CN115260170A - 抗坏血酸多肽衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗坏血酸多肽衍生物及其制备方法和应用，涉及化妆品原料开发技术领域，抗坏血酸多肽衍生物为由通式(1)代表的化合物或其盐。本发明全新结构的抗坏血酸多肽衍生物，兼具了VC美白和肌肽抗衰的优异功效，并解决了传统VC结构的稳定性问题。细胞实验证明，化合物具有良好的生物活性，包括降低ROS，促进胶原蛋白I的产生，降低酪氨酸酶的活性和下调黑色素的分泌。在24.25μM的浓度下，EAC‑L‑肌肽可将黑色素的分泌下调27.85％，大于相同浓度下的EAC和肌肽的总和。在皮肤弹性，皮肤色调和减少皱纹方面具有理想的抗衰老作用，是一种有前途的抗衰老活性物质。

Description

抗坏血酸多肽衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化妆品原料开发技术领域，尤其是涉及一种抗坏血酸多肽衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

随着地球臭氧层不断破坏，紫外线日益强烈，人们愈发重视预防“光老化”的方法和原料。UVA被称为肌肤老化的隐形杀手，它对肌肤的伤害非常的隐蔽，没有明显的征兆，但是伤害却是不可逆的。UVA不仅能够引起黑色素沉着，让皮肤“黑化”，也会通过诱导生成ROS，造成胶原蛋白的流失，使得肌肤逐步衰老，出现皱纹、松弛和黑色暗沉等现象。因此，同时抵御黑色素沉积和真皮层细胞水平的老化是抗衰的高效途径。

L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是一种天然水溶性抗氧化剂美白，又名维生素C，被广泛应用于化妆品的抗衰老成分，然而，其对光和氧敏感，不稳定的结构限制了其在化妆品工业中的应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种抗坏血酸多肽衍生物，全新结构的抗坏血酸多肽衍生物，兼具了VC美白和肌肽抗衰的优异功效，并解决了传统VC结构的稳定性问题。

本发明的目的之二在于提供一种抗坏血酸多肽衍生物的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种抗坏血酸多肽衍生物在制备化妆品中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种包含抗坏血酸多肽衍生物作为有效成分的化妆品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗坏血酸多肽衍生物，由下列通式(1)代表的化合物或其盐：

其中，m为0且n为1，或者，m为1且n为0；

X₁、X₂独立的为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基；

Q₁、Q₂独立的为C1～C6的烷基链；

a、b、c独立的选自1-10的整数；

e为0且d为1-10的整数，或者，e为1且d为0。

进一步的，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(3)代表的化合物：

进一步的，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(4)代表的化合物：

进一步的，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(6)代表的化合物：

第二方面，本发明提供了一种上述抗坏血酸多肽衍生物的制备方法，包括：

先对具有氨基保护基团的原料A进行羧基活化，再和原料B反应，脱保护基团后得到所述抗坏血酸多肽衍生物；

其中，所述原料A为由下列通式(7)代表的化合物：

a、b独立的选自1-10的整数；

所述原料B为由下列通式(8)代表的化合物：

k选自1-10的整数；

Q为C1～C6的烷基链；

Y为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基。

进一步的，所述原料A为具有氨基保护基团的肌肽；所述原料B为3-O-乙基抗坏血酸；

所述制备方法包括以下步骤：

具有氨基保护基团的原料A先与二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应，反应结束后除去副产物，再加入原料B和缚酸剂反应，再脱保护基团，得到所述抗坏血酸多肽衍生物。

