CN115227819A

CN115227819A - 一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115227819A
Application number: CN202210856873.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋冠; 王云; 杨春生; 夏佳丽; 孙丹丹; 唐慧敏; 丁明明
Original assignee: Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Priority date: 2022-07-20
Filing date: 2022-07-20
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2042-07-20
Also published as: CN115227819B

Abstract

本发明提供了一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒及其制备方法和应用，属于纳米生物医学技术领域。本发明通过“一锅法”成功制备了新型自产氧纳米粒MAL‑CAT@ZIF‑8/T(MCZT)，该纳米粒呈核‑壳‑壳结构，MAL和CAT分布于纳米粒内部，ZIF‑8作为载体材料构成纳米粒内壳，最外层通过化学修饰包被有TRPV1mAb作为外壳，制备的纳米粒大小均一、粒径分布规律，分散性好，粒径为115～125nm。通过FT‑IR、XRD、荧光光谱等手段证明光敏剂MAL及CAT被成功包覆，以及TRPV1mAb对纳米粒子的表面成功改性修饰，并在635nm红光辅助下对UVA辐照诱导的光老化HFF‑1细胞及光老化裸鼠发挥PDT作用，为皮肤光老化的预防、治疗提供了新的思路和方法。

Description

一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物医学技术领域，具体而言，涉及一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒，尤其涉及一种以沸石咪唑骨架材料作为载体的新型自产氧纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，具有物质代谢、吸收、感觉、屏障、体温调节等重要功能^[2]。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化，内源性老化是指时间引起的自然衰老，其外在皮肤特征是皮肤苍白、干燥、弹性较小、皱纹细小。外源性老化是指由紫外线、创伤、化学物质、吸烟、饮食等引起的外在老化。其中，由紫外线引起的老化作用最强，被称为光老化。光老化不仅与人类的健康，美学，心理和生活质量息息相关，而且光老化的不当治疗会导致光化性角化病，并最终导致皮肤肿瘤，例如鳞状细胞癌和黑色素瘤。

光老化是由太阳光引起的，地球表面的阳光主要由红外线(52-55％)、可见光(44％)和紫外光(3％)组成。太阳的绝大部分紫外线辐射(UVR，400-1000nm)被地球大气层阻挡，到达地球表面的UVR由95％长波紫外线(UVA，400-315nm)和大约5％中波紫外线(UVB，315-280nm)组成，尤其是UVA可以穿透人体皮肤真皮组织，减少胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白的合成并引起异常降解，从而导致真皮基质质量和数量的变化并引起皮肤光老化。皮肤光老化的组织病理学特征是皮肤基质构成组分的变化，即胶原成分的减少和异常弹性纤维的堆积。真皮中最主要成分包含氨基多糖、蛋白多糖、弹力纤维和胶原纤维等基质，而这些物质均来自于皮肤成纤维细胞合成。光老化被认为是紫外线辐照所致损伤在皮肤老化基础上的叠加，尤其是A型长波紫外线(UVA)，UVA过度辐照将导致皮肤红斑生成、成纤维细胞的过早衰老、ROS异常表达、MMPs、COX-2等表达增加并导致炎症发生，胶原纤维的紊乱、异常胶原蛋白的积累、细胞间基质更新减少，从而产生皱纹，加重光老化进程。许多权威研究证实，真皮成纤维细胞在UVA光老化进程中起主导作用(Wang M,Lei M,Chang L,et al.Bach2regulates autophagy to modulate UVA-induced photoaging in skin fibroblasts[J].Free Radic Biol Med,2021,169(22):304-316.)。且近年来对光老化机制的深入研究，为我们理解真皮成纤维细胞在光老化中所扮演的角色提供了新的线索。

