CN115260007B - 一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中提取3,4‑二羟基苯乙醇的方法，涉及3,4‑二羟基苯乙醇提取技术领域。该方法包括：将目标发酵液经膜过滤、活性炭吸附后，收集过滤清液并将其流入离子交换系统进行吸附，收集柱穿透液，离子交换系统为阴离子树脂柱与阳离子树脂柱按阳离子至阴离子顺序串联使用；将柱穿透液通过反渗透膜脱除其中的部分水分，再经减压蒸发浓缩后得，使用吸湿剂吸除微量残余水分。本发明通过对工艺进行简化，同时整个过程以水为溶剂，避免使用有机试剂，大大降低了3,4‑二羟基苯乙醇的生产成本，解决了成品中的有机试剂的残留问题与其生产过程对环境的污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及3,4-二羟基苯乙醇提取技术领域，具体而言，涉及一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法。
背景技术
3,4-二羟基苯乙醇又名羟基酪醇，是一种天然多酚类化合物，其邻苯二酚的结构使其具有非常强的抗氧化活性，与此同时更有研究表明，3,4-二羟基苯乙醇具有抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗癌和抗菌等多种生物活性，因此它逐渐被广泛地应用到食品、保健品、化妆品和医疗等领域。
3,4-二羟基苯乙醇在自然界中主要以非游离态的橄榄苦苷形式存在于橄榄的果实与叶片中，工业上可以从橄榄油的生产废水以及橄榄叶和果汁中进行提取分离。由于植物资源的限制，植物提取3,4-二羟基苯乙醇的工业规模化生产较难实现。如公开号为CN106187708A的发明专利申请，公布了一种属于化工领域由橄榄苦苷中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的制备方法：（1）以乙醇为溶剂水解含橄榄苦苷的原料；（2）浓缩水解液至粘稠状，乙酸乙酯反复萃取；（3）有机相浓缩液乙酸乙酯复溶后，采用硅胶柱分离；（4）最终以1000g橄榄苦苷为原料制备成品3,4-二羟基苯乙醇约25g。通过该方法所制备的3,4-二羟基苯乙醇纯度为98%，但是其酸解温度需控制在80-1000℃，且仍需要硅胶层析柱反复分离，工艺繁琐，需要大量有机试剂，此外原料来源中3,4-二羟基苯乙醇含量较低，不适合工业放大生产。
相较3,4-二羟基苯乙醇的植物提取，化学合成领域所作出的努力虽然一定程度上解决了3,4-二羟基苯乙醇的来源问题，但复杂的反应导致其生产工艺通常需要伴随使用大量的有机溶剂和较严苛的高温条件。如公开号为WO2008128629的发明专利申请，采用四氢锂铝还原3，4-二羟基苯乙酸甲酯，以干燥的四氢呋喃为溶剂，将得到的粗品采用高温减压蒸馏的方式得到纯度为93%的3,4-二羟基苯乙醇产品，其工艺流程中所采用的四氢呋喃对环境有较严重的污染，所得产品纯度也很低，且高温反应一方面也会影响3,4-二羟基苯乙醇的稳定性导致收率低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，本发明通过对生产工艺进行简化，同时整个过程以水为溶剂，避免使用有机试剂，大大降低了3,4-二羟基苯乙醇的生产成本，解决了成品3,4-二羟基苯乙醇中的有机试剂的残留问题与其生产过程对环境的污染问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
将目标发酵液经膜过滤、活性炭吸附后，收集过滤清液；
将所述过滤清液流入离子交换系统进行吸附，收集柱穿透液，所述离子交换系统为阴离子树脂柱与阳离子树脂柱按阳离子至阴离子顺序串联使用；
将所述柱穿透液通过反渗透膜脱除其中的部分水分，得到第一浓缩液；
将所述第一浓缩液经减压蒸发浓缩后得到第二浓缩液；
使用吸湿剂吸除所述第二浓缩液中的微量残余水分，得到高纯度的3,4-二羟基苯乙醇。
在可选的实施方式中，所述阴离子树脂柱与所述阳离子树脂柱的装填比例为1：1-1.2，料液处理体积为20-40BV；
优选地，所述阴离子树脂柱为大孔弱碱性阴离子交换树脂D301；
优选地，所述阳离子树脂为强酸型阳离子交换树脂SL650；
优选地，流入所述离子交换系统内的所述过滤清液的温度为30-70℃。
在可选的实施方式中，所述反渗透膜浓缩将所述柱穿透液浓缩至3,4-二羟基苯乙醇的含量为8%-15%；
优选地，通入所述反渗透膜内的所述柱穿透液的温度为30-70℃。
在可选的实施方式中，所述减压蒸发浓缩条件为：真空度不高于100pa，水浴温度60-90℃。
在可选的实施方式中，所述吸湿剂为PEG8000。
在可选的实施方式中，所述吸湿剂的使用方法为：将密封有所述吸湿剂的透析袋置于所述第二浓缩液中，搅拌吸附1-5h；
优选地，所述吸湿剂的用量为所述第二浓缩液质量的10-20%；
优选地，所述透析袋的截留分子量为100-200Da。
在可选的实施方式中，所述膜过滤包括：先将所述目标发酵液加热至70-80℃，并用酸或碱调节pH值为2.0-9.0，采用陶瓷膜对所述目标发酵液进行膜过滤，收集膜过滤清液；
优选地，所述酸包括盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种；
优选地，所述碱包括氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种；
优选地，所述酸和所述碱的配制浓度为100-300g/L。
在可选的实施方式中，在所述活性炭吸附过程中，活性炭的加入质量与所述膜过滤清液的体积之比为1:5-1:50；
优选地，在所述活性炭吸附之前，保持所述膜过滤清液的温度为70-80℃；
优选地，所述活性炭吸附的时间为1-5h。
在可选的实施方式中，所述活性炭吸附和所述离子交换系统进行吸附依次进行作为一次吸附脱除操作，所述吸附脱除操作可循环进行1-3次。
在可选的实施方式中，所述目标发酵液是大肠杆菌为工程菌种制得的含有3,4-二羟基苯乙醇的发酵液，所述目标发酵液中所述3,4-二羟基苯乙醇的浓度为20-40g/L，所述目标发酵液的pH范围为5.0-9.0。