第三方面，本发明提供了一种上述抗坏血酸多肽衍生物在制备化妆品中的应用。

第四方面，本发明提供了一种包含上述抗坏血酸多肽衍生物作为有效成分的化妆品；所述抗坏血酸多肽衍生物的有效浓度为10～50ppm。

本发明提供的抗坏血酸多肽衍生物至少具有如下有益效果：

本发明将抗坏血酸类衍生物结构和多肽类结构进行偶合，经理性化分子改良修饰设计合成一种新的抗坏血酸多肽衍生物，化学结构清晰明确。

全新结构的抗坏血酸多肽衍生物结构稳定，生物安全性高，解决了传统VC结构不稳定的问题。

该类抗坏血酸类衍生物经功效评价证明了其在美白、抗衰维度的显著协同性功效。细胞实验证明，化合物具有良好的生物活性，包括降低ROS，促进胶原蛋白I的产生，降低酪氨酸酶的活性和下调黑色素的分泌。在24.25μM的浓度下，EAC-L-肌肽可将黑色素的分泌下调27.85％，大于相同浓度下的EAC和肌肽相关效果的简单叠加。在皮肤弹性，皮肤色调和减少皱纹方面具有理想的抗衰老作用，是一种有前途的抗衰老活性物质，可广泛应用于化妆品、护肤品等产品中。

此外，本申请获得的相关抗坏血酸类衍生物还具有抗糖化，抗蓝光，抗自噬等功效，并可用于各部位皮肤(手，面部，四肢，头皮等)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1的3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的合成路线图；

图2为实施例1合成的3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的HPLC谱图；

图3为实施例1合成的3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的MS谱图；

图4为实施例1合成的3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的核磁共振氢谱；

图5为实施例1合成的3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的H，H-COSY谱；

图6为试验例1SIRC刺激性试验结果图；

图7为试验例1腐蚀性鸡胚绒毛尿囊膜试验结果图；

图8为试验例2酪氨酸酶酶活试验结果图；

图9为试验例2黑色素试验结果图，其中(a)为不同原料下试验结果，(b)为不同浓度下试验结果；

图10为试验例2角质形成细胞的能量代谢能力试验结果图；

图11为试验例2氧化应激下角质层细胞抗衰修复试验结果图，其中(a)为样品细胞相对增值率结果图，(b)为样品ROS表达量结果图；

图12为试验例2永生化角质形成细胞(HaCaT)预防UVA诱导损伤试验结果图，其中(a)为样品细胞毒性检测图；(b)为预防UVA损伤后的细胞活率(CSR)；(c)为预防UVA损伤后的细胞内活性氧(ROS)表达情况；(d)为预防UVA损伤后的细胞内羟脯氨酸(HYP)表达情况；

图13为试验例2成纤维细胞I型胶原蛋白的合成试验结果图；

图14为试验例2人包皮成纤维细胞(HFF)预防UVA诱导损伤试验结果图，其中(a)为预防UVA损伤后的细胞活率(CSR)；(b)为预防UVA损伤后的细胞内活性氧(ROS)表达情况；(c)为预防UVA损伤后的细胞内羟脯氨酸(HYP)表达情况；

图15为HFF细胞在UVA诱导损伤下胶原蛋白Ⅰ含量结果图；

图16为试验例3试验组人群皮肤弹性值的结果图；

图17为试验例3试验组人群ITA皮肤色泽度的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

调节黑色素生成，胶原蛋白合成以及细胞再生活性是化妆品活性成分开发中的重要目标。水溶性抗氧化剂L-抗坏血酸(维生素C)超不稳定结构限制了其在化妆品工业中的应用。

为了解决这个问题，本发明开发了一种有效且稳定的多功能抗坏血酸多肽衍生物。在结构上，保留了高度还原的C＝C双键，同时，添加了多肽结构。这种新的抗坏血酸多肽不仅在细胞外基质增强，抗氧化和黑色素抑制等方面均表现出稳定的特性，而且与抗坏血酸和多肽相比抗衰老性显著改善。

根据本发明的第一个方面，提供了一种抗坏血酸多肽衍生物，由下列通式(1)代表的化合物或其盐：

抗坏血酸多肽衍生物是抗坏血酸和多肽有机(化学键)结合而形成的一种稳定的衍生物。

化合物盐一般指化合物的金属盐，例如钠盐、钾盐等。

通式(1)上述结构中：

(I)当m为0且n为1时，通式为：

其中，a选自1-10的整数，a为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

b选自1-10的整数，b为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

e为0且d为1-10的整数(d为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，或者，e为1且d为0；

