CN115259313A - 一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用，涉及微生物学、生物工程发酵技术领域，由30～80份阳离子羟乙基纤维素、5～15份胶质类芽孢杆菌胞外多糖、1～5份椰油酰胺丙基甜菜碱以及0.1～1份十二烷基硫酸钠制成。胶质类芽孢杆菌胞外多糖由分类学命名为胶质类芽孢杆菌，拉丁名为Paenibacillus mucilaginosus，自主编号为YZHY21.A07，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：62049的菌株发酵生产制备。本发明采用自分离的胶质类芽孢杆菌发酵的胞外多糖制备出一种生物捕集剂，可用于将蓝藻聚集并悬浮于水体表面，同时还可以抑制蓝藻的生长，制备方法简单，操作方便。

Description

一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物学、生物工程发酵技术领域，具体是涉及一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用。

背景技术

蓝藻水华会引起水质恶化，破环水生生态系统的平衡发展，使水中的溶氧量减少而造成鱼类的死亡和污染生活用水等。此外，部分蓝藻还会释放毒素，如微囊藻释放的毒素易溶于水，不挥发，化学性质相对稳定，自然降解的过程十分缓慢，它有很高的耐热性，加热煮沸都不能将毒素破坏。因此，如何治理蓝藻污染已成为当今国内外努力探索的一大难题。

铜绿微囊藻是单细胞蓝藻，藻团粒径分布范围大，小粒径(<200μm)藻团在中小水体各个深度几乎均匀分布，中等粒径(200-800μm)藻团集中在水体表层而大粒径(>800μm)藻团更易集中在水体底层。铜绿微囊藻的这种特性使得打捞处理清藻效率低，人工成本高。提高铜绿微囊藻和小球藻打捞效率的方法有很多种，主要策略是促进藻体悬浮在水体表层，并且提高滤水性能。中国专利CN 202010910222.2公开了一种用于低流速水体悬浮蓝藻的导流聚集装置，使用安全方便，可以用于聚集低流速水体中的悬浮型蓝藻及类似漂浮物，但是这个装置仍然要求蓝藻处于悬浮状态才能使用。

中国专利CN 201010276707.7公开了一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基，其特点是该培养方法和培养基能够提高了发酵密度并缩短了发酵时间。中国专利CN201310651488.X已经公开了一种采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，具有工艺成本低、收率高、产品纯度及活性高等特点，该絮凝剂是将分散在水体物品下沉聚集。

本发明采用自分离的胶质类芽孢杆菌发酵的胞外多糖制备出一种生物捕集剂，可用于将蓝藻聚集并悬浮于水体表面，同时还可以抑制蓝藻的生长，制备方法简单，操作方便。

发明内容

本发明公开了一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用，实现蓝藻能悬浮在水体表层，便于打捞，净化水体。

首先，本发明从华南理工大学的校园内土壤中筛选得到一株生产胞外多糖的胶质类芽孢杆菌，该菌株的分类学命名为胶质类芽孢杆菌，拉丁名为Paenibacillusmucilaginosus，自主编号为YZHY21.A07，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：62049，保藏日期为2021年11月9日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，邮政编码510070。

其次，本发明提出了利用该筛选到的菌株发酵出胞外多糖以制备生物捕集剂。

本发明所提出的一种生物复合捕集剂，按照重量份计，由30～80份阳离子羟乙基纤维素、5～15份胶质类芽孢杆菌胞外多糖、1～5份椰油酰胺丙基甜菜碱以及0.1～1份十二烷基硫酸钠制成。

作为本发明的优选技术方案，所述阳离子羟乙基纤维素的制备方法为：将10～30g羟乙基纤维素分散在50～150mL异丙醇中，搅拌均匀，再用NaOH溶液调节pH值至6～8，加入3～10mL浓度为60～70wt％的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在60～70℃下反应1～3h；反应结束后，用丙酮进行提纯后洗涤、冷冻干燥，过60～100目筛即得阳离子羟乙基纤维素。

