CN115261290B - 一种具有免疫调节功能的戊糖片球菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种戊糖片球菌免冠株（MIANGUAN），所述菌株的保藏号为CGMCC NO.24491，保藏日期为2022年03月09日，保藏分类命名为戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的菌株可显著提高新冠病毒血清结合抗体滴度，延长保护时间。本发明还提供了所述菌株在制备疫苗免疫增强剂中的应用。

Description

一种具有免疫调节功能的戊糖片球菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种戊糖片球菌保藏菌株及应用，属于微生物和疫苗领域。
背景技术
新冠病毒传播力强、传播范围广、传染途径多，新变种不断出现，全球保持国际开放的国家和地区都难以幸免，截止2022年5月8日，WHO报告的全球新冠确诊病例有5.14亿，死亡病例超过6百万。疫苗虽然是控制新冠病毒传播的有力武器，全球在研的新冠病毒疫苗超百种，但病毒变异不断出现新的变种，疫苗研发相对滞后，不能完全依赖接种疫苗来防控新变种病毒的流行。评价新冠病毒自然感染或疫苗接种后获得的免疫保护效力，多用中和抗体作参考指标。健康人接种SARS-CoV-2疫苗或感染SARS-CoV-2后，通常第1-2周后抗体水平开始显著升高，第31-40天抗体水平达到峰值，产生的血清中和抗体可维持数月，然后开始下降，这可能会影响疫苗的免疫保护效果，因此有必要提高SARS-CoV-2疫苗接种者的抗体水平和抗感染细胞免疫功能，提高宿主的抗感染免疫力。
免疫菌（immunobiotics）是2003年日本学者首次提出，指通过激活人体黏膜免疫而发挥免疫调节作用的细菌。免疫菌作用于肠道黏膜免疫系统的抗原递呈细胞，引起多种T细胞和B细胞激活和增殖，刺激产生的细胞因子或抗体经淋巴和血液循环到达呼吸道，影响呼吸道黏膜的抗病毒免疫应答，发挥抗呼吸道微生物感染的作用。这种通过肠道和肺部之间的双向调节是谓肠-肺轴。免疫菌的功能具有菌株特异性，同菌种的所有菌株都具有类似的免疫调节功能，需要菌株特异性地进行评价。有些免疫菌具有佐剂样作用，能够刺激增强某些细菌性疫苗，或者某些病毒疫苗，产生的特异性抗体水平，增强免疫保护作用。如鼠李糖乳杆菌GG株和轮状病毒疫苗联合免疫，可使猪的特异性抗体水平提高。研究也发现植物乳杆菌冠克株与SARS-CoV-2疫苗联合免疫小鼠，可能通过增强干扰素途径和抑制炎症反应和凋亡途径增强和延长小鼠黏膜以及系统免疫应答，促进SARS-CoV-2特异性免疫反应应答（CN113308396A）。在西班牙的一项随机、双盲、安慰剂对照的人体试验表明，接种了三价流感疫苗的60名65-85岁的住院志愿者，在口服含有植物乳杆菌的脱脂奶粉3个月后，可使流感特异性IgA和IgG抗体水平升高。一项随机、双盲、安慰剂对照的包括50名志愿者的人体临床试验表明，口服发酵乳杆菌（ Lactobacillus fermentum CECT5716）可增强抗流感疫苗的免疫应答，并可通过增强辅助性T细胞I型应答和病毒中和抗体，增强机体对感染的保护作用。
鉴于免疫菌有可能成为应对COVID-19的新武器，解决目前新冠病毒变种流行，疫苗保护力迅速下降的问题，本发明目的就是提供一株免疫菌，与SARS-CoV-2疫苗联合应用时增强和延长粘膜和获得性免疫应答，从而提高SARS-CoV-2疫苗的效力，单独使用也可发挥非特异性的抗新冠病毒免疫调节，起到抗感染作用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种戊糖片球菌菌株MIANGUAN株（以下简称PPM株），所述菌株的保藏号为CGMCC NO.24491，保藏日期为2022年03月09日，保藏分类命名为戊糖片球菌 Pediococcuspentosaceus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述菌株分离自健康人粪便标本，属于国家卫生健康委员会颁布的“可用于食品的菌种名单”。
其次，本发明还提供了上述菌株在制备疫苗免疫增强剂中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述疫苗为重组质粒疫苗、重组腺病毒载体疫苗或者细胞载体疫苗。