目前，预防及治疗光老化的方法主要有涂抹防晒霜、抗氧化产品、局部使用维生素A衍生物、光电疗法、物理治疗、注射填充等。随着医药健康领域的不断发展，越来越多的方法可用于光老化皮肤的预防和治疗，但这些方法均很难取得满意的疗效，因此探索新的高效无毒的治疗手段具有重要的意义。近年来，许多研究发现光动力疗法(photodynamictherapy，PDT)是一种缓解治疗光老化，改善皮肤状况的有效手段，但是其发挥光老化治疗作用的机制尚未有明确报道。PDT即靶细胞中外源性或内源性的光敏剂在特定波长的光的作用下与氧发生一系列光化学反应，通过生成氧自由基、单态氧等活性氧物质(reactiveoxygen species，ROS)，诱导靶细胞死亡，从而有选择性地破坏靶组织的一种治疗方法。PDT能通过光敏剂在增生活跃的病变组织富集，在光的激活作用下细胞内产生具有细胞毒性的ROS，使肿瘤细胞以及被病毒感染的细胞发生死亡从而达到治疗肿瘤和病毒疣的作用。然而，有研究证明UV照射可以激活表皮的辣椒素受体I型(TRPV1)，诱导多种炎症因子释放，进一步引起光老化的产生(Jiang R,Xu X,Sun Z,et al.Protective Effects of GinsengProteins on Photoaging of Mouse Fibroblasts Induced by UVA[J].PhotochemPhotobiol,2020,96(1):113-123.)。TRPV1/VR1是一种热激活的阳离子通道，是通过辣椒的活性成分辣椒素激活发现，对Ca²⁺具有高通透性，可被各种内源性和外源性因子激活，可诱发水肿、炎症等症状。TRPV1已被证实在紫外线照射后的角质形成细胞中高表达。研究表明，类似于表皮角质形成细胞，热处理能够上调皮肤成纤维细胞中TRPV1的表达(Bosch R,Philips N,Suárez-Pérez J A,et al.Mechanisms of Photoaging and CutaneousPhotocarcinogenesis,and Photoprotective Strategies with Phytochemicals[J].Antioxidants(Basel),2015,4(2):248-268.)。TRPV1通道开放后启动信号传递，引起IL-1b、IL-6、IL-8等多种炎症细胞因子的表达，这些促炎细胞因子还可诱导胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶(MMPs)高表达，包括MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-12等，引起皮肤纹理加深、胶原蛋白丢失(Honeybrook A,Bernstein E.Oral isotretinoin and photoaging:A review[J].J Cosmet Dermatol,2020,19(7):1548-1554.)，而胶原蛋白的减少是光老化和自然老化中皮肤皱纹产生的主要原因。因而TRPV1与光老化有着密切的联系。

纳米粒子具有纳米级尺寸、良好的生物相容性和可塑性强等特点，在近年来引起了越来越多研究者的关注，各种基于纳米粒子的PDT(nano-PDT)策略被开发以克服传统PDT的上述局限性。通过检索现有技术，尚未发现采用沸石咪唑骨架材料作为载体，通过表面修饰TRPV1mAb赋予其靶向性而构建介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的文献报道。

发明内容

鉴于紫外线照射可以激活皮肤细胞膜上的辣椒素受体I型(TRPV1)通道，诱导多种炎症因子释放，进一步引起光老化的产生，因此本发明的目的在于从提高治疗靶向性和安全性入手，将纳米治疗与光动力治疗结合起来，提供一种采用PDT介导并靶向TRPV1的自产氧纳米粒及其制备方法和治疗皮肤光老化的应用。

发明人考虑到，PDT会诱导光老化皮肤胶原蛋白的增加和日光性弹力纤维变性的减少，而PDT在缺氧微环境组织中疗效有限，因为PDT中的光敏剂中ROS的生成会大量迅速消耗内源性氧，明显阻碍PDT的疗效。过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种胞内酶，广泛存在于哺乳动物和非哺乳动物需氧体中含有细胞色素系统的细胞，其通过催化过氧化氢(H₂O₂)分解成水和氧气，使得H₂O₂不至于与O₂在铁螯合物作用下反应生成对机体有损伤作用的-OH。

鉴于此，本发明人拟将光敏剂甲基氨基酮戊酸(methyl aminolaevulinate，MAL)和过氧化氢酶CAT负载在ZIF-8孔隙中，ZIF-8在组织中的降解会导致MAL和CAT溢出，CAT催化光老化细胞内源性的H₂O₂产生O₂，促进了MAL在近红外光照射下，形成杀死光老化细胞的¹O₂和其他ROS，进而增强了PDT对光老化细胞的疗效，降低了对正常组织细胞的毒副作用。借助ZIF-8载体，MAL可以完全被隔离在MOFs材料骨架中，以减少光敏剂的自聚集淬灭，增强了光敏剂诱导产生¹O₂和其他ROS的能力，而且MOFs材料的多孔结构可以更快的将生成的¹O₂和其他ROS扩散。

因此，本发明人以沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8为纳米载体，装载光敏剂MAL和过氧化氢酶CAT并通过表面修饰TRPV1mAb赋予其靶向性，构建新型自产氧纳米粒MAL-CAT@ZIF-8/T(MCZT)，探索其在UVA辐照所构建的HFF-1细胞体外模型和UV辐照构建的裸鼠光老化模型中的生物学作用及潜在机制，最终为皮肤光老化的预防和治疗提供新的思路和方法。

具体地，本发明的技术目的是这样实现的：一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒，该纳米粒呈核-壳-壳结构，MAL和CAT分布于纳米粒内部，ZIF-8作为载体材料构成纳米粒内壳，最外层通过化学修饰包被有TRPV1mAb作为外壳，其中MAL为甲基氨基酮戊酸，CAT为过氧化氢酶，ZIF-8为2-甲基咪唑锌盐，TRPV1mAb为辣椒素受体I型单抗。

进一步地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒，其经SEM、TEM、水合粒径及Zeta电位等指标表征，结果显示所制备的纳米粒大小均一、粒径分布规律，分散性好，粒径为115～125nm，具有很高的载药量，且生物物相容性优良。通过FT-IR、XRD、荧光光谱等手段证明光敏剂MAL及CAT被成功包覆，以及TRPV1mAb对纳米粒子的表面成功改性修饰，可作为光老化治疗的潜在药物。

