CN115232851B - 一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用。本发明以酸性蛋白酶对蚕蛹进行酶解制备得到的蚕蛹免疫肽兼具抑菌和抗氧化活性，且其抑菌和抗氧化活性较采用其他蛋白酶制备得到的蛋白肽的活性更强，可用于制备水产动物养殖相关的产品，以提高水产动物的免疫力，为健康养殖提供技术支持，同时也拓展了桑蚕产业的产业链。

Description

一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着水产业的迅速发展与扩张，水产养殖业进入了高密度、高产量的精养模式，水产养殖病害日益严重。抗生素等鱼药在水产养殖与疾病控制上起着不可替代的作用，但是因鱼药大多是仿制兽药、人用药和农药而成，存在科学性不足、针对性不强、药效不高、对环境影响大等问题。根据《农业农村部第194号公告》，饲料用抗生素自2020年7月1日起全面停用。为保障畜禽水产养殖的生产效益和食品安全，开发安全、高效的抗生素替代品成为养殖业健康发展的难点和热点。
我国蚕桑资源极为丰富，桑园种植面积超过1300万亩，蚕蛹年产量30万吨以上。蚕蛹中蛋白质含量较高，占其干物质重量的45％～50％，蚕蛹蛋白是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资源。近几年，蚕蛹蛋白肽在鳊鱼、草鱼、鸭嘴鱼、南美白对虾、罗氏沼虾等养殖上应用的相关研究表明，蚕蛹蛋白肽能明显降低饲料成本，提高生长速度和降低饵料系数等。同时，蚕蛹不仅是优质蛋白原料来源，其还富含黄酮、抗菌肽、诱食肽等功能性活性物质。但是目前的蚕蛹蛋白肽作为饲料来源不能很好的发挥其在免疫力增强方面的功效。因而，寻求制备可提高水产动物免疫力的蛋白肽的方法对于本领域来讲较为迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蚕蛹免疫肽及其制备方法和应用，采用本发明所述制备方法得到的蚕蛹免疫肽兼具抑菌和抗氧化双重活性，可以显著提高水产动物的免疫力。
本发明提供了一种蚕蛹免疫肽的制备方法，包括如下步骤：
以酸性蛋白酶酶解蚕蛹，所得酶解液中包括所述蚕蛹免疫肽。
优选的，所述酶解前，还包括将所述蚕蛹制成蚕蛹浆液。
优选的，所述蚕蛹浆液的制备步骤包括：将蚕蛹与水混合，匀浆，得到所述蚕蛹浆液；
所述蚕蛹与水的质量体积比为1g：0.90～1.10mL。
优选的，所述酸性蛋白酶的用量为5000～7000U/g蚕蛹蛋白。
优选的，进行所述酶解的温度为40～45℃，时间为2～4h，pH值为3.0～4.0。
优选的，所述蚕蛹包括鲜蚕蛹和/或缫丝蛹。
本发明提供了一种蚕蛹免疫肽，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明提供了上述技术方案所述的蚕蛹免疫肽在下述Ⅰ～Ⅳ中的一项或多项中的应用：
Ⅰ：制备抑菌产品；
Ⅱ：制备具有抗氧化活性的产品；
Ⅲ：制备提高水产动物免疫力的产品；
Ⅳ：制备除Ⅰ～Ⅲ以外的其他水产动物养殖产品。
优选的，所述抑菌产品包括用于抑制嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和哈维氏弧菌中的一种或多种的产品。
本发明还提供了一种水产动物养殖产品，所述水产动物养殖产品的活性成分包括上述技术方案所述的蚕蛹免疫肽。
有益效果：
本发明提供了一种蚕蛹免疫肽的制备方法，包括如下步骤：以酸性蛋白酶酶解蚕蛹，所得酶解液中包括所述蚕蛹免疫肽。本发明以酸性蛋白酶对蚕蛹进行酶解，并以总抗氧化活力和抑菌效果为靶标对得到的肽进行筛选，制备得到的蚕蛹免疫肽兼具抑菌和抗氧化活性，且其抑菌和抗氧化活性较采用其他蛋白酶制备得到的蛋白肽的活性更强，可用于制备包括药物、饲料等在内的水产动物养殖相关产品，以提高水产动物的免疫力，为健康养殖提供技术支持，同时也拓展了桑蚕产业的产业链。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为蚕蛹免疫肽的制备技术路线图；
