CN115252685A - 一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蒙药巴特日‑7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，涉及医药技术领域，以放射性肠炎小鼠为研究对象，探讨蒙药巴特日‑7在预防和治疗放射性肠炎中的应用，研究结果表明蒙药巴特日‑7能有效改善由放射引起的小鼠肠道损伤、保护肠绒毛结构、降低炎性因子表达、延长存小鼠活时间。

Description

一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用。

背景技术

如今随着全球癌症患者数量的迅速增长，预计持续到第2040年，全球癌症新发病例数目将达2840万例，比2020年的1930万例增长47％(SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,etal.Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence andMortality Worldwide for 36Cancers in 185Countries[J].CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-49.)。至今，临床上通常将手术疗法、化疗、放射治疗等治疗方案作为肿瘤疾病的主要治疗手段，有研究显示超六成的肿瘤患者需要实施放射治疗处理。但是很多患者对放疗引起的严重毒性反应不予重视，最终导致极其严重的不良事件发生(黄智昊,钟陆行.食管癌放疗技术及放疗方式研究进展[J]中国肿瘤临床.2016,43(12):527-30.张立,胡永,刘斯青.放疗技术员对放疗患者急性毒性反应掌握情况调查[J]福建医药杂志.2019,41(01):136-7+46.)，严重影响了患者的生存质量。

放射性肠炎(Radiation enteritis，RE)是盆腔恶性肿瘤患者放疗后最常见的并发症(KORANY D A,SAID R S,AYOUB I M,et al.Protective effects of Browneagrandiceps(Jacq.)against Upsilon-radiation-induced enteritis in rats inrelation to its secondary metabolome fingerprint[J].Biomed Pharmacother,2022,146:112603.)，在接受盆腔放疗的患者中，大约90％的患者在接受放疗后会出现排便习惯的永久性改变，50％患者的生活质量会相应降低。尽管在减少放射治疗的肠道毒性方面取得了相当大的进展，但目前最常用的方法仍然是减少放射剂量，这必然会降低放疗效果(WANG Z,WANG Q,WANG X,et al.Gut microbial dysbiosis is associated withdevelopment and progression of radiation enteritis during pelvic radiotherapy[J].J Cell Mol Med,2019,23(5):3747-56.)。肠上皮细胞对辐射损伤非常敏感(RIEHL TE,FOSTER L,STENSON W F.Hyaluronic acid is radioprotective in the intestinethrough a TLR4 and COX-2-mediated.)，肠道细胞更新率高，所以肠粘膜比其他邻近结构更容易受到辐射损伤(BHUTTA B S,FATIMA R,AZIZ M.Radiation Enteritis[M].StatPearls.Treasure Island(FL).2022.)。有研究报道(ZHANG T,SHI L,LI Y,etal.Polysaccharides extracted from Rheum tanguticum ameliorate radiation-induced enteritis via activation of Nrf2/HO-1[J].J Radiat Res,2021,62(1):46-57.)，肠炎疾病发生是由于体内的自由基过量产生远超内源性生物的抗氧化防御机制，包括体内谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，导致体内有害生物活性氧大量在人体内积累，因此，打破了活性氧的产生和自由基清除之间的平衡，这种不平衡可能会介导许多生物大分子(包括脂质、蛋白质和DNA)的损伤，并导致严重的位点特异性氧化损伤。有研究学者也认为放射性肠炎的病理机制为放射线损坏了肠道组织的各屏障功能，从而导致人体肠道机械屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障系统的损伤，致使肠道内各屏障功能产生异常(李荣富,孙涛.放射性肠炎发生机制的研究进展[J]医学综述.2011,17(02):257-9.)。完整的上皮体系表代表物理屏障，保护机体免受病原体和有害物质入侵，防止营养物质损失(FISCHER J C,WINTGES A,HAAS T,et al.Assessment of mucosal integrity byquantifying neutrophil granulocyte influx in murine models of acuteintestinal injury[J].Cell Immunol,2017,316:70-6.)。在受到辐射后，肠绒毛可能会发生不同程度的钝化和融合，肠绒毛上皮细胞的衰减、增生和隐窝的严重丧失，导致上皮细胞内环境稳定和上皮完整性的破坏(MERRITT A J,POTTEN C S,KEMP C J,et al.The roleof p53 in spontaneous and radiation-induced apoptosis in the gastrointestinaltract of normal and p53-deficient mice[J].Cancer Res,1994,54(3):614-7.)。放射性肠损伤严重影响了腹部或盆腔肿瘤患者的治疗，降低患者的生活质量。然而，在临床上却没有针对放射性肠炎治疗的统一临床路径(CHENG Y,DONG Y,HOU Q,et al.Theprotective effects of XH-105against radiation-induced intestinal injury[J].JCell Mol Med,2019,23(3):2238-47.)。许多研究报告显示中草药或提取物可能会减少受照动物脑、食道和血液系统由于放射诱导的损伤(KINDEKOV I,MILEVA M,KRASTEV D,etal.Radioprotective effect of Rapana thomasiana hemocyanin in gamma inducedacute radiation syndrome[J].Biotechnol Biotechnol Equip,2014,28(3):533-9.LUL,WANG Y Y,ZHANG J L,et al.p38 MAPK Inhibitor Insufficiently Attenuates HSCSenescence Administered Long-Term after 6Gy Total Body Irradiation in Mice[J].Int J Mol Sci,2016,17(6).LI D,TIAN Z,TANG W,et al.The Protective Effectsof5-Methoxytryptamine-alpha-lipoic Acid on Ionizing Radiation-InducedHematopoietic Injury[J].Int J Mol Sci,2016,17(6).SURYAVANSHI S,SHARMA D,CHECKER R,et al.Amelioration of radiation-induced hematopoietic syndrome byan antioxidant chlorophyllin through increased stem cell activity andmodulation of hematopoiesis[J].Free Radic Biol Med,2015,85:56-70.LI J,XU J,XUW,et al.Protective Effects of Hong Shan Capsule against Lethal Total-BodyIrradiation-Induced Damage in Wistar Rats[J].Int J Mol Sci,2015,16(8):18938-55.)，但对保护放射诱导肠道损伤的药物研究仍在进行。

