CN115247161A - Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶活性的应用和方法 - Google Patents
Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶活性的应用和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了Genapol X‑080用于提高胆固醇酯酶活性的应用和方法。本发明的提高胆固醇酯酶活性的方法包括将表面活性剂Genapol X‑080与胆固醇酯酶混合。本发明具有特别优异的提高胆固醇酯酶活性的效果，可将胆固醇酯酶的活力提高2‑400倍。另外，本发明的方法简单、低毒，具有良好的环境友好性。
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，涉及Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶酶活的应用和方法。
背景技术
胆固醇酯酶(Sterol esterase，EC 3.1.1.13)，是一类能催化胆固醇酯的酯键断裂或合成的水解酶。胆固醇酯酶活性中心催化三联体由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸三个氨基酸残基构成。研究表明，很多的人类多发症，如心脑血管疾病、肝胆疾病、肾病、糖尿病等，都与人体的胆固醇代谢出现异常有关联。因而，测定血浆总胆固醇的含量己经成为临床诊断中的一个重要参考指标。就现阶段的胆固醇检测来看，胆固醇酯酶是其中的一个关键酶，它能够快速准确的检测出血清中总胆固醇的浓度，以用来作为诊断诸如动脉硬化的脂质紊乱疾病。除此之外，其还可以用来研究其他诸多临床相关疾病，如糖尿病、肾病等。另外，胆固醇酯酶在有机合成(尤其是甾醇衍生物类药物的合成)、造纸、食品加工、高分子材料的合成(或降解)等领域也有广阔的应用前景。
非离子表面活性剂是分子中含有在水溶液中不解离的醚基为主要亲水基的表面活性剂，其表面活性由中性分子体现出来。非离子表面活性剂具有高的表面活性，刺激性小，良好的增溶、洗涤、抗静电、钙皂分散等性能。Genapol X-080 表面活性剂是一种非离子表面活性剂，具有无毒、无刺激、生物降解性好、稳定性高等优点，且在水溶液中不电离，不受强电解质、强酸、强碱的影响，可与其他表面活性剂配伍，在纺织、皮革、印染、医药及洗护用品等方面具有良好的应用前景。
目前可以用蛋白质修饰技术，比如有机溶剂的修饰、固定化技术等来调节和提高酶的活性。但是这些技术通常无法从本质上改变其催化水解的性能。目前已有文献报道，利用表面活性剂来提高酯酶的水解活性。比如合成特定的表面活性剂去处理酯酶而形成"包衣酶"，或者在有机相中利用表面活性剂形成反胶束，增加酶蛋白非水相中的溶解性从而提高其活性。但这些技术操作复杂且不具有通用性，因此开发一些简单方便的提高酯酶水解活性的技术具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、可简单方便地提高胆固醇酯酶的酶活的方法。
(1)一种提高胆固醇酯酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括将表面活性剂Genapol X-080与胆固醇酯酶混合。
(2)根据(1)所述的方法，其特征在于，在4.5-9的pH值下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合；优选地，在5.0-5.5的pH值下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。
(3)根据(1)所述的方法，其特征在于，在30℃-60℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合；优选地，在55℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。
(4)根据(1)所述的方法，其特征在于，表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶的混合重量比为(0.1-5):1。
(5)根据(1)所述的方法，其特征在于，在保护剂的存在下将表面活性剂 GenapolX-080与所述胆固醇酯酶混合。
(6)根据(5)所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括EDTA及其盐、白蛋白和缓冲剂。
(7)根据(1)-(6)中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括将表面活性剂Genapol X-080、胆固醇酯酶和胆固醇酯酶的底物混合。
(8)根据(7)所述的方法，其特征在于，在助溶剂和胆酸钠的存在下将表面活性剂Genapol X-080、胆固醇酯酶和胆固醇酯酶的底物混合。
(9)根据(7)所述的方法，其特征在于，所述胆固醇酯酶的底物包括2-18 元酸的胆固醇酯。
(10)表面活性剂Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶的活性的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明出乎意料地发现表面活性剂Genapol X-080具有特别优异的提高胆固醇酯酶活性的效果，并且只需简单地将Genapol X-080与胆固醇酯酶在溶液中混合即可实现提高其酶活的效果。由此，本发明开发了一种简单方便的提高胆固醇酯酶的酶活的方法。本发明的方法可将胆固醇酯酶的活力在不同程度上有所提高，可将胆固醇酯酶的活力提高2-400倍。
本发明还发现，表面活性剂Genapol X-080发挥提高胆固醇酯酶活性的作用的适宜pH值为4.5-9，适宜温度为30℃-60℃。这与胆固醇酯酶的最适pH值和温度一致。因此，Genapol X-080的加入并未改变胆固醇酯酶的最适pH值和温度。本发明还发现，Genapol X-080的加入也未改变胆固醇酯酶的底物特异性等性质。
表面活性剂Genapol X-080具有生物相容性、低毒性和良好的环境友好性。
附图说明