Q₂为C1～C6的烷基链，可以为直链也可以为支链；

X₂为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基；

烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、异丙氧基、异丙烯氧基、叔丁氧基、叔丁基过氧基或丁酮肟；

烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。

卤素基包括但不限于氯基、溴基、碘基。

需要说明的是，烷基包括直链或支链的烷基。

在一种优选的实施例中，X₂为乙氧基。

作为一种优选的实施方式，(I)的所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(2)代表的化合物或其盐：

其中，R₁为C1～C6的烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)；烷基包括直链或支链的烷基。

a、b独立的为1-5的整数(a、b独立的为1、2、3、4或5)；

e为0且d为1-5的整数(d为1、2、3、4或5)，或者，e为1且d为0。

一种优选的实施例，R₁为乙基，Q₂为C2烷基链，a为2，b为1，e为1且d为0，抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(3)代表的化合物：

另一种优选的实施例，R₁为乙基，Q₂为C1烷基链，a为2，b为1，e为0且d为1，抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(4)代表的化合物：

通式(1)上述结构中：

(II)当m为1且n为0时，通式为：

其中，a选自1-10的整数，a为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

b选自1-10的整数，b为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

c选自1-10的整数，c为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

Q₁为C1～C6的烷基链，可以为直链也可以为支链；

X₁为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基；

烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、异丙氧基、异丙烯氧基、叔丁氧基、叔丁基过氧基或丁酮肟；

烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)，烷基包括直链或支链的烷基。

卤素基包括但不限于氯基、溴基、碘基。

在一种优选的实施例中，X₁为乙氧基。

作为一种优选的实施方式，(II)的所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(5)代表的化合物或其盐：

其中，R₂为C1～C6的烷基,包括但不限于甲基、乙基、甲基乙基、丙基、异丙基或丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)；

Q₁为C1～C6的烷基链；

a、b、c独立的为1-5的整数(a、b、d独立的为1、2、3、4或5)。

一种优选的实施例，Q₁为C1烷基链，R₂为乙基，a为2，b、c独立的为1，抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(6)代表的化合物：

根据本发明提供的第二个方面，提供了一种上述抗坏血酸多肽衍生物的制备方法，包括：

先对具有氨基保护基团的原料A进行羧基活化，再和原料B反应，脱保护基团后得到所述抗坏血酸多肽衍生物；

其中，原料A为由下列通式(7)代表的化合物：

p选自1-10的整数,p为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

q选自1-10的整数，q为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

原料B为由下列通式(8)代表的化合物：

k选自1-10的整数，k为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

Q为C1～C6的烷基链；

Y为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基。

烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、异丙氧基、异丙烯氧基、叔丁氧基、叔丁基过氧基或丁酮肟；

烷基包括但不限于甲基、乙基、甲基乙基、丙基、异丙基或丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)，烷基包括直链或支链的烷基。。

卤素基包括但不限于氯基、溴基、碘基。

作为一种优选的实施方式，原料A为具有氨基保护基团的肌肽(L-Carnosine)：

原料B为3-O-乙基抗坏血酸(EAC)：

作为一种优选的实施方式，通式(3)、(4)、(6)代表的化合物或其盐可以按照如下反应制备：

所述制备方法包括以下步骤：

具有氨基保护基团的肌肽先与二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应，反应结束后除去副产物，再加入3-O-乙基抗坏血酸和缚酸剂反应，再脱保护基团，得到抗坏血酸多肽衍生物。

利用二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对肌肽的羧基进行活化。

有机溶剂包括但不限于DMF、二氧六环(1,4-dioxane)、丙酮。

缚酸剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺、二异丙基乙胺(EDIPA)、三乙胺。

反应温度和反应时间可以一般为1-30h，优选12-18h，反应温度可以一般为5-50℃，优选15-35℃。

具体的制备方法如下：

(a)将Boc-L-Carnosine溶于DMF中，加入DCC和NHS，室温反应12-18h，过滤后出去固体副产物(N,N-二环己基脲)；

(b)在滤液中加入3-O-乙基抗坏血酸醚和DIPEA，室温反应1-5h，浓缩、干燥、重结晶，得到带有保护基团的通式(3)、(4)、(6)代表的化合物，脱保护基团后获得产物EAC-L-Carnosine。

