CN115260370A - 一种活体检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明制备了一种生物相容性高、毒性低、亲水性好、水分散性好、荧光稳定性强的活体检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球。本发明选用氧化石墨烯量子点（o‑CQDs），通过微乳液聚合的方法嵌入到聚苯乙烯（PS）微球中，即o‑CQDs@PS（CPS）。CPS具有抗干扰、低毒性和体内荧光跟踪，对环境中共存金属离子（Fe3+，K+，Ba2+，Zn2+，Mg2+，Ca2+，Na+）表现出良好的抗干扰性。CPS并不增加聚苯乙烯微球的毒性且通过荧光示踪证明了聚苯乙烯能够进入丰年虾体内。因此，标准尺寸的CPS适合于在生物体内活体示踪和定量检测。
Description
技术领域
本发明属于微塑料检测应用技术领域，具体涉及一种生物相容性高、毒性低、亲水性好、水分散性好、荧光稳定性强的活体示踪和检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球制备方法。
背景技术
微塑料存在于世界各地的环境以及食品和饮用水中，这引起了人们对其对生态系统和人类健康影响的担忧。MPs被定义为几微米到5毫米的微小塑料颗粒。2020年全球塑料年产量达到3.67亿吨，其中10%最终进入海洋，占所有海洋废物的60%至80%。微塑料已遍布全球海洋、沉积物和生物体，很容易被海洋生物误食，其潜在的危害效应可以沿着食物链运输和积累，从而破坏生态系统或影响微生物、鱼类甚至人类健康。
聚苯乙烯塑料是世界上生产最多的塑料之一，用于食品储存、一次性刀具和工业包装，由于其重复使用率低，难降解，更普遍存在于水环境中，从而增加其生态污染风险。荧光示踪是研究PS颗粒在水体及食物链生物体中行为的有效手段，合成适用于活体检测的低毒、荧光性强的聚苯乙烯微球，可为PS在水环境迁移转化研究提供技术基础。基于染料的荧光标记是常用且主要使用的方法，但这些染料有毒，在使用过程中容易释放，带来生物毒性，可能会诱发假阳性，荧光检测前应去除生物组织，均属于非活体追踪。这种非活体追踪无法研究微塑料通过同一生物体或食物链的摄取、同化和排泄过程，难以满足对海洋生物的长期和短期影响、代内和代间传递影响之间的差异研究。
与基于重金属的量子点和有机染料的荧光指示剂相比，碳基光致发光量子点，包括氧化石墨烯量子点（o-CQDs），具有低毒性和更好的生物相容性的优点。o-CQD因其低毒、高生物相容性、良好的水分散性和强荧光稳定性而嵌入PS中。通过优化水溶性引发剂的类型和数量来控制CPS的尺寸，测试了CPS的抗干扰性能和毒性，揭示了常见金属离子共存对CPS荧光强度的影响。
发明内容
本发明制备了一种生物相容性高、毒性低、亲水性好、水分散性好、荧光稳定性强的活体示踪和检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球。
本发明的技术方案如下：
1、一种生物相容性高、毒性低、亲水性好、水分散性好、荧光稳定性强的活体示踪和检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球，其特征在于：包括如下步骤：
（1）三硝基芘（TNP）的合成
量取60 mL浓硝酸和20 mL的浓硫酸，加入盛有0.5~2 g芘的圆底烧瓶中，在40~80℃条件下油浴，待反应完成后将至室温，用超纯水稀释后进行减压抽滤，获得金黄色成品，置于60 ℃条件下的电热恒温鼓风干燥箱中干燥。
（2）氧化石墨烯量子（o-CQDs）的合成
将0.1 g TNP超声分散于甲苯之中，获得均匀的悬浮液后移至含聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜，在100~180 ℃条件下反应，待反应完成自然冷却后得到红褐色的氧化墨烯量子点（o-CQDs），用有机滤膜过滤，过滤完成后将滤液旋蒸，待溶剂蒸发后得到固体氧化石墨烯量子点（o-CQDs）。
（3）o-CQDs包埋式聚苯乙烯荧光微球（CPS）合成
0.06 g的o-CQDs溶解于15 mL St配制成C1溶液，取2 mL的C1溶液同3 mLSt混合成C2液，3 mL的C1同2 mL St混合配制成C3液，反应温度控制在40~80 ℃中反应。其中H2O为50mL，NaHCO3为0.12 g，APS为0.05~0.50 g，o-CQDs和St总量为5.00 mL，MMA为0.50 mL。
所述步骤（1）中60 mL浓硝酸和20 mL的浓硫酸，加入0.5~2 g芘，在40~80 ℃条件下油浴。