在一个更为优选的实施方案中，所述疫苗为新型冠状病毒腺病毒载体疫苗。
更为优选地，新型冠状病毒腺病毒载体疫苗携带新冠病毒S蛋白受体结合域RBD的编码基因。
最后，本发明还提供了含有上述的菌株组合物，所述组合物还含有疫苗。
在一个优选的实施方案中，所述疫苗为重组质粒疫苗、重组腺病毒载体疫苗或者细胞载体疫苗。
在一个更为优选的实施方案中，所述疫苗为所述疫苗为新型冠状病毒腺病毒载体疫苗。
更为优选地，所述新型冠状病毒疫苗携带新冠病毒S蛋白受体结合域RBD的编码基因。
尤为优选地，所述组合物被制备为注射剂、胶囊、冻干粉、喷雾剂、悬液或者片剂。
本发明是从健康人粪便中分离纯化得到具有免疫增强作用的戊糖片球菌益生菌PPM株。实验证明分离得到的戊糖片球菌对动物无害，且经动物实验确证具有增强接种新冠病毒疫苗个体血清特异性结合抗体的滴度。所述戊糖片球菌免冠能够有效维持接种后小鼠的血清中结合抗体水平滴度，显示出在制备新冠疫苗免疫增强制剂中的优异应用前景。
附图说明
图1显示口服PMM可显著增强ICR新冠疫苗免疫小鼠血清中抗RBD IgG抗体滴度。横坐标为时间点（天），纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p<0.05；
图2显示口服PPM对ICR新冠疫苗免疫小鼠BAL中抗RBD IgG抗体滴度无显著影响。横坐标为时间点（天），纵坐标为结合抗体的滴度，NS表示无统计学显著差异；
图3显示口服PPM对ICR新冠疫苗免疫小鼠血清中中和抗体滴度无显著影响。横坐标为时间点（天），纵坐标为结合抗体的滴度，NS表示无统计学显著差异；
图4显示口服PPM可不显著升高ICR新冠疫苗免疫小鼠BAL中中和抗体滴度。横坐标为时间点（天），纵坐标为中和抗体滴度，*表示p<0.05；
图5显示口服PPM可显著增加ICR新冠疫苗免疫小鼠RBD特异性T细胞反应。横坐标为时间点（天），纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量；*表示p<0.05；
图6显示口服PPM可显著增强ICR新冠疫苗免疫小鼠血清中抗RBD IgG1抗体滴度。横坐标为时间点（天），纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p<0.05；
图7显示口服PPM对ICR新冠疫苗免疫小鼠血清中抗RBD IgG2a抗体滴度无显著影响。坐标为时间点（天），纵坐标为结合抗体的滴度，NS表示无统计学显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1 PPM株的分离、保藏和鉴定
1. PPM菌株的分离
1）从保菌管中取出人粪便来源的粪便标本100 μL，加入到预装900 μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，粪便标本浓度稀释至10-6倍；
2）取不同稀释度的样品100 μL涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；
3）在37℃，0.5% CO2环境中培养48 h；
4）取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48 h，连续转接3次，将纯化菌株在pH=3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。
2. 菌种保藏
本实验室用含25%甘油的培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：
1）将容量为2 mL的保菌管经121℃，15 min高压灭菌处理后以备使用；
2）细菌在固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入1.5 mL的无菌保菌液；
3）用L棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中；
4）将菌液转移到保菌管中，混匀后于-80℃保藏。
3. 菌落外观和菌体形态观察
戊糖片球菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧条件下，戊糖片球菌亦可生长，菌落颜色多为乳白色。镜下观察戊糖片球菌为革兰染色阳性球菌等。
4. 细菌总DNA的提取
