CN115259168A - 一种具有硼酸定向修饰与peg局部后修饰的细胞印迹聚合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物、制备方法及其应用。细胞印迹聚合物制备过程中没有使用抗体等生物试剂,极大降低了制备成本,且提高了材料的稳定性,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医用材料领域,涉及一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物、制备方法及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞是指自发或因诊疗操作等原因由实体瘤或转移灶释放进入人体外周血液循环的所有肿瘤细胞的统称,在肿瘤转移过程中起到重要作用。检测循环肿瘤细胞可提供肿瘤细胞的多组学信息,在肿瘤疗效评价、预后评估与辅助治疗决策中有广阔的应用前景。同时循环肿瘤细胞作为液态活检标本,具有样本易获取、操作简单和可重复操作等优点。然而,循环肿瘤细胞在外周血中数量极少,具有异质性,使得高效分离面临巨大挑战。现有富集分离方法,如密度梯度离心法、免疫磁珠分离法分别存在着灵敏度低、需求血量大和抗体不稳定、容易遗漏EpCAM阴性细胞等缺点。因此,亟需研发一种稳定、高效、高灵敏、低成本捕获循环肿瘤细胞的方法。
分子印迹聚合物作为人工抗体,在模板细胞存在下固化,可提供定制尺寸、形状和取向的空腔,可选择性地结合靶细胞;聚二甲基硅氧烷具有优良的生理惰性、耐热抗寒、无毒抗震,已用于制备哺乳动物细胞相关的印迹聚合物;循环肿瘤细胞细胞膜表面携带有大量糖蛋白,硼亲和材料可与糖蛋白上的顺式二羟基发生可逆共价结合,2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸可在生理条件下选择性识别细胞膜上糖蛋白,在印迹腔内修饰硼酸基团可提高位点对细胞的亲和性,提高捕获效率;聚二甲基硅氧烷疏水性较高,易与细胞膜磷脂双分子层发生疏水作用,导致非特异性吸附,通过模板细胞占据位点,在非印迹区域修饰PEG可显著降低细胞印记聚合物的非特异性吸附,提高捕获选择性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物的制备方法及其捕获循环肿瘤细胞的应用。在制备方面,首先,在固定的模板细胞上,利用硼亲和作用,接枝硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒,再加入聚二甲基硅氧烷,固化后剥离翻转,然后通过模板细胞占据位点,在非印迹区域修饰硅烷化的PEG,最后去除模板细胞。在应用方面,将含有靶细胞的血液加到具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物,置于孵箱孵育后,用磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)去除未捕获的细胞,用胰酶将捕获的细胞释放出来。该捕获材料整合了硼亲和定向印迹和PEG局部后修饰,无抗体细胞印迹聚合物可高效捕获靶细胞,具有成本低、制备简单、稳定性高、和选择性高等优点。
具体的,本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了一种硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料包括氨基修饰二氧化硅纳米颗粒、2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸制备而成。
优选地,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料还包括甲醇、氰基硼氢化钠。
优选地,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料的质量百分比如下所示:
氨基修饰二氧化硅纳米颗粒:0.10-10.56%;
2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸:0.19-1.00%;
甲醇:90.90-98.56%;
氰基硼氢化钠:0.79-1.23%;
上述的各原料的质量组成之和为100%。
本发明提供了前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
1)将3-氨丙基三乙氧基硅烷与二氧化硅纳米颗粒反应获得氨基修饰二氧化硅纳米颗粒;
2)将2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸与步骤1)获得的氨基修饰二氧化硅纳米颗粒反应获得硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒。
优选地,步骤1)的具体操作如下:取二氧化硅纳米颗粒,加入无水乙醇、纯水,超声分散后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷、氨水;磁力搅拌;产物用水/无水乙醇交替清洗,真空干燥,制备得到氨基修饰二氧化硅纳米颗粒。
优选地,步骤1)的具体操作如下:取0.5g上述二氧化硅纳米颗粒,加入无水乙醇40mL,纯水10mL,超声分散后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷500μL、氨水200μL;40℃磁力搅拌3h;产物用水/无水乙醇交替清洗三次,60℃真空干燥,制备得到氨基修饰二氧化硅纳米颗粒。
优选地,步骤2)的具体操作如下:取氨基修饰二氧化硅纳米颗粒,2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸,加入含1%氰基硼氢化钠的甲醇,超声分散后,室温下磁力搅拌;产物用水/无水乙醇交替清洗,真空干燥,制备得到硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒;将其超声分散在磷酸缓冲盐溶液中,得到混悬液。
优选地,步骤2)的具体操作如下:取100mg氨基修饰二氧化硅纳米颗粒, 80mg 2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸,加入20mL含1%氰基硼氢化钠的甲醇,超声分散后,室温下磁力搅拌12h;产物用水/无水乙醇交替清洗三次,60℃真空干燥,制备得到硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒;将其超声分散在pH 7.2-7.4,10 mM磷酸缓冲盐溶液中,得到浓度为100μg/mL的混悬液。