蒙药巴特日-7是由草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、银朱、麝香7味药材组成的水丸制剂，功能主治为：清瘟解毒，消“粘”，止痛，散瘀止痢。是蒙医临床用于治疗肠炎的常用经典复方。现代药理实验证明巴特日-7水丸制剂具有抗病毒、抗菌、抗炎、增强免疫等药理作用，临床疗效确切，具有蒙药抗菌药物之称(李淑艳,包晓华,李淑红,等.蒙药巴特日七味丸不同提取部位体外抗菌活性筛选和急性毒性研究[J]中国现代应用药学.2019,36(23):2888-93.)。李淑艳等(李淑艳,乌云参丹,刘燕,等.巴特日-7对肠炎大鼠及其血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平的影响[J]中成药.2020,42(07):1748-53.)研究了巴特日-7对肠炎大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10三项炎性指标的影响，用HE染色观察结肠组织病理学改变。结果给药组与对照组相比较，TNF-ɑ、IL-1β水平降低，IL-10水平增加(P＜0.05，P＜0.01)，结肠组织病理学明显改善。希仁塔娜(希仁塔娜.蒙药巴特日-7治疗急性细菌性痢疾临床效果观察[J]健康之路.2016,15(11):79-80.)研究题为《蒙药巴特日-7治疗急性细菌性痢疾临床效果观察》一文中指出蒙药巴特日-7具有明显的止泻作用。何东一(何东一.蒙药巴特日-7治疗急性细菌性痢疾80例疗效分析[J]生物技术世界.2013,(09):56.)对蒙药巴特日-7与西药诺氟沙星对细菌性痢疾效果的研究，结果显示服用蒙药巴特日-7患者的止泻时间短于服用诺氟沙星的患者，临床治疗效果良好。综上所述，蒙药巴特日-7具有明显的抗炎、止泻作用，临床应用普遍。但未见蒙药巴特日-7用于治疗放射性肠炎的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，以放射性肠炎小鼠为研究对象，探讨蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠炎中的应用。

进一步地，还包括放射性肠损失模型的建立和给药剂量、给药方法的选择，以12Gy⁶⁰Coγ射线全身照射的小鼠建立放射性肠损伤模型，设计了三个给药剂量组，低剂量组265mg/kg、中剂量组530mg/kg、高剂量组1060mg/kg，设计了照前预防给药组、照后治疗给药组、预防+治疗给药组3种给药方案。

进一步地，还包括药物预处理：用研钵研磨蒙药巴特日-7为细粉末状，根据小鼠体重称取对应重量的巴特日-7粉末，用带盖试管进行盛装，根据小鼠数量量取对应容量的生理盐水对粉末进行溶解，按每只小鼠0.4ml生理盐水计算，溶解过程中先后用漩涡振荡器和超声进行辅助溶解。

进一步地，还包括样本制备：照射后6h、24h每个时间节点各取正常对照组，照射对照组，530mg/kg给药组小鼠各5只，处死后取小鼠小肠段进行免疫组化、炎性因子的检测；第3.5d每组各处死5只小鼠，取小鼠小肠段进行HE染色、免疫组化检测、炎性因子、异硫氰酸荧光素-葡聚糖的检测。

进一步地，还包括肠道HE染色，染色后在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

进一步地，免疫组化检测包括BrdU、Ki67、Olfm4、Tunel免疫组化检测，然后在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