将单个菌落接种于BHI（含5%脱纤维羊血）培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(Promega）说明书操作，提取DNA。
5. 通过与模式株比较ANI和DDH准确鉴别菌株
提取该菌株的基因组，经草图测序，通过与模式株比较，进行基因组相关性分析（基因组杂交（digital DNA-DNA hybridization,dDDH; dDDH＜70 %）和平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity, ANI;ANI＜95 %））进一步准确鉴别菌株。两种方法为判定原核生物物种的金标准，均在线完成（dDDH, http://ggdc.dsmz.de; ANI, http://enve-omics.ce. gatech.edu/ani/）。
（1）基因组提取与草图送测
基因组的提取方法在原始试剂盒（Wizard® Genomic DNA Purification Kit，Promega）说明的基础上稍做了修改，具体如下：
1)刮取菌体纯培养物于1.5 mL的EP管中（内含1 mL细胞裂解液），吹吸混匀，置于4℃冰箱静置过夜使细胞壁裂解充分，16000 rpm离心5 min，弃上清；
2)吸取500 µL的EDTA（50 mM）于上述EP管中，将菌体吹打混匀；
3)吸取100 µL的溶菌酶于上述EP管中，上下颠倒混匀置于37 ºC的金属浴中，放置60-90 min，16000 rpm离心5 min，弃上清；
4)吸取600 µL核酸裂解液于EP管中，吹打至垂悬，将EP管置于80 ºC的金属浴中，放置10-15 min，冷却至室温；
5)吸取3 µL的RNase（RNA酶）于上述EP管中，上下翻转混匀后将其置于37 ºC金属浴中放置60-90 min，16000 rpm离心5 min，弃上清；
6)加入200 µL蛋白沉淀液，高速混悬30 s，冰浴30 min，16000 rpm离心70 min；
7)将上清（务必清亮） 移至新的 EP 管中，做好标记，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒直至形成絮状沉淀，静置15 min，16000 rpm离心10 min，弃上清；
8)吸取600 µL的dH2O于EP管中，加入150 µL中酚（取液面以下），摇匀混悬，16000rpm离心5 min；
9)将上清吸取至新的EP管中，做好标记，加入150 µL氯仿，摇匀混悬， 16000rpm，离心5 min；
10)将上清吸取至新的EP管中，做好标记，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠（3 M），-80 ºC 冻存过夜；
11)将EP管取出，室温放置半小时，16000 rpm离心5 min，弃上清；
12)用70 %的乙醇清洗两次，晾干，加入100 µL的dH2O；
13)冷链运输至北京诺禾致源科技股份有限公司完成基因组的草图测序。
（2）基因组相关性分析
1）基因组基本特征
草图结果显示，PPM株的基因组大小为1768036 bp，GC含量为37.24%。
2）dDDH与ANI
选择戊糖片球菌的模式株 PediococcuspentosaceusATCC 33316株与PPM株进行dDDH和ANI比较。结果显示，模式菌株ATCC 33316株与PPM株之间的dDDH与ANI值分别为91.70%和98.99%，支持这两个菌株为同一个细菌种。
该菌株的保藏信息为：菌株保藏号为CGMCC NO. 24491，保藏日期为2022年03月09日，保藏分类命名为戊糖片球菌  Pediococcuspentosaceus （本发明中称为MIANGUAN株，简称PPM株），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
 实施例2 戊糖片球菌MIANGUAN株对新冠疫苗免疫小鼠的抗体滴度及T细胞应答的影响
1. 样品：活化培养的PPM株对数生长期菌液。
2. 实验动物：
