛选阳性克隆，即获得重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，IPTG添加终浓度为0.4-0.6mM。
3.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，添加IPTG时发酵液中菌体OD600nm≥10。
4.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，当培养基中菌体OD600nm<10时，使培养基在35-40℃、pH6.5-7.5条件下培养大肠杆菌重组菌至菌体OD600nm≥10，然后向其中添加IPTG。
5.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述培养基包括蛋白胨10-15g/L、酵母粉20-25g/L、甘油9-11g/L、磷酸二氢钾2-2.5g/L、磷酸氢二钾12-13g/L和维生素C 4.5-5.5g/L。
6.根据权利要求5所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述培养基是将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合灭菌后加入维生素C，并调节至pH6.5-7.5得到。
7.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌种子液是将大肠杆菌重组菌置于培养液中，并于35-40℃、pH6.5-7.5培养8-16h得到，所述培养液包括蛋白胨8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，NaCl 9-11g/L，甘油4-6g/L。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Application of bacterial tyrosinases in organic synthesis;Mayowa Agunbiade 等;World Journal of Microbiology and Biotechnology;第38卷(第2期);1-19 * |
| 基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化;范代娣 等;西北大学学报（自然科学版）;第32卷(第1期);33-35 * |
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