进一步地，炎性因子的检测为qPCR检测炎性指标IL-6、TNF-α、Cxcl-5。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本申请以放射性肠炎小鼠为研究对象，探讨蒙药巴特日-7对放射性肠炎的预防和治疗作用，是首次将蒙药巴特日-7应用到放射性肠损伤的实验研究，结果显示巴特日-7能很好的保护照射后的小鼠肠绒毛结构，延长生存时间。随着放射疗法在癌症治疗中的不断应用，如何将放射疗法的副作用降到最小，提高患者的生活质量，是有待解决的迫切问题。蒙药属于民族医药，同中药一样具有副作用小，疗效确切等优点，由于民族地域限制，蒙药的应用范围受限，将蒙药巴特日-7应用到放射性肠损伤的研究，拓展了其研究范围。结蒙药巴特日-7能有效改善由放射引起的小鼠肠道损伤、保护肠绒毛结构、降低炎性因子表达、延长存小鼠活时间。此申请为放射诱发肠道损伤的患者寻找新的有效的治疗药物提供依据。

附图说明

图1为12Gy照射后第3.5d各实验组小鼠肠道外观；

图2为12Gy照射后第3.5d各实验组小肠组织HE染色(20X)；

图3为Bateri-7对12Gy照射后3.5d小肠绒毛高度和隐窝深度的影响；

图4为FITC-dextran标准曲线的绘制；

图5为Bareri-7对受照小鼠FITC-dextran检测结果的影响；

图6为12Gy照射后小鼠小肠BrdU免疫组化染色(20X)；

图7为12Gy照射后3.5d小鼠小肠Ki67免疫组化染色(20X)；

图8为12Gy照射后3.5d Olfm4干细胞免疫组化染色(20X)；

图9为BrdU、Ki67检测Bateri-7对12Gy照射后小肠隐窝细胞增殖的影响；

图10为12Gy照射后3.5d小肠隐窝Olfm4阳性干细胞表达情况；

图11为巴特日-7对12Gy照射后不同时间点小肠隐窝细胞凋亡的影响(20X)；

图12为12Gy照射后不同时间点小肠隐窝Tunel阳性细胞表达量；

图13为巴特日-7对12Gy受照小鼠小肠炎性因子表达的影响；

图14为巴特日-7对12Gy照射后小鼠存活时间的影响；

图15为巴特日-7对12照射后小鼠体重的影响。

具体实施方式

一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，以放射性肠炎小鼠为研究对象，探讨蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠炎中的应用。

实验方法

(一)给药剂量和给药方法的选择

确定巴特日-7防治放射性肠损伤的最佳剂量，通过成人临床给药剂量经过换算得到小鼠体内的给药剂量为530mg/kg。以12Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射的小鼠建立放射性肠损伤模型，我们设计了三个给药剂量组，低剂量组(265mg/kg)、中剂量组(530mg/kg)、高剂量组(1060mg/kg)，结果发现中剂量组(530mg/kg)的BrdU、Ki67阳性隐窝数和小肠绒毛高度最优，低剂量组次之，高剂量组最差。给药方法选择实验，设计照前预防给药组、照后治疗给药组、预防+治疗给药组3种给药方案，从BrdU、Ki67阳性隐窝数和小肠绒毛高度方面评价，预防+治疗给药组效果最佳。

(二)实验动物分组

75只SPF级C57 BL/6J雄性小鼠，采用随机数字表法分为6组，分别为：正常对照组(n＝15)、照射对照组(n＝15)、给药组(530mg/kg)(n＝15)、存活照射对照组(n＝10)、存活低剂量给药组(265mg/kg)(n＝10)、存活高剂量给药组(530mg/kg)(n＝10)，实验遵循国家《实验动物管理条例》。

(三)给药方法

给药组(530mg/kg)小鼠照射前7d和照射后3d连续灌胃给药巴特日-7，每天一次。在给药7d后进行12Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射小鼠。照射对照组按以上时间节点给予灌胃生理盐水，每天一次。巴特日-7给药组按530mg/kg剂量给药；存活低剂量给药组按265mg/kg剂量给药、存活高剂量给药组按530mg/kg剂量给药，每天根据小鼠体重换算给药量，每只小鼠给药量为0.4ml，照射对照组给予等体积的生理盐水，正常对照组正常饲养。

(四)药物预处理

给药配置：用研钵研磨蒙药巴特日-7为细粉末状，根据小鼠体重称取对应重量的巴特日-7粉末，用带盖试管进行盛装。根据小鼠数量量取对应容量的生理盐水对粉末进行溶解，按每只小鼠0.4ml生理盐水计算，溶解过程中先后用漩涡振荡器和超声进行辅助溶解。