6-8周龄雌性ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司的ICR雌性SPF级小鼠，体重范围18-22g。许可证号为SCXK（京）2064-0006。饲养地点为中国疾病预防控制中心新址实验动物楼，级别为屏障环境，许可证号SYXK(京)2017-0021。维持饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证号SCXK（京）2014-0010。根据实验要求，实验分为对照组和益生菌组，每组各5只小鼠。小鼠适应一周后，用新冠疫苗AdC68-Delta-S对小鼠右后肢进行肌肉注射免疫，4周后加强免疫一次。免疫加强前，给予抗生素预处理小鼠的肠道菌群，3天后换正常饮用水，给予免疫加强。并每日经口灌胃给予5×109CFU益生菌，连续灌胃三天进行免疫调节。
3.菌株给予方式与剂量：
小鼠适应饲养5日后，用新冠疫苗AdC68-Delta-S对小鼠右后肢进行肌肉注射免疫（5×1010VP, 100μL/只），4周后加强免疫一次。加免前对小鼠进行抗生素处理以清除肠道菌群和定植抗性。抗生素共5种（万古霉素；庆大霉素、氨苄、甲硝唑和两性霉素B）。其中，万古霉素（0.5 g/L）、庆大霉素（0.5 g/L）和氨苄（1 g/L）自由饮水；甲硝唑（8g/L）和两性霉素B（0.1 g/L）灌胃处理（200 μL /只）。连续处理3天。每天采集粪便样本，500μLPBS重悬后接种于BHI血板分别置于厌氧和需氧条件下培养48 h，评估抗生素处理情况。
4.小鼠免疫方式和免疫原的选择：
对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射。
免疫原选择重组腺病毒载体疫苗：AdC68-Delta-S黑猩猩腺病毒载体（由复旦大学上海市公共卫生临床中心赠予）AdC68是一种线性DNA病毒，基因组大小26-45 kb，相比于其他腺病毒（如Ad5和Ad26）而言，其在人群中预存免疫低，会避免载体自身带来的疫苗效果削弱，同时黑猩猩腺病毒的Hexon与凝血因子X结合后不稳定，不在肝脏富集，更为安全。我们以黑猩猩腺病毒AdC68为载体，携带含有新冠病毒受体结合域（RBD）的免疫原RHAF（Genebank: NC_045512.2，Genebank: AGI60292.1，Genebank: M97164.1），构成了AdC68-Delta-S新冠疫苗。5E10 vp /只小鼠，100 μL(肌肉注射)。
5.样本采集：加强免疫同时给与益生菌后的第七天和第十四天处死小鼠。采集血清、支气管肺泡灌洗液、脾细胞、肺组织和肠系膜淋巴结、纵隔淋巴结、回肠、结肠、肺。
（1）血样采集
眼球取血。剪掉小鼠胡须，避免溶血；采用弯镊迅速拔掉小鼠眼球，用EP管收集小鼠全血。采集完成后，37℃水浴1 h，3500 rpm离心10 min，分装血清，做好标记后-80℃保存。注意采集过程避免溶血，避免反复冻融。
（2）脾细胞分离
取血结束后，脱臼处死小鼠。无菌取出小鼠脾组织。放入加有5 mL完全RPIM1640培养基的小平皿中用孔径为70 μm孔径的过滤筛进行研磨。加入4 mL 1640培养基研磨后，4℃，1700 rpm离心5 min；去除上清，加入3 mL红细胞裂解液，室温条件下处理5~10 min；加入4 mL 1640培养基终止裂解，4℃，1700 rpm离心5 min；去除上清，加入含有1% 双抗的Hank液3 mL, 4℃，1000 rpm离心5 min; 循环一次；去除上清，加入3 mL 1640培养基重悬，4℃，1000 rpm离心5 min；去除上清，加入含有10% 血清的1640培养基重悬。若来不及实验，则用冻存液（90% 胎牛血清+10% DMSO）进行梯度冻存。
（3）支气管肺泡灌洗液采集
分离小鼠喉部组织，暴露小鼠支气管，采用手术剪剪开支气管，移液枪吸取500 μL无菌PBS后缓慢冲洗肺部组织，尽可能回收液体；收取结束后，重新吸取1000 μL无菌PBS继续冲洗一次。冲洗结束后，2000 rpm离心，保留上清后，-80℃分装保存；细胞采用含10%FBS的1640培养基重悬，再次离心后收集，梯度冻存（方法同脾细胞）。
6.样本检测方法：
（1）ELSIA检测结合抗体
1）用4℃预冷的ELISA包被液稀释检测的抗原蛋白(S1，购自北京义翘神州科技有限公司；RBD，购自上海近岸生物科技有限公司)，至终浓度为1 μg/mL。在ELISA板的每孔加入100 μL包被抗原溶液，4℃过夜；
2）第二天，取出ELISA板，弃掉包被液，用0.05%的PBST缓冲液洗板3次，每次220 μL；