本发明具有以下有益效果：本申请提供的从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法通过利用膜过滤、活性炭吸附、离子交换树脂除盐脱色，反渗膜浓缩等简单工艺可以从含有3,4-二羟基苯乙醇的生物发酵液中提取分离高纯度3,4-二羟基苯乙醇，整体工艺温度条件相对温和，有效解决了3,4-二羟基苯乙醇在生产过程中的稳定性问题，同时全过程以水为溶剂，避免使用有机试剂，大大降低了3,4-二羟基苯乙醇的生产成本，解决了成品3,4-二羟基苯乙醇中的有机试剂的残留问题与其生产过程对环境的污染问题。本发明具有使用材料来源易得，工艺简单易操作，产物单一易纯化，产物收率与纯度高的特点，适合工业化的放大生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请提供的3,4-二羟基苯乙醇标品HPLC示意图；
图2为本申请提供的3,4-二羟基苯乙醇标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括如下步骤：
S1、膜过滤。
将目标发酵液进行膜过滤以除去菌体及变性蛋白等不溶性杂质。具体来说，先将目标发酵液加热至70-80℃，并用酸或碱调节pH值为2.0-9.0，采用陶瓷膜对目标发酵液进行膜过滤，收集膜过滤清液；其中，酸包括但不限于盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种；碱包括但不限于氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种；酸和碱的配制浓度为100-300g/L。
本申请研究发现，目标发酵液的pH值对于产品颜色和含量影响较大，当目标发酵液的体系pH值过大，碱性较强时会使3,4-二羟基苯乙醇产生了不可逆的颜色变化，所得产品颜色较深，含量较低。而pH值过小时，酸性较强会导致引入设备上的Fe2+，导致所得成品3,4-二羟基苯乙醇颜色异常为深绿色。进一步地，目标发酵液的加热温度也对纯度和得率有一定的影响，当温度过高时，易产生3,4-二羟基苯乙醇氧化产物，进而导致最终产物颜色深且纯度和收率低；当温度过低时，最终产物纯度低。
本申请中所针对的目标发酵液是大肠杆菌为工程菌种制得的含有3,4-二羟基苯乙醇的发酵液。生物工程技术的兴起，使“工程菌”或“工程细胞株”在经过大规模的培养后，可定向生产大量的有用代谢产物，相比化工领域，它具有条件温和，副反应少，绿色环保等特点。应用生物工程技术构建的工程菌，可将目标化合物大量快速的转化为3,4-二羟基苯乙醇，一方面多种多样的反应路径为3,4-二羟基苯乙醇的提取来源提供保障，另一方面其定向转化的特点更方便了纯化分离工作的进行，不仅节约了设备投入和生产成本，其简易化的操作工艺也更加适合工业放大生产的应用。
本申请中以大肠杆菌为工程菌种制得的含有3,4-二羟基苯乙醇的发酵液的方法为现有技术，可参阅常规的发酵方法进行，本申请不做具体阐述，本申请主要限定的是目标发酵液中3,4-二羟基苯乙醇的浓度为20-40g/L，目标发酵液的pH范围为5.0-9.0，其液相检测结果为所含3,4-二羟基苯乙醇液相纯度占比99.5%至99.9%。
S2、活性炭吸附。
保持膜过滤清液的温度为70-80℃，接着对膜过滤清液采用活性炭进行吸附，吸附的时间为1-5h，收集过滤清液；在活性炭吸附过程中，活性炭的加入质量与膜过滤清液的体积之比为1:5-1:50。
本申请中，利用活性炭发达的微孔结构与极强的吸附特性，去除生物色素与异味，以及因加热产生的少量3,4-二羟基苯乙醇氧化产物，此过程维持1-5h后，脱碳过滤，得过滤清液。
S3、离子交换系统进行吸附。
将过滤清液在30-70℃条件下流入离子交换系统进行吸附，收集柱穿透液；本申请中的离子交换系统为阴离子树脂柱与阳离子树脂柱按阳离子至阴离子顺序串联使用，阴离子树脂柱与阳离子树脂柱的装填比例为1：1-1.2，料液处理体积为20-40BV；其中，阴离子树脂柱为大孔弱碱性阴离子交换树脂D301；阳离子树脂为强酸型阳离子交换树脂SL650。
本申请采用离子交换系统进行吸附可以有效去除体系中的有色成分以及发酵过程产生的有机酸分子杂质，得到无色透明含高纯度3,4-二羟基苯乙醇的稀溶液。
此外，值得说明的是，步骤S2的活性炭吸附和步骤S3的离子交换系统进行吸附依次进行，其整体作为一次吸附脱除操作，吸附脱除操作可循环进行1-3次。
S4、反渗透膜脱水。
将柱穿透液在30-70℃条件下通过反渗透膜脱除其中的部分水分，得到第一浓缩液；反渗透膜浓缩将柱穿透液浓缩至3,4-二羟基苯乙醇的含量为8%-15%。
S5、减压蒸发浓缩。
将第一浓缩液经减压蒸发浓缩后得到第二浓缩液，减压蒸发浓缩条件为：真空度不高于100pa，水浴温度60-90℃。
S6、吸湿剂除水。
使用吸湿剂吸除第二浓缩液中的微量残余水分，得到高纯度的3,4-二羟基苯乙醇。本申请中，吸湿剂为PEG8000。吸湿剂的使用方法为：将密封有吸湿剂的透析袋置于第二浓缩液中，搅拌吸附1-5h；吸湿剂的用量为第二浓缩液质量的10-20%；透析袋的截留分子量为100-200Da。
本申请中通过利用膜过滤、活性炭吸附、离子交换树脂除盐脱色，反渗膜浓缩等简单工艺，由一种含有3,4-二羟基苯乙醇的生物发酵液中提取分离高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，整体工艺温度条件相对温和，有效解决了3,4-二羟基苯乙醇在生产过程中的稳定性问题，同时全过程以水为溶剂，解决了成品3,4-二羟基苯乙醇中的有机试剂的残留问题与其生产过程对环境的污染问题。本发明具有使用材料来源易得，工艺简单易操作，产物单一易纯化，产物收率与纯度高的特点，适合工业化的放大生产。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
标准曲线制作：分别取适量3,4-二羟基苯乙醇标品（采购于阿拉丁，98%），用100mL容量瓶配置浓度为0.1g/L，0.2g/L，0.4g/L，0.8g/L，1.0g/L的3,4-二羟基苯乙醇标准溶液，之后各取1mL使用液相检测，根据检测结果，以3,4-二羟基苯乙醇浓度为x轴横坐标，以对应检测结果中的3,4-二羟基苯乙醇特征峰的峰面积为y轴纵坐标制作3,4-二羟基苯乙醇标准曲线，结果如图1和图2。
实施例1