(五)放射性肠损伤模型的建立

于给药第8d，将小鼠盛放在照射固定装置内，放置于放射源下，给予12Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射小鼠造模。放射源采用中国人民解放军军事医学科学院辐射医学研究所⁶⁰Coγ射线放射源，源皮距离为3m，照射剂量为12Gy，剂量率60.06cGy/min。造模成功的标准为照射对照组小鼠体重下降、出现大便形状改变，如稀便、粘液便、血便。

(六)样本制备

照射后6h、24h每个时间节点各取正常对照组，照射对照组，给药组(530mg/kg)小鼠各5只，处死后取小鼠小肠段进行免疫组化(BrdU、Tunel)、炎性因子(IL-6、TNF-α、Cxcl-5)的检测；第3.5d每组各处死5只小鼠，取小鼠小肠段进行HE染色、免疫组化(BrdU、Ki67、Tunel、Olfm4)检测、炎性因子(IL-6、TNF-α、Cxcl-5)、FITC-dextran(n＝5)的检测，所有检测试剂均采用商品化的试剂盒。存活观察组正常饲养观察。

(七)肠道HE染色

1、脱蜡

二甲苯(I)6min，二甲苯(Ⅱ)6min，二甲苯(Ⅲ)6min，100％乙醇(I)6min，100％乙醇(Ⅱ)6min，95％的乙醇4min(I)，95％的乙醇(Ⅱ)4min，90％乙醇4min，85％乙醇4min，75％乙醇4min。

2、染色

脱蜡后自来水冲洗，洗掉玻片上多余的乙醇；苏木素染色5min，然后自来水再次冲洗，去掉染色液；分化液2～3s，自来水冲洗，去掉分化液；碳酸锂溶液30s，用自来水返蓝10min；以下顺序依次进行70％乙醇2min；85％乙醇2min；95％乙醇2min；伊红染色10s；95％乙醇(I)30s；95％乙醇(II)1min；100％乙醇(I)2min；100％乙醇(II)2min；二甲苯3min；中性树脂封片。

3、结果判读

在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

(八)BrdU、Ki67、Olfm4的免疫组化检测

1、脱蜡和水化

石蜡切片处理后置于新鲜二甲苯中，2缸，浸泡6min/缸；

去除多余的液体后，将切片置于无水乙醇中，2缸，每缸浸泡6min；

去除多余的液体后，将切片置于95％乙醇中，1缸，浸泡6min；

去除多余的液体后，将切片置于75％乙醇中，1缸，浸泡4min；

去除多余的液体后，蒸馏水冲洗，置于PBS缓冲液中。

2、抗原修复

在高压锅中加入pH8.0的EDTA抗原修复液，待修复液沸腾后将切片置于修复液中，计时4min；将高压锅移至冷水中冷却；待锅中液体冷却至室温后取出切片，用PBS冲洗缓冲液浸泡清洗3次，每次5min。

3、内源性过氧化物酶阻断

每张玻片加入100μl的内源性过氧化物酶阻断剂(3％H₂O₂)，室温孵育10min；用蒸馏水清洗2次后甩干液体，用疫组化笔在距离组织周围2～3mm处画圈，将组织圈起。

4、加一抗(BrdU、Ki67、Olfm4)试剂

每张玻片滴加100μl一抗工作液，2～8℃在保湿盒内孵育过夜；过夜后用PBS缓浸泡冲液3次，每次5min。

5、滴加酶标羊抗鼠/兔lgG聚合物。

每张玻片滴加100μl酶标羊抗鼠/兔lgG聚合物，37℃孵育20min或室温孵育1h；用PBS缓中液浸泡3次每次5min。

6、滴加显色剂

每张玻片滴加100μl新鲜配制的DAB显色剂，室温下显示1～2min。

7、复染

将以上显示好的玻片先用自来水冲洗，然后苏木素染色液室温染色5min，自来水冲洗干净，进行盐酸酒精分化，分化后自来水返蓝10min。然后依次进行一下步骤：70％乙醇1min；80％乙醇1min；95％乙醇(Ⅰ)1min；95％乙醇(II)2min；100％乙醇4min；二甲苯3min；中性树脂封片。

8、结果判读

在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

(九)Tunel免疫组化检测

1、脱腊和水化步骤同上

2、消化

标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1～15min，0.01MTBS洗3次每次2min。

3、标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片，以保持切片湿润。每张切片取TdT和BIO-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液，混匀，甩去片上多余的液体后加标记液，20ml/片。置样品于湿盒内，37℃标记2h。

4、0.01M TBS洗3次每次2min。

5、加封闭液50ml/片，室温30min，甩掉封闭液，不洗。

6、用SABC稀释液1:100稀释，SABC-POD，取1ml SABC稀释加SABC原液10μl，混匀后50ml/片加至切片。37℃反应60min。0.01M TBS(PH7.5)洗4次每次5min。