根据本发明的第三个方面，提供了一种上述抗坏血酸多肽衍生物在制备化妆品中的应用。

根据本发明的第四个方面，提供了一种包含上述抗坏血酸多肽衍生物作为有效成分的化妆品；抗坏血酸多肽衍生物的有效浓度为10～50ppm。

本发明化合物通过将抗坏血酸类衍生物结构和多肽类结构(典型的将功效成分维生素VC(L-抗坏血酸)和肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)有效结合,并进行理性化分子改良修饰设计最终开发而成。全新结构的抗坏血酸多肽衍生物，兼具了VC美白和肌肽抗衰的优异功效，并解决了传统VC结构的稳定性问题。

通过多种细胞、半体内模型以及人群功效评价来评估该创新多肽衍生物的安全性和功效性能，证明了在较低的有效浓度下(24.25μM/10ppm)可以获得良好的美白、抗衰协同功效，包括通过肌肽和L-抗坏血酸刺激胶原蛋白合成，抑制ROS和黑色素生成等。通过科学配方制备了化妆品样品，进行合理的志愿者功效测试，验证该化合物的抗衰老活性，证明了(10～50ppm)在符合经济性条件的情况下全新结构的抗坏血酸多肽衍生物可以应用于化妆品的使用场景。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

所用试剂：DCC，C₁₃H₂₂N₂，二环己基碳二亚胺，失水剂；NHS，N-Hydroxysuccinimide，又名HOSu，C₄H₅NO₃，N-羟基琥珀酰亚胺；DMF，二甲基甲酰胺，吸水性，水和大部分有机溶剂互溶；DIPEA，N,N-二异丙基乙胺，碱性有机溶剂；1,4-dioxane，1,4二氧六环，溶剂，稳定剂。

实施例1 3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的合成

3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的合成路线如图1所示，包括以下步骤：

1、首先，Boc-L-Carnosine(13g，39.9mmoL)溶于DMF(400mL)中；

2、其次，加入DCC(7.98g，38.8mmol)和HOSu(4.45g,38.8mmol)；

3、然后，溶液在室温下搅拌15h左右，过滤后出去固体副产物(N,N-二环己基脲)；

4、接着，在滤液中加入3-O-乙基抗坏血酸醚(8.2g，40.2mmol)和DIPEA(16mL,92mmol)；

5、随后，混合物在室温下搅拌3h，然后浓缩，真空干燥；

6、固体用甲醇和异丙醚重结晶得到Boc-EAC-L-Carnosine(16.4g，32mmol)，为淡黄色固体；

7、Boc-EAC-L-Carnosine溶于1,4-二氧六环(100mL)中，加入4M盐酸和1,4-二氧六环(99mL，396mmol)；

8、混合物在室温下搅拌4h，然后浓缩，固体用丙酮和异丙醇研磨纯化得到EAC-L-Carnosine(3-O-乙基抗坏血酸-肌肽)(5.2g，98％)；

9、冻干后，EAC-L-Carnosine呈白色粉末(产率4.9％)。

3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的HPLC谱图如图2所示，检测条件：泵A：100％水中0.065％三氟乙酸(v/v)；泵B：100％乙腈中0.05％三氟乙酸(v/v)；总流量：1ml/min；波长：220nm；

LC时间程序：

时间	模块	命令	值
				0.01	泵	B.Conc	0
5.00	泵	B.Conc	0
				20.00	泵	B.Conc	30
25.00	泵	B.Conc	65
				25.01	泵	B.Conc	95
27.00	泵	B.Conc	95
				27.01	泵	B.Conc	0
35.00	泵	B.Conc	0
				35.01	控制器	停止	-

