CN115246877A - 一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin‑1EG及应用，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin‑1EG是由黑斑蛙编码的多肽，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin‑1EG的前体氨基酸序列为SEQID NO.2；所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin‑1EG的分子量为2637.28道尔顿，等电点为9.50，亲水性平均系数为0.815，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin‑1EG的氨基酸序列为SEQID NO.3。本发明的抗菌肽Brevinin‑1EG具有分子量小、合成简单、高效的抗菌活性、无明显副作用等特点，可作为新型抗菌产品或药物，并应用于医药、食品、养殖等领域。

Description

一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用。
背景技术
目前，抗生素的出现挽救了无数的生命，为人类的发展做出了不可磨灭的贡献。由于人类滥用抗生素，出现了一系列新型耐药菌株。令人担忧的是，这些新型耐药菌株致使传统抗生素的作用大大减弱甚至消失。因此，全球公共卫生面临着巨大的威胁和挑战，故亟需开发新型作用机制的药物来面对此问题。
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)有安全高效、不易产生耐药的优势，有希望成为高效的新型抗菌药物。抗菌肽又称天然免疫防御肽，通常由10～60氨基酸残基组成，整体带有正电荷，广泛存在于植物、动物之中，尤其是具有“天然储存库”之称的两栖动物。据统计，已从两栖动物中发现8000多种抗菌肽。两栖动物抗菌肽的表达多样性与其生活环境有着密不可分的关系。研究发现抗菌肽对细菌、真菌、病毒等均具有杀灭作用，为药物研发提供了大量的候选分子。
黑斑蛙广泛分布于东南亚各国，适应能力性强，抗菌肽的表达与其环境适应能力有着重要的意义。目前，已从黑斑蛙中发现了50多种编码抗菌肽的序列。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统抗生素具有耐药性。
解决以上问题及缺陷的难度为：
抗生素抗微生物的作用机制无非是通过抑制细胞壁的合成、影响细胞膜功能、抑制蛋白质的合成、干扰核酸代谢四种途径，但是微生物可通过改变自身的代谢途径或者产生相应的灭活物质抵御传统抗生素的侵害，致使传统抗生素的疗效大大缩减。因此，从长期的角度看，无论在原有药物的基础修饰或合成新型化药都可能产生耐药性。
解决以上问题及缺陷的意义为：
抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的天然小分子多肽。与传统抗生素相比，抗菌肽具有不同的杀菌机制，它与微生物接触后，可发生电荷相互作用或作用于微生物膜受体，进而破坏膜结构的完整性，导致内容物质流出、细胞破裂；同时抗菌肽也可能存在抗生素作用机制的方式。抗菌肽还具有调节免疫的作用，增强机体的免疫反应。这些都决定了抗菌肽具有极大的临床应用潜力，有望代替传统抗生素，成为抗菌的首选药物。
发明内容
针对传统抗生素存在的耐药性问题，本发明提供了一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用，尤其涉及一种来源黑斑蛙皮肤抗菌肽Brevinin-1EG基因的获取、合成及应用。
本发明是这样实现的，一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG是由黑斑蛙编码的多肽，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体氨基酸序列为SEQID NO.2；
其中，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体肽由71个氨基酸残基组成，成熟肽Brevinin-1EG由24个氨基酸残基组成。
进一步，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的分子量为2637.28道尔顿，等电点为9.50，亲水性平均系数为0.815，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的氨基酸序列为SEQID NO.3。
本发明的另一目的在于提供一种编码所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的黑斑蛙抗菌肽基因，所述黑斑蛙抗菌肽基因的核苷酸序列为SEQID NO.1，由219个核苷酸组成。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法包括以下步骤：
步骤一，提取在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌环境下饲养的黑斑蛙皮肤总RNA；
步骤二，利用RT-PCR合成cDNA，采用巢式PCR，以设计的引物扩增下游部分编码序列，重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽Brevinin-1EG基因序列。
进一步，所述步骤二中的黑斑蛙皮肤cDNA的合成包括：
制备RNA模板变性混合液，65℃加热5min，迅速置于冰上静置2min，得混合液8μL、2×RT Mix
Figure BDA0003437386590000031
10μL、Enzyme Mix 2μL；配置第一链cDNA合成反应液用移液器轻轻吹打混匀，按条件进行第一链cDNA合成反应。
其中，所述RNA模板变性混合液包括CDSIII 1μL、total RNA 3μL、RNase freeddH2O 5μL；所述CDSIII的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；所述合成反应条件为：25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min。
进一步，所述步骤三中采用长末端聚合酶链式反应LD-PCR方法扩增黑斑蛙抗菌肽基因下游序列包括：
95℃预热PCR仪，将5μL cDNA、16μL去离子水、25μL 2×mix、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物于离心管进行反应；在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，30s；22个循环：95℃，5s；52℃，5min；72℃，30s；循环结束后，进行胶回收；以正向引物1与反向引物1进行扩增，扩增产物以正向引物2与反向引物1进行扩增后，回收产物。