作为本发明的优选技术方案，利用胶质类芽孢杆菌发酵制备胞外多糖发酵液的方法为：

将胶质类芽孢杆菌斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h；取适当活化后的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5mL无菌水将斜面的菌苔清洗下来，以3～6％的接种量接入发酵培养基中，37℃、125r/min震荡培养1～5d。

优选地，所述发酵培养基的组成为：蔗糖4～6g/L、Na₂HPO₄ 1～4g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～1g/L、CaCO₃ 0.05～0.15g/L、FeCl₃ 0.001～0.01g/L，pH值为6.5～7.5。

作为本发明的优选技术方案，对胞外多糖发酵液进行提纯制备所述胶质类芽孢杆菌胞外多糖的方法为：

将液体培养物离心，上清液用滤膜真空抽滤除去残余菌体得到胞外多糖粗液，再用透析袋进行浓缩得到胞外多糖浓缩液，加入乙醇，胞外多糖浓缩液与乙醇的体积比为1：2～6，离心收集沉淀；加入适量37～45℃纯水，溶解、离心收集上清液，上清液装入透析袋中透析；向透析液中再次加入乙醇，透析液与乙醇的体积比为1：2～6，离心收集沉淀，经过冷冻干燥，研磨过筛，即得胶质类芽孢杆菌胞外多糖。

本发明还提出了一种生物复合捕集剂的应用，步骤如下：

1)、将阳离子羟乙基纤维素与胶质类芽孢杆菌胞外多糖按比例混合研磨均匀，过60～100目筛收集得到A试剂；

2)、将椰油酰胺丙基甜菜碱和十二烷基硫酸钠按比例混合得到B试剂；

3)、向含藻类待处理溶液中先加入A试剂，搅拌均匀后，再加入B试剂，搅拌后鼓气，通过生物复合捕集剂能够对待处理溶液中藻类实现悬浮式捕集。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

1)、本发明使用自分离筛选的菌株发酵生产的胞外多糖、自制备的阳离子羟乙基纤维素、椰油酰胺丙基甜菜碱和十二烷基硫酸钠制备出的生物捕集剂，能够使分散在水体中的蓝藻上浮，便于打捞，同时具有抑制蓝藻生长的作用。

2)、本发明为处理水体中蓝藻提供了一个新的方式，其制备方法简单，可行性高，具有能大规模处理蓝藻的潜力。

附图说明

图1为胶质类芽孢杆菌的革兰氏染色显微照片。

图2为胶质类芽孢杆菌菌株16SrDNA序列构建所得的系统进化树图。

图3为胶质类芽孢杆菌胞外多糖GPC图。

图4胞外多糖和生物捕集剂乙酰胆碱酯酶评价柱状图。

图5为各生物捕集剂的蓝藻悬浮捕集率柱状图。

图6为部分生物捕集剂的蓝藻悬浮捕集照片。

具体实施方式

实施例1

一株胶质类芽孢杆菌的分离与筛选：

(1)菌体富集：取1g华南理工大学校园内的土壤加入1％蛋白胨培养基(装液量70mL培养基/300mL三角瓶)，在80℃条件下水浴加热20min，摇床震荡培养24h(30℃，150r/min)。

(2)初筛：取步骤(1)中的富集液1mL加入9mL无菌水中获得10^-1样品稀释液，如此方法依次得到10^-1、10^-2、10^-3、……10^-9、10^-10不同梯度稀释液。各梯度稀释液分别取0.1mL涂布于硅酸盐平板中，在37℃的恒温条件下培养24h。

(3)分离纯化：挑选粘稠透明、菌落大、形状为泪滴状的菌株至对应平板，进一步分离纯化。

(4)复筛：将分离纯化得到的菌株接种到硅酸盐液体培养基(装液量：70mL培养基/300mL三角瓶)中，在37℃的恒温条件下，摇床震荡培养基发酵72h。当培养基黏度升高后，采用乙醇沉淀法(见实施例3步骤(4))分离出胞外多糖，并计算其含量。