图2为以Trolox为标准品的抗氧化活性标准曲线图；
图3为实施例1和对比例4～6中制备得到的蚕蛹蛋白肽对哈维氏弧菌的抑菌结果图；
图4为实施例1和对比例4～6中制备得到的蚕蛹蛋白肽对嗜水气单胞菌的抑菌结果图；
图5为实施例1和对比例4～6中制备得到的蚕蛹蛋白肽对荧光假单胞菌的抑菌结果图；
图6为实施例1和实施例4、对比例4和对比例7、对比例5和对比例9与对比例6和对比例12对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的抑菌结果图；
图7为实施例1和实施例4、对比例4和对比例7、对比例5和对比例9中酶解液总抗氧化活性结果图；
图8为实施例1、实施例5、对比例2～3中制备得到的酶解液的总抗氧化活性结果图；
图9为实施例1、实施例5、对比例2～3中得到的酶解液对嗜水气单胞菌的抑菌活性结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种蚕蛹免疫肽的制备方法，包括如下步骤：以酸性蛋白酶酶解蚕蛹，所得酶解液中包括所述蚕蛹免疫肽。
本发明在进行所述酶解前，优选还包括将所述蚕蛹制成蚕蛹浆液。本发明优选将蚕蛹与水混合，匀浆，得到所述蚕蛹浆液。本发明所述蚕蛹与水的质量体积比优选为1g：0.90～1.10mL，更优选为1g：1mL。本发明对所述匀浆的具体参数没有特殊限定，得到的蚕蛹浆液中无块状物即可。本发明所述蚕蛹优选包括鲜蚕蛹和/或缫丝蛹，更优选包括鲜蚕蛹或缫丝蛹。
得到所述蚕蛹浆液后，本发明优选以酸性蛋白酶酶解所述蚕蛹浆液，得到酶解混合物。本发明所述酸性蛋白酶的用量优选为5000～7000U/g蚕蛹蛋白，更优选为6000U/g蚕蛹蛋白。本发明所述蚕蛹蛋白优选为所述蚕蛹中含有的总蛋白，所述蚕蛹蛋白优选采用凯氏定氮法进行测定。本发明进行所述酶解前，优选采用HCl溶液调节所述蚕蛹浆液的pH值，所述pH值优选为3.0～4.0，更优选为3.0。本发明所述HCl溶液的浓度优选为0.5M。本发明所述酶解的温度优选为40～45℃，更优选为43℃；所述酶解的时间优选为2～4h，更优选为4h。本发明进行所述酶解时，优选伴随搅拌。本发明对所述搅拌的速度和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规搅拌速度和步骤即可。本发明所述搅拌有助于酶解反应均匀，避免酶解过程中的分层沉淀，导致酶解不彻底。完成所述酶解后，本发明优选还包括煮沸所述酶解混合物，以达到灭酶目的，得到灭酶后酶解混合物；所述煮沸的时间优选为5min。
得到所述灭酶后酶解混合物后，本发明优选还包括对所述灭酶后酶解混合物进行过滤，取滤过液，得到酶解液。本发明所述酶解液中包括所述蚕蛹免疫肽。本发明优选采用滤布进行所述过滤。本发明所述滤布的孔径优选为150～200目，更优选为200目。
得到所述酶解液后，本发明优选还包括对所述酶解液进行干燥，得到蚕蛹免疫肽粉。本发明所述干燥优选为真空干燥。本发明对所述真空干燥的条件没有特殊限定，采用本领域中常规真空干燥条件即可。
本发明提供了一种蚕蛹蛋白肽，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。采用本发明所述制备方法得到的蚕蛹蛋白肽兼具高抑菌和抗氧化活性，进而具有较高的免疫活性，对包括哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌在内的多种水产养殖常见菌抑菌效果明显。
依据所述蚕蛹蛋白肽所具有的上述活性，可将其进行下述Ⅰ～Ⅳ中的一项或多项中的应用：Ⅰ：制备抑菌产品；Ⅱ：制备具有抗氧化活性的产品；Ⅲ：制备提高水产动物免疫力的产品；Ⅳ：制备除Ⅰ～Ⅲ以外的其他水产动物养殖产品。本发明所述抑菌产品优选包括用于抑制嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和哈维氏弧菌中的一种或多种的产品。本发明所述产品优选包括药物和饲料。
