CN115260253A - 一种二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法及用途,可以简单高效的从核桃多酚粗提物中得到高纯度的单体成分glansreginin A;进一步的,本发明从细胞层面对其降脂作用进行了实验,glansreginin A具有抑制前脂肪细胞3T3‑L1增殖的作用,可用于制备减肥和/或降脂的医药和保健品、功能性食品、食品添加剂的用途,进一步提供了glansreginin A在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗肥胖症以及肥胖症引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合征等疾病的相关的医药、保健品、功能性食品、食品添加剂、特殊医学配方食品的用途。
Description
技术领域
本发明涉及Glansreginin A制备领域,具体涉及一种Glansreginin A和其制备方法及用途。
背景技术
Glansreginin A,分子式为C28H35NO13,CAS:860267-30-7,是一种二羧酸衍生物,有研究表明,对比其它坚果,该物质是核桃中特有成分,因此可能是核桃的指示性成分。通过实验表明,该物质在核桃压榨去油后核桃粕中大量存在,而现在对于核桃粕的利用较少,大部分用在饲料中,利用价值较低。
目前存在的问题在于Glansreginin A在分离上无法完全分离纯化,没有一种高效且简单的方式将单一成分进行分离,不少研究也就停留在对提取物的整体研究上,对于其中有效成分的研究较少或研究深度较浅。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于提供一种二羧酸衍生物Glansreginin A和其制备方法及用途。
为此,本发明提供了如下的技术方案:
一种二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,包括:
照高效液相色谱法,色谱柱为反相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱的条件如下:
0-2.5min:流动相A体积百分比为10%→15%;
2.5-5min:流动相A体积百分比为15%→25%;
5-8min:流动相A体积百分比为25%→28%;
8-10min:流动相A体积百分比为28%→47%;
10-12min:流动相A体积百分比为47%→90%;
12-16min:流动相A体积百分比为90%;
16-18min:流动相A体积百分比为90%→10%;
18-25min:流动相A体积百分比为10%;
色谱条件中,流速为15mL/min;和/或
色谱条件中,进样量为500-1000μL;和/或
色谱条件中,检测波长为265nm。
可选的,收集保留时间为8.42min所在色谱峰对应的流份,然后干燥。
可选的,供试品溶液为核桃多酚粗提物配制成的50-100mg/ml的溶液,离心,取上清液过滤;
可选的,过滤采用0.22μm微孔滤膜过滤。
可选的,所述核桃多酚粗提物的制备方法包括:
将核桃粕粉进行醇提,得到粗提液,过滤,干燥;
可选的,所述核桃粕粉由核桃粕粉碎,过60-80目筛得到;
可选的,所述醇提步骤中,采用的提取溶剂为甲醇溶液或乙醇溶液;
可选的,所述醇提步骤中,采用的提取溶剂为体积百分比30-60%的乙醇溶液;
可选的,所述醇提步骤中,核桃粕粉与提取溶剂按照料液比1:10-1:70混合,料液比的关系为g/mL;
可选的,所述醇提步骤中,提取条件为温度为30℃-50℃,超声功率为100-200W,提取时间为30-60分钟。
可选的,还包括对Glansreginin A纯度检测的步骤,包括:
照高效液相色谱法,色谱柱为反相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为C:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相D:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱条件如下:
0-5min:流动相D体积百分比为10%→22%;
5-10min:流动相D体积百分比为22%→23%;
10-20min:流动相D体积百分比为23%→60%;
20-21min:流动相D体积百分比为60%→90%;
21-25min:流动相D体积百分比为90%;
25-26min:流动相D体积百分比为10%;
26-30min:流动相D体积百分比为10%;
取供试品溶液,注入高效液相色谱仪,进行分离制备。
色谱条件中,流速为0.8mL/min;和/或
色谱条件中,进样量为500-1000μL;和/或
色谱条件中,检测波长为265nm。
由所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法制备得到的二羧酸衍生物Glansreginin A或其衍生物、或其药学上可接受的盐具有如下的用途:
(1)、在制备减肥和/或降脂的产品中的用途;
(2)、在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗肥胖症或肥胖症引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病或睡眠呼吸暂停综合征的产品中的用途;
(3)、在制备抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖的产品中的用途。
可选的,所述产品包括药物、食品或食品添加剂;
可选的,所述食品包括功能性食品、保健品或特殊医学用途配方食品。