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至2.0后然后将其加热至80℃，再经陶瓷膜过滤后按1：5（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附1h，脱碳过滤，滤液温度降低至40℃以下后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为250mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至80g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有 PEG8000 （PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌 5 h 完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约 380.0 g，得率 95%，3,4-二羟基苯乙醇含量 99.9%。
实施例2
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为35g/L，用浓盐酸将其pH调节至9.0后然后将其加热至75℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：20（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附2h，脱碳过滤，滤液温度降低至70℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的15%）的200Da透析袋搅拌1h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约339.5g，得率97%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.8%。
实施例3
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液20L，测定其含量为38g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0后然后将其加热至70℃，再经陶瓷膜过滤后按1：50（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附5h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为1000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度90℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的20%）的150Da透析袋搅拌2h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约744.8g，得率98%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.5%；
实施例4
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液20L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至75℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：5（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附1h，脱碳过滤，滤液温度降低至70℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌1h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约780.0g，得率97.5%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.8%。
实施例5
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液30L，测定其含量为20g/L，用浓盐酸将其pH调节至8.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：30（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附3h，脱碳过滤，滤液温度降低至70℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为1000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至120g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约582.0g，得率97%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.85%。
实施例6
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液30L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至75℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至50℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为1000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过 1 g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至 150g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有 PEG8000 （PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌 5h 完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约 1152.0 g，得率 96%，3,4-二羟基苯乙醇含量 99.95%；
