CN115235753A - 基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，使用原子力显微镜AFM对药物作用下的细胞进行定时间点机械特性的检测,对相应时间点的单细胞的细胞骨架和细胞核进行荧光染色后进行共聚焦成像，使用ImageJ软件计算定时间点细胞骨架密度，并建立起细胞骨架密度与细胞机械特性参数之间的偶联关系，并根据此对药物作用下细胞的状态进行分析。本发明可以建立细胞骨架密度与细胞的机械特性参数的关系，根据细胞骨架密度对细胞的机械特性参数进行预测，结合细胞骨架密度与细胞的机械特性参数进行药物作用下细胞状态的分析。操作简单、无毒，是基于单细胞尺度的药物作用下的细胞状态分析。因此，在单细胞尺度的药物敏感性分析领域具有重要的潜在应用。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞分析领域，具体为一种可以进行无创、无毒、免标记的单细胞分析方法。
背景技术
临床上，由于患者自身存在的异质性会导致对某些化疗药物不敏感或者耐药，化疗药物的选择、药物浓度的制定是医生对于患者化疗方案制定的关键。临床医生主要根据患者的病理分型、病人的身高、体重等指标，结合单细胞测序等多组学技术，制定化疗用药方案。但是，这些方法主要是患者群体的指标，忽略了患者自身存在的显著性差异，现有的单细胞分析技术在细胞群上进行，程序冗长、涉及其它有毒试剂容易造成假阳性率，并且不能检测出细胞群中的个体差异。因此，有必要开发出一种体外的基于单细胞尺度的药物敏感性分析技术，能够准确地评估个体患者对于某种药物的敏感性，确定用药剂量以及可以对药物起作用的时间进行估计，使用毒性较小或无毒的化合物，检测程序简短，并在单细胞水平上反映细胞的异质性。
已有研究表明：细胞的机械特性与细胞的生理病理状态，宏观机体的生命活动息息相关，并可以反应宏观机体的状态。细胞机械特性的改变会影响会影响细胞的运动、转移、侵袭、分化等生理活动。同时，细胞在化疗药物的作用下，会影响细胞的有丝分裂过程，重塑细胞骨架结构，力学特性和细胞状态也会随之发生改变。此外，一些靶向药物会与细胞表面的靶点结合，药物与靶点之间的结合力的大小，以及细胞表面靶点分布的密集程度也会影响到药物的治疗效果。因此，研究药物作用下细胞的力学特性变化可以促进对疾病病理过程的了解，并允许在单细胞尺度上进行药物敏感性和状态分析。
在众多细胞机械特性的检测技术中，原子力显微镜(AFM)，可以在液体环境下同时对细胞进行纳米级空间分辨率和毫秒时间分辨率的的力学特性检测，具有独一无二的优势。然而，目前对于细胞机械特性的检测大多是基于单个时间点的，忽略了细胞生理状态随时间的动态变化。研究表明，细胞骨架结构与细胞的机械特性以及生理状态直接相关。因此，在药物作用下特定时间内测量细胞机械特性并建立其与相应时间点的细胞骨架密度的偶联关系，对于更好地进行评估细胞的状态，进行单细胞尺度的药物敏感性分析，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以进行无创、无毒、免标记的单细胞状态分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。具体说是结合了微纳技术检测、共聚焦成像技术、统计学分析方法。主要用于进行单细胞尺度的细胞骨架密度与机械特性偶联和细胞状态分析。在单细胞分析及临床药敏感测试领域具有重要的潜在应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，包括以下步骤：
1)对于某种细胞，使用AFM对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行设定时间点机械特性的检测；
2)对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行细胞核和细胞骨架染色，并对细胞骨架平均荧光强度进行统计，以表征细胞骨架密度；
3)建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，并基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析。
通过使用原子力显微镜对细胞的机械特性检测，以实现对细胞的无毒、无损检测。
所述对细胞骨架平均荧光强度进行统计，通过荧光度分析软件实现。
所述建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，包括以下步骤：
构建细胞骨架密度与细胞机械特性的关系式：
y＝P1×x+P2
其中，x代表机械特性，为多维粘弹性参数向量α0＝(k0 k1 k2 b1 b2)T或者杨氏模量，k0,k1,k2,b1,b2代表粘弹性参数；y代表细胞的骨架密度，P1、P为系数矩阵；
将检测得到的机械特性、细胞骨架密度代入关系式中，得到P1、P，即得到细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系。
所述细胞的机械特性为多维粘弹性参数和杨氏模量中的至少一种。
所述基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析，具体如下：
根据待测细胞的机械特性，通过细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，得到待测细胞的骨架密度；
根据骨架密度对细胞的生理状态进行分析：
骨架密度越大，表示细胞的状态越差，药物作用效果越好；
骨架密度越小，表示细胞的状态越好，药物作用效果越差。
基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析装置，包括：
机械特性获取模块，用于获取使用AFM对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞进行检测得到的机械特性；
细胞骨架密度获取模块，用于获取细胞骨架密度，所述细胞骨架密度通过对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行细胞核和细胞骨架染色，并对细胞骨架平均荧光强度进行统计和表征得到；