图1为pH＝7.5的条件下，不同温度对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响，图例中0代表不加表面活性剂，1代表加表面活性剂；
图2为T＝37℃的条件下，不同pH值对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响，图例中0代表不加表面活性剂，1代表加表面活性剂；
图3为T＝37℃，pH＝7.5的条件下，Genapol X-080对胆固醇酯酶底物特异性的影响，图例中0代表不加表面活性剂，1代表加表面活性剂；
图4为T＝37℃，pH＝7.5的条件下，不同加样顺序对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响，横坐标中0代表不加表面活性剂，1代表加表面活性剂。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，所述的表面活性剂为Genapol X-080，分子式如式Ⅰ所示：
HO-(CH2CH2O)9-(CH2)12-H (I)
本发明出乎意料地发现表面活性剂Genapol X-080具有特别优异的提高胆固醇酯酶活性的效果，并且只需将Genapol X-080与胆固醇酯酶在溶液中混合即可实现提高其酶活的效果。不希望受到理论的束缚，但推测Genapol X-080通过在水溶液中与胆固醇酯酶直接相互作用，通过改变胆固醇酯酶的微结构，从而提高胆固醇酯酶的活性。
基于以上发现，本发明提供了一种提高胆固醇酯酶的酶活的方法，其特征在于，所述方法包括将表面活性剂Genapol X-080与胆固醇酯酶混合。两者混合的时间可以为1-10分钟。
优选地，Genapol X-080与胆固醇酯酶的混合重量比为(0.1-5):1，在此范围内胆固醇酯酶的活力均有不同程度的提高。最优选地，Genapol X-080与胆固醇酯酶的混合重量比为0.8:1。当混合比不在此范围时，酶活提高不明显。
优选地，在去离子水中将Genapol X-080与胆固醇酯酶混合。
在一些具体的实施方案中，使用去离子水将Genapol X-080稀释至合适的浓度，然后加入胆固醇酯酶溶液中。所使用的Genapol X-080的合适的浓度优选为 1％(w/v)，所使用的胆固醇酯酶的浓度优选为0.08-0.22U/mL。
为了进一步提高胆固醇酯酶的活性，优选在4.5-9的pH值下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。例如，调节含有胆固醇酯酶的溶液的pH 至4.5-9或5-8，其为胆固醇酯酶的适宜pH。最优选地，在5.0-5.5的pH值下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。当pH值低于4.5或高于9 时，胆固醇酯酶本身的活力会下降。
还优选地，在30℃-60℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。例如，调节含有胆固醇酯酶的溶液的温度至30℃-60℃，其为胆固醇酯酶的适宜温度。最优选地，在55℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。当温度低于30℃或高于60℃时，胆固醇酯酶本身的活力会下降。
在一些具体的优选实施方案中，在保护剂的存在下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。保护剂的作用包括防止胆固醇酯酶降解。
所述保护剂优选包括EDTA及其盐、白蛋白和缓冲剂。
EDTA的盐包括EDTA-Na2、EDTA-K2；白蛋白包括BSA、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白、兔血清白蛋白等；所述缓冲剂可以为磷酸盐缓冲液，例如磷酸钾缓冲液。
表面活性剂Genapol X-080与胆固醇酯酶的混合体系中还可以包含MgCl2。
进一步地，本发明的方法还包括将胆固醇酯酶的底物与表面活性剂Genapol X-080以及胆固醇酯酶混合。其中，所述底物包括2-18元酸的胆固醇酯，包括醋酸胆固醇酯、丁酸胆固醇酯、己酸胆固醇酯、癸酸胆固醇酯、月桂酸胆固醇酯、胆固醇棕榈酸酯、硬脂酸胆固醇酯、油酸胆固醇酯、亚油酸胆固醇酯。
在本发明的方法中，表面活性剂Genapol X-080可以先与胆固醇酯酶混合，然后再将所得混合物与底物混合；或者先将表面活性剂Genapol X-080与底物混合，然后再将所得混合物与胆固醇酯酶混合。本发明发现，混合的顺序对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性的提高作用影响不大。
在一些具体的优选实施方案中，在助溶剂和胆酸钠的存在下将表面活性剂Genapol X-080、胆固醇酯酶和胆固醇酯酶的底物混合。助溶剂包括异丙醇、乙二醇、丙三醇、聚乙二醇等。
本发明发现，表面活性剂Genapol X-080可使胆固醇酯酶的活性有不同程度的提高，可将胆固醇酯酶的活力提高2-400倍，例如2倍、3倍、6倍、16倍、 156倍或400倍。所述胆固醇酯酶可购自日本旭化成公司、Roche公司、TOYOBO 公司、北京阿匹斯生物公司、Amano公司、Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
可以采用本领域常用的测定方法检测胆固醇酯酶的活性。在一些实施方案中，采用以下方法检测胆固醇酯酶的活性：
酶活定义：单位酶活定义为，在一定条件下，每分钟催化生成1μmol H2O2所需的酶量。
测定原理：胆固醇酯酶水解胆固醇酯为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇再被胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase,COD)氧化为Δ4-胆甾烯酮和H2O2，然后用显色系统(过氧化物酶(POD)，4-氨基安替比林(4-Aminonatipyrine,4-AA)和苯酚(phenol)，三者合称(PAP))来检测H2O2。
具体反应原理如下：
反应生成的红色醌亚胺染料可用分光光度计在555nm条件下检测。反应产生的颜色强度与胆固醇的含量和胆固醇酯酶的活性成正比，因此可以用比色法测定胆固醇酯酶的活力。