其中，所述正向引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，正向引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，反向引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
进一步，所述PCR产物回收包括：
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测后，利用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
待琼脂糖凝胶电泳结束后，从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的胶块，放置于离心管中并加入相对胶块质量2倍体积的溶胶液，置于提前加热好的水浴锅中，55℃水浴10min，并翻转离心管1～2次；胶块充分溶解后，转入到吸附柱中，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；在吸附柱正上方缓慢滴加700μL漂洗液W2，静置3～5min，待漂洗液浸泡吸附柱后，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；再次滴加500μL漂洗液W2，静置2min，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；将只含吸附柱的离心管置于离心机中，再次使用12000rpm离心2min后，将吸附柱置于无菌通风橱静置10min；待吸附柱被彻底晾干后，放入新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入40μL的洗脱缓冲液TE，静置4min，12000rpm离心1min，收集并低温保存含DNA的溶液。
进一步，所述步骤二中的重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽Brevinin-1EG基因序列包括：
(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按比例1：100再接种于50mL LB培养液中，37℃振荡2h；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；将细菌转移到无菌、用冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液重悬每份细胞沉淀；于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；每50mL初始培养物用2mL预冷过的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
(2)连接、转化
在PCR离心管中加入1μL Takara Pmd19T simple载体、4μL胶回收PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物，16℃反应3h后，全部加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃，90s；冰浴1min；加入890mL LB培养基中，37℃缓慢震荡培养60min，取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜以形成单菌落。
(3)阳性克隆筛选
挑取上述单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min培养4h后，进行PCR扩增；扩增条件同前述扩增抗菌肽编码基因，引物为正向引物2与反向引物1，并将确定PCR扩增的阳性克隆提取质粒，测序。
(4)抗菌肽基因上游序列扩增
根据步骤(3)测序结果设计反向引物2，先以反向引物1与正向引物1进行扩增，扩增产物以反向引物2与正向引物1进行扩增，并回收产物。
(5)抗菌肽基因确定
将步骤(3)和步骤(4)获得的序列进行拼接，并将拼接结果在NCBI基因数据库和蛋白数据库进行比对，未发现相同编码基因和氨基酸序列。
进一步，所述步骤(1)中的CaCl2-MgCl2溶液由80mmol/L MgCl2和20mmol/L CaCl2组成；
所述步骤(4)中的反向引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
本发明的另一目的在于提供一种所述的黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG在制备抗菌药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用，通过基因工程的方法获得了编码抗菌肽Brevinin-1EG的基因序列，通过固相多肽合成的方法制备，并对其性质进行研究。同时将本发明的编码抗菌肽基因序列及氨基酸序列分别在基因数据库和蛋白质数据库进行比对，未发现相同序列信息。
本发明的抗菌肽是由黑斑蛙编码的一种多肽，其前体氨基酸序列如SEQID NO.2所示；成熟肽分子量2637.28道尔顿，等电点9.50，氨基酸序列如SEQID NO.3所示。通过固相多肽合成方法制备的抗菌肽对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌具有强大的抗菌活性，并且抗菌作用迅速，无明显的溶血活性。抗菌肽Brevinin-1EG具有分子量小、合成简单、高效的抗菌活性、无明显副作用等特点，可作为新型抗菌产品或药物，并应用于医药、食品、养殖等领域。
本发明解决了传统抗生素耐药性的问题，提供黑斑蛙皮肤前体抗菌肽Brevinin-1EG的基因序列(见SEQID NO.1)、抗菌肽Brevinin-1EG氨基酸序列(见SEQID NO.3)以及黑斑蛙抗菌肽的应用。本发明从黑斑蛙皮肤组织cDNA文库中首次发现Brevinin-1EG基因序列，在基因数据库和蛋白数据库进行比对，推断出编码抗菌肽的核酸序列以及氨基酸序列；采用固相多肽合成方法获得Brevinin-1EG，实验证明Brevinin-1EG有抗菌活性并且安全高效。
本发明提供了强抗菌活性的抗菌肽Brevinin-1EG的编码基因和氨基酸序列，黑斑蛙抗菌肽对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有显著的抗菌活性，抗菌肽Brevinin-1EG具有分子量小、合成简单、低溶血性、高效的抗菌活和无明显副作用的特点，可开发为新型抗菌产品或药物，并应用于医药、食品、养殖等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法流程图。