细胞状态分析模块，用于建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，并基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析。
一种基于单细胞动态机械特性的药效评估装置，包括存储器和处理器；所述存储器，用于存储计算机程序；所述处理器，用于当执行所述计算机程序时，实现所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法。
一种计算机可读存储介质，所述存储介质上存储有计算机程序，当所述计算机程序被处理器执行时，实现所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法。
本发明具有以下有益效果及优点：
1.本发明在使用AFM进行细胞机械特性检测过程中，对细胞无毒、无损伤。在进行完连续时间的机械特性检测后，细胞仍然具有活性，可用于其它检测。
2.本发明通过量化细胞骨架密度，与细胞的机械特性以及细胞状态建立耦联关系，建立细胞骨架密度与细胞机械特性参数之间的线性模型，可根据该线性模型根据细胞的机械特性对细胞的骨架密度进行预测，并根据预测结果对药物作用下细胞的状态进行分析。
附图说明
图1为本发明的原理示意图；
图2为压痕实验获取细胞机械特性的示意图；
图3a为活细胞表面获取应力-松弛曲线中应力-松弛部分拟合图；
图3b为活细胞表面获取应力-松弛曲线；
图3c为活细胞表面获取的力曲线；
图4为不同药物不同作用时间下两种细胞的细胞核和细胞骨架染色共聚焦成像图。
图5a为MCF-7对照组、PTX_100nM组、PTX_1000nM组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图5b为HEK293对照组、PTX_100nM组、PTX_1000nM组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6a为MCF-7对照组、PTX_0～4h组、PTX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6b为MCF-7对照组、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6c为HEK293对照组、PTX_0～4h组、PTX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6d为HEK293对照组、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图7a为MCF-7对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数k0与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
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图7c为MCF-7对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数k2与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
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图7e为MCF-7对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数b2与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
图7f为MCF-7对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数杨氏模量与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
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图8d为HEK293对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数b1与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
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图8f为HEK293对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数杨氏模量与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。
图9a为MCF-7细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)的真实测量值与基于杨氏模量线性关系表达式以及基于粘弹性参数向量表达式预测值的比较。
图9b为HEK293细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)的真实测量值与基于杨氏模量线性关系表达式以及基于粘弹性参数向量表达式预测值的比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，根据原子力显微镜测量的细胞力学特性及当前时间点细胞骨架密度，建立二者之间的偶联关系并进行细胞状态分析。对对照组和加药组中细胞进行固定时间点的压痕实验，并通过模型计算相应时间点细胞的机械特性。对对照组和加药组中固定时间点细胞进行细胞核和细胞骨架的染色，并使用共聚焦显微镜进行细胞核和细胞骨架的成像。使用ImageJ对细胞骨架密度进行统计，并进行对照组和加药组中细胞骨架密度的显著性差异分析。使用皮尔森相关性分析，分析细胞机械特性参数与细胞骨架密度之间的线性关系。建立每个机械特性参数与细胞骨架密度之间的线性关系，并进行细胞骨架密度的预测。建立多维粘弹性参数向量与细胞骨架密度之间的关系，并进行细胞骨架密度的预测。根据机械特性参数与细胞骨架密度的偶联关系，进行单细胞的状态分析。本发明可以根据细胞的机械特性，对药物作用下细胞的骨架密度进行预测，建立细胞机械特性与细胞状态之间的关系，此外，与传统方法相比，大大缩短了药物测试周期，可以实现基于单细胞尺度的细胞状态分析。因此，在临床上基于单细胞尺度的药物敏感性测试和单细胞分析领域具有重要的潜在应用。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：使用AFM对未加药、加入不同浓度药物、不同药物作用时间的细胞进行固定时间点的机械特性检测，并进行固定时间点的细胞核、细胞骨架染色和共聚焦成像，使用分析ImageJ对细胞骨架密度进行分析统计，建立细胞骨架密度与细胞机械特性之间的偶联关系，并根据该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析。