本发明还提供了一种水产动物养殖产品，所述水产动物养殖产品的活性成分包括上述技术方案所述的蚕蛹蛋白肽。本发明所述水产动物养殖产品优选包括水产动物养殖用药物和水产动物养殖用饲料。本发明对所述水产动物养殖产品中所述蚕蛹蛋白肽的含量没有特殊限定，根据制备的产品常规调整即可。本发明所述水产动物养殖产品优选还包括其他活性成分和/或辅料。本发明对所述其他活性成分和辅料的用量和类型均没有特殊限定，依据所制备的产品常规调整即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种蚕蛹免疫肽的制备方法，由以下步骤组成：
收集鲜蚕蛹，加入与其质量相等体积的蒸馏水，匀浆15min，得到蚕蛹浆液；采用浓度为0.5M的HCl调节蚕蛹浆液的pH为3.0，按6000U/g蚕蛹蛋白的比例加入酸性蛋白酶，43℃下，搅拌酶解4h，煮沸5min，停止反应，滤布过滤，获得高免疫活性的酶解液，经真空干燥，获得蚕蛹免疫肽干粉。
实施例2
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于，采用的是缫丝蛹；实施例1～2中的制备方法的技术路线如图1所示，其中起始位置的鲜蚕蛹，缫丝蛹代表鲜蚕蛹或缫丝蛹。
实施例3
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于搅拌酶解时间为3h。
实施例4
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于搅拌酶解时间为2h。
对比例1
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于搅拌酶解时间为1h。
实施例5
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于酶解pH为4.0。
对比例2
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于酶解pH为5.0。
对比例3
采用实施例1中的制备方法制备蚕蛹免疫肽，区别在于酶解pH为6.0。
测试例1
利用蛋白定量试剂盒(购买自南京建成生物工程有限公司)对实施例1、实施例3～4和对比例1中得到的酶解液的蛋白浓度进行测定，并计算酶解液中蛋白得率，其中酶解液中蛋白的得率的计算公式如下：其中酶解液蛋白含量＝酶解液的蛋白浓度×酶解液体积；
酶解液蛋白得率＝酶解液蛋白含量/蚕蛹总蛋白含量×100％；
其中蚕蛹总蛋白的含量参照凯氏定氮法进行测定。
测定的结果如表1所示：
表1实施例1、实施例3～4和对比例1中制备得到的酶解液蛋白得率
由表1可以得出：相同酶解方法下，酶解1h，酶解液蛋白得率为53.64％，而酶解2～4h的酶解液蛋白得率依次为77.86％、81.67％和78.24％，可见，对比例1中酶解1h的蛋白得率显著小于实施例1和实施例3～4中酶解2～4h的蛋白得率。
测试例2
酶解液的总抗氧化活性检测
采用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒对实施例1、实施例3～4和对比例1中得到的酶解液的总的抗氧化活性进行检测。以Trolox为对照，按说明书操作说明建立标准曲线，标准曲线如图2所示，获得反应体系吸光度值(y)和样品浓度(x)间的线性关系公式为：y＝-0.8074x+1.1217，R2＝0.9956。
参照上述试剂盒中的说明书对实施例1、实施例3～4和对比例1中得到的酶解液的抗氧化能力进行换算后，得出实施例1、实施例3～4和对比例1酶解液总抗氧化能力依次为0.86±0.058、0.78±0.039、0.74±0.00.035和0.68±0.037。可见，采用实施例1、实施例3～4中的制备方法制备的得到的酶解液的抗氧化能力要较采用对比例1中的方法制备得到的酶解液的抗氧化能力更强。