图2是本发明实施例提供的黑斑蛙皮肤抗菌肽Brevinin-1EG的杀菌活性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG是由黑斑蛙编码的多肽，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体氨基酸序列为SEQID NO.2；
其中，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体肽由71个氨基酸残基组成，成熟肽Brevinin-1EG由24个氨基酸残基组成。
本发明实施例提供的黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的分子量为2637.28道尔顿，等电点为9.50，亲水性平均系数为0.815，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的氨基酸序列为SEQID NO.3。
如图1所示，本发明实施例提供的黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法包括：
S101，提取在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌环境下饲养的黑斑蛙皮肤总RNA；
S102，利用RT-PCR合成cDNA，采用巢式PCR，以设计的引物扩增下游部分编码序列；
S103，重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽Brevinin-1EG基因序列。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。但本发明的内容并不局限于此，本实施例中无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂无特殊说明的采用常规试剂或按照常规方法配置。
实施例1：来源黑斑蛙皮肤抗菌肽Brevinin-1EG及其应用
本发明的目的在于解决传统抗生素耐药性的问题，提供黑斑蛙皮肤前体抗菌肽Brevinin-1EG的基因序列(如SEQID NO.1)、抗菌肽Brevinin-1EG氨基酸序列(如SEQIDNO.3)以及黑斑蛙抗菌肽的应用。本发明从黑斑蛙皮肤组织cDNA文库中首次发现Brevinin-1EG基因序列，在基因数据库和蛋白数据库进行比对，推断出编码抗菌肽的核酸序列以及氨基酸序列。采用固相多肽合成方法获得Brevinin-1EG，实验证明Brevinin-1EG有抗菌活性并且安全高效。
黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法如下：
首先，提取在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌环境下饲养的黑斑蛙皮肤总RNA，利用RT-PCR合成cDNA，采用巢式PCR，以设计的引物扩增下游部分编码序列，重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽
Brevinin-1EG基因序列，所获得阳性克隆核苷酸测序自5’端至3’端序列如SEQ IDNO.1所示：
ATGTTCACCACAAAGAAATCCATGTTACTCATTTTCTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTATCTGTCAGGAAGAGAGAAGTGTCGATATGGATGAAAAAAGAGATGAGTCAGAGGAAGGTGATGTTGAAGTGGAAAAACGTTTTTTGCCATTGCTGGCCGGTCTGGCTGCTAATTTCTTGCCGACAATATTTTGTAAAATAAGCAGAAAATGTTGAAACTTTGGAATTGGAAATCATCAGATGTGGAATATCAATAGGATAAATACACATCAGATGTCATATAAAAAATAAAGATATTGCATACACAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
黑斑蛙抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MFTTKKSMLLIFFLGTINLSICQEERSVDMDEKRDESEEGDVEVEKRFLPLLAGLAANFLPTIFCKISRKC，编码成熟抗菌肽核苷酸序列为第141～213位，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：FLPLLAGLAANFLPTIFCKISRKC。
Brevinin-1EG的前体肽由71个氨基酸残基组成，来源于黑斑蛙。成熟肽Brevinin-1EG具有抗菌功能，由24个氨基酸残基组成，预测分子量为2637.28道尔顿，包含3个带正电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为9.50。该抗菌肽的亲水性平均系数为0.815，具有亲水的水溶性，是一种带有3个正电荷的阳离子多肽。
所述黑斑蛙抗菌肽对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有显著的抗菌活性。
本发明的有益效果在于：提供了强抗菌活性的抗菌肽Brevinin-1EG的编码基因和氨基酸序列。抗菌肽Brevinin-1EG具有分子量小、合成简单、低溶血性、高效的抗菌活和无明显副作用的特点，可开发为新型抗菌产品或药物，并应用于医药、食品、养殖等领域。
实施例2：黑斑蛙抗菌基因克隆
一、黑斑蛙的预处理
采集雄性黑斑蛙，用生理盐水清洗处理，饲养于无菌环境中一周后，使用大肠杆菌和肺炎克雷伯菌进行诱导处理二天后，取背部皮肤迅速放置于液氮中并提取总RNA。
二、黑斑蛙皮肤总RNA的提取
称取30mg的皮肤组织，同时加入1ml的trizon溶液进行均浆5min。加入0.3mL的氯仿，上下颠倒离心管使溶液混匀，静置10min，12000rpm/min离心10min。取上层水相并加入预冷的异丙醇，室温放置10min，7500rpm/min，4℃离心10min，弃上清。用75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min。晾干后，加入用DEPC处理的20μL H2O，保存于-80℃。
三、黑斑蛙皮肤cDNA的合成
采用Vazyme公司HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit文库构建试剂盒。具体操作参考说明书。