7、BCIP/NBT显色：BCIP/NBT(×20)按1:20的比例用0.01M TBS(PH9.0～9.5)稀释，混匀，显色液加置标本上。

8、复染同上。

9、结果判读同上。

(十)qPCR检测炎性指标IL-6、TNF-α、Cxcl-5

1、肠道RNA提取

(1)肠道组织样品处理：取材小鼠小肠组织，去除小肠表面水分后放于标记组别的1.5ml无RNA酶EP管中，加入1ml Trizol溶液，每管加入三粒钢珠进行组织匀浆处理，离心后取上清溶液。

(2)三氯甲烷抽提：加入200μl三氯甲烷溶液，手动剧烈摇晃15～20s后静置10min，静置后4℃12000rpm离心15min吸取上层液体于无RNA酶EP管中。

(3)异丙醇沉淀纯化RNA：在上步分离的液体中加入500μl异丙醇，漩涡震荡充分混匀沉淀物后静置10min，4℃12000rpm离心10min后用微量加样器小心将上清液吸干净，保留下层沉淀。

(4)乙醇洗涤RNA：在含有RNA沉淀的EP管中加入1ml 75％无水乙醇溶液，轻轻振荡，悬浮沉淀，4℃8000rpm离心10min。

(5)晾干RNA沉淀：用微型台式真空泵小心吸尽上清液，尽可能吸干管壁液体，而后置于通风处干燥10min。

(6)用20μl DEPC处理的水将RNA溶解，漩涡震荡后，用微量分光光度计检测RNA的含量和纯度。

2、逆转录

(1)逆转录第一步体系的配置

表1逆转录第一步体系的配置

混匀后，42℃孵育2min，4℃保持。

(2)逆转录第二步体系配置

表2逆转录第二步体系配置

混匀后上机(37℃孵育15min，85℃5s，4℃Forever)逆转录，获得cDNA。

3、RT-PCR反应

按照下表配置反应体系：

表3配置反应体系

体系配置完成后，进行上机扩增，运行程序是：95℃10min；95℃变性15s，60℃复性1min，72℃延伸30s，共经过40个循环；最后进行95℃15s，60℃1min，95℃15s。运行结束后使用Bio-rad软件分析各基因相对表达量。

表4引物序列信息

(十一)异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)检测

1、小鼠禁食禁水8h后，通过口服灌胃给药FITC-dextran；

2、4.5h后，从小鼠心脏取血，8800rpm离心10min；

3、离心后血浆与PBS 1:1混合，并在平板读取器上以485nm激发波长和535nm发射波长进行分析。

三、统计学分析

应用Graphpad prism 8软件进行统计分析和作图。Kaplan-Meier法进行生存分析，生存数据的比较采用Log-rank检验，体质量采用重复测量的方差分析，根据方差齐性结果采用LSD检验或Tamhane's T2检验进行事后比较。P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果

一、巴特日-7对受照小鼠肠道绒毛高度和隐窝深度的影响

12Gy照射后第3.5d，解剖小鼠观察肠道外观变化，取小肠组织制备病理切片，HE染色观察小鼠肠绒毛组织形态学改变并测量绒毛高度和隐窝深度。解剖小鼠腹腔发现，照射对照组与正常对照组相比，小鼠肠道组织出现较严重损伤，肠管充血水肿、肠壁变薄，肠内容物稀溏。巴特日-7给药组小鼠肠道组织接近正常状态，未发生明显的充血水肿及肠壁变化(见图1)。小肠组织切片HE染色结果显示，照射后第3.5d，照射对照组小鼠肠绒毛全部脱落，隐窝排列不齐；巴特日-7给药组小鼠肠绒毛组织结构良好，排列整齐，形态完整，少量绒毛发生断裂(见图2)。用ImageJ软件测量两组小肠绒毛长度和隐窝深度，巴特日-7给药组与照射对照组相比肠绒毛长度差异具有统计学意义(P<0.001)，两组隐窝深度比较无明显差异(见图3)。

图1和图2中A：正常对照组B：照射对照组C：巴特日-7给药组(530mg/kg)；

图3中照射后3.5d给药组小鼠小肠绒毛长度与照射对照组相比，****P＜0.001。

二、巴特日-7对受照小鼠小肠屏障功能的影响

12Gy照射后3.5d，巴特日-7给药组和照射对照组各取5只小鼠，提前8h禁食禁水，FITC-dextran灌胃给药，给药4.5h后，心脏取血，离心后将血浆与PBS 1:1混合，在平板读取器上进行分析。结果显示，巴特日-7给药组小鼠外周血中FITC-dextran的浓度显著低于照射对照组，差异有统计学意义(P<0.001)(见图5)。