色谱柱：Inertsil ODS-3 4.6×250mm；

检测设备：SS-CM-0309。

出峰如下表所示：

探测器A通道1 220nm

峰号	出峰时间	面积	高度	面积比％
					1	15.329	346699	40972	1.729
2	15.794	19711028	2016121	98.271
					总和		20057727	2057092	100.000

3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的MS谱图如图3所示，检测条件：接口：ESI；雾化流量：1.5L/min；CDL温度：250；块温度：200；设备：GK11010007；界面偏置：+4.5kV；干燥气体流量：5L/min；流量：0.2ml/min；B.conc：50％H₂O/50％MeOH。

3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的核磁共振氢谱如图4所示(400MHz,溶剂D₂O)。

3-O-乙基抗坏血酸-肌肽的H，H-COSY谱如图5所示(400MHz,溶剂D₂O)。

将实施例1合成的物质作为化妆品原料，利用多种细胞模型来评估其安全性和功效，包括体外角膜细胞(SIRC)的生物安全性评估，人永生化角质形成细胞(HaCaT)的抗氧化活性评估ROS含量降低测试，人体内胶原蛋白合成评估皮肤成纤维细胞(FB)以及酪氨酸酶活性和黑色素对黑色素瘤细胞(B16)模型的黑色素调节评估。还使用VISIA CR和CK仪器进行了抗衰老效果验证的体内研究。

试验例1安全性评估试验

实施例1合成的物质在公司自有细胞模型平台下已完成以下安全性动物替代测试，如下表：

(1)SIRC刺激性试验：

将实施例1合成的原料配制成10ppm的溶液样品，依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3084.2-2014进行检测，结果为CSR＝106.0，表明样品为无刺激物。

检测方法：兔眼角膜细胞SIRC细胞生存率测试，将待测细胞用PBS清洗1～2次，每孔加入100μLMEM完全培养基和10μL CCK-8溶液，置于二氧化碳培养箱中，培养2～4h。在450nm波长，测定吸光度(OD)值。CCK-8试剂可以用MTT代替。

不同样品的细胞存活率如图6所示。

(2)化妆品眼刺激性/腐蚀性鸡胚绒毛尿囊膜试验：

将实施例1合成的原料配制成10ppm的溶液样品，依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2329-2009进行检测，结果为IS＝0，表明呈阴性反应，样品无刺激性。

腐蚀性鸡胚绒毛尿囊膜试验结果如图7所示。

验证最低有效浓度下原料水溶液无任何不良反应，有很好的生物安全性。

试验例2功效评估试验

(1)美白功效

依据化妆品美白功效测试团体标准T/SHRH 021-2019，结合NCBI和知网文献调研，设计B16小鼠黑色素瘤细胞美白功效体外检测方法：

1)酪氨酸酶酶活试验：

将经过诱导剂(α-MSH)和待测物处理的细胞样品于96孔细胞培养板内，进行反复冻融裂解，每孔加入100μL的0.1～0.5％的左旋多巴，37℃细胞培养箱内孵育2h左右，在450nm波长，测定吸光度(OD)值。结果如图8所示。

2)黑色素含量测定：

将经过诱导剂(α-MSH)和待测物处理的细胞样品于6孔细胞培养板内，加入0.5～2mL细胞裂解液，在65℃恒温烘箱中，静置2h。然后，将裂解液混匀后，以150μL/孔添加到96孔检测板中，在450nm波长，测定吸光度(OD)值。结果如图9所示。

试验证明该原料可以有效抑制黑色素生成和酪氨酸酶酶活，同浓度下(24.25μM/10ppm)，相对于经典VC衍生物单体3-O-乙基抗坏血酸醚(简称EAC，一种的较为稳定的抗坏血酸衍生物)、二肽单体(肌肽)以及两者的物理混合(EAC+肌肽)相比对酪氨酸酶的抑制能力EAC-肌肽更好，而对最终黑色素的抑制能力显著提升。抑制效果与0.05％的资生堂专利成分4-MSK接近(模型的诱导剂浓度：0.1μg/mL(63nM)的α-MSH)。

