CN115245121A - 一种通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法,具体为将恶臭假单胞菌UW4菌液通过根部灌施的方法施用于大蒜根部。本发明所提供的通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法简单,易于操作,效果显著。通过采用恶臭假单胞菌UW4灌根处理,连作大蒜的根系生长指标增幅达18%~85%,从而促进了大蒜的健康生长。恶臭假单胞菌UW4在连作大蒜中的使用,可以降低化肥和农药的使用量,避免了化学农药的施用带来的环境污染等问题,促进了大蒜生产的可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于高原大蒜栽培技术领域,具体涉及促生菌在改善高原大蒜发生连作障碍时的应用。
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属二年生草本植物,富含多种营养物质和生物活性成分,是世界范围广泛栽培的药食兼用蔬菜。青海地处青藏高原,因昼夜温差大、日照时间长、光照辐射强等气候优势,为大蒜的生长和发育提供了优良的生长环境。‘乐都紫皮大蒜’作为青海省重要的创汇商品和地理标志产品,因鳞茎饱满、蒜素含量髙、辣度适中、营养丰富等品质特性,逐渐成为市场高度认可的大蒜产品。但为了满足不断增长的市场需求和追求高效的经济效益,青海大蒜主产区高复种指数种植引发了连作障碍等种植问题,连作现象日益严重,东部农业区连续种植‘乐都紫皮大蒜’已超过20年,连作面积及连作时间日趋增加,导致高原大蒜长势减弱、二次生长频发、病虫害加重、种性退化,大蒜品质及产量严重下降。很大程度上限制着乐都大蒜产业的发展。
促生菌(Plant growth-promoting bacteria,PGPB)是天然的一类细菌,能定殖于植物根系与植物共生,显著提高土壤养分指标,改良根、叶微生态,增强植物叶绿素的储存,促进植物生长;并且间接在干旱、盐胁迫或者重金属污染等恶劣环境中通过对土壤病原微生物的拮抗作用来防治土传病害,使植物不易引起抗性(吕俊等,2020)。
近年来,促生菌作为一种新型微生物资源,其对土壤微生物的改良及蔬菜连作障碍防控作用受到广泛关注。目前,国内外通过生物防治缓解作物连作障碍所选择的促生菌多为丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌或EM菌剂(Effective Microorganism有效微生物群组混合菌剂)。然而AM真菌不能够纯培养,必须与植物共生才能生存,操作复杂,施用范围有限。同时,EM菌剂作为光合细菌、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群、丝状菌群等5科10属80余种微生物组成的混合菌剂,缓解连作障碍的效果并不持久稳定。例如在连作大蒜施用EM菌剂后,不仅大蒜幼苗的干物质累积相对于对照降低了1.61%(刘素慧,2011),其他形态指标相比于对照的增幅也随着生长期的延长而迅速下降(刘素慧等,2016)。说明EM菌剂对于大蒜连作障碍的防控效果并非长期有效,EM菌剂效能的发挥既取决于其自身在土壤中的存活能力与竞争能源与碳源的能力,也受到各种环境因素的影响,因此,对高原大蒜生产中因连茬种植造成的问题一直是种植业中难以解决的问题。
发明内容
本发明针对高原大蒜生产中因连茬种植造成的生长受阻问题,通过合理利用自然界中的微生物资源,集成大蒜连作障碍土壤健康生态综合治理技术,改良根际土壤的理化性质,构建高原连作大蒜土壤生态修复技术体系,促进高原大蒜生产的可持续发展。