对细胞的机械特性检测过程中使用原子力显微镜，实现了对细胞的无毒、无损检测。使用多维粘弹性参数和杨氏模量分别表征细胞的机械特性。比较未加药、不同浓度以及不同药物和不同药物作用时间下的细胞骨架密度的显著性差异。建立每个粘弹性参数与细胞骨架密度之间的线性关系，并根据该线性关系使用细胞的机械特性对细胞的骨架密度进行预测。比较根据建立的机械特性参数与细胞骨架密度之间的关系表达式对细胞骨架密度的预测结果与细胞真实骨架密度之间的差异。根据基于细胞机械特性进行细胞骨架密度的预测结果，评估不同药物、不同作用时间、不同浓度药物作用下对细胞的作用效果，根据骨架密度对细胞的生理状态进行分析。
使用AFM对细胞进行压痕实验，获取细胞的机械特性。图2中展示的AFM针尖对细胞进行下压，获取细胞机械特性示意图。
图3b是通过示波器记录下的活细胞表面应力-松弛曲线，图3a是记录下活细胞表面获取应力-松弛曲线中应力-松弛部分拟合图，使用广义的麦克斯维模型对应力-松弛曲线进行拟合，得到细胞的多维粘弹性参数：
其中，u和y分别代表系统的输入和输出，状态变量xi代表第i条通路中弹簧与阻尼之间的相对位移，该变量与细胞的形变密切相关，ki和bi分别是相应弹簧和阻尼的弹性和粘性系数。这里，输入信号u(t)代表应力-松弛过程中，PZT在Z轴方向上的位移始终保持恒定，输出信号y(t)是应力-松弛曲线。使用Hankle矩阵对系统阶次进行辨识，得到系统阶次n＝2,然后，使用最小二乘法对五个粘弹性参数k0,k1,k2,b1,b2进行确定。
图3c是使用软件Nanoscope记录细胞力曲线。使用如下赫兹模型对力曲线进行拟合，可以得到细胞的杨氏模量：
其中，F为AFM探针的加载速度，E是细胞的杨氏模量，δ为压痕深度，θ为锥形针尖半开角度数，υ为细胞泊松比率。在这里，我们将细胞看成是一个近似匀质的物体，因此，υ＝0.5。根据胡克定律，加载力F可写为：
F＝kx
其中，k是悬臂梁的弹簧常数，x是悬臂梁的偏转量，可以直接从力曲线中获得。
对固定时间点的细胞进行机械特性的检测，同时，进行细胞核和细胞骨架的染色并进行共聚焦拍照。使用ImageJ对细胞骨架蛋白进行荧光度分析，计算得到细胞骨架密度。使用皮尔森分析计算每个粘弹性参数与细胞骨架密度之间的线性相关性。最后，使用线性关系式y＝P1×x+P2(x代表多维粘弹性参数向量α0＝(k0 k1 k2 b1 b2)T或杨氏模量，y代表细胞骨架密度)建立细胞骨架密度和多维粘弹性参数和杨氏模量的关系，并分别根据多维粘弹性参数向量和杨氏模量对细胞骨架密度进行预测，基于建立起来的线性关系式，对药物作用下细胞的状态进行分析。
图4为不同药物不同作用时间下两种细胞的细胞核和细胞骨架染色共聚焦成像图。
图5a～图5b为MCF-7和HEK293细胞对照组、PTX_100nM组、PTX_1000nM组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6a为MCF-7对照组、PTX_0～4h组、PTX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6b为MCF-7对照组、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6c为HEK293对照组、PTX_0～4h组、PTX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图6d为HEK293对照组、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)显著性差异分析图。
图7a～图7f分别为MCF-7对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数k0，k1,k2,b1,b2,杨氏模量与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。其中，橙色点为对照组，浅绿色点为PTX_100nM组(PTX_0～4h组)，青色点为PTX_100nM组，深绿色点为PTX_4～8h组，浅蓝色点为DOX_0～4h组，深蓝色为DOX_4～8h组。红星代表每组机械特性参数和骨架蛋白的均值。
图8a～图8f分别为HEK293对照组、PTX_100nM组(PTX_0～4h组)、PTX_1000nM组、、PTX_4～8h、DOX_0～4h组、DOX_4～8h组细胞粘弹性参数k0，k1,k2,b1,b2,杨氏模量与细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)皮尔森相关性分析图。其中，橙色点为对照组，浅绿色点为PTX_100nM组(PTX_0～4h组)，青色点为PTX_100nM组，深绿色点为PTX_4～8h组，浅蓝色点为DOX_0～4h组，深蓝色为DOX_4～8h组。红星代表每组机械特性参数和骨架蛋白的均值。
图9a～图9b分别为MCF-7和HEK293细胞骨架蛋白平均荧光强度(细胞骨架密度)的真实测量值与基于杨氏模量线性关系表达式以及基于粘弹性参数向量表达式预测值的比较。
本发明通过建立的粘弹性参数和杨氏模量与细胞骨架密度之间的模型，通过测量机械特性参数可以对细胞骨架密度进行预测，同时，根据建立的细胞骨架密度、细胞机械特性参数以及细胞生理状态之间的联系，对药物作用下细胞的状态进行分析。
实施例一