实施例2

胶质芽孢杆菌的鉴别

(1)革兰氏染色

1)涂布：取生理盐水1滴置载玻片上，用接种环取试管中菌苔少许，在盐水中磨匀，涂布成直径1cm大小的圆形薄膜。

2)干燥：将载玻片标本面朝上，用酒精灯远火慢慢烘干。

3)固定：将载玻片涂标本的背面以钟摆速度通过酒精灯火焰温度最高处3次，将细菌固定在载玻片上。

4)染色：(初染)在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用1分钟后，用细流水轻轻冲洗；(媒染)滴加媒染剂碘液数滴，室温作用1分钟，用细流水冲洗；(脱色)滴加95％酒精数滴，轻轻摇动载玻片几秒钟，使之均匀脱色，然后斜持载玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍显淡紫色为止(约需30秒)，立即用细流水将酒精冲掉；(复染)滴加沙黄染液复染室温作用1分钟后，用细流水轻轻冲洗。

5)镜检：标本染色后，晾干。用显微镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。本发明菌种革兰氏染色后呈紫色(图1所示)，因此为革兰氏阳性菌。

(2)16S rRNA基因测序

1)利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取实施例1复筛获得菌株的DNA，以上游引物27F和下游引物1492R PCR扩增16S rRNA。将扩增后产物胶回收纯化，送至广州艾基生物技术有限公司进行基因测序。

2)测序结果表明，该菌株的16S rRNA基因的长度为1391bp(拼接序列如SEQ IDNo.1所示)。将测序结果与NCBI数据库进行比对，即可获知与该细菌的16S rDNA序列同源性最高的已知序列。通过比对可知，其与Paenibacillus mucilaginosus的相似性最高，匹配度达到95.78％(如图2所示)。因此，根据上述数据，将分离菌株鉴定为胶质类芽孢杆菌Paenibacillus mucilaginosus，自主命名为胶质类芽孢杆菌YZHY21.A07(Paenibacillusmucilaginosus YZHY21.A07)。

实施例3

胶质类芽孢杆菌胞外多糖的制备

(1)发酵培养基制备：配制800mL发酵培养基，其中各组分含量为：蔗糖5g/L、Na₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、CaCO₃ 0.1g/L、FeCl₃ 0.005g/L，pH值7.2。分装至10个300mL的三角瓶，装液量为25％。121℃灭菌20min。

(2)菌体活化：胶质类芽孢杆菌斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h。

(3)液体发酵：取适当步骤(2)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5mL无菌水将斜面的菌苔清洗下来，以5％的接种量接入步骤(1)制备的液体发酵液中，150r/min、37℃震荡培养5d。

(4)提取胶质类芽孢杆菌胞外多糖：

1)取步骤(3)的发酵液(液体培养物)，1.2×10⁴r/min离心10min，上清液用0.45μm滤膜真空抽滤除去残余菌体得到胞外多糖粗液。

2)用透析袋进行浓缩。

3)浓缩液加入95％乙醇(V∶V＝1∶3)进行沉淀，1.2×10⁴r/min离心收集沉淀，按照原发酵液体积的1/5加入热水(45℃)溶解30min，1.2×10⁴r/min离心10min，上清液装入截留量4～10kDa透析袋中4℃下透析60h；再加入95％乙醇(V∶V＝1∶3)进行二次沉淀。

4)收集沉淀，真空干燥后，研磨过80目筛即得胶质类芽孢杆菌胞外多糖。

(5)对获得的胞外多糖进行GPC液相凝胶色谱检测(如图3所示)，主要有三段波峰，其中波峰1平均分子量为7.16×10¹⁰，波峰2平均分子量为79226(为主波峰)，波峰3平均分子量为176。

实施例4

生物捕集剂的制备

(1)阳离子羟乙基纤维素制备：首先将20g羟乙基纤维素分散在100mL异丙醇中，搅拌均匀，再用1mol/LNaOH调pH至7，最后加入5mL 3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液(65wt％)，在65℃下反应2h；反应结束后，用丙酮进行提纯后洗涤、冷冻干燥过80目筛。