实施例7
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液50L，测定其含量为30g/L，用浓盐酸将其pH调节至4.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：20（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为2000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至80g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌5h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约1432.5g，得率95.5%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.99%；
实施例8
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液50L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至3.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：40（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附5h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为2000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行经减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌5h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约1958.0g，得率97.9%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.86%；
实施例9
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液100L，测定其含量为37g/L，用浓盐酸将其pH调节至2.0后然后将其加热至70℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：40（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附5h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为5000mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行经减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约3581.6g，得率96.8%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.8%；
实施例10：
本实施例提供了一种从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，其包括：
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液100L，测定其含量为40g/L，用氢氧化钠将其pH调节至9.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：50（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附1h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为2500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度80pa，水浴温度80℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约3920.0g，得率98%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.53%；
根据本发明公布的一种由含有3,4-二羟基苯乙醇的发酵液中提取分离高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法，当工艺参数均在本发明所述范围之内时，可获得高纯度的3,4-二羟基苯乙醇产品，其表观性状为淡黄色澄清透明的油状液体。实施条件参数的改变，会导致3,4-二羟基苯乙醇产品在颜色，产品纯度上产生较明显的差异。
对比例1
对比例1中，未使用离子交换树脂吸附除杂，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过反渗透膜将活性炭吸附后的过滤清液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得浑浊状的深黄色油状物约572.3g，3,4-二羟基苯乙醇含量67.4%。将该方案制备的3,4-二羟基苯乙醇产品在乙醇之中按100g/L浓度复溶后，有明显的固态晶体不溶物。
对比例2