本发明另一方面提供了表面活性剂Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶的酶活的应用。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
除非特别说明，否则以下例子中所用常规流程、操作、材料和条件不再赘述。
下述例子中所用的胆固醇酯酶为购买的商品化的胆固醇酯酶，分别来源于日本旭化成公司(货号：T-243)、Roche公司(货号：11641735103)、TOYOBO 公司(货号：94280)、北京阿匹斯生物公司(货号：AA0007C)、Amano公司 (货号：43105)、Sigma-Aldrich公司(货号：C1403)、武汉瀚海新酶生物科技有限公司(货号：HH0407)。
实施例1：Genapol X-080表面活性剂对胆固醇酯酶活力的影响
(1)表面活性剂溶液的配制
以去离子水为溶剂，配制1％Genapol X-080(购自Sigma Aldrich)。
(2)底物溶液配制
不加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯(购自TCI)，加入 2.0mL异丙醇，加入约80mL 1％Genapol X-080于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，加入1％Genapol X-080定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
(3)胆固醇酯酶溶液配制
在pH 7.5，20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％ BSA)(酶稀释液)中配制不同来源的胆固醇酯酶溶液，以将酶稀释至0.15 U/mL。其中不同来源的胆固醇酯酶分别购于日本旭化成公司、Roche公司、 TOYOBO公司、北京阿匹斯生物公司、Amano公司、Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
(4)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液(购自Roche公司)。
(5)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液(购自瀚海新酶公司)。
(6)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS(购自BBI Life Sciences)溶液和 50mM4-AA(购自Sigma Aldrich)溶液。
(7)0.2M磷酸钾缓冲液的配制
以去离子水为溶剂，配制0.2M磷酸钾溶液，并调节pH值至7.5。
(8)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL底物溶液，15μLPOD溶液， 50μLTOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，37℃温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入100μL酶稀释液，混匀，37℃反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs)和空白(ΔAb)在 OD555nm时，1min内吸光度的变化。
活力计算公式：
重量活力(U/mg)＝体积活力×1/C
ΔA＝ΔAs-ΔAb；2.95：反应液总体积(mL)；0.10：酶液体积(mL)；1：反应时间(min)；df：稀释倍数；C：酶浓度(mg/mL)；1/2：1摩尔过氧化氢生成 1/2摩尔醌亚胺染料；39.2：标准反应条件下，生色基团在555nm处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。
表1为Genapol X-080表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶酶活力的影响。结果如表1所示，当添加1％Genapol X-080时，胆固醇酯酶酶活力有大幅度提高。其中购买于瀚海新酶胆固醇酯酶酶活由0.51U/mg提高到204.49U/mg，旭化成来源， Roche来源，TOYOBO来源，阿匹斯来源，Amano来源和Sigma-Aldrich来源的胆固醇酯酶酶活也分别由72.41U/mg，6.02U/mg，44.34U/mg，1.19U/mg，0.56U/mg， 0.60U/mg提高到204.55U/mg，99.49U/mg，294.62U/mg，186.14U/mg，1.89U/mg， 2.01U/mg。
表1：Genapol X-080表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶活力的影响
实施例2：其他种类表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶活力的影响
(1)表面活性剂溶液的配制
以去离子水为溶剂，配制1％不同种类的表面活性剂，其中Genapol X-100购于Sigma Aldrich，Tween 80购于国药集团化学试剂有限公司，Brij 35购于 Sigma Aldrich。
(2)底物溶液配制
不加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，加入约80mL 1％不同种类的表面活性剂于72±2℃下水浴并不停搅拌30min 至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
(3)胆固醇酯酶溶液配制
在pH 7.5，20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％ BSA)(酶稀释液)中配制不同来源的胆固醇酯酶溶液，以将酶稀释至0.15 U/mL。其中不同来源的胆固醇酯酶分别购买自日本旭化成公司，Roche公司， TOYOBO公司，北京阿匹斯生物公司，Amano公司，Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