优选地,所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法如下:在一容器中将氨水、纯水和无水乙醇常温下磁力搅拌;在另一容器中加入正乙氧基硅烷和无水乙醇,超声混匀,而后将两个容器中的物质混匀;搅拌下反应;产物用水/无水乙醇交替清洗,制备得到二氧化硅纳米颗粒。
优选地,所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法如下:于三颈烧瓶加入氨水4 mL、纯水4mL和无水乙醇40mL,常温下磁力搅拌20min;同时,在一烧杯中加入5mL正乙氧基硅烷和40mL无水乙醇,超声混匀10min,然后倒入上述三颈烧瓶;50℃搅拌下反应5h,产物用水/无水乙醇交替清洗三次,制备得到二氧化硅纳米颗粒。
本发明提供了一种具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,所述具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料包括前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒、聚二甲基硅氧烷。
优选地,所述具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料的质量百分比如下:
聚二甲基硅氧烷:50.00-100.00%;
硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒:0.00-50.00%;
上述的各原料的质量组成之和为100%。
本发明提供了前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
1)将前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒与固定细胞反应形成接枝有硼酸的固定细胞;
2)与聚二甲基硅氧烷反应获得具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
优选地,所述制备方法包括如下步骤:
1)按照前面所述的制备方法制备前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液;
2)将前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液与固定细胞反应形成接枝有硼酸的固定细胞;
3)将步骤2)获得的接枝有硼酸的固定细胞与聚二甲基硅氧烷反应获得具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物。
优选地,步骤2)的具体操作如下:将固定细胞加入前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液,静置后,用磷酸缓冲盐溶液洗涤,得到接枝有硼酸的固定细胞。
优选地,步骤2)的具体操作如下:向固定细胞中加入前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液,室温静置1h后,用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻洗涤3次,得到接枝有硼酸的固定细胞。
优选地,步骤3)的具体操作如下:将有机硅前体与固化剂混合,超声脱气,将预聚液浇筑在步骤2)获得的接枝有硼酸的固定细胞上固化;将固化的PDMS 从细胞培养板上剥离并倒置。
优选地,步骤3)的具体操作如下:将有机硅前体与固化剂以10:1重量比的比例进行混合,超声脱气,将预聚液浇筑在步骤2)中接枝有硼酸的固定细胞上,80℃下固化2h;将固化的PDMS从细胞培养板上剥离并倒置。
优选地,所述固定细胞通过以下方法制备:使用多聚甲醛将细胞固定获得固定细胞。
优选地,所述固定细胞通过以下方法制备:将模板细胞接种到细胞培养皿中,细胞在含血清培养基中培养,置于37℃、含5%CO2的培养箱中孵育2h;弃去培养基,用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻清洗3次,加入多聚甲醛,固定15min,再用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液清洗3次。
本发明提供了一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,所述具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料包括权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物、PEG。
优选地,所述具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料的质量百分比如下:
前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物: 97.55%-99.80%;
PEG:0.20-2.45%;
上述的各原料的质量组成之和为100%。
优选地,PEG是甲氧基聚乙二醇(三乙氧基)硅烷。
本发明提供了一种前面所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
1)制备模板细胞占位的前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
2)活化步骤1)获得的模板细胞占位的前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
3)在非印记区域修饰PEG;
4)去除模板细胞。
优选地,步骤1)的具体操作如下:将权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物与模板细胞孵育,磷酸缓冲盐溶液后使用多聚甲醛固定。
优选地,步骤1)的具体操作如下:将权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物用75%乙醇和紫外线光灭菌后,向其接种5× 104个细胞,并在37℃下孵育4小时;pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻洗涤3次,并用4%多聚甲醛固定。
优选地,步骤2)的具体操作如下:向权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中加入氢氧化钠,然后用纯水、无水乙醇洗涤。