首先制备RNA模板变性混合液(CDSIII primer 5'-GTAGACTAGACTGCTCCGATGTTTTTTTTTTTTTTT-3’)1μL、total RNA3μL、RNase free ddH2O 5μL)，65℃加热5min，迅速置于冰上静置2min。然后配置第一链cDNA合成反应液(上一步混合液8μL、2×RT Mix
Figure BDA0003437386590000091
10μL、Enzyme Mix 2μL)用移液器轻轻吹打混匀，按下列条件进行第一链cDNA合成反应25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min。
四、黑斑蛙抗菌肽基因克隆筛选及鉴定
(a)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增黑斑蛙抗菌肽基因下游序列。
95℃预热PCR仪，将5μL cDNA、16μL去离子水、25μL 2×mix、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物于离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，30s；22个循环(95℃，5s；52℃，5min；72℃，30s)。循环结束后，进行胶回收。正向引物1为5’-ATGTTCACCACAAAGAAATCC-3’，正向引物2为5’-AAACGTTTTTTGCCATTGCTG-3’，反向引物1为5’-GTAGACTAGACTGCTCCGATG-3，先以正向引物1与反向引物1进行扩增，扩增产物以正向引物2与反向引物1进行扩增，回收产物进行下述(c)～(f)步骤。
(c)PCR产物回收
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
待琼脂糖凝胶电泳结束后，小心从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的胶块，放置于离心管中并加入相对胶块质量2倍体积的溶胶液，置于提前加热好的水浴锅中，55℃水浴10min，在此过程中温和翻转离心管1～2次。胶块充分溶解之后，将其转入到吸附柱中，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。在吸附柱正上方缓慢滴加700μL漂洗液W2，静置3～5min，待漂洗液浸泡吸附柱之后，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。再次滴加500μL漂洗液W2，静置2min，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液。将只含吸附柱的离心管置于离心机中，再次使用12000rpm离心2min。接着将吸附柱置于无菌通风橱静置10min。待吸附柱被彻底晾干之后，将其放入一个新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入40μL的洗脱缓冲液TE，静置4min，12000rpm离心1min，收集并低温保存含有DNA的溶液以供后续实验使用。
(d)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1：100再接种于50mL LB培养液中，37℃振荡2h。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。每50mL初始培养物用2mL预冷过的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
(e)连接、转化
在PCR离心管中加入1μL TakaraPmd19T simple载体、4μL胶回收PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物，16℃反应3h。将其全部加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃，90s；冰浴1min。加入890mL LB培养基中，37℃缓慢震荡培养60min，取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜以形成单菌落。
(f)阳性克隆筛选
挑取上述单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min培养4h，然后进行PCR扩增。扩增条件同前述扩增抗菌肽编码基因，引物为正向引物2与反向引物1。将确定PCR扩增的阳性克隆提取质粒，测序。
(g)抗菌肽基因上游序列扩增
根据步骤(f)测序结果设计反向引物2：5’-GCAGCCAGACCGGCCAG-3，先以反向引物1与正向引物1进行扩增，扩增产物以反向引物2与正向引物1进行扩增，回收产物进行上述(c)～(f)步骤。
(h)抗菌肽基因确定
将上述(f)、(g)步骤获得的序列进行拼接，将拼接结果在NCBI基因数据库和蛋白数据库进行比对，未发现相同编码基因和氨基酸序列。因此，本发明确定为一种新型抗菌肽编码基因，编码抗菌肽的核苷酸序列长度为219个碱基，其氨基酸序列如SEQID NO.2所述，包括了信号肽区、富含酸性氨基酸的间隔区、转化酶切位点、成熟区四部分，成熟肽的序列为如SEQID NO.3所示。
SEQID NO.4的序列为：gtagactagactgctccgatgttttttttttttttt。
SEQID NO.5的序列为：atgttcaccacaaagaaatcc。
SEQID NO.6的序列为：aaacgttttttgccattgctg。
SEQID NO.7的序列为：gtagactagactgctccgatg。
SEQID NO.8的序列为：gcagccagaccggccag。
实施例3：黑斑蛙抗菌肽的应用
一、抗菌肽活性检测
采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的检测，选择大肠杆菌和肺炎克雷伯菌作为受试菌株。将试验菌株接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，用MH液体培养基稀释到2×105CFU/mL。在无菌96孔板各孔中预先加入100μL MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μL用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的Breinvin-EG溶液，混匀后取100μL加入第2孔，依次倍比稀释，自第9孔吸出100μL弃去，第10孔为对照管。最后每孔中加入已稀释好的菌株培养液100μL，37℃培养箱中培养18h，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。