(4)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液。
(5)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液。
(6)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS溶液和50mM 4-AA溶液。
(7)0.2M磷酸钾缓冲液的配制
以去离子水为溶剂，配制0.2M磷酸钾溶液，并调节pH值至7.5。
(8)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL底物溶液，15μLPOD溶液， 50μLTOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，37℃温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入100μL酶稀释液，混匀，37℃反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs)和空白(ΔAb)在 OD555nm时，1min内吸光度的变化。利用实施例1中所述的活力计算公式计算酶活。
表2：其它种类表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶活力的影响
表2为其他种类的表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶的酶活力的影响。结果如表2所示，当添加1％其他种类的表面活性剂时，胆固醇酯酶酶活力都不如加入1％GenapolX-080表面活性剂时高，甚至可能会对胆固醇酯酶的酶活起到抑制作用。
实施例3：pH＝7.5条件下，不同温度对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性的影响
(1)表面活性剂的配制
以去离子水为溶剂，分别配制1％Genapol X-080溶液
(2)底物溶液配制
不加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
加入表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，加入约80mL 1％Genapol X-080于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至 100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
(3)胆固醇酯酶溶液配制
在pH 7.5，20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％ BSA)(酶稀释液)中配制胆固醇酯酶(购自武汉瀚海新酶生物科技有限公司(货号：HH0407))溶液，以将酶稀释至0.15U/mL，并将该溶液分别在30℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃热激，得到不同温度下的胆固醇酯酶溶液。
(4)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液。
(5)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液。
(6)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS溶液和50mM 4-AA溶液。
(7)0.2M磷酸钾缓冲液的配制
以去离子水为溶剂，配制0.2M磷酸钾溶液，并调节pH值至7.5。
(8)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL底物溶液，15μLPOD溶液， 50μLTOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，分别在不同温度(30℃，37℃， 40℃，45℃，50℃，55℃，60℃)下温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入100μL酶稀释液，混匀，37℃下反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs)和空白(ΔAb)在OD555nm时， 1min内吸光度的变化。利用实施例1中所述的活力计算公式计算酶活。将不加Genapol X-080表面活性剂的酶活定义为100％。
图1为pH＝7.5条件下，不同温度对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响。由图可知加入Genapol X-080表面活性剂后，温度对胆固醇酯酶的活性影响并未改变，温度在30℃～60℃时表面活性剂可提高胆固醇酯酶的活性，在温度为55℃时胆固醇酯酶的活性达到了最大，Genapol X-080并未改变胆固醇酯酶的最适温度。
实施例4：T＝37℃条件下，不同pH值对Genapol对胆固醇酯酶活性的影响
(1)表面活性剂的配制
以去离子水为溶剂，分别配制1％Genapol X-080溶液
(2)底物溶液配制
不加表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL 异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
加入表面活性剂底物的配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，加入约80mL 1％Genapol X-080于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至 100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
(3)胆固醇酯酶溶液配制
在2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％BSA和不同pH值缓冲液(醋酸盐缓冲液(pH4.5～5.5)；K-磷酸盐(pH 6.0～8.0)；Tris-HCl(pH8.0～ 9.0)；甘氨酸-NaOH(pH 9.0～10.0))(酶稀释液)中配制，得到不同pH 值下的胆固醇酯酶(购自武汉瀚海新酶生物科技有限公司(货号：HH0407)) 溶液，以将酶稀释至0.15U/mL。