优选地,步骤2)的具体操作如下:向权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中加入0.1M NaOH反应过夜,以活化 PDMS,然后用纯水、无水乙醇洗涤。
优选地,步骤3)的具体操作如下:步骤2)处理后,加入溶解后的PEG,反应后用无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液洗涤。
优选地,步骤3)的具体操作如下:步骤2)处理后,加入无水乙醇溶解的 PEG,室温反应8h,用无水乙醇、pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液洗涤3次。
优选地,PEG是甲氧基聚乙二醇(三乙氧基)硅烷5000。
优选地,步骤4)的具体操作如下:将步骤3)得到的细胞印迹聚合物与胰蛋白酶溶液反应,然后洗涤。
优选地,步骤4)的具体操作如下:将步骤3)得到的细胞印迹聚合物与0.25%胰蛋白酶溶液在37℃下放置5min,然后在超声波条件下用蒸馏水洗涤3次。
本发明提供了一种捕获靶细胞的方法,所述方法包括利用前面所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物捕获靶细胞。
进一步,所述方法包括以下步骤:
1)将待测样品加到前面所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中,孵育2h;
2)用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次,捕获靶细胞。
进一步,所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
本发明提供了一种应用,所述应用包括以下任一项:
1)前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒在捕获靶细胞中的应用;
2)前面所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
3)前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞中的应用;
4)前面所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
5)权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在捕获靶细胞中的应用;
6)前面所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
优选地,所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
本发明的优势和有益效果:
本发明提供的一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物,利用印迹腔提供的空间匹配作用与定向修饰硼酸提供的硼亲和作用,两者协同,高效捕获循环肿瘤细胞。同时,用模板细胞占据印迹空腔,在印迹聚合物的非印记区域修饰PEG,大大提高了对靶细胞的选择性。细胞印迹聚合物制备过程中没有使用抗体等生物试剂,极大降低了制备成本,且提高了材料的稳定性,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物的制备过程示意图;
图2显示具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物的扫描电子显微镜图;
图3显示硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒的用量对细胞印迹材料捕获能力影响的结果图;
图4显示PEG分子量对聚二甲基硅氧烷非特异性吸附影响的结果图;
图5显示PEG浓度对聚二甲基硅氧烷非特异性吸附影响的结果图;
图6显示以Hela细胞为模板制备的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物捕获肿瘤细胞的结果图。
具体实施方式
为了更好的阐述本发明方案,下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。所描述的实施例是本发明中的一部分实施例,而不是全部实施例。实施例中所用的通用设备、材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备
一、步骤
制备过程示意图如图1所示。首先,使用多聚甲醛固定细胞,然后在生理条件下,利用2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸与糖蛋白的硼亲和作用,在固定的模板细胞上接枝硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒,再加入聚二甲基硅氧烷固化,然后通过模板细胞占据位点,在非印迹区域修饰硅烷化的PEG,最后使用胰酶洗脱模板细胞;并对制备的多重修饰细胞印迹聚合物进行扫描电镜表征,具体操作步骤如下:
第一步:以乳腺癌细胞系SKBR3细胞为模板细胞,按5×104个/孔的密度接种到24孔板中,细胞在含血清1640培养基中培养,置于37℃、含5%CO2的培养箱中孵育2h。弃去培养基,用磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)轻轻清洗3次,加入多聚甲醛500μL-1mL,室温下固定15min,再用磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)清洗3次。细胞固定后可在印迹过程中保持细胞形态结构的完整,增强了印迹腔与靶细胞的结合。
第二步:于三颈烧瓶加入氨水4mL、纯水4mL和无水乙醇40mL,常温下磁力搅拌20min。同时,在一烧杯中加入5mL正乙氧基硅烷和40mL无水乙醇,超声混匀10min,然后倒入上述三颈烧瓶。50℃搅拌下反应5h,产物用水/无水乙醇交替清洗三次,制备得到二氧化硅纳米颗粒;取0.5g上述二氧化硅纳米颗粒,加入无水乙醇40mL,纯水10mL,超声分散后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 500μL、氨水200μL。40℃磁力搅拌3h。产物用水/无水乙醇交替清洗三次,60℃真空干燥,制备得到氨基修饰二氧化硅纳米颗粒;取100mg氨基修饰二氧化硅纳米颗粒,80mg 2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸,加入20mL甲醇(含1%氰基硼氢化钠),超声分散后,室温下磁力搅拌12h。产物用水/无水乙醇交替清洗三次, 60℃真空干燥,制备得到硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒。将其超声分散在适量磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)中,得到浓度为100μg/mL的混悬液。向第一步固定细胞中加入500μL硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒(100μg/mL),室温静置1h后,用磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)轻轻洗涤3次,得到接枝有硼酸的固定细胞。