3）洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200 μL ELISA封闭液(0.5%脱脂奶粉，PBST溶解)进行封闭，室温封闭2 h；
4）封闭结束后，用0.05%的PBST洗板3次，每次220 μL；
5）对于血清或者血浆，用ELISA样品稀释液(0.5%脱脂奶粉，PBST溶解)稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置空白孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100 μL，室温孵育3 h；
6）样品孵育结束后，继续用PBST洗板5次，每次220 μL；
7）用ELISA封闭液(0.5%脱脂奶粉，PBST溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2305)，每孔加入100 μL，室温孵育1-1.5 h；
8）二抗孵育结束后，用0.05%的PBST洗板5次，每次220 μL；
9）用TMB Substrate Reagent Set试剂盒进行显色。A液和B液1：1混合后，取100μL加入每孔，避光反应5min；
10）显色结束后，用50 μL 2 nM H2SO4进行终止，在酶标仪上读取OD450-OD630值；
11）以最后一个稀释度OD450大于2倍的(negative mean + SD)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。
（2）293T-ACE2细胞检测中和抗体：
1）取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(CC)(150 μL)，第二列设置病毒对照(VC)(100 μL)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100 μL。
2）除细胞对照组外，每孔加50 μL SARS-CoV-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200 TCID50。
3）轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5% CO2孵育1 h。
4）当孵育时间至20 min时，开始准备293T-hACE2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至105个细胞/mL。
5）当孵育时间至1 h，向96孔透明底黑板中每孔加100 μL靶细胞，使每孔细胞为104个。
6）前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5% CO2培养48 h。
7）培养48 h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100 μL PBS清洗一遍，吸去PBS，每孔加入50 μL 1×的裂解缓冲液(购自Promega公司 Cat#E153A)，室温在水平摇床上孵育30 min使细胞充分裂解；
8）加30 μL荧光素酶的底物(购自Promega公司，Cat#E1501)于96孔黑板中，用仪器GloMax® 96微孔板发光检测仪检测荧光素酶活性。
9）导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用Graphpad Prism5.0软件计算ID50。
。
（3） ELISPOT检测T细胞应答：
实验操作按照Mouse IFN-γ/Monkey IFN-γ说明书进行。
1)用纯化IFN-γ抗体包被试剂盒(购自BD，货号551083)提供的Millipore板，比例1：250，4℃过夜包被；
2) 甩掉板中的包被抗体溶液，用200 μL RPMI 1640完全培养基洗板一遍，随后用200 μL RPMI 1640完全培养基封闭液封闭Millipore板，室温孵育2 h；
3)弃掉孔板中的封闭液，根据不同的实验设计，在Millipore板中加入刺激肽库(苏州强耀生物科技有限公司合成单肽，每条单肽15个氨基酸，覆盖RBD序列，共65条单肽，每个肽库5条单肽，共13个肽库，50 μL/孔，每条肽的浓度为5 μg/mL。在阴性对照孔加入50μL RPMI 1640完全培养基；阳性对照孔中加入50 μL佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA，购自Sigma，货号FXP012)(终浓度100ng/mL)和离子霉素(Ionomycin，终浓度2 μg/mL)的RPMI1640完全培养基；