(4)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液。
(5)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液。
(6)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS溶液和50mM 4-AA溶液。
(7)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL底物溶液，15μL POD溶液，50μL TOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，37℃温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL不同pH值的胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入酶稀释液100μL，混匀，37℃反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs)和空白(ΔAb)在OD555nm时，1min内吸光度的变化。利用实施例1中所述的活力计算公式计算酶活。将不加Genapol X-080表面活性剂的酶活定义为100％。
图2为T＝37℃条件下，不同pH值对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响。由图可知加入Genapol X-080表面活性剂后，pH值对胆固醇酯酶的活性影响并未改变，pH值在4.5～9时表面活性剂可提高胆固醇酯酶的活性，在pH值为5时胆固醇酯酶的活性达到了最大，Genapol X-080并未改变胆固醇酯酶的最适pH值。
实施例5：T＝37℃，pH＝7.5条件下，Genapol X-080对胆固醇酯酶底物特异性的影响
(1)表面活性剂的配制
以去离子水为溶剂，分别配制1％Genapol X-080溶液
(2)底物溶液配制
不加表面活性剂底物的配制：称取39mg不同碳链长C2-C18的胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到不同碳链长度的底物胆固醇酯溶液。
加入表面活性剂底物的配制：称取39mg不同碳链长C2-C18的胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，加入约80mL 1％Genapol X-080于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到不同碳链长度的底物胆固醇酯溶液。
这里所指的不同碳链长C2-C18的胆固醇酯是指醋酸胆固醇酯(C2)、丁酸胆固醇酯(C4)、己酸胆固醇酯(C6)、癸酸胆固醇酯(C10)、月桂酸胆固醇酯(C12)、胆固醇棕榈酸酯(C16)、硬脂酸胆固醇酯(C18:0)、油酸胆固醇酯(C18:1)、亚油酸胆固醇酯(C18:2)。
(3)胆固醇酯酶溶液配制
在pH 7.5，20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％ BSA)(酶稀释液)中配制不同来源的胆固醇酯酶溶液，以将酶稀释至0.15U/mL。其中胆固醇酯酶分别购买自日本旭化成公司，Roche公司，TOYOBO公司，北京阿匹斯生物公司，Amano公司，Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
(4)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液。
(5)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液。
(6)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS溶液和50mM 4-AA溶液。
(7)0.2M磷酸钾缓冲液的配制
以去离子水为溶剂，配制0.2M磷酸钾溶液，并调节pH值至7.5。
(8)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL不同碳链长度的胆固醇酯底物溶液，15μLPOD溶液，50μLTOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，37℃温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入100μL酶稀释液，混匀，37℃反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs) 和空白(ΔAb)在OD555nm时，1min内吸光度的变化。利用实施例1中所述的活力计算公式计算酶活。将加入表面活性剂，底物为亚油酸胆固醇酯的酶活性定义为100％。
图3为Genapol X-080对胆固醇酯酶底物特异性的影响。结果如图所示，添加Genapol X-080表面活性剂后对胆固醇酯酶底物特异性没有影响。
实施例6：不同加样顺序对Genapol X-080表面活性剂对不同来源的胆固醇酯酶活力的影响
(1)表面活性剂溶液的配制
以去离子水为溶剂，配制1％Genapol X-080溶液
(2)A)表面活性剂先与底物混合：
底物溶液配制：称取39mg亚油酸胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，加入约 80mL 1％Genapol X-080于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到底物亚油酸胆固醇酯溶液。
胆固醇酯酶溶液配制：在pH 7.5，20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2， 0.5mM EDTA-Na2，0.2％BSA)(酶稀释液)中配制不同来源的胆固醇酯酶溶液，以将酶稀释至0.15U/mL。其中胆固醇酯酶分别购买自日本旭化成公司，Roche公司，TOYOBO公司，北京阿匹斯生物公司，Amano公司， Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