可见，EAC-肌肽具有显著的美白功效，并在部分指标优于金标准成分比如3-O-乙基抗坏血酸(3-O-Ethyl Ascorbic Acid)和4-甲氧基水杨酸钾(4-MSK)等。

EAC-L-Carnosine于24.25μM(10ppm左右)存在显著抑制黑色素分泌的作用。于24.25μM浓度下，EAC-L-Carnosine的效果最优。推测可能与EAC-L-Carnosine的还原性、肌肽结构和细胞增殖有关。

(2)抗氧化抗衰老

1)角质形成细胞的能量代谢能力试验：

测试了HaCaT细胞内ATP是否会受到EAC-肌肽的影响，人永生化角质形成细胞HaCaT，将受试物处理后的细胞，使用一定量的细胞裂解液充分裂解，于4℃，12000g，离心5min，取上清，将各实验组细胞裂解样品以20μL/孔添加到96孔检测板中(不透明)，再加入100μL/孔的ATP检测液，室温下静置3～5min，使用全波段酶标仪检测自发光强度。结果如图10所示。

结果证明，相对于空白组，24.25μMEAC-肌肽能提高25.0％的ATP表达，说明其有显著性上调ATP的作用，即有提高细胞活性的作用。(注本研究中使用的实验阳性对照组1nMEGF，该原料是药品，测试浓度为1nM,不能用于护肤品)，本发明原料可显著增强角质形成细胞的能量代谢能力。

2)氧化应激下角质层细胞抗衰修复试验：

为了研究本发明原料在氧化应激下对角质层细胞抗衰修复的功效，依据化妆品紧致、抗皱功效测试-体外角质形成细胞活性氧(ROS)抑制测试方法(团体标准T/SHRH 032-2020)，通过H₂O₂诱导HaCaT细胞构建氧化损伤细胞模型，分别测定了细胞相对增值率和ROS表达量。

人永生化角质形成细胞HaCaT，铺板后，细胞融合度65％左右时，去除原有培养基，用含一定浓度的H₂O₂培养基，置于二氧化碳培养箱2h。诱导完毕后，去除原有培养基，替换为含待测样品(或阳性样品)的培养基，置于二氧化碳培养箱。

ROS检测：24h后，替换为一定量的DCFH-DA工作液，避光孵育15～30min，无血清培养基清洗3～5次后，加入100μL无血清培养基，于488nm激发波长，525发射波长，检测刺激后荧光强度。

细胞活率检测：24h后，替换为含10％的CCK-8的无血清培养基，二氧化碳培养箱孵育2～4h后，于450nm波长下检测OD值。

结果如图11所示，表示双氧水(H₂O₂)损伤后，样品修复24h后，永生化角质形成细胞(HaCaT)相对增值率和ROS表达情况。

实验结果说明，该原料可以有效修复氧化损伤，显著提高细胞活力，并显著下调ROS表达量，同浓度下，与VC衍生物(EAC)、肌肽以及肌肽和EAC物理混合协同作用相比，综合功效更加优异，体现出“1+1>2”的效果。

3)UVA光老化应激下角质层细胞抗衰修复试验：

人永生化角质形成细胞HaCaT，铺板后，细胞融合度65％左右时，去除原有培养基，用含待测样品的PBS替代原有的培养基，置于特定的紫外装置下，UVA照射剂量为15J/cm²。诱导完毕后，去除含药PBS，替换为含待测样品的培养基，置于二氧化碳培养箱。

ROS检测：24h后，替换为一定量的DCFH-DA工作液，避光孵育15～30min，无血清培养基清洗3～5次后，加入100μL无血清培养基，于488nm激发波长，525发射波长，检测刺激后荧光强度。

细胞活率检测：24h后，替换为含10％的CCK-8的无血清培养基，二氧化碳培养箱孵育2～4h后，于450nm波长下检测OD值。

选用了一定剂量的UVA诱导损伤HaCaT，构建了角质形成细胞UVA损伤细胞模型。

图12为HaCaT细胞UVA损伤实验数据图，结论如下：

本发明EAC-肌肽(约24μM/10ppm)在无细胞毒性的情况下，有上调UVA照射后角质形成细胞的活性、显著对自由基ROS的产生有抑制效果，并对胶原蛋白前体羟脯氨酸HYP具有显著的激活作用。以上指标水平均优于VC单体(24μM)的作用，并与阳性对照TGF-β1(100ng/mL)接近。