一种药物制剂,包括所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法制备得到的二羧酸衍生物Glansreginin A或其衍生物、或其药学上可接受的盐。
可选的,还包括制剂允许的药物赋形剂或载体;
可选的,所述药物制剂的形式包括液体制剂和固体制剂;
可选的,所述药物制剂包括注射剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的一种二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,包括:照高效液相色谱法,色谱柱为反相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱的条件如下:0-2.5min:流动相A体积百分比为10%→15%;2.5-5min:流动相A体积百分比为15%→25%;5-8min:流动相A体积百分比为25%→28%;8-10min:流动相A体积百分比为28%→47%;10-12min:流动相A体积百分比为47%→90%;12-16min:流动相A体积百分比为90%;16-18min:流动相A体积百分比为90%→10%;18-25min:流动相A体积百分比为10%;取供试品溶液,注入高效液相色谱仪,进行分离制备;采用上述方法分离制备二羧酸衍生物Glansreginin A,可以简单高效的从二羧酸衍生物Glansreginin A粗提物中得到高纯度的单体成分glansreginin A;
进一步的,本发明从细胞层面对二羧酸衍生物glansreginin A的降脂作用进行了实验,发现二羧酸衍生物glansreginin A具有抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖的作用,可用于制备减肥和/或降脂的医药和保健品、功能性食品、特殊医学用途配方食品、食品添加剂的用途,进一步提供了glansreginin A在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗肥胖症以及肥胖症引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合征等疾病的相关的医药和保健品、功能性食品、特殊医学用途配方食品、食品添加剂的用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中粗提物的高效液相色谱图;
图2是本发明实施例1中纯化后的二羧酸衍生物Glansreginin A的高效液相色谱图;
图3是本发明实验例1中二羧酸衍生物glansreginin A对前脂肪细胞3T3-L1增殖的影响图;(图中**表示与对照组相比具有极显著差异,P<0.01);
图4是本发明实验例1中二羧酸衍生物glansreginin A对前脂肪细胞3T3-L1前脂肪细胞LDH释放率的影响图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法
本实施例提供了二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,包括如下步骤:
1、将核桃粕用中药粉碎机粉碎,过80目筛,得核桃粕粉,备用;
2、Glansreginin A粗提物的制备:
(1)按料液比1:10将核桃粕粉20g和体积百分比60%乙醇水溶液200ml混合均匀得到混合液;
(2)将步骤(1)混合液利用超声进行粗提物浸提,超声浸提时间为50min,温度为50℃,超声功率为100W,得到粗提液I;
(3)利用抽滤将步骤(2)得到粗提液I中的残渣进行分离,得到粗提液II;
(4)将步骤(3)得到的粗提液II在50℃条件下进行旋蒸浓缩,利用冷冻干燥进行冻干,得到粗提物1.5g,低温冷藏备用。
3、粗提物的纯化
(1)将上述所得的粗提物利用纯水配置成50mg/ml的溶液,8000rpm/min离心20min,取上清液,过0.22微孔滤膜。
(2)采用反相HPLC进行二羧酸衍生物glansreginin A组分纯化,色谱柱为Peptide CSHTM C18(150mm×19mm,粒径5μm),流动相为A:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,流速为15mL/min,进样量1000μL,检测波长为265nm;洗脱条件为:0-2.5min:流动相A体积百分比为10%→15%;
2.5-5min:流动相A体积百分比为15%→25%;
5-8min:流动相A体积百分比为25%→28%;
8-10min:流动相A体积百分比为28%→47%;
10-12min:流动相A体积百分比为47%→90%;
12-16min:流动相A体积百分比为90%;
16-18min:流动相A体积百分比为90%→10%;
18-25min:流动相A体积百分比为10%;取供试品溶液,注入高效液相色谱仪,进行分离制备;高效液相色谱图如图1所示,收集保留时间为8.42所在色谱峰对应的流份。
(3)将上述得到的二羧酸衍生物glansreginin A流份进行旋蒸浓缩,再进行冷冻干燥,低温冷藏备用。
(4)将步骤(3)所得纯化后物质二羧酸衍生物glansreginin A利用分析型高效液相色谱仪进行纯度检测:
分析型高效液相色谱仪所用色谱柱为Peptide CSHTM C18(4.5mm×150mm,粒径5μm),流动相为C:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相D:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流速为0.8mL/min,检测波长为265nm;洗脱条件为:0-5min:流动相D体积百分比为10%→22%;5-10min:流动相D体积百分比为22%→23%;10-20min:流动相D体积百分比为23%→60%;20-21min:流动相D体积百分比为60%→90%;21-25min:流动相D体积百分比为90%;25-26min:流动相D体积百分比为10%;26-30min:流动相D体积百分比为10%;取供试品溶液(将供试品用纯水配置成50mg/ml的溶液),注入高效液相色谱仪。
结果如图2所示,利用面积归一化计算glansreginin A的纯度大于98%。
实施例2
本实施例提供了Glansreginin A的制备方法,包括如下步骤:
1、将核桃粕用中药粉碎机粉碎,过60目筛,得核桃粕粉,备用;
2、Glansreginin A粗提物的制备:
(1)按料液比1:70将核桃粕粉20g和体积百分比30%乙醇水溶液1400ml混合均匀得到混合液;
(2)将步骤(1)混合液利用超声进行粗提物浸提,超声浸提时间为60min,温度为30℃,超声功率为200W,得到粗提液I;
(3)利用抽滤将步骤(2)得到粗提液I中的残渣进行分离,得到粗提液II;
(4)将步骤(3)得到的粗提液II在50℃条件下进行旋蒸浓缩,利用冷冻干燥进行冻干,得到粗提物,低温冷藏备用。
3、粗提物的纯化
(1)将上述所得的粗提物利用纯水配置成100mg/ml的溶液,8000rpm/min离心20min,取上清液,过0.22微孔滤膜。
(2)采用反相HPLC进行glansreginin A组分纯化,方法同实施例1,区别在于进样量为500μL。
(3)将上述得到的glansreginin A进行旋蒸浓缩,再进行冷冻干燥,低温冷藏备用。
(4)将步骤(3)所得纯化后物质glansreginin A利用分析型高效液相色谱仪进行纯度检测,方法同实施例1,区别在于将供试品用纯水配置成100mg/ml。
实施例3
本实施例提供了Glansreginin A的制备方法,包括如下步骤:
1、将核桃粕用中药粉碎机粉碎,过70目筛,得核桃粕粉,备用;
2、Glansreginin A粗提物的制备:
(1)按料液比1:40将核桃粕粉20g和体积百分比45%乙醇水溶液800ml混合均匀得到混合液;
(2)将步骤(1)混合液利用超声进行粗提物浸提,超声浸提时间为30min,温度为40℃,超声功率为150W,得到粗提液I;
(3)利用抽滤将步骤(2)得到粗提液I中的残渣进行分离,得到粗提液II;
(4)将步骤(3)得到的粗提液II在50℃条件下进行旋蒸浓缩,利用冷冻干燥进行冻干,得到粗提物,低温冷藏备用。
3、粗提物的纯化
(1)将上述所得的粗提物利用纯水配置成80mg/ml的溶液,8000rpm/min离心20min,取上清液,过0.22微孔滤膜。
(2)采用反相HPLC进行glansreginin A组分纯化,方法同实施例1,区别在于进样量为800μL。
(3)将上述得到的glansreginin A进行旋蒸浓缩,再进行冷冻干燥,低温冷藏备用。
(4)将步骤(3)所得纯化后物质glansreginin A利用分析型高效液相色谱仪进行纯度检测,方法同实施例1,区别在于将供试品用纯水配置成80mg/ml。
实验例1对前脂肪细胞3T3-L1的生长抑制
前脂肪细胞3T3-L1细胞按3000个/孔的密度接种到96孔培养板,在含有10%(V/V)小牛血清的高糖DMEM培养基37℃、5%CO2培养箱中培养,待24h细胞贴壁后,更换培养基,分组并换不同浓度含glansreginin A的DMEM完全培养液继续培养,使得glansreginin A终浓度分别达到50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml(为实验组)。以0μg/ml浓度的glansreginin A的DMEM完全培养液为对照组。空白组为加入等体积的完全培养液,不含前脂肪细胞3T3-L1细胞,不含glansreginin A。每组设6个平行复孔,分别作用24h,48h进行CCK-8比色测定活细胞增殖,检测前4h,用完全培养基配置10%(V/V)的cck-8试剂,然后弃培养液,加入100μL配置好的cck-8试剂,置于培养箱中孵育4h,于酶联检测仪450nm波长处测定各组吸光度值(OD值),并根据公式计算每组存活率。
存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100。
结果如图3所示,glansreginin A对前脂肪细胞3T3-L1有明显的增殖抑制作用,随着glansreginin A的浓度的升高(100-500μg/ml),其抑制细胞增殖的能力增强,剂量效应关系显著。
实验例2乳酸脱氢酶(LDH,lactate dehydrogenase)释放量检测
将处于对数生长期的前脂肪细胞3T3-L1以3000个/孔的密度接种于96孔板中,其中空白组不含细胞,加入等体积的完全培养液,边缘孔中加入PBS(避免边缘效应),于37℃,5%CO2恒温培养箱中静置培养。培养过夜后,弃完全培养液,药物处理组加入含不同浓度glansreginin A(使其终浓度为100、200、400、600μg/ml)的完全培养液200μl,无细胞、不含glansreginin A的空白组,未经药物处理的最大酶活性对照组(含细胞,不含glansregininA)换等体积的培养液。每个组6个复孔,于培养箱中分别培养24h和48h。在到达预定时间前1h,从培养箱中取出96孔板,未经药物处理的最大酶活性对照组加入20μl的LDH释放试剂(释放剂由碧云天乳酸脱氢酶检测试剂盒提供)。到达预定时间后,于400g离心5min。取上清120μl于一新的96孔板中,加入60μl的LDH工作液(工作液由碧云天乳酸脱氢酶检测试剂盒提供)。混匀,室温孵育30min,于酶联检测仪490nm波长处测定吸光度值(OD值)。