抗菌肽Breinvin-EG对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均具有较强的抗菌活性，其最小抑菌浓度不超过15μL。
二、杀菌动力学测试
为了进一步了解抗菌肽的抗菌活性，本发明选取大肠杆菌作为指示菌株进行了杀菌动力学检测。将培养过夜的菌稀释至1×105CFU/ml，取适当的抗菌肽溶液加入190μL菌液，同时采用MH培养基对照，37℃，100rpm/min培养，分别在0、15、60、120、240min取培养液稀释涂板检测，37℃培养箱中培养24h后进行菌落计数。
结果如图2所示，黑斑蛙抗菌肽杀菌作用迅速，在后面时间没有出现菌落明显增加。
三、溶血活性检测
采集昆明小鼠血，按照1：l比例与阿氏液混合，1000rpm离心5min。用0.9％的生理盐水洗涤。使用血球计数板计数，调整洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成107～108个/ml。加入不同浓度溶解的抗菌肽，37℃，30min。1000rpm离心5min，于540nm波长处检测上清液吸收值。使用生理盐水作为阴性对照，阳性对照使用Triton X-100。
结果证明，抗菌肽breinvin-EG在200μM浓度时也未存在溶血现象。
通过上述实施例表明，本发明中的黑斑蛙抗菌肽breinvin-EG可通过固相多肽合成的方式获得，抗菌肽Breinvin-EG对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌有这着极强的抗菌活性。其次，该抗菌肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低的特点，可作为新型抗菌药物应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttcacca caaagaaatc catgttactc attttcttcc ttgggaccat caacttatct 60
atctgtcagg aagagagaag tgtcgatatg gatgaaaaaa gagatgagtc agaggaaggt 120
gatgttgaag tggaaaaacg ttttttgcca ttgctggccg gtctggctgc taatttcttg 180
ccgacaatat tttgtaaaat aagcagaaaa tgttgaaact ttggaattgg aaatcatcag 240
atgtggaata tcaataggat aaatacacat cagatgtcat ataaaaaata aagatattgc 300
atacacaaaa aaaaaaaaaa aaaatcgatg tcgactcgag tcaat 345
<210> 2
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Thr Thr Lys Lys Ser Met Leu Leu Ile Phe Phe Leu Gly Thr
1 5 10 15
Ile Asn Leu Ser Ile Cys Gln Glu Glu Arg Ser Val Asp Met Asp Glu
20 25 30
Lys Arg Asp Glu Ser Glu Glu Gly Asp Val Glu Val Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Thr Ile Phe
50 55 60
Cys Lys Ile Ser Arg Lys Cys
65 70
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Thr Ile
1 5 10 15
Phe Cys Lys Ile Ser Arg Lys Cys
20
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagactaga ctgctccgat gttttttttt tttttt 36
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttcacca caaagaaatc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacgttttt tgccattgct g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtagactaga ctgctccgat g 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagccagac cggccag 17

Claims (10)

1.一种黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG，其特征在于，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG是由黑斑蛙编码的多肽，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体氨基酸序列为SEQID NO.2；
其中，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的前体肽由71个氨基酸残基组成，成熟肽Brevinin-1EG由24个氨基酸残基组成。
2.如权利要求1所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG，其特征在于，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的分子量为2637.28道尔顿，等电点为9.50，亲水性平均系数为0.815，所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的氨基酸序列为SEQID NO.3。
3.一种编码权利要求1～2任意一项所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG的黑斑蛙抗菌肽基因，其特征在于，所述黑斑蛙抗菌肽基因的核苷酸序列为SEQID NO.1，由219个核苷酸组成。
4.一种如权利要求3所述黑斑蛙抗菌肽基因克隆方法，其特征在于，所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法包括以下步骤：
步骤一，提取在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌环境下饲养的黑斑蛙皮肤总RNA；
步骤二，利用RT-PCR合成cDNA，采用巢式PCR，以设计的引物扩增下游部分编码序列，重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽Brevinin-1EG基因序列。