第三步:将有机硅前体与固化剂(PDMS试剂盒(道康宁,Sylgard184)中包含有机硅前体与固化剂)以10:1(wt/wt)的比例进行混合,超声脱气15min,将预聚液以0.2g/孔加入到上一步接枝硼酸的固定细胞上,80℃下固化2h。之后,将固化的PDMS从细胞培养板中剥离并倒置,得到硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物。
第四步:将上一步得到的硼酸修饰细胞印迹聚合物用75%乙醇和紫外线 (UV)光灭菌后,向其接种5×104个细胞,并在37℃下孵育4小时。磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)轻轻洗涤3次,并用4%多聚甲醛固定。向模板细胞占位的硼酸修饰细胞印迹聚合物中加入1mL 0.1M NaOH反应过夜,以活化 PDMS,然后用纯水、无水乙醇洗涤3次。加入500μL2mg/mL硅烷化PEG5000 (购自天津为康科技发展有限公司,货号WK010605,无水乙醇中溶解),室温反应8h,用无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4,10mM)洗涤3次,得到局部修饰PEG的细胞印迹聚合物。
第五步:将上一步得到的细胞印迹聚合物进一步与0.25%胰蛋白酶溶液在37℃下放置5min,然后用枪头轻轻吹打,弃去胰酶,在超声波条件下用蒸馏水洗涤3次,得到最终具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物。
表征:使用扫描电子显微镜表征细胞印迹聚合物。
二、结果
结果如图2所示,在聚二甲基硅氧烷上形成一个直径约16μm的印迹腔,表明细胞形态成功复制在聚二甲基硅氧烷上。同时,可以看到印迹腔内有大量二氧化硅纳米颗粒,表明硼酸的成功修饰。综上表明,具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物制备成功。
实施例2硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒浓度优化
制备具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,对硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒的浓度进行考察并优化。具体操作步骤如下:
同上述方法(实施例1第一、二、三、五步)制备相同,只改变硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒浓度,加入500μL浓度分别为5000、1000、100、10、1、0μg/mL 的硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒(分散在磷酸缓冲盐溶液中)。向得到的硼酸定向修饰细胞印迹聚合物加入5×104个SKBR3细胞,捕获2h,磷酸缓冲盐溶液清洗2次,显微镜下计数。
结果如图3所示,硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒的用量对细胞印迹材料捕获能力有影响。随着硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒浓度的增加,细胞印迹聚合物捕获靶细胞的数量呈现先增加后降低的趋势,在0-100μg/mL的浓度范围内,随着硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒浓度的增加,细胞捕获量逐渐增加。浓度超过100 μg/mL后,随浓度增大,捕获量降低。硼酸功能化二氧化硅纳米颗粒浓度为100 μg/mL时,对靶细胞的捕获量达到最大值。
实施例3PEG的分子量/浓度优化
制备具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,对硅烷化PEG的分子量以及浓度进行优化。具体操作步骤如下:
不使用模板细胞,同上述方法(实施例1第四、五步)制备相同,改变硅烷化PEG的分子量或硅烷化PEG的浓度。
使用硅烷化PEG分子量分别为:PEG200、PEG1000、PEG5000。向得到的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物加入 2×105个SKBR3细胞,捕获2h,磷酸缓冲盐溶液清洗2次,显微镜下计数。
使用硅烷化PEG浓度分别为:0、0.5、1、2、3、4、5mg/mL。向得到的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物加入 2×105个SKBR3细胞,捕获12h,磷酸缓冲盐溶液清洗2次,显微镜下计数。
结果如图4所示,硅烷化PEG分子量对聚二甲基硅氧烷非特异性吸附有影响。随着硅烷化PEG分子量的增加,聚二甲基硅氧烷上吸附的细胞相继减少,经硅烷化PEG5000修饰后,非特异性吸附最低。
结果如图5所示,硅烷化PEG浓度对聚二甲基硅氧烷非特异性吸附有影响。随着硅烷化PEG浓度的增加,聚二甲基硅氧烷非特异性吸附的细胞数量呈现先降低后平稳的趋势。硅烷化PEG浓度在0-2mg/mL内,随着浓度的增加,吸附细胞数量逐渐减少。硅烷化PEG浓度大于2mg/mL后,随着浓度增加,吸附细胞数量不再继续降低。
实施例4循环肿瘤细胞捕获
制备具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物,用于循环肿瘤细胞捕获考察材料的选择性与普遍适用性。具体操作步骤如下:
同上述方法(实施例1)制备相同,只改变模板细胞的种类。
使用Hela细胞为模板细胞,制备具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物。并按1.5×104个/孔分别接种Hela细胞和SKBR3细胞,37℃,5% CO2,孵育2h,磷酸缓冲盐溶液清洗2次,显微镜下观察并计数。