LDH漏出率(%)=(药物处理组OD值-空白组OD值)/(未经药物处理的细胞最大酶活性组的OD值-空白组OD值)×100%。
结果如图4显示,经glansreginin A处理后,前脂肪细胞3T3-L1的LDH释放率没有增加,反而减少了,实验结果表明glansreginin A对前脂肪细胞3T3-L1细胞的增殖抑制作用不是通过改变细胞膜通透性实现的,可以说明glansreginin A对3T3-L1前脂肪细胞生长没有毒性作用,并且说明对该细胞的抑制作用不是通过这种方式。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,其特征在于,包括:
照高效液相色谱法,色谱柱为反相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱的条件如下:
0-2.5min:流动相A体积百分比为10%→15%;
2.5-5min:流动相A体积百分比为15%→25%;
5-8min:流动相A体积百分比为25%→28%;
8-10min:流动相A体积百分比为28%→47%;
10-12min:流动相A体积百分比为47%→90%;
12-16min:流动相A体积百分比为90%;
16-18min:流动相A体积百分比为90%→10%;
18-25min:流动相A体积百分比为10%;
取供试品溶液,注入高效液相色谱仪,进行分离制备。
3.根据权利要求1-2任一项所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,其特征在于,收集保留时间为8.42min所在色谱峰对应的流份,然后干燥。
4.根据权利要求1-3任一项所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,其特征在于,供试品溶液为核桃多酚粗提物配制成的50-100mg/ml的溶液,离心,取上清液过滤;
可选的,过滤采用0.22μm微孔滤膜过滤。
可选的,所述核桃多酚粗提物的制备方法包括:
将核桃粕粉进行醇提,得到粗提液,过滤,干燥;
可选的,所述核桃粕粉由核桃粕粉碎,过60-80目筛得到;
可选的,所述醇提步骤中,采用的提取溶剂为甲醇溶液或乙醇溶液;
可选的,所述醇提步骤中,采用的提取溶剂为体积百分比30-60%的乙醇溶液;
可选的,所述醇提步骤中,核桃粕粉与提取溶剂按照料液比1:10-1:70混合,料液比的关系为g/mL;
可选的,所述醇提步骤中,提取条件为温度为30℃-50℃,超声功率为100-200W,提取时间为30-60分钟。
5.根据权利要求1-4任一项所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法,其特征在于,还包括对Glansreginin A纯度检测的步骤,包括:
照高效液相色谱法,色谱柱为反相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为C:含体积百分比0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相D:含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱条件如下:
0-5min:流动相D体积百分比为10%→22%;
5-10min:流动相D体积百分比为22%→23%;
10-20min:流动相D体积百分比为23%→60%;
20-21min:流动相D体积百分比为60%→90%;
21-25min:流动相D体积百分比为90%;
25-26min:流动相D体积百分比为10%;
26-30min:流动相D体积百分比为10%;
取供试品溶液,注入高效液相色谱仪,进行分离制备。
7.由权利要求1-6任一项所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法制备得到的二羧酸衍生物Glansreginin A或其衍生物、或其药学上可接受的盐具有如下的用途:
(1)、在制备减肥和/或降脂的产品中的用途;
(2)、在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗肥胖症或肥胖症引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病或睡眠呼吸暂停综合征的产品中的用途;
(3)、在制备抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖的产品中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于,所述产品包括药物、食品或食品添加剂;
可选的,所述食品包括功能性食品、保健品或特殊医学用途配方食品。
9.一种药物制剂,其特征在于,包括由权利要求1-6任一项所述的二羧酸衍生物Glansreginin A的制备方法制备得到的二羧酸衍生物Glansreginin A或其衍生物、或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的药物制剂,其特征在于,还包括制剂允许的药物赋形剂或载体;
可选的,所述药物制剂的形式包括液体制剂和固体制剂;
可选的,所述药物制剂包括注射剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
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