B)表面活性剂先与酶混合：
胆固醇酯酶溶液配制：在1％Genapol X-080溶液，pH 7.5、20mM磷酸钾缓冲液(含2mM MgCl2，0.5mM EDTA-Na2，0.2％BSA)(酶稀释液)中配制不同来源的胆固醇酯酶溶液，以将酶稀释至0.15U/mL。其中胆固醇酯酶分别购买自日本旭化成公司，Roche公司，TOYOBO公司，北京阿匹斯生物公司，Amano公司，Sigma-Aldrich公司、武汉瀚海新酶生物科技有限公司。底物溶液配制：称取39mg不同碳链长C2-C18的胆固醇酯，加入2.0mL异丙醇，于72±2℃下水浴并不停搅拌30min至至完全溶解。冷却溶液至室温后，加入0.6g胆酸钠，充分搅拌溶解，定容至100mL，得到不同碳链长度的底物胆固醇酯溶液。
(3)过氧化物酶(POD)溶液配制
配制1kU/mL过氧化物酶溶液。
(4)胆固醇氧化酶(COX)溶液配制
配制300U/mL胆固醇氧化酶溶液。
(5)TOOS溶液和4-氨基安替比林(4-AA)溶液配制
以去离子水为溶剂，分别配制50mM TOOS溶液和50mM 4-AA溶液。
(6)0.2M磷酸钾缓冲液的配制
以去离子水为溶剂，配制0.2M磷酸钾溶液，并调节pH值至7.5。
(7)酶活测定
分别取两支3mL比色皿(一支作为样品，一支作为空白)，分别向两支比色皿中加入1.5mL 0.2M磷酸钾缓冲液，1mL底物溶液，15μL POD溶液，50μL TOOS溶液和50μL 4-AA溶液，并用去离子水定容至2.75mL。然后向样品和空白比色皿中分别加入100μL COX溶液，37℃温浴2min。之后再向样品比色皿中加入100μL胆固醇酯酶溶液，向空白比色皿中加入100μL酶稀释液，混匀， 37℃反应1分钟。使用分光光度计检测样品(ΔAs)和空白(ΔAb)在OD555nm时，1min内吸光度的变化。利用实施例1中所述的活力计算公式计算酶活。
将不加Genapol X-080表面活性剂的酶活定义为100％。
图4为t＝37℃，pH＝7.5条件下，不同加样顺序对Genapol X-080对胆固醇酯酶活性提高作用的影响结果图。由图4可知，改变加样顺序，Genapol X-080对胆固醇酯酶的活性影响不大。
综上所述，Genapol X-080可以显著提高胆固醇酯酶的活性，并且加入 GenapolX-080表面活性剂没有改变pH值、温度对胆固醇酯酶活性的影响。
实施例7：Genapol X-080(1％)与胆固醇酯酶在(0.1-5):1的混合重量比下，均可提高不同来源的胆固醇酯酶的酶活力
按照实施例1的方法配制各试剂并检测酶活，不同之处在于，按照下表所列Genapol X-080(1％)与胆固醇酯酶的混合重量比进行。
Claims (10)
1.一种提高胆固醇酯酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括将表面活性剂GenapolX-080与胆固醇酯酶混合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在4.5-9的pH值下将表面活性剂GenapolX-080与所述胆固醇酯酶混合；优选地，在5.0-5.5的pH值下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在30℃-60℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合；优选地，在55℃的温度下将表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表面活性剂Genapol X-080与所述胆固醇酯酶的混合重量比为(0.1-5):1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在保护剂的存在下将表面活性剂GenapolX-080与所述胆固醇酯酶混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括EDTA及其盐、白蛋白和缓冲剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括将表面活性剂Genapol X-080、胆固醇酯酶和胆固醇酯酶的底物混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在助溶剂和胆酸钠的存在下将表面活性剂Genapol X-080、胆固醇酯酶和胆固醇酯酶的底物混合。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胆固醇酯酶的底物包括2-18元酸的胆固醇酯。
10.表面活性剂Genapol X-080用于提高胆固醇酯酶的活性的应用。
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| US4851335A (en) * | 1985-09-18 | 1989-07-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the specific determination of HDL cholesterol in serum or plasma |
| DE19520210A1 (de) * | 1995-06-01 | 1996-12-05 | Heinrich Prof Dr Med Wieland | Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Proteinfraktionen, Enzymlösung zur Durchführung des Verfahrens sowie Verwendung des Verfahrens |
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| 吴翠玲等: "胆固醇酯酶高产菌株的筛选及动力学性质研究", 中国酿造 * |
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