4)对小鼠脾细胞进行计数，将细胞调整为4×106个细胞/mL，每孔加入50 μL细胞，最终使每孔的细胞数为2×105个细胞。将Millipore板放入湿盒，在37℃ 5% CO2培养箱中孵育20-22 h，期间切勿摇动板子，以免造成细胞的偏移；
5)培养孵育结束后，从培养箱中取出Millipore板，将板中的液体弃掉，用预冷的去离子水洗两遍，每次220 μL，每次清洗孵育3 min；
6)用0.05%的PBST (PBS+0.05% Tween-20)洗板3次，每次200 μL；
7)用10%FBS的PBS抗体稀释液稀释生物素化检测抗体(Biotinylated Detectionantibody，比例1：200)，每孔加入100 μL，室温孵育2 h；
8)孵育结束后，再用0.05%的PBST洗板3次，每次220 μL；
9)将链霉亲和素-HRP偶联抗体用抗体稀释液进行稀释(比例1：100)，每孔加入100μL，室温孵育1 h；
10)孵育结束后，用0.05%的PBST洗板4次，每次220 μL；
11)再用PBS清洗板子2次，每次220 μL；
12)准备底物溶液(1 mL的底物缓冲液加1滴底物溶液)，每孔加入100 μL底物溶液。反应5-60 min，孵育时间根据斑点形成的情况而定；
13)用去离子水冲洗终止反应，室温晾干后进行计数；
14)利用ChampSpot III型酶联斑点图像分析仪进行斑点形成细胞SFC(spotforming cell，SFC)的计数以及QC。
7.统计分析方法：
所有数据的统计分析均使用GraphPad Prism 5。数据以均数±标准差(SD)表示。各组间差异采用单因素方差分析和t检验，不符合正态分布的数据做对数转换或进行非参分析。
8. 结果
为观察新冠疫苗接种同时给予小鼠戊糖片球菌MIANGUAN株灌胃，对于疫苗引起的T细胞应答和抗体水平是否有提升。我们采用6-8周龄雌性ICR小鼠，重组腺病毒载体AdC68-Delta-S新冠疫苗肌肉注射进行初次免疫，4周后采用同疫苗肌肉注射加强免疫一次。加免前三天给予抗生素预处理。加免后当天灌胃戊糖片球菌MIANGUAN株，并进行持续3天的免疫调节，每次每只小鼠给予5×109CFU戊糖片球菌。灌胃后第7和第14天处死小鼠，采集血、肺灌洗液细胞及脾细胞，血清、肺泡灌洗液分别进行结合抗体及中和抗体的检测，脾细胞进行T细胞应答的检测。
（1）本实施例分为两个组，分别为加免后连续3天灌胃戊糖片球菌MIANGUAN组（PPM实验组）和加免后连续三天灌胃PBS组（对照组）。结果显示实验组小鼠在经MIANGUAN干预7天后小鼠血清中抗新冠病毒RBD IgG结合抗体的滴度较对照组显著增高。实验组小鼠第7天血清中抗RBD IgG结合抗体滴度是2.0 ×106，显著高于对照组的抗体滴度0.78×106，两组小鼠的血清抗RBD IgG结合抗体水平在益生菌干预之前的基线值接近均为0.20 ×106（图1）。PPM干预7天和14天后对免疫小鼠肺泡灌洗液（BAL）中抗RBD IgG结合抗体的滴度无显著影响（图2）。另外，PPM干预7天后小鼠血清中抗新冠病毒RBD IgG1亚型的滴度（1.2 ×106）显著高于PBS组小鼠（0.3 ×106）（p<0.05），第14天部分小鼠有类似趋势，由于组内个体差异无统计学差异（图6）。PPM干预7天和14天后小鼠血清中抗新冠病毒RBD IgG2亚型的滴度虽然均显著高于基线水平，但实验组和对照组两组之间无显著差异（图7），表明PPM干预对抗新冠病毒RBD IgG2亚型无显著影响。
（2）PPM株干预7天后小鼠血清中抗新冠病毒假病毒的中和抗体的滴度无显著影响（图3）。但疫苗加强和PPM干预7天后，小鼠BAL中抗新冠中和抗体的滴度的均值（282）有高于PBS组的抗体滴度均值（180）的趋势（p<0.1），益生菌干预后14天的中和抗体和第7天有类似的趋势（p=0.15）（图4）。这说明PPM能够增强血清和肺局部的抗体水平。
（3）我们利用脾细胞检测免疫小鼠对RBD特异肽段刺激产生的T细胞应答能力，结果发现PPM株灌胃组脾细胞T细胞应答在第7天产IFN个的细胞数（~6586）显著高于PBS组（1291）（p<0.05），到第14 天两组小鼠产IFN个的细胞数均降低，益生菌灌胃组14天的数值与PBS组7天的数值接近 (图5）。