表5 12Gy照射后第3.5d FITC-dextran浓度测定

图5中照射后3.5d给药组与照射对照组血浆FITC-dextran浓度相比，***P＜0.001。

三、巴特日-7对受照小鼠小肠隐窝细胞的增殖作用

12Gy照射后第6h、24h、3.5d分别取小鼠小肠组织进行BrdU免疫组化检测，在第3.5d同时进行Ki67的检测，观察照射后小鼠肠道隐窝细胞增殖情况。结果显示，照后6h、24h巴特日-7给药组和照射对照组相比BrdU的阳性隐窝细胞数量无明显差别(见图6A1、A2、B1、B2)；照后第3.5d，照射对照组BrdU和Ki67检测阳性隐窝细胞数量明显减少，而巴特日-7给药组BrdU和Ki67检测的阳性隐窝细胞数量均明显增加(见图6C1、C2，图7A、B)，差异均具有统计学意义(P<0.01、P<0.05)(见图9A、B)。表明蒙药巴特日-7能够促进照射后小鼠小肠隐窝细胞再生功能。照射后第3.5d检测小鼠小肠隐窝Olfm4阳性干细胞数发现，巴特日-7给药组与照射对照组相比，无统计学差异(P＞0.05)(见图10)。

图6中A1、B1、C1分别为照射对照组6h、24h、3.5d Brdu免疫组化染色；A2、B2、C2分别为巴特日-7给药组6h、24h、3.5dBrdu免疫组化染色；

图7中A为照射对照组免疫组化染色、B为巴特日-7给药组免疫组化染色；

图8中A：正常对照免疫组化染色B：照后3.5d照射对照组免疫组化染色C：照后3.5d巴特日-7给药组免疫组化染色

图9中照射后3.5d给药组BrdU+隐窝数与照射对照组相比，**P＜0.01，照射后3.5d给药组Ki67+隐窝数与照射对照组相比，*P＜0.05。

四、巴特日-7对受照小鼠小肠隐窝细胞凋亡影响

由于在照射早期小肠隐窝细胞即会发生凋亡，故选择照射后6h和24h观察隐窝细胞凋亡情况。结果显示，照后6h和24h，巴特日-7给药组与照射对照组相比小鼠小肠隐窝Tunel阳性细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)(见图11、图12)。表明巴特日-7具有明显抑制照射后小鼠隐窝细胞凋亡的作用。

图11中A1：6h正常对照组、A2：照后6h照射对照组、A3：照后6h给药组B1：24h正常对照组、B2：照后24h照射对照组、B3：照后24h给药组

图12中照射后6h给药组小肠隐窝细胞凋亡数量与照射对照组相比，**P<0.01，照射后24h给药组小肠隐窝细胞凋亡数量与照射对照组相比，*P<0.05。

五、巴特日-7对小鼠小肠炎性因子表示水平的影响

照射后6h、24h、3.5d取小鼠小肠组织检测IL-6、TNF-α、Cxcl-5的表达。照射后6h，巴特日-7给药组小鼠小肠组织IL-6和Cxcl-5的表达水平较照射对照组均升高(P＜0.01，P＜0.01)(见图13A、C)；在照射后24h，巴特日-7给药组小鼠小肠组织TNF-α的表达高于照射对照组(P＜0.05)，IL-6的表达低于照射对照组(P＜0.001)(见图13A、B)；在照射后3.5d，巴特日-7给药组小鼠小肠组织IL-6、TNF-α和Cxcl-5的表达均低于照射对照组，两组相比较具有统计学意义(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)(见图13A、B、C)。以上实验结果提示，巴特日-7能够抑制放射性肠损伤小鼠小肠炎性反应。

图13中照射后6h给药组IL-6的表达与照射对照组相比，**P＜0.01，照射后24h、3.5d给药组IL-6的表达与照射对照组相比，***P＜0.001、**P＜0.01；照后24h给药组TNF-α的表达与照射对照相比，*P＜0.05，照射后3.5d给药组TNF-α的表达与照射对照组相比，**P＜0.01；照射后6h给药组Cxcl-5的表达与照射对照组相比，**P＜0.01，照射后3.5d给药组Cxcl-5的表达与照射对照组相比，***P＜0.001。

六、巴特日-7对受照后小鼠存活时间的影响

存活实验各组小鼠在照射后均能正常摄水、摄食，在照射后第2d 3组小鼠一般状态出现变化，表现为不同程度的体重减轻，反应迟钝。照射后第3d，照射对照组和265mg/kg巴特日-7低剂量给药组小鼠开始出现肠道症状，表现为稀便，精神状态较照射前萎靡，行动迟缓，530mg/kg巴特日-7高剂量给药组精神状态稍好。照射后第4d三组小鼠均出现死亡现象，照射后第6d 265mg/kg低剂量给药组小鼠全部死亡，照射后第7d照射对照组小鼠全部死亡，照射后第10d 530mg/kg巴特日-7高剂量给药组小鼠全部死亡。三组小鼠均未出现脓血便情况。530mg/kg巴特日-7高剂量给药组小鼠生存时间与存活照射对照组和265mg/kg巴特日-7低剂量给药组小鼠生存时间相比，均具有统计学意义(P<0.05；P<0.05)；265mg/kg巴特日-7低剂量给药组小鼠与存活照射对照组小鼠存活时间相比无统计学差异(P>0.05)(见图14)。照射后三组小鼠组间体重变化无统计学差异(P>0.05)(见图15)。