本发明选用的促生菌为假单胞菌属(Pseudomonas)中的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida UW4,菌株来源于加拿大滑铁卢大学(University of waterloo)。恶臭假单胞菌UW4(Pseudomonas putida UW4)在美国农业研究菌种保藏中心保藏(保藏编号为NRRL B-50193,保藏日为2008年6月9日)。美国农业研究菌种保藏中心位于伊利诺伊州皮契里亚,由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心,英文全称Agrieultutal Research Service Culture Colleetion,简称NRRL。
本发明一方面提供一种改善连作大蒜生长的根部灌施菌剂,所述菌剂为恶臭假单胞菌悬浮菌液。
本发明另一方面提供一种通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法,具体为将恶臭假单胞菌UW4菌液通过根部灌施的方法施用于大蒜根部。
在一些实施例中,所述的恶臭假单胞菌悬浮菌液OD600为0.8-3.0。
在一些实施例中,根部灌施的时间为大蒜苗为4-6cm时进行。
本发明所述的促生菌菌株恶臭假单胞菌UW4的培养和纯化方法可以按照本领域的常规方法,例如本发明提供一种具体的促生菌菌株Pseudomonas putida UW4的培养与纯化方法如下:
(1)将冻存的甘油菌株通过平板划线法接种到固体培养基上,将平板倒置于28~30℃下培养8~12h,直至长出单菌落;
(2)挑选一个单菌落接种到液体培养基中,于28~30℃下150~200rpm振荡培养8~12h,直至OD600达0.8-3.0。
本发明所述的固体培养基包括LB固体培养基和100mg/L氨苄;LB固体培养基成分为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂粉13~15g/L,pH为7.0~7.5。
本发明所述的液体培养基包括LB液体培养基和100mg/L氨苄;LB液体培养基的成分为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,pH为7.0~7.5。
本发明所述的促生菌恶臭假单胞菌UW4悬浮液的制备可以采用本领域常规的方法,在一种具体的实施例中,本发明提供一种具体的促生菌Pseudomonas putida UW4悬浮液的制备方法:将纯化好的促生菌菌液于2800~3200rpm离心4~6min,取沉淀菌体用无菌水清洗1~3次,使重悬浮菌液OD600达0.8-3.0。
在一些实施例中,本发明还提供一种具体的通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法:
(1)选取已解除休眠、大小均匀的大蒜鳞茎,播种于含栽培基质(草炭土:蛭石:珍珠岩=2:1:1)的盆钵中,将播种后的盆钵置于植物光照培养箱中进行培养,培养条件:25℃/20℃(昼/夜),光周期14h/10h(昼/夜),光照强度200μmol·m-2·s-1。培养至大蒜苗高达5cm进行移栽,移栽至不同处理的土壤中,试验所用的培养盆上口径为16cm、下口径为12cm、高为15cm,单盆装供试土壤1.6Kg。
(2)试验共设4个处理:连作土壤(CK)、连作土壤施促生菌(CKP)、连作土壤灭菌(RS)、连作土壤灭菌施促生菌(RSP)。土壤灭菌采用高压蒸汽灭菌,并重复间隔灭菌3次。
(3)不同处理的大蒜幼苗缓苗3d后,将制备好的促生菌菌悬液浇灌于植株根部,CKP、RSP处理施100ml PGPB菌液,CK、RS处理浇施100ml蒸馏水。
本发明通过对连作土壤施加恶臭假单胞菌UW4,得到恶臭假单胞菌UW4能显著促进连作大蒜地上部及地下根系的生长,进而降低连作障碍对大蒜植株的抑制作用,有效缓解其长势减弱、二次生长频发、病虫害加重、种性退化,大蒜品质及产量严重下降等问题。该方法缓解了连作土壤带来的弊端,实现了大蒜在连作土壤中亦可健康生长的效果。
本发明提供的一种通过促生菌改善大蒜连作障碍的方法简单,易于操作,效果显著。通过采用恶臭假单胞菌UW4灌根处理,连作大蒜的根系生长指标增幅达18%~85%,从而促进了大蒜的健康生长。恶臭假单胞菌UW4在连作大蒜中的使用,可以降低化肥和农药的使用量,避免了化学农药的施用带来的环境污染等问题,促进了大蒜生产的可持续发展。