4)成纤维细胞I型胶原蛋白的合成试验

依据化妆品、抗皱功效检测-体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定(团体标准T/SHRH 032-2020)，使用人原代成纤维细胞FB，测定了(24.25μM/10ppm)浓度下该各原料组别对FB分泌胶原蛋白的影响。

人原代成纤维细胞FB，铺板后，细胞融合度45％～65％，去除原有培养基，用含待测样品的PBS替代原有的培养基，置于二氧化碳培养箱培养24h±2h。孵育培养结束后，每孔收集200μL细胞培养上清液于1.5mL无菌离心管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

ELISA检测，使用人Ⅰ型胶原酶免疫试剂盒。首先，使用标准品检测并绘制标准曲线，然后，检测稀释合适比例的成纤维细胞上清液含有的胶原蛋白含量。结果如图13所示。

结果证明，同浓度下，该EAC-肌肽相对于经典EAC、二肽单体以及两者的混合物有更加显著促胶原蛋白生成的效果。其中TGF-B1为阳性对照，浓度100ng/mL。可见，EAC-肌肽可显著增强成纤维细胞I型胶原蛋白的合成。

5)UVA光老化应激下对成纤维细胞抗衰修复试验

HFF人包皮成纤维细胞，铺板后，细胞融合度65％～85％时，去除原有培养基，用含待测样品的PBS替代原有的培养基，置于特定的紫外装置下，UVA照射剂量为5J/cm²。诱导完毕后，去除含药PBS，替换为含待测样品的培养基，置于二氧化碳培养箱。

ROS检测：24h后，替换为一定量的DCFH-DA工作液，避光孵育15～30min，无血清培养基清洗3～5次后，加入100μL无血清培养基，于488nm激发波长，525发射波长，检测刺激后荧光强度。

细胞活率检测：24h后，替换为含10％的CCK-8的无血清培养基，二氧化碳培养箱孵育2～4h后，于450nm波长下检测OD值。

HYP(细胞裂解液)含量检测：使用羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒。首先，使用HYP标准品检测并绘制标准曲线，然后，检测稀释合适比例的成纤维细胞裂解液中含有的HYP(细胞上清)含量。结果如图14所示。

Ⅰ型胶原蛋白含量检测：ELISA检测，使用人Ⅰ型胶原(ColⅠ)酶联免疫试剂盒。首先，使用Ⅰ型胶原蛋白标准品检测并绘制标准曲线，然后，检测稀释合适比例的成纤维细胞上清液含有的胶原蛋白含量。

GraphPad Prism 8.0.2软件处理，HFF细胞在UVA诱导损伤下胶原蛋白Ⅰ含量测定实验结果如图15所示。

EAC-肌肽(约24μM/10ppm)在无细胞毒性的情况下，有显著上调UVA照射后成纤维细胞的活性、显著对自由基ROS的产生有抑制效果，并对胶原蛋白前体羟脯氨酸HYP具有显著的激活作用。以上指标水平均优于VC单体/EAC单体与肌肽的混合添加协同作用，以及专利VC衍生物AA2G的作用，并与阳性对照TGF-β1接近。

可见，EAC-肌肽具有在个多维度指标上显著抗衰修护效果，并在部分指标优于经典的肌肽和VC衍生物物理混合后效果的简单叠加,具有协同的抗衰效果，实现“1+1>2”的表现。