对比例4～12
采用实施例1中的制备方法，制备蚕蛹免疫蛋白肽，区别在于，对比例4～12中采用的蛋白酶、酶解时的pH值以及酶解温度不同，实施例1和对比例4～12中具体的制备参数如表2所示：
表2实施例1和对比例4～12的制备参数
测试例3
不同蛋白酶制备得到的蚕蛹免疫肽抑菌活性测定：
1)将实施例1和对比例4～6中制备得到的酶解液分别采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分别得到除菌后实施例1和对比例4～6的酶解液。
2)将含有106CFU/L淡水鱼类病原菌嗜水气单胞菌(中国标准物质网，编号BNCC336453)、荧光假单胞菌(中国标准物质网，编号BNCC336632)和哈维氏弧菌(北纳生物，BNCC336937)的NA/BHI培养基倒入培养皿，凝固后用打孔器打孔，孔径为0.3cm。
3)将步骤1)中得到的实施例1和对比例4～6的酶解液分别在步骤2)的孔中点样，点样量均为10μL，待吸收干燥后，28℃倒置培养过夜，观察抑菌圈，如图3～5所示。图3、图4和图5分别代表含有哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的培养基；在图3、图4和图5中1、2、3和4均分别代表以木瓜蛋白酶(对比例4)、菠萝蛋白酶(对比例5)、酸性蛋白酶(实施例1)和中性蛋白酶(对比例6)酶解得到的酶解液的抑菌圈，培养基中间圆孔代表阳性对照庆大霉素(100μg/mL)的抑菌圈，箭头所指为酸性蛋白酶酶解液对所检病原菌的抑菌圈，短线所示为抑菌圈直径大小。
由图3～5可以看出：实施例1中采用酸性蛋白酶制备得到的酶解液对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌都具有明显的抑菌圈，即实施例1中制备得到的酶解液对上述三种病原菌都有显著的抑菌效果；而采用木瓜蛋白酶(对比例4)、菠萝蛋白酶(对比例5)和中性蛋白酶(对比例6)制备得到的酶解液则没有明显的抑菌圈。
测试例4
不同蛋白酶不同酶解时间制备得到的蚕蛹免疫肽抑菌活性测定：
采用测试例3中的方法对实施例1、实施例3～4、对比例4～12中得到的酶解液的对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的抑菌活性测定，结果如图6所示。在图6中，左图、中图和右图分别代表的是含有嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和哈维氏弧菌的培养基；在左图、中图和右图中，0代表阳性对照庆大霉素，1，2分别代表木瓜蛋白酶酶解2h(对比例7)和4h(对比例4)得到的酶解液的抑菌圈，3，4分别代表菠萝蛋白酶酶解2h(对比例9)和4h(对比例5)得到的酶解液的抑菌圈，5，6分别代表酸性蛋白酶酶解2h(实施例4)和4h(实施例1)得到酶解液的抑菌圈；7，8分别代表中性蛋白酶酶解2h(对比例12)和4h(对比例6)得到的酶解液的抑菌圈；箭头所指为酸性蛋白酶酶解液对所检病原菌的抑菌圈。
根据图6可以得出：采用酸性蛋白酶对蚕蛹酶解2h和4h制备得到的酶解液对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌都具有明显的抑菌圈，即实施例1和实施例4中制备得到的酶解液对上述三种病原菌都有显著的抑菌效果；而采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶对蚕蛹酶解2h和4h制备得到的酶解液则均没有明显的抑菌圈。