图14中高剂量给药组小鼠存活时间与对照组小鼠存活时间相比，*P<0.05；高剂量给药组小鼠存活时间与低剂量给药组小鼠存活时间相比，*P<0.05。

讨论

放射性肠炎是接受腹盆放疗的癌症患者的主要副作用。放射治疗是一种有效的癌症治疗方法，但同时也会引起周围健康组织暴露。胃肠道，尤其是小肠，对辐射特别敏感，这使得它在腹部和盆腔癌的放射治疗中邻近组织容易受到辐射。辐射引起胃肠道损伤的组织病理学特征是隐窝细胞破坏，绒毛高度和数量减少，上皮屏障功能受损。哺乳类动物的小肠上皮由单层上皮细胞组成，这些细胞排列形成“隐窝-绒毛”结构，不仅极大增加了肠道吸收的有效面积，其构成的机械屏障也是维持肠粘膜屏障完整的重要组成部分。放射性肠损伤是一种特殊类型的肠损伤。放射可迅速引起肠上皮细胞出现大量凋亡、坏死、脱落。位于隐窝内的小肠干细胞一旦受损，表现为干细胞数量急剧减少和功能减退，导致损伤后的肠上皮修复非常困难，如何促进小肠干细胞数量和功能的恢复是当前治疗放射性肠损伤、修复受损肠上皮研究的热点。

最近几年中蒙药研究取得显著的效果，根据资料来分析，天然药物有效成分能够利用诱导细胞凋亡、调节细胞信号转导、诱导细胞分化、逆转多药耐药、抑制端粒酶活性等方式产生显著的效果。蒙药作为蒙古族特有的一种药物，其具有低毒、高效、疗效独特等显著优势，而且还具有不容易产生耐药性的特征，患者长期服用除了能够提升机体功能，还能够多环节、多靶点、多效应的发挥出显著的作用。蒙药巴特日-7是蒙医传统验方，由草乌叶、诃子、茜草、多叶棘豆、黑芸香、人工麝香、银朱七味药材组成。蒙医临床主要用于治疗内科、妇科、耳鼻喉科、口腔科、皮肤科等疾病。它具有抗病毒、抗菌、抗炎、镇痛、增强免疫等作用，蒙医临床用于治疗肠炎。巴特日-7具有清热解毒、消粘的功效，为肠刺痛及黏热症的常用主方。在现代药理研究中，草乌叶具有抗炎、镇痛之效；诃子对平滑肌有解痉效果，能抑菌、抗氧化；麝香则能在抗炎的同时对血管通透性进行抑制；茜草具有抗血小板聚集、解痉、抑制病菌之效。经长期临床实践证明，巴特日-7对于某些真菌以及大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、肺炎球菌、结核杆菌及金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，临床抗炎疗效显著，是蒙医临床治疗肠炎的首选药物，具有蒙药抗生素之称。

本研究在成功建立小鼠放射性肠损伤模型的基础上，探讨蒙药巴特日-7对小鼠放射性肠损伤的作用。本研究结果显示在照射后3.5d小鼠小肠HE染色发现，给药组小鼠小肠绒毛组织结构良好，绒毛排列整齐，形态完整；照射对照组小鼠肠绒毛全部脱落或缺如，隐窝排列不齐。经ImageJ软件测量给药组小鼠小肠绒毛长度明显大于对照组。证明巴特日-7能有效保护受照小鼠小肠绒毛结构。小肠绒毛是肠道机械屏障的重要组成部分，肠道屏障是一个半透性屏障，用于分隔内外环境，选择性地吸营养物质和电解质，同时阻止其他有害物质的进入。既然巴特日-7对小鼠小肠绒毛结构有显著保护作用，由此推测巴特日-7也能保护放射性肠损伤小鼠的肠道屏障功能。通过查阅文献得知，荧光标记物异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC–dextran)渗透实验正是用于评价炎性肠病中肠道通透性的经典技术手段。葡聚糖分子(dextran)是一种惰性不易消化的探针，可与荧光标记物异硫氰酸荧光素(FITC)相连，形成FITC-dextran化合物。在肠粘膜严重受损时，口服FITC–dextran分子可以从肠腔进入全身血液循环，测量小鼠外周血中FITC–dextran含量，来反映肠粘膜的受损程度。实验结果显示，巴特日-7给药组小鼠外周血中FITC-dextran的含量显著低于照射对照组，两组差异有统计学意义(P<0.001)，该结果表明巴特日-7能有效保护受照小鼠小肠屏障功能。