上述实验数据显示，经口给予PPM株，可提高抗新冠病毒的结合抗体IgG滴度（提高1.28倍）、以及抗新冠的特异性T细胞应答（提高5.1倍），延长抗体与T细胞保护时间至少两周，对新冠感染的防治有重要意义。
9.小结
连续经口给予PPM株3天。与对照组相比，经口给与PPM株，可提高抗新冠病毒的结合抗体滴度、以及抗新冠的特异性T细胞应答，延长抗体与T细胞保护时间，对新冠感染的防治有重要意义。

Claims (6)

1.一种戊糖片球菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.24491，保藏日期为2022年03月09日，保藏分类命名为戊糖片球菌 Pediococcuspentosaceus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的菌株在制备疫苗增强剂中的应用，其特征在于，所述疫苗为新型冠状病毒腺病毒载体疫苗。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒腺病毒载体疫苗携带新冠病毒S蛋白受体结合域RBD的编码基因。
4.一种含有权利要求1所述戊糖片球菌菌株的组合物，其特征在于，所述组合物还含有疫苗，所述疫苗为新型冠状病毒腺病毒载体疫苗。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述新型冠状病毒腺病毒载体疫苗携带新冠病毒S蛋白受体结合域RBD的编码基因。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备为注射剂、胶囊、冻干粉、喷雾剂、悬液或者片剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050130288A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-16 Eromlife Co., Ltd. Novel microorganism Pediococcus pentosaceus EROM101, having immune enhancement, anticancer and antimicrobial activities
JP3970249B2 (ja) * 2004-02-04 2007-09-05 エロムライフ株式会社 ペディオコッカスペントサセウスｅｒｏｍ１０１と、それを含有する免疫増強用組成物と抗癌用組成物、抗菌用組成物、整腸用組成物、生菌剤用組成物、飼料用組成物、食品添加用組成物、発酵製品並びにそれらの培養方法と微生物生長をコントロールする方法
JP2007308419A (ja) * 2006-05-18 2007-11-29 Shinshu Univ 腸管免疫活性化剤及びＩｇＡ抗体産生促進剤、並びにこれらが含まれた食品、動物飼料及び医薬品
CN103540545B (zh) * 2013-09-28 2015-02-25 浙江大学 一种戊糖片球菌及其应用
CN107802831B (zh) * 2016-09-08 2020-12-01 潍坊华英生物科技有限公司 一种灭活乳酸菌疫苗佐剂
WO2019174002A1 (zh) * 2018-03-15 2019-09-19 江南大学 戊糖片球菌ccfm1012、其发酵食品及其在制备拮抗空肠弯曲杆菌感染药物中的应用
CN116615212A (zh) * 2020-11-12 2023-08-18 生物合成公司 合生素组合物
CN113308396B (zh) * 2021-05-18 2023-03-21 上海市公共卫生临床中心 一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用
CN113388551B (zh) * 2021-07-16 2023-05-05 新希望六和股份有限公司 一株戊糖片球菌NHB-PpA9601及应用
CN114470187B (zh) * 2022-01-30 2023-03-17 山东农业大学 静脉注射用药物组合物、含其制剂及其制备方法和应用

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