所述步骤（2）中0.1 g TNP超声分散于甲苯之中，在含聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜内于100~180 ℃条件下反应。
所述步骤（3）中0.06 g的o-CQDs溶解于15 mL St配制成C1溶液，取2 mL的C1溶液同3 mL St混合成 C2液，3 mL的C1同2 mL St混合配制成C3液，反应温度控制在40~80 ℃中反应。其中H2O为50 mL，NaHCO3为0.12 g，APS为0.05~0.50 g，o-CQDs和St总量为5.00 mL，MMA为0.50 mL。
所述活体检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球选用氧化石墨烯量子点（o-CQDs），通过微乳液聚合的方法嵌入到PS微球中。
附图说明
图1（a）和（b）为本发明实施例1中尚未反应完全的o-CQDs聚苯乙烯的HRTEM；（c-f）为反应完成后CPS的HRTEM。
图2（a-c）为本发明实施例1中CPS微球直径分别为200、150、100 nm的粒径和粒径分布图。（a）和（b）为加入不同量引发剂合成的 CPS；（c）为高浓度o-CQDs（C3液）合成的CPS。
图3（a）为本发明实施例1中200 nm CPS浓度在0.4~1.6 mg/mL范围内的荧光线性关系图；（b）为不同离子对200 nm CPS荧光强度的影响；（c）为o-CQDs和CPS在Fe3+浓度为0 ~10 mol/L时的荧光变化。
图4（a-c）为本发明实施例1中小球藻的叶绿素含量分别在200 nm、150 nm、100 nm不同CPS微球浓度条件下四天生长变化；（d-f）为丰年虾分别在200 nm、150 nm、100 nm不同CPS微球浓度条件下的存活率。
图5为本发明实施例1中摄食CPS后的丰年虾共焦激光扫描显微镜拍摄图；（a1，b1）为暗场图像；（a2，b2）为亮场图像；（a3，b3）为差分干涉对比图像。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：
1、红色荧光聚苯乙烯微球（CPS）的合成过程
CPS的合成过程如图1a和1b所示。可以观察到CPS的球形已经形成，此外，CPS微球的表面被图1b中的量子点包裹，其中量子点的0.344 nm晶格间距符合o-CQDs（002）晶格间距，量子点的尺寸约为3.74 nm。o-CQDs被来自单体液滴溶液的聚合物结合，导致单体溶液相的o-CQDs含量越来越少，最后形成一种特殊结构，微球的中心是o-CQDs，表面是PS，如图1c所示。可以推测CPS微球合成过程中的两个主要因素。一方面，这种结构的形成可能是因为o-CQDs C sp2亲脂性杂化和苯乙烯单体苯环疏水性结构引起π-π亲和力，使得o-CQDs可以附着在聚合物表面。另一方面，随着聚合过程的进展，被o-CQDs聚合物包裹的表面被新聚合物更新，导致聚合物表面和单体相的新分布。深入观察图1d，对于多次分布，单体相中o-CQD的含量越来越少，直到可以忽略，并且在反应完成后获得表面清洁的CPS微球，而没有多余的o-CQD附着在微球表面。
2、红色荧光聚苯乙烯微球（CPS）的粒径控制
通过添加不同量的过硫酸铵，制备了不同粒径的CPS微球。合成CPS微球的直径分布小于200 nm（图2）。随着过硫酸铵含量的增加，CPS颗粒的平均直径从200 nm减小到150nm（图2a和2b）。o-CQDs在苯乙烯中的分散浓度从C2增加到C3，微球也减少到100 nm。过硫酸铵的用量会引起聚合物表面能的变化。在反应开始时，过硫酸铵的增加会带来更多的初级自由基，从而形成更多的小PS颗粒。在适当的浓度下，小颗粒不会聚集在一起，因此产生的颗粒越多，得到的微球就越小。
3、红色荧光聚苯乙烯微球（CPS）对环境中离子的抗干扰性
环境中可能存在的离子对CPS的荧光影响。制备一系列CoCl2、BaCl2、ZnSO4、Al（NO3）3、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、CoCl2、NaCl溶液，与3 mg/mL 200 nm CPS溶液（HCl调节pH约3）混合，以测定荧光变化。虽然Co2+干扰CPS，但浓度为0.05M的Co2+并没有完全熄灭CPS的荧光。CPS对Fe2+、Fe3+、K+、Ba2+、Al3+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和Na+表现出良好的抗干扰性（图3b）。如图3a所示，这是200 nm大小的CPS球体水分散体的荧光线性曲线。荧光强度随浓度的增加呈良好的线性关系，而且随着Fe3+离子浓度从0增加到10 mmol/L，o-CQDs荧光减弱，相反，CPS微球在水分散体中的荧光具有相对稳定性。这可能是因为CPS有一层聚苯乙烯层作为阻挡Fe3+离子渗透的屏障，从而避免了Fe3+与o-CQDs接触导致o-CQDs荧光猝灭。