附图说明
图1:不同处理对大蒜幼苗生长指标的影响;
图2:不同处理对大蒜幼苗根系形态结构的影响(利用Epson根系扫描仪对大蒜根系生长形态状况进行扫描,直观观察大蒜植株根部形态的生长);
图3:不同处理对大蒜根系指标的影响(通过根系空间构型差异,利用Win-RHIZO软件精确分析不同处理中大蒜总根长、分支数、根尖数、根系平均直径、根系表面积、根体积等指标);
图4:不同处理对大蒜根系活力的影响(根系活力的高低是体现植物根系吸收、合成和分配营养物质能力强弱的重要指标之一)。
图5:不同处理对大蒜叶片渗透调节物质含量的影响;
图6:不同处理对大蒜叶片氧化伤害物质含量的影响;
图7:不同处理对大蒜叶片抗氧化酶活性的影响;
图8:不同处理对大蒜叶片抗氧化物质含量的影响;
图9:不同处理对大蒜根际土壤营养状况的影响;
图10:不同处理对大蒜根际土壤酶活性的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1.1试验材料与处理
供试大蒜品种为“乐都紫皮大蒜”。
试验所用PGPB(Pseudomonas putida UW4)菌株接种于LB液体培养基中,在28℃摇床上以160rpm的转速振荡培养至OD600=0.6,菌液于3000rpm离心5min收集菌体,弃上清,用等量无菌蒸馏水溶解沉淀于管底的菌体,重新悬浮于无菌dd H2O中以待浇施。
选取已解除休眠、大小均匀的大蒜鳞茎,播种于含栽培基质(草炭土:蛭石:珍珠岩=2:1:1)的盆钵中,将播种后的盆钵置于植物光照培养箱中进行培养,培养条件:25℃/20℃(昼/夜),光周期14h/10h(昼/夜),光照强度200μmol·m-2·s-1。培养至大蒜苗高达5cm进行移栽,移栽至不同处理的土壤中,试验所用的培养盆上口径为16cm、下口径为12cm、高为15cm,单盆装供试土壤1.6Kg。
试验共设4个处理:连作土壤(CK)、连作土壤施促生菌(CKP)、连作土壤灭菌(RS)、连作土壤灭菌施促生菌(RSP)。土壤灭菌采用高压蒸汽灭菌,并重复间隔灭菌3次。不同处理的大蒜幼苗缓苗3d后,将制备好的促生菌菌悬液浇灌于植株根部,CKP、RSP处理施100mlPGPB菌液,CK、RS处理浇施100ml蒸馏水。处理15d进行大蒜生长及生理指标的测定。
1.2指标测定
1.2.1幼苗生长指标测定
参照《大蒜种质资源描述规范和数据标准》使用卷尺、游标卡尺、称量天平测定大蒜株高、叶长、叶宽、假茎长、假茎粗、地上部鲜重和干重,并通过Epson根系扫描仪和Win-RHIZO根系分析系统分析总根长、分支数、根尖数、根系平均直径、根表面积等指标。
1.2.2幼苗生理指标的测定
幼苗叶片光合色素含量(Chl.a、Chl.b、Car.b)、可溶性蛋白、可溶性糖、抗坏血酸、活性氧(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量的测定参考《植物生理生化实验原理和技术》。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定;过氧化物酶(POD)用愈创木酚法测定《植物生理生化实验原理和技术》;过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照Aebi H的实验方法;谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定参照Nakano Y的方法;APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性测定参照Hong Zhu的方法。