基于测试例3～4中的结果可以证明：采用本发明制备方法制备得到的蚕蛹免疫肽对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌具有较强的抑菌活性。
测试例5
不同蛋白酶不同酶解时间制备得到的蚕蛹免疫肽总抗氧化活性测定：
采用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒对实施例1、实施例3～4、对比例4～12中制备得到的酶解液的总抗氧化活性进行检测，标准曲线的构建方法和标准曲线同测试例2。其中，实施例1和实施例4、对比例4和对比例7、对比例5和对比例9与对比例6和对比例12中酶解液总抗氧化活性的结果如图7所示。
由图7可以得出：采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶酶解4h制备得到的酶解液的抗氧化活性均高于对应蛋白酶酶解2h得到的酶解液的抗氧化活性，尤其是酸性蛋白酶酶解4h得到的酶解液的抗氧化活性最高，且与其他组的抗氧化活性具有显著差异(p＜0.05)。
测试例6
不同pH条件下酸性蛋白酶酶解液的总抗氧化活性和抑菌活性测定
1)采用南京建成生物工程研究所总抗氧化活性(T-AOC)检测试剂盒对实施例1、实施例5、对比例2～3中制备得到的酶解液的总抗氧化活性进行检测，标准曲线的构建方法和标准曲线同测试例2。测定结果如图8所示。
由图8可以看出：酶解pH为3～4条件下获得的酶解液的抗氧化活性均较强，尤其当pH值为3时酶解液的抗氧化活性显著高于pH为5～6条件下获得的酶解液的抗氧化活性。
2)采用测试例3中的方法对实施例1、实施例5、对比例2～3中得到的酶解液对嗜水气单胞菌的抑菌活性测定，结果如图9所示，其中中间圆孔代表的是阳性对照庆大霉素(100μg/mL)对嗜水气单胞菌的抑菌圈。
由图9可以看出：酶解pH为3～4(实施例1和实施例5)条件下获得的酶解液对嗜水气单胞菌均具有较为明显的抑菌圈，尤其pH值为3条件下获得的酶解液的抑菌圈更大更明显，而pH为5～6(对比例2～3)条件下获得的酶解液对嗜水气单胞菌并没有抑菌圈。
基于测试例5～6的结果可以得出：采用本发明制备方法制备得到的蚕蛹免疫肽具有较高的抗氧化活性。
由以上实施例可以得出：采用本发明所述的制备方法得到的蚕蛹免疫肽兼具高抗氧化和抑菌活性，较对比例中制备得到的蛋白肽地抗氧化和抑菌活性更高，进而使其免疫性更强。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.蚕蛹免疫肽在制备抑菌产品和/或制备具有抗氧化活性的产品中的应用；所述抑菌产品包括用于抑制嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和哈维氏弧菌中的一种或多种的产品；
所述蚕蛹免疫肽的制备方法，包括如下步骤：
将蚕蛹与水混合，匀浆，得到所述蚕蛹浆液；
以酸性蛋白酶酶解所述蚕蛹浆液，所得酶解液中包括所述蚕蛹免疫肽；
所述蚕蛹与水的质量体积比为1g：0.90~1.10mL；
所述酸性蛋白酶的用量为5000~7000U/g蚕蛹蛋白；
所述酶解的温度为40~45℃，时间为2~4h，pH值为3.0~4.0。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蚕蛹包括鲜蚕蛹和/或缫丝蛹。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蚕蛹与水的质量体积比为1g：1mL。
4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述酸性蛋白酶的用量为6000U/g。
5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述酶解的温度为43℃，时间为4h，pH值为3.0。
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