结果如图6所示,以Hela细胞为模板制备的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的细胞印迹聚合物对靶细胞的选择性与普适性。以Hela细胞为模板,得到的细胞印迹聚合物对Hela细胞有显著的捕获能力,同时,捕获的SKBR3细胞数明显较少。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒,其特征在于,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料包括氨基修饰二氧化硅纳米颗粒、2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸制备而成;
优选地,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料还包括甲醇、氰基硼氢化钠;
优选地,所述硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备原料的质量百分比如下所示:
氨基修饰二氧化硅纳米颗粒:0.10-10.56%;
2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸:0.19-1.00%;
甲醇:90.90-98.56%;
氰基硼氢化钠:0.79-1.23%;
上述的各原料的质量组成之和为100%。
2.权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
1)将3-氨丙基三乙氧基硅烷与二氧化硅纳米颗粒反应获得氨基修饰二氧化硅纳米颗粒;
2)将2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸与步骤1)获得的氨基修饰二氧化硅纳米颗粒反应获得硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒;
优选地,步骤1)的具体操作如下:取二氧化硅纳米颗粒,加入无水乙醇、纯水,超声分散后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷、氨水;磁力搅拌;产物用水/无水乙醇交替清洗,真空干燥,制备得到氨基修饰二氧化硅纳米颗粒;
优选地,步骤1)的具体操作如下:取0.5g上述二氧化硅纳米颗粒,加入无水乙醇40mL,纯水10mL,超声分散后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷500μL、氨水200μL;40℃磁力搅拌3h;产物用水/无水乙醇交替清洗三次,60℃真空干燥,制备得到氨基修饰二氧化硅纳米颗粒;
优选地,步骤2)的具体操作如下:取氨基修饰二氧化硅纳米颗粒,2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸,加入含1%氰基硼氢化钠的甲醇,超声分散后,室温下磁力搅拌;产物用水/无水乙醇交替清洗,真空干燥,制备得到硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒;将其超声分散在磷酸缓冲盐溶液中,得到混悬液;
优选地,步骤2)的具体操作如下:取100mg氨基修饰二氧化硅纳米颗粒,80mg 2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸,加入20mL含1%氰基硼氢化钠的甲醇,超声分散后,室温下磁力搅拌12h;产物用水/无水乙醇交替清洗三次,60℃真空干燥,制备得到硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒;将其超声分散在pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液中,得到浓度为100μg/mL的混悬液;
优选地,所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法如下:在一容器中将氨水、纯水和无水乙醇常温下磁力搅拌;在另一容器中加入正乙氧基硅烷和无水乙醇,超声混匀,而后将两个容器中的物质混匀;搅拌下反应;产物用水/无水乙醇交替清洗,制备得到二氧化硅纳米颗粒;
优选地,所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法如下:于三颈烧瓶加入氨水4mL、纯水4mL和无水乙醇40mL,常温下磁力搅拌20min;同时,在一烧杯中加入5mL正乙氧基硅烷和40mL无水乙醇,超声混匀10min,然后倒入上述三颈烧瓶;50℃搅拌下反应5h,产物用水/无水乙醇交替清洗三次,制备得到二氧化硅纳米颗粒。
3.一种具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,其特征在于,所述具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料包括权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒、聚二甲基硅氧烷;
优选地,所述具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料的质量百分比如下:
聚二甲基硅氧烷:50.00-100.00%;
硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒:0.00-50.00%;
上述的各原料的质量组成之和为100%。
4.权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
1)将权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒与固定细胞反应形成接枝有硼酸的固定细胞;
2)与聚二甲基硅氧烷反应获得具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
优选地,所述制备方法包括如下步骤:
1)按照权利要求2所述的制备方法制备权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液;
2)将权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液与固定细胞反应形成接枝有硼酸的固定细胞;
3)将步骤2)获得的接枝有硼酸的固定细胞与聚二甲基硅氧烷反应获得具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
优选地,步骤2)的具体操作如下:将固定细胞加入权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液,静置后,用磷酸缓冲盐溶液洗涤,得到接枝有硼酸的固定细胞;