幼苗根际土壤营养元素测定:采用凯氏定氮法测定全氮含量;采用钼锑抗比色法测定全磷含量;采用NaOH熔融-火焰光度计法测定全钾含量;采用碱解扩散法测定速效氮含量;采用NH4OAC浸提-火焰光度法测定速效钾含量;采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定速效磷含量;采用酸度计测定土壤PH值(鲍士旦)。根际土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定;土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定;土壤蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定;土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定;多酚氧化酶采用邻苯三酚比色法测定(关松荫)。
为评价PGPB对大蒜连作土壤酶活性的整体影响效果,用同一处理供试土样平均酶活性为参比,分别计算各土样不同酶活性的相对值,然后累加得到酶活性参数(何文祥等,2010;孟繁昊等,2018)。
总体酶活参数(E)=∑Xi/X
式中:Xi为供试处理样品不同酶活性实测值,X为同种酶活性平均值。1.4数据处理与分析
数据整理及制图采用Excel 2010、Origin 2018,SPSS 19.0软件进行单因素差异显著分析,并结合R语言工具包和SIMCA-P软件完成相关性分析和主成分分析。
2.结果与分析
2.1促生菌对大蒜幼苗生长的影响
由图1可以看出,连作土壤严重抑制了大蒜幼苗生长指标的增加及生物量的积累,而施PGPB能促进连作障碍下大蒜地上部的生长及生物量的积累。在连作土壤(CK)中生长的大蒜植株生长势减弱,其株高、叶长、叶宽及假茎粗均显著低于其他处理。连作土壤(CK)还会造成大蒜的产量下降,如图1中CK处理的大蒜干鲜重显著低于其他处理。而在连作土壤中施用促生菌处理(CKP)能够显著提高植株生长势,增加大蒜的产量。
2.2促生菌对大蒜根系生长的影响
利用Epson根系扫描仪对大蒜根系生长形态状况进行扫描,可以直观观察大蒜植株根部形态的生长(图2)。初步观察结果表明,施用促生菌的处理(CKP和RSP)中根分支数、根长、根系分布面积明显高于未施促生菌的处理(CK和RS),表明接种促生菌对于连作大蒜根系生长具有显著促进效果。
通过根系空间构型差异,进一步利用Win-RHIZO软件精确分析不同处理中大蒜总根长、分支数、根尖数、根系平均直径、根系表面积、根体积等指标。由图3可以看出,连作土壤施促生菌(CKP)较连作土壤(CK)生长的大蒜根长、分支数、根尖数、根系平均直径、根系表面积、根体积分别提高了33.74%、56.10%、29.40%、18.95%、22.54%、85.03%。其中CKP处理中根长、分支数、根尖数、根体积等指标较CK的整体提升幅度在20%以上,CKP处理中根系平均直径和根表面积提升均在15%以上。表明施加促生菌能够显著降低连作障碍对根系生长的抑制作用。
根系活力的高低是体现植物根系吸收、合成和分配营养物质能力强弱的重要指标之一。由图4可以看出,施用促生菌的处理(CKP和RSP)的根系活力显著高于未施促生菌的处理(CK和RS),CKP和RSP处理中大蒜根系活力较CK分别提高37.61%和36.48%。
2.3促生菌对大蒜幼苗光合色素含量的影响
基于叶片农艺性状的差异,测定大蒜幼苗叶片中光和色素含量以探究不同处理下叶片光合作用强弱。由表1可知,与其他处理相比,连作土壤施促生菌(CKP)下大蒜幼苗的叶绿素a(Chl.a)、叶绿素b(Chl.b)以及总叶绿素(Chl)含量均达最大值,三者分别比连作土壤(CK)提高了48.67%、59.35%和50.82%。这表明促生菌能够通过提高叶片总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b的含量,增强连作大蒜的光合作用。
表1不同处理对大蒜幼苗光合色素含量的影响
注:CK:连作土壤;CKP:连作土壤施PGPB;RS:灭菌土壤;RSP:灭菌土壤施PGPB
2.4促生菌对大蒜幼苗渗透调节物质含量的影响