试验例3实际志愿者人群功效

测试方法：20ppm EAC-二肽原料加入基础料乳霜中，并进行每周两次的使用，并在4周和8周进行效果的测试，以不含EAC-二肽原料的基础料乳霜为空白安慰剂。

测试人群：15人实验组，15人安慰剂组。(31-54岁,女性)。

使用方法：志愿者每天早晚使用乳霜各一次，每次使用量1g，并均匀的进行全脸涂抹。

测试设备：CK instrument。

测试方法：利用CK设备的cutometer以及Colorimeter探头分别在恒温恒湿环境下，在0周、产品使用4周和8周后对每位志愿者随机一侧脸颊进行皮肤弹性测试和皮肤色泽度测试；

空白安慰剂和测试膏霜的成分如下表所示。

试验组人群皮肤弹性值的结果如图16所示；结果表明：试验组人群皮肤弹性值R2，第14天和地28天有显著的提升趋势；安慰剂组提升幅度低于试验组，证明了EAC-二肽的显著应用抗衰功效。

试验组人群ITA皮肤色泽度的结果如图17所示；结果表明：试验组人群ITA皮肤色泽度，第14天和地28天有显著的提升趋势；安慰剂对照组色泽度略有下降，证明了EAC-二肽的美白提亮肤色的效果。

结论：细胞实验证明，化合物3-O-乙基抗坏血酸-肌肽具有良好的生物活性，包括降低ROS，促进胶原蛋白I的产生，降低酪氨酸酶的活性和下调黑色素的分泌。具体而言，在24.25μM的浓度下，EAC-肌肽可将黑色素的分泌下调27.85％，大于相同浓度下的EAC和肌肽的总和，证明了美白、抗衰维度的显著协同性功效，并在部分关键性指标中，该衍生物体现了同时优于VC和肌肽单体及其物理复配的功效。此外，人类志愿者的研究结果支持了3-O-乙基抗坏血酸-肌肽在皮肤弹性，皮肤色调和减少皱纹方面具有理想的抗衰老作用，具有多种功能(抗衰老、美白、抗氧化、抗炎等)，是一种有前途的抗衰老活性物质。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(1)代表的化合物或其盐：

其中，m为0且n为1，或者，m为1且n为0；

X₁、X₂独立的为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基；

Q₁、Q₂独立的为C1～C6的烷基链；

a、b、c独立的选自1-10的整数；

e为0且d为1-10的整数，或者，e为1且d为0。

2.根据权利要求1所述的抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(2)代表的化合物或其盐：

其中，R₁为C1～C6的烷基；

Q₂为C1～C6的烷基链；

a、b独立的为1-5的整数；

e为0且d为1-5的整数，或者，e为1且d为0。

3.根据权利要求2所述的抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(3)代表的化合物：

4.根据权利要求2所述的抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(4)代表的化合物：

5.根据权利要求1所述的抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(5)代表的化合物或其盐：

其中，R₂为C1～C6的烷基；

Q₁为C1～C6的烷基链；

a、b、c独立的为1-5的整数。

6.根据权利要求5所述的抗坏血酸多肽衍生物，其特征在于，所述抗坏血酸多肽衍生物为由下列通式(6)代表的化合物：

7.一种权利要求1-6任一项所述的抗坏血酸多肽衍生物的制备方法，其特征在于，包括：

先对具有氨基保护基团的原料A进行羧基活化，再和原料B反应，脱保护基团后得到所述抗坏血酸多肽衍生物；

其中，所述原料A为由下列通式(7)代表的化合物：

p、q独立的选自1-10的整数；

所述原料B为由下列通式(8)代表的化合物：

k选自1-10的整数；

Q为C1～C6的烷基链；

Y为C1～C6的烷基、C1～C6的烷氧基或卤素基。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述原料A为具有氨基保护基团的肌肽；所述原料B为3-O-乙基抗坏血酸；

所述制备方法包括以下步骤：

具有氨基保护基团的原料A先与二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应，反应结束后除去副产物，再加入原料B和缚酸剂反应，再脱保护基团，得到所述抗坏血酸多肽衍生物。

9.一种权利要求1-6任一项所述的抗坏血酸多肽衍生物在制备化妆品中的应用。

10.一种化妆品，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的抗坏血酸多肽衍生物作为有效成分；所述抗坏血酸多肽衍生物的有效浓度为10～50ppm。

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