优选地,步骤2)的具体操作如下:向固定细胞中加入权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒混悬液,室温静置1h后,用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻洗涤3次,得到接枝有硼酸的固定细胞;
优选地,步骤3)的具体操作如下:将有机硅前体与固化剂混合,超声脱气,将预聚液浇筑在步骤2)获得的接枝有硼酸的固定细胞上固化;将固化的PDMS从细胞培养板上剥离并倒置;
优选地,步骤3)的具体操作如下:将有机硅前体与固化剂以10:1重量比的比例进行混合,超声脱气,将预聚液浇筑在步骤2)中接枝有硼酸的固定细胞上,80℃下固化2h;将固化的PDMS从细胞培养板上剥离并倒置;
优选地,所述固定细胞通过以下方法制备:使用多聚甲醛将细胞固定获得固定细胞;
优选地,所述固定细胞通过以下方法制备:将模板细胞接种到细胞培养皿中,细胞在含血清培养基中培养,置于37℃、含5%CO2的培养箱中孵育2h;弃去培养基,用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻清洗3次,加入多聚甲醛,固定15min,再用pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液清洗3次。
5.一种具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物,其特征在于,所述具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料包括权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物、PEG;
优选地,所述具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备原料的质量百分比如下:
权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物:97.55%-99.80%
PEG:0.20-2.45%;
上述的各原料的质量组成之和为100%;
优选地,PEG是甲氧基聚乙二醇(三乙氧基)硅烷。
6.权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
1)制备模板细胞占位的权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
2)活化步骤1)获得的模板细胞占位的权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物;
3)在非印记区域修饰PEG;
4)去除模板细胞;
优选地,步骤1)的具体操作如下:将权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物与模板细胞孵育,磷酸缓冲盐溶液后使用多聚甲醛固定;
优选地,步骤1)的具体操作如下:将权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物用75%乙醇和紫外线光灭菌后,向其接种5×104个细胞,并在37℃下孵育4小时;pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液轻轻洗涤3次,并用4%多聚甲醛固定;
优选地,步骤2)的具体操作如下:向权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中加入氢氧化钠,然后用纯水、无水乙醇洗涤;
优选地,步骤2)的具体操作如下:向权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中加入0.1M NaOH反应过夜,以活化PDMS,然后用纯水、无水乙醇洗涤;
优选地,步骤3)的具体操作如下:步骤2)处理后,加入溶解后的PEG,反应后用无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液洗涤;
优选地,步骤3)的具体操作如下:步骤2)处理后,加入无水乙醇溶解的PEG,室温反应8h,用无水乙醇、pH 7.2-7.4,10mM磷酸缓冲盐溶液洗涤3次;
优选地,PEG是甲氧基聚乙二醇(三乙氧基)硅烷5000;
优选地,步骤4)的具体操作如下:将步骤3)得到的细胞印迹聚合物与胰蛋白酶溶液反应,然后洗涤;
优选地,步骤4)的具体操作如下:将步骤3)得到的细胞印迹聚合物与0.25%胰蛋白酶溶液在37℃下放置5min,然后在超声波条件下用蒸馏水洗涤3次。
7.一种捕获靶细胞的方法,所述方法包括利用权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物捕获靶细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)将待测样品加到权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物中,孵育2h;
2)用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次,捕获靶细胞。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
10.一种应用,所述应用包括以下任一项:
1)权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒在捕获靶细胞中的应用;
2)权利要求1所述的硼酸功能化的二氧化硅纳米颗粒在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
3)权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞中的应用;
4)权利要求3所述的具有硼酸定向修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
5)权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在捕获靶细胞中的应用;
6)权利要求5所述的具有硼酸定向修饰与PEG局部后修饰的聚二甲基硅氧烷细胞印迹聚合物在制备捕获靶细胞的细胞印记材料中的应用;
优选地,所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
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