白细胞介素-6(IL-6)是一种功能广泛的多效性细胞因子，可调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要由活化的单核/巨噬细胞产生，促进中性粒细胞吞噬，抗感染，是重要的炎症因子，参与某些自身免疫疾病的病理损伤。趋化因子-5(Cxcl-5)主要来源上皮细胞，能与中性粒细胞表面的特异性受体CXCR2结合，激活和趋化中性粒细胞，促进炎症反应。核因子-κB(NF-κB)转录因子家族被认为是炎症过程的中心介质，是先天性和适应性免疫应答的关键参与者。他参与细胞对外界刺激(细胞因子、辐射等)的反应，金辉等研究发现巴特日-7能够降低大鼠胰腺组织NF-κB的表达。本实验中在照后第3.5d经巴特日-7干预的小鼠小肠组织IL-6、TNF-α、Cxcl-5的表达均处于较低水平，与照射对照组相比较差异具有统计学意义。说明巴特日-7能够降低炎性因子表达，机制可能与降低肠道组织NF-κB表达有关，相关机制有待下一步研究。

肠干细胞在放射诱导损伤后粘膜再生中起着至关重要的作用，而放射诱导的细胞凋亡可能是引发胃肠道综合征的主要因素。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Tunel)染色被广泛用于衡量细胞凋亡，是评估生物系统中细胞凋亡表现的有力工具。5-溴-2'-去甲酰尿苷(BrdU)常被用于科学研究中，作为新分裂细胞的标记物，通常用于标记增殖细胞。通过巴特日-7干预的小鼠照射后小肠隐窝Tunel阳性的数量明显减少，BrdU阳性隐窝数增多，说明巴特日-7能够促进照射后小鼠隐窝细胞增殖和抑制由照射引起的细胞凋亡。

小肠绒毛上皮细胞，特别是隐窝干细胞，对照射早期非常敏感，即使照射剂量控制在一定范围内，小肠隐窝干细胞通过自我更新的方式进行修复，但是干细胞补偿式增殖更新有限，最终还将会导致炎症的发生和粘膜屏障的受损，随后出现肠炎相关症状。粘膜屏障是肠道屏障中最重要的部分，放射线可破坏肠道粘膜结构的完整性，导致肠道组织结构及功能发生变化。因此，提高上皮细胞增殖、维持肠道粘膜完整对于放射性肠道损伤的预防和治疗至关重要。存活实证明经巴特日-7给药能够有效延长放射性肠损伤小鼠的存活时间，这与巴特日-7能够促进小肠隐窝增殖，保护粘膜屏障，降低炎性因子表达和延缓细胞凋亡有关，但放射性肠炎发生机制复杂，尚需进一步研究。

放射性肠炎迁延反复，顽固难愈，蒙药和中药同宗，具有副作用小，治疗彻底等优点，本研究拓展了蒙药巴特日-7临床应用思路，也为临床治疗放射性肠损伤提供了新的视角。

Claims (7)

1.一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，以放射性肠炎小鼠为研究对象，探讨蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠炎中的应用。

2.根据权利要求1所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，还包括放射性肠损失模型的建立和给药剂量、给药方法的选择，以12Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射的小鼠建立放射性肠损伤模型，设计了三个给药剂量组，低剂量组265mg/kg、中剂量组530mg/kg、高剂量组1060mg/kg，设计了照前预防给药组、照后治疗给药组、预防+治疗给药组3种给药方案。

3.根据权利要求2所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，还包括药物预处理：用研钵研磨蒙药巴特日-7为细粉末状，根据小鼠体重称取对应重量的巴特日-7粉末，用带盖试管进行盛装，根据小鼠数量量取对应容量的生理盐水对粉末进行溶解，按每只小鼠0.4ml生理盐水计算，溶解过程中先后用漩涡振荡器和超声进行辅助溶解。

4.根据权利要求3所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，还包括样本制备：照射后6h、24h每个时间节点各取正常对照组，照射对照组，530mg/kg给药组小鼠各5只，处死后取小鼠小肠段进行免疫组化、炎性因子的检测；第3.5d每组各处死5只小鼠，取小鼠小肠段进行HE染色、免疫组化检测、炎性因子、异硫氰酸荧光素-葡聚糖的检测。

5.根据权利要求4所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，还包括肠道HE染色，染色后在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

6.根据权利要求5所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，免疫组化检测包括BrdU、Ki67、Olfm4、Tunel免疫组化检测，然后在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。

7.根据权利要求6所述一种蒙药巴特日-7在预防和治疗放射性肠道损伤中的应用，其特征在于，炎性因子的检测为qPCR检测炎性指标IL-6、TNF-α、Cxcl-5。

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