(2)将50份步骤(1)制备的阳离子羟乙基纤维素与10份实施例3制备的胶质类芽孢杆菌胞外多糖按比例混合研磨均匀，过80目筛收集得到A试剂；将2份椰油酰胺丙基甜菜碱和0.15份十二烷基硫酸钠按比例混合得到B试剂。将A试剂和B试剂混合均匀。

实施例5

生物捕集剂和胶质类芽孢杆菌胞外多糖的安全性评价(采用广州浩谱尔科学仪器有限公司生产的PDK204NS农药残留速测试剂盒检测)

取实施例4制备出的生物捕集剂(A试剂+B试剂)，利用缓冲液分别配制成25、50、100、200、500、1000mg/L浓度的样品。

取实施例3制备出的胶质类芽孢杆菌胞外多糖，利用缓冲液分别配制成125、200、500、1000、2000、10000mg/L浓度的样品。

在反应瓶或试管中加入2.5mL上述含样品的缓冲液，再分别加入100μL胆碱酯酶和100μL显色剂，混匀。反应10min后加入100μL底物。测试在412nm波长的吸光度变化值△A0；同样的操作测试样品3min的吸光度变化值△At。抑制率计算如下：

抑制率(％)＝[(△A0-△At)/△A0]×100％

若样品抑制率≥50％，表示样品农残超标，为阳性，否则为阴性。

检测结果如图4所示，结果表明：胶质类芽孢杆菌胞外多糖浓度为10000mg·L^-1，乙酰胆酯碱酯酶的相对活性下降了23.3％；生物捕集剂浓度为500mg·L^-1时，乙酰胆碱酯酶的抑相对活性下降了33.5％。

一般来说，一种物质的含量水平导致50％的乙酰胆碱酯酶活性丧失，被认为是有毒的。显然，胶质类芽孢杆菌胞外多糖和生物捕集剂在使用浓度内对乙酰胆碱酯酶无明显毒性。

实施例6

生物捕集剂对蓝藻的捕集作用

(1)取OD₆₀₀＝0.1的微囊藻液600mL，分装50mL至100mL烧杯中，搅拌均匀。共10个烧杯进行实验。

(2)然后加入50mg阳离子羟乙基纤维素、2mg椰油酰胺丙基甜菜碱、不同量的十二烷基硫酸钠和胶质类芽孢杆菌胞外多糖，边搅拌边鼓气，静置10min后检测蓝藻悬浮率。

(3)捕集蓝藻悬浮率按照以下方式计算：

空瓶称重，重量为y。向瓶中加入50mL藻液、50mg阳离子羟乙基纤维素、2mg椰油酰胺丙基甜菜碱、RmL胶质类芽孢杆菌胞外多糖和Mg十二烷基硫酸钠，然后在一起烘干，重量为z。将处理10min后漂浮在水面上的蓝藻捞起并烘干，然后称重，重量为x。

捕集蓝藻悬浮率＝x/(z-y)×100％。

捕集蓝藻悬浮率结果如表1所示，综合考虑十二烷基硫酸钠的安全性，当阳离子羟乙基纤维素为50mg，胶质类芽孢杆菌胞外多糖为10mg，十二烷基硫酸钠为0.15mg，椰油酰胺丙基甜菜碱含量为2mg时，综合效果最好(样例1-2)。捕集蓝藻悬浮率柱状图如图5所示，部分捕集效果图如图6所示。

表1

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽粤智徽源生物科技有限公司

华南理工大学

<120> 一种生物复合捕集剂及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttgcgggt taccccaccg gcttcgggtg ttgtaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg 60

tgtacaagac ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcaattcc 120

gacttcatgc aggcgagttg cagcctgcaa tccgaactga gaccggcttc taaggattcg 180

ctccatctcg cgacttcgct tcccgttgta ccggccattg tagtacgtgt gtagcccagg 240

tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt 300

cactctagag tgcccaactc aatgctggca actaaagtca agggttgcgc tcgttgcggg 360

acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcacctctg 420

tcccgaagga gggccctatc tctagggctt tcagagggat gtcaagacct ggtaaggttc 480

ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatact ccactgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc 540

tttgagtttc actcttgcga gcgtactccc caggcggagt gcttattgtg tttacttcgg 600

caccaagggt atcgaaaccc ctaacaccta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag 660

ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta cagtccagaa 720

agccgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa 780

ttccgctttc ctctcctgca ctcaagtctt ccagtttccg gtgcgaaccg gggttgagcc 840

ccgggcttaa acaccagact taaaagaccg cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg 900

gacaacgctt gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggggctttc 960

ttctcaggta ccgtcattcg cagagcagtt actctccacg acgttcttcc ctggcaacag 1020

agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag gcttgcgccc 1080

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgggc cgttaccccg 1200

ccaactagct aatgcgccgc aggcccatcc gtaagccaca ggttgccccg tgtttcatga 1260

ttccggcatg caccgaaacc agctatccgg tcttagctac cgtttccggt agttatcccg 1320

atcttacagg caggttgcct acgtgttact cacccgtccg ccgctaagca ccgaagtgct 1380

ccgctcgact t 1391

Claims (7)

1.一种生物复合捕集剂，其特征在于，按照重量份计，由30～80份阳离子羟乙基纤维素、5～15份胶质类芽孢杆菌胞外多糖、1～5份椰油酰胺丙基甜菜碱以及0.1～1份十二烷基硫酸钠制成。

2.如权利要求1所述的生物复合捕集剂，其特征在于，所述阳离子羟乙基纤维素的制备方法为：将10～30g羟乙基纤维素分散在50～150mL异丙醇中，搅拌均匀，再用NaOH溶液调节pH值至6～8，加入3～10mL浓度为60～70wt％的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在60～70℃下反应1～3h；反应结束后，用丙酮进行提纯后洗涤、冷冻干燥，过60～100目筛即得阳离子羟乙基纤维素。

3.如权利要求1所述的生物复合捕集剂，其特征在于，所述胶质类芽孢杆菌胞外多糖由胶质类芽孢杆菌菌株经过发酵、提纯、干燥制成，该菌株分类学命名为胶质类芽孢杆菌，拉丁名为Paenibacillus mucilaginosus，自主编号为YZHY21.A07，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：62049，保藏日期为2021年11月9日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，邮政编码510070。

4.如权利要求3所述的生物复合捕集剂，其特征在于，利用胶质类芽孢杆菌发酵制备胞外多糖发酵液的方法为：

将胶质类芽孢杆菌斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h；取适当活化后的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5mL无菌水将斜面的菌苔清洗下来，以3～6％的接种量接入发酵培养基中，37℃、125r/min震荡培养1～5d。

5.如权利要求4所述的生物复合捕集剂，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：蔗糖4～6g/L、Na₂HPO₄ 1～4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2～1g/L、CaCO₃ 0.05～0.15g/L、FeCl₃0.001～0.01g/L，pH值为6.5～7.5。

6.如权利要求4所述的生物复合捕集剂，其特征在于，对胞外多糖发酵液进行提纯制备所述胶质类芽孢杆菌胞外多糖的方法为：

将液体培养物离心，上清液用滤膜真空抽滤除去残余菌体得到胞外多糖粗液，再用透析袋进行浓缩得到胞外多糖浓缩液，加入乙醇，胞外多糖浓缩液与乙醇的体积比为1：2～6，离心收集沉淀；加入适量热水，溶解、离心收集上清液，上清液装入透析袋中透析；向透析液中再次加入乙醇，透析液与乙醇的体积比为1：2～6，离心收集沉淀，经过冷冻干燥，研磨过筛，即得胶质类芽孢杆菌胞外多糖。

7.如权利要求1所述生物复合捕集剂的应用，其特征在于，步骤如下：

1)、将阳离子羟乙基纤维素与胶质类芽孢杆菌胞外多糖按比例混合研磨均匀，过60～100目筛收集得到A试剂；

2)、将椰油酰胺丙基甜菜碱和十二烷基硫酸钠按比例混合得到B试剂；

3)、向含藻类待处理溶液中先加入A试剂，搅拌均匀后，再加入B试剂，搅拌后鼓气，通过生物复合捕集剂能够对待处理溶液中藻类实现悬浮式捕集。

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