可溶性糖和可溶性蛋白是植物中重要的渗透调节物质。由图5可以看出,连作土壤施促生菌(CKP)的大蒜中可溶性糖含量为14.17%,较连作大蒜(CK)提高了31.22%。施用促生菌的处理(CKP和RSP)的可溶性蛋白含量高于连作大蒜(CK),分别比CK高出15.68%和44.56%。
2.5促生菌对大蒜幼苗氧化伤害物质含量的影响
H2O2和MDA是植物中的氧化伤害物质,其含量的高低能反映植物受胁迫伤害的程度。图6表明,促生菌显著降低了连作障碍下大蒜中的H2O2和MDA含量。在连作大蒜(CK)的叶片中H2O2含量高达82.88nmol/g,而连作土壤施促生菌(CKP)处理中H2O2含量较CK降低了40.71%;MDA含量在各处理中表现出类似的趋势,CKP处理中MDA含量较CK降低了33.01%。表明连作障碍会导致大蒜幼苗叶片中过氧化物质的累积,而施加PGPB可缓解连作障碍对大蒜幼苗的伤害作用。
2.6促生菌对大蒜幼苗抗氧化系统的影响
施用促生菌可提高连作大蒜的抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX、GR)活性,增加抗氧化物质(AsA和GSH)含量,强植株抗氧化能力。在连作障碍下,与不接种促生菌(CK)相比,接种P.putida UW4分别使抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX和GR活性提高了28.69%、513.66%、18.91%、5.81%和63.61%(图7)。不同处理对抗氧化物质(AsA、GSH)含量的影响与抗氧化酶结果一致,AsA含量和GSH含量在CKP处理中均达到最高,分别为186.99mg/g FW和21.79mg/g FW,较CK分别高出65.37%、159.72%(图8)。
2.7促生菌对大蒜根际土壤营养状况的影响
通过大蒜地上部形态和根系生长指标的差异,测定大蒜根际土壤营养元素含量,明晰施PGPB对连作土壤根际营养状况的影响。由图9可以看出,与连作障碍(CK)相比,连作土壤施PGPB后(CKP),根际土壤中全氮、全磷、全钾含量变化差异不明显。而CKP处理中速效磷、速效钾含量显著升高,较CK分别提高了6.05%和11.92%,
2.8促生菌对大蒜根际土壤酶活性的影响
从图10可知,四种处理中土壤酶活性变化差异显著。与连作障碍(CK)相比,连作土壤施促生菌(CKP)显著提高了连作大蒜根际的土壤酶活性。其中,CKP处理中过氧化氢酶活性较CK提高5.44%,磷酸酶活性较CK提高5.80%,脲酶活性较CK提高9.65%。其中蔗糖酶和多酚氧化酶活性变化差异最显著,CKP处理中蔗糖酶和多酚氧化酶活性较CK分别提高13.43%和8.88%。
Claims (7)
1.一种改善连作大蒜生长的根部灌施菌剂,其特征在于,所述菌剂为恶臭假单胞菌悬浮菌液。
2.根据权利要求1所述的改善连作大蒜生长的根部灌施菌剂,其特征在于,所述的恶臭假单胞菌悬浮菌液OD600为0.8-3.0。
3.权利要求1或2所述的根部灌施菌剂在连作大蒜种植中的应用。
4.一种通过促生菌改善连作大蒜根系生长的方法,其特征在于,将恶臭假单胞菌UW4菌液通过根部灌施的方法施用于大蒜根部。
5.根据权利要求4所述的通过促生菌改善连作大蒜根系生长的方法,其特征在于,所述的恶臭假单胞菌悬浮菌液OD600为0.8-3.0。
6.根据权利要求4所述的通过促生菌改善连作大蒜根系生长的方法,其特征在于,根部灌施的时间为大蒜苗为4-6cm时进行。
7.根据权利要求4所述的通过促生菌改善连作大蒜根系生长的方法,其特征在于,恶臭假单胞菌UW4悬浮液的制备方法:将纯化好的促生菌菌液于2800~3200rpm离心4~6min,取沉淀菌体用无菌水清洗1~3次,使重悬浮菌液OD600达0.8-3.0。
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檀国印等: "植物根际促生菌及其在克服连作障碍中的潜力", 热带作物学报, pages 135 - 141 * |
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