5.如权利要求4所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤二中的黑斑蛙皮肤cDNA的合成包括：
制备RNA模板变性混合液，65℃加热5min，置于冰上静置2min，得混合液8μL、2×RT Mix
Figure FDA0003437386580000011
10μL、Enzyme Mix 2μL；配置第一链cDNA合成反应液用移液器吹打混匀，按条件进行第一链cDNA合成反应；
其中，所述RNA模板变性混合液包括CDSIII 1μL、total RNA 3μL、RNase free ddH2O 5μL；所述CDSIII的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；所述合成反应条件为：25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min。
6.如权利要求4所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤三中采用长末端聚合酶链式反应LD-PCR方法扩增黑斑蛙抗菌肽基因下游序列包括：
95℃预热PCR仪，将5μL cDNA、16μL去离子水、25μL 2×mix、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物于离心管进行反应；在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，30s；22个循环：95℃，5s；52℃，5min；72℃，30s；循环结束后，进行胶回收；以正向引物1与反向引物1进行扩增，扩增产物以正向引物2与反向引物1进行扩增后，回收产物；
其中，所述正向引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，正向引物2的核苷酸序列为SEQ IDNO.6，反向引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
7.如权利要求6所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述PCR产物回收包括：利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测后，利用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
待琼脂糖凝胶电泳结束后，从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的胶块，放置于离心管中并加入相对胶块质量2倍体积的溶胶液，置于提前加热好的水浴锅中，55℃水浴10min，并翻转离心管1～2次；胶块溶解后，转入到吸附柱中，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；在吸附柱正上方缓慢滴加700μL漂洗液W2，静置3～5min，待漂洗液浸泡吸附柱后，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；再次滴加500μL漂洗液W2，静置2min，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；将只含吸附柱的离心管置于离心机中，再次使用12000rpm离心2min后，将吸附柱置于无菌通风橱静置10min；待吸附柱被彻底晾干后，放入新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入40μL的洗脱缓冲液TE，静置4min，12000rpm离心1min，收集并低温保存含DNA的溶液。
8.如权利要求4所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤二中的重新设计引物后，扩增上游部分编码序列，拼接获得并验证黑斑蛙抗菌肽Brevinin-1EG基因序列包括：
(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按比例1：100再接种于50mL LB培养液中，37℃振荡2h；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；将细菌转移到无菌、用冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液重悬每份细胞沉淀；于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；每50mL初始培养物用2mL预冷过的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用；
(2)连接、转化
在PCR离心管中加入1μL Takara Pmd19T simple载体、4μL胶回收PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物，16℃反应3h后，全部加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃，90s；冰浴1min；加入890mL LB培养基中，37℃缓慢震荡培养60min，取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜以形成单菌落；
(3)阳性克隆筛选
挑取上述单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min培养4h后，进行PCR扩增；扩增条件同前述扩增抗菌肽编码基因，引物为正向引物2与反向引物1，并将确定PCR扩增的阳性克隆提取质粒，测序；
(4)抗菌肽基因上游序列扩增
根据步骤(3)测序结果设计反向引物2，先以反向引物1与正向引物1进行扩增，扩增产物以反向引物2与正向引物1进行扩增，并回收产物；
(5)抗菌肽基因确定
将步骤(3)和步骤(4)获得的序列进行拼接，并将拼接结果在NCBI基因数据库和蛋白数据库进行比对，未发现相同编码基因和氨基酸序列。
9.如权利要求8所述黑斑蛙抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(1)中的CaCl2-MgCl2溶液由80mmol/L MgCl2和20mmol/L CaCl2组成；
所述步骤(4)中的反向引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
10.一种如权利要求1～2任意一项所述黑斑蛙来源抗菌肽Brevinin-1EG在制备抗菌药物中的应用。
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