4、本实施例的具体检测方法如下：
（1）采用BG11培养基培养小球藻，培养箱的光照强度为100 μmol光子m-2 s-1，昼夜比为14 h:10 h，温度为25℃，每天摇匀三次。每天监测叶绿素a浓度和光合产量（Fv/Fm），以评估CPS对海洋浮游植物生长和光合作用的毒性。丰年虾在室温下用托盘孵化30小时。在孔板上选择30只虾，在不同浓度的三种粒径CPS微球（CPS微球浓度分别为（0、005、0.25、10mg/L）的投喂条件下进行研究。通过计算每种浓度下30小时后的丰年虾存活率，研究了CPS微球对丰年虾毒性。
每组进行了三个平行实验。在不同浓度CPS（0、005、0.25、10 mg/L）的情况下，监测蛋白核小球藻4天的叶绿素生长变化。与对照组相比，发现CPS微球对小球藻叶绿素生长没有影响（图4a、图4b和图4c）。由结果如图4（d-f）可以看到，丰年虾的存活率在96%以上，这表明不同浓度的三种粒径CPS（0、005、0.25、10 mg/L）对丰年虾的存活没有影响。通过以上讨论，200 nm、150 nm、100 nm的CPS微球对小球藻和丰年虾的正常生长没有影响，即合成的CPS微球是低毒的（如图4）。
（2）用不同浓度（0、005、0.25、10 mg/L）的CPS微球培养丰年虾进行标记。用激光共聚焦显微镜观察CPS微球标记丰年虾，CPS微球在丰年虾中的分布如图5所示。从图中可以看出，虾线的位置显示出稳定的红色荧光，表明CPS微球主要聚集在丰年虾的虾线位置。
Claims (6)
1.一种生物相容性高、毒性低、亲水性好、水分散性好、荧光稳定性强的活体检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球，其特征在于：包括如下步骤：
（1）三硝基芘（TNP）的合成
量取60 mL浓硝酸和20 mL的浓硫酸，加入盛有0.5~2 g芘的圆底烧瓶中，在40~80 ℃条件下油浴，待反应完成后将至室温，用超纯水稀释后进行减压抽滤，获得金黄色成品，置于60 ℃条件下的电热恒温鼓风干燥箱中干燥。
（2）氧化石墨烯量子（o-CQDs）的合成
将0.1 g TNP超声分散于甲苯之中，获得均匀的悬浮液后移至含聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜，在100~180 ℃条件下反应，待反应完成自然冷却后得到红褐色的氧化墨烯量子点（o-CQDs），用有机滤膜过滤，过滤完成后将滤液旋蒸，待溶剂蒸发后得到固体氧化石墨烯量子点（o-CQDs）。
（3）o-CQDs包埋式聚苯乙烯荧光微球（CPS）合成
0.06 g的o-CQDs溶解于15 mL 苯乙烯（St）配制成C1溶液，取2 mL的C1溶液同3 mL的St混合成 C2液，3 mL的C1同2 mL St混合配制成C3液，反应温度控制在40~80 ℃中反应。其中H2O为50 mL，NaHCO3为0.12 g，过硫酸铵（APS）为0.05~0.50 g，o-CQDs和St总量为5.00 mL，甲基丙烯酸（MMA）为0.50 mL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中60 mL浓硝酸和20 mL的浓硫酸，加入0.5~2 g芘，在40~80 ℃条件下油浴。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中0.1 g TNP超声分散于甲苯之中，在含聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜内于100~180 ℃条件下反应。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中0.06 g的o-CQDs溶解于15 mLSt配制成C1溶液，取2 mL的C1溶液同3 mL的St混合成 C2液，3 mL的C1同2 mL St混合配制成C3液，反应温度控制在40~80 ℃中反应。
5.其中H2O为50 mL，NaHCO3为0.12 g，APS为0.05~0.50 g，o-CQDs和St总量为5.00 mL，MMA为0.50 mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述活体检测生物体内聚苯乙烯的荧光微球选用氧化石墨烯量子点（o-CQDs），通过微乳液聚合的方法嵌入到PS微球中。
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