1)取冻存的乳腺癌细胞(MCF-7)和小鼠成纤维细胞(HEK293),复苏后，采用5毫升细胞完全培养基(89％体积的高糖DMEM培养基+10％体积的胎牛血清+1％体积的青链霉素混合液)培养于直径为60毫米的细胞培养皿中，并在37摄氏度，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养；
2)每天更换新的细胞增殖培养基，直至细胞增殖到铺满培养皿底部面积的80％；
3)吸出培养皿中的细胞增殖培养基，分别在两种细胞中加入药物：对于每一种细胞，分别加入100nM紫杉醇(PTX)、1000nM的紫杉醇(PTX)、100nM的阿霉素(DOX)培养液，并设置对照组，即加入原培养基(5毫升细胞完全培养基)。
4)对对照组、及加入100nM和1000nM紫杉醇培养液的培养皿中的两种细胞，选取40个形态相似的细胞，在加药后4小时对细胞进行一次压痕实验。
5)对加入100nM紫杉醇及100nM阿霉素培养液的培养皿中的两种细胞，选取40个形态相似的细胞，分别在加药后4小时、8小时对细胞进行一次压痕实验。
6)使用赫兹模型和广义的麦克斯维模型根据压痕实验的结果对细胞的杨氏模量和多维粘弹性参数进行计算。
7)分别对对照组、100nM和1000nM紫杉醇作用下4小时、100nM紫杉醇及100nM阿霉素作用下的4小时及8小时细胞的骨架和细胞核进行染色，并进行共聚焦拍照。
8)使用ImageJ对7)中细胞骨架平均荧光强度进行计算。
9)使用皮尔森分析建立不同药物，不同药物浓度、不同药物作用时间下细胞机械特性参数与细胞骨架密度之间的线性关系。
10)建立细胞的各单一机械特性参数与细胞骨架密度之间的耦联关系。
11)建立细胞的多维粘弹性参数与细胞骨架密度之间的耦联关系。
12)根据多维粘弹性参数与细胞骨架密度之间的耦联关系，进行细胞骨架密度的预测。
13)建立细胞骨架密度、细胞机械特性参数以及细胞生理状态之间的联系，使用细胞的机械特性参数，用来评估药物的作用效果。
Claims (9)
1.基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对于某种细胞，使用AFM对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行设定时间点机械特性的检测；
2)对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行细胞核和细胞骨架染色，并对细胞骨架平均荧光强度进行统计，以表征细胞骨架密度；
3)建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，并基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析。
2.根据权利要求1所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，通过使用原子力显微镜对细胞的机械特性检测，以实现对细胞的无毒、无损检测。
3.根据权利要求1所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，所述对细胞骨架平均荧光强度进行统计，通过荧光度分析软件实现。
4.根据权利要求1所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，所述建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，包括以下步骤：
构建细胞骨架密度与细胞机械特性的关系式：
y＝P1×x+P2
其中，x代表机械特性，为多维粘弹性参数向量α0＝(k0 k1 k2 b1 b2)T或者杨氏模量，k0,k1,k2,b1,b2代表粘弹性参数；y代表细胞的骨架密度，P1、P为系数矩阵；
将检测得到的机械特性、细胞骨架密度代入关系式中，得到P1、P，即得到细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系。
5.根据权利要求1或4所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，所述细胞的机械特性为多维粘弹性参数和杨氏模量中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法，其特征在于，所述基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析，具体如下：
根据待测细胞的机械特性，通过细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，得到待测细胞的骨架密度；
根据骨架密度对细胞的生理状态进行分析：
骨架密度越大，表示细胞的状态越差，药物作用效果越好；
骨架密度越小，表示细胞的状态越好，药物作用效果越差。
7.基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析装置，其特征在于，包括：
机械特性获取模块，用于获取使用AFM对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞进行检测得到的机械特性；
细胞骨架密度获取模块，用于获取细胞骨架密度，所述细胞骨架密度通过对未加药、不同药物中每种药物的不同浓度、不同药物中每种药物作用时间下的细胞，进行细胞核和细胞骨架染色，并对细胞骨架平均荧光强度进行统计和表征得到；
细胞状态分析模块，用于建立细胞骨架密度与细胞机械特性的偶联关系，并基于该偶联关系进行药物作用下细胞状态分析。
8.一种基于单细胞动态机械特性的药效评估装置，其特征在于，包括存储器和处理器；所述存储器，用于存储计算机程序；所述处理器，用于当执行所述计算机程序时，实现如权利要求1-6任一项所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法。
9.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述存储介质上存储有计算机程序，当所述计算机程序被处理器执行时，实现如权利要求1-6任一项所述的基于细胞骨架密度与机械特性偶联的单细胞分析方法。
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