对比例2中，尝试将离子交换层析工艺中阴离子树脂柱与阳离子树脂柱串联顺序交换，使阴离子树脂柱在前，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为37g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至70℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附 5 h，脱碳过滤，滤液温度降低至 30℃之后通过离子交换层析系统（D301 与 SL650 装填体积均为 500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过 1 g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150 g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有 PEG8000 （PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌 3h 完全吸除水分，取出透析袋得红棕色油状物约 358.1 g，得率96.8%，3,4-二羟基苯乙醇含量 99.8%。从结果来看，树脂串联顺序的改变对本发明的3,4-二羟基苯乙醇成品得率和含量影响较小，但是其颜色却发生了较明显的改变，其原因为阴离子交换树脂置前后，在吸附过程中产生了一定量的氢氧根，导致3,4-二羟基苯乙醇酚羟基被氧化。
对比例3
对比例3中，树脂的装填体积与处理料液体积之比为1：100，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为100mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得较浑浊的淡黄色油状物约402.0g，3,4-二羟基苯乙醇含量94.5%。将该方案制备的3,4-二羟基苯乙醇产品在乙醇之中按100g/L浓度复溶后，有明显的固态晶体不溶物。
对比例4
对比例4中，未使用PEG8000对真空浓缩液进行吸附处理，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至无水分蒸出，得淡黄色油状物约393.6g，得率98.4%，3,4-二羟基苯乙醇含量98%，经卡尔费休水分测定法测得其中水分含量约为1.95%，含水量较高。
对比例5
对比例5中，除使用氢氧化钠将体系pH调节至10.0外，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用氢氧化钠将其pH调节至10.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得近红棕色油状物约380.0g，得率95%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.47%。由于体系碱性较强使3,4-二羟基苯乙醇产生了不可逆的颜色变化，所得产品颜色较深，含量较低。
对比例6
对比例6中，除使用浓盐酸将体系pH调节至1.0外，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至1.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得深绿色油状物约391.2g，得率97.8%，3,4-二羟基苯乙醇含量99.79%。体系pH过低导致相同工艺条件下引入了设备上的Fe2+，导致所得成品3,4-二羟基苯乙醇颜色异常为深绿色。
对比例7
对比例7中，膜过滤前温度与活性炭吸附温度设置为90℃，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为38g/L，用浓盐酸将其pH调节至8.0后然后将其加热至90℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得深棕色油状物约359.1g，3,4-二羟基苯乙醇含量90.35%；结果表明该高温条件下产生的3,4-二羟基苯乙醇氧化产物已超出活性炭吸附处理极限，制备得到的3,4-二羟基苯乙醇颜色为深棕色，且纯度和得率均较低。
对比例8
对比例8中，膜过滤前温度与活性炭吸附温度设置为60℃，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至8.0后然后将其加热至60℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过 1 g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至 150 g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有 PEG8000 （PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌 3h 完全吸除水分，取出透析袋得淡黄色油状物约 441.5 g，3,4-二羟基苯乙醇含量 87.4%；结果表明制备得到的3,4-二羟基苯乙醇纯度较低，其将其在纯水之中按100g/L浓度复溶后，有明显的蛋白不溶物。
对比例9
对比例9中，活性炭加入比例为1：80（w：v=活性炭：清液体积），其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤后按1：80（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至150g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得浑浊状的淡黄色油状物约405.8g，3,4-二羟基苯乙醇含量93.9%。将该方案制备的3,4-二羟基苯乙醇产品在纯水之中按100g/L浓度复溶后，有明显的蛋白不溶物。
对比例10
对比例10中，未使用活性炭对陶瓷清液进行吸附处理，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为38g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，再经陶瓷膜过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有 PEG8000 （PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌 3h 完全吸除水分，取出透析袋得浑浊状的红褐色油状物约 442.7g，3,4-二羟基苯乙醇含量 81.6%。通过该方案制备得到得3,4-二羟基苯乙醇颜色极深，且将其在纯水之中按 100g/L 浓度复溶后，有明显的浑浊不溶物。
对比例11
对比例11中，尝试将活性炭吸附工艺置于陶瓷膜过滤分离工艺之前，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为38g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至80℃左右，按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤之后，再经陶瓷膜过滤，滤液温度降低至30℃之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，之后使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得红褐色油状物约371.64g，3,4-二羟基苯乙醇含量99.2%。通过该方案制备得到得3,4-二羟基苯乙醇颜色极深，且将其在纯水之中按100g/L浓度复溶后，有少量的蛋白不溶物，其原因为菌体等不溶性杂质以及酪醇氧化产物的量一定程度上超过了活性炭的吸附处理范围。
对比例12
对比例12中，尝试将离子交换层析工艺置于活性炭吸附工艺之前，其它工艺条件参数均在本发明所述范围之内。
取含3,4-二羟基苯乙醇的发酵液10L，测定其含量为40g/L，用浓盐酸将其pH调节至7.0后然后将其加热至70℃左右，再经陶瓷膜过滤，滤液之后通过离子交换层析系统（D301与SL650装填体积均为500mL）进行吸附，完毕后用纯水洗至流出液的液相检测3,4-二羟基苯乙醇含量不超过1g/L，收集全部离子交换穿透液，按1：10（w：v=活性炭：清液体积）比例加入活性炭维持当前温度搅拌吸附4h，脱碳过滤之后，使用反渗膜将柱吸附液反渗浓缩至100g/L，得到的第一浓缩液于真空度90pa，水浴温度60℃的条件下进行减压蒸发浓缩至仅剩微量水分后，再向其中加入密封有PEG8000（PEG8000的质量为第二浓缩液质量的10%）的100Da透析袋搅拌3h完全吸除水分，取出透析袋得红棕色油状物约392g，3,4-二羟基苯乙醇含量99.5%。通过该方案制备得到得3,4-二羟基苯乙醇颜色较深，由于离子交换树脂脱色工艺提前后，3,4-二羟基苯乙醇产品存在残余色素导致其颜色变深。
综上所述，本申请提供的从发酵液中提取高纯度3,4-二羟基苯乙醇的方法通过利用膜过滤、活性炭吸附、离子交换树脂除盐脱色，反渗膜浓缩等简单工艺可以从含有3,4-二羟基苯乙醇的生物发酵液中提取分离高纯度3,4-二羟基苯乙醇，整体工艺温度条件相对温和，有效解决了3,4-二羟基苯乙醇在生产过程中的稳定性问题，同时全过程以水为溶剂，解决了成品3,4-二羟基苯乙醇中的有机试剂的残留问题与其生产过程对环境的污染问题。本发明具有使用材料来源易得，工艺简单易操作，产物单一易纯化，产物收率与纯度高的特点，适合工业化的放大生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，其包括：
将目标发酵液经膜过滤、活性炭吸附后，收集过滤清液；
将所述过滤清液流入离子交换系统进行吸附，收集柱穿透液，所述离子交换系统为阴离子树脂柱与阳离子树脂柱按阳离子至阴离子顺序串联使用；
将所述柱穿透液通过反渗透膜脱除其中的部分水分，得到第一浓缩液；
将所述第一浓缩液经减压蒸发浓缩后得到第二浓缩液；
使用吸湿剂吸除所述第二浓缩液中的微量残余水分，得到3,4-二羟基苯乙醇；
其中，所述目标发酵液是大肠杆菌为工程菌种制得的含有3,4-二羟基苯乙醇的发酵液，所述目标发酵液中所述3,4-二羟基苯乙醇的浓度为20-40g/L，所述目标发酵液的pH范围为5.0-9.0；
所述膜过滤包括：先将所述目标发酵液加热至70-80℃，并用酸或碱调节pH值为2.0-9.0，采用陶瓷膜对所述目标发酵液进行膜过滤，收集膜过滤清液；
在所述活性炭吸附之前，保持所述膜过滤清液的温度为70-80℃；在所述活性炭吸附过程中，活性炭的加入质量与所述膜过滤清液的体积之比为1:5-1:50；所述活性炭吸附的时间为1-5h；
所述阴离子树脂柱与所述阳离子树脂柱的装填比例为1：1-1.2，料液处理体积为20-40BV；所述阴离子树脂柱为大孔弱碱性阴离子交换树脂D301；所述阳离子树脂为强酸型阳离子交换树脂SL650；流入所述离子交换系统内的所述过滤清液的温度为30-70℃；
所述吸湿剂为PEG8000。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述反渗透膜将所述柱穿透液浓缩至3,4-二羟基苯乙醇的含量为8%-15%。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，通入所述反渗透膜内的所述柱穿透液的温度为30-70℃。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述减压蒸发浓缩的条件为：真空度不高于100pa，水浴温度60-90℃。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述吸湿剂的使用方法为：将密封有所述吸湿剂的透析袋置于所述第二浓缩液中，搅拌吸附1-5h。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述吸湿剂的用量为所述第二浓缩液质量的10-20%。
7.根据权利要求5所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为100-200Da。
8.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述酸包括盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述碱包括氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述酸和所述碱的配制浓度为100-300g/L。
11.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述活性炭吸附和所述离子交换系统进行吸附依次进行作为一次吸附脱除操作，所述吸附脱除操作可循环进行1-3次。
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