另外，本发明还提供了上述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将锌盐溶解于双蒸水中，所得溶液备用；

(2)将2-甲基咪唑、MAL和CAT溶解于双蒸水中，然后快速加入步骤(1)配制的溶液并搅拌混匀，随后静置2～5h，于离心机上9000～11000rpm离心水洗1～4次，每次的离心时间8～13min，所得沉淀为MAL-CAT@ZIF-8，备用；

(3)将步骤(2)得到MAL-CAT@ZIF-8加入双蒸水中，随后加入TRPV1mAb，冰浴条件下搅拌3～5h，反应结束后得到所述自产氧纳米粒。

进一步优选地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其中的锌盐、2-甲基咪唑、MAL、CAT的用量分别为：锌盐0.08～0.20重量份；2-甲基咪唑1.7～2.3重量份；MAL 0.02～0.05重量份；CAT0.01～0.03重量份)。

再进一步优选地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其中的锌盐、2-甲基咪唑、MAL、CAT的用量分别为：锌盐0.09～0.12重量份；2-甲基咪唑1.9～2.0重量份；MAL 0.03～0.04重量份；CAT0.01～0.02重量份。

进一步优选地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其中步骤(1)所述的锌盐选自如下的一种或两种以上：硝酸锌、硫酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、乙酸锌。

进一步优选地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其步骤(3)中所述MAL-CAT@ZIF-8加入双蒸水后，在超声波清洗器中超声4～8min，然后再加入TRPV1mAb进行反应。

进一步优选地，如上所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其步骤(3)中MAL-CAT@ZIF-8与TRPV1mAb的质量比为1：(0.03～0.05)。

本发明的试验研究结果显示：UVA辐照可诱导HFF-1细胞衰老，细胞活力降低，给予本发明纳米粒MCZT预孵育介导PDT后，可通过产生ROS，下调细胞内炎症因子的水平，降低COX-2和MMP-1的表达，减轻UVA诱导的HFF-1细胞衰老和凋亡，减缓光老化进程。另外，UV辐照可诱导裸鼠皮肤粗糙变厚、水分流失、真皮胶原纤维变性、炎性细胞浸润，给予纳米粒预涂抹介导PDT后，可通过上调I型胶原和III型胶原含量，提高胶原蛋白的表达，抑制炎症因子的释放，降低COX-2和MMP-1的表达，促进皮肤组成成分的恢复，从而改善光老化现象，为皮肤光老化的预防、治疗提供新的思路和方法。因此，本发明还提供了上述自产氧纳米粒在制备预防或治疗皮肤光老化的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明利用新型纳米材料ZIF-8装载光敏剂MAL和过氧化氢酶CAT，以TRPV1mAb对ZIF-8纳米粒进行化学修饰赋予靶向性，所制备的自产氧纳米粒具有如下优点和显著进步性：

(1)通过“一锅法”成功制备了新型自产氧纳米粒MCZT，制备的纳米粒大小均一、粒径分布规律，分散性好，粒径为115～125nm。通过FT-IR、XRD、荧光光谱等手段证明光敏剂MAL及CAT被成功包覆，以及TRPV1mAb对纳米粒子的表面成功改性修饰，可作为光老化治疗的潜在药物。

(2)TRPV1mAb抗体的导向作用可使ZIF-8纳米粒主动靶向于UVA照射后的衰老皮肤成纤维细胞，增强药物敏感性，延长药物有效作用时间。ZIF-8的多孔结构可实现持续缓释MAL和CAT，实现UVA照射后皮肤组织内高浓度氧，清除光老化过程中产生的自由基，降低IL-1b，IL-6，IL-8、MMP-1、MMP-3和MMP-9等炎症因子的表达。ZIF-8纳米控释载体借635nm红光增强PDT发挥作用，PDT会诱导光老化皮肤胶原蛋白增加和日光性弹力纤维变性的减少，加速表皮剥脱更替，较好抑制皮肤光老化。

(3)通过CCK-8法评价本发明的自产氧纳米粒MCZT，结果显示其具备良好的生物相容性，且证明红光照射对HFF-1没有明显的细胞毒性，具有良好的治疗剂量安全性。

(4)通过衰老标志物SA-β-Gal的检测，表明经过UVA照射后阳性衰老细胞数量明显增加，而经过治疗后阳性衰老细胞数量减少。流式细胞术检测结果表明：MCZT-PDT可使细胞凋亡率降低，治疗组与模型组相比差异有统计学意义。WB检测结果表明：与模型组相比，MCZT-PDT治疗干预组细胞内MMP-1、COX-2蛋白降低，差异有统计学意义。

(5)MCZT纳米粒在裸鼠光老化模型中的生物安全性评价显示MCZT治疗裸鼠光老化时，无明显的系统毒性。氧化应激相关指标的变化、炎症相关指标的变化、皮肤组成成分的变化均证明MCZT可抑制裸鼠皮肤光老化。免疫组化检测结果表明：与模型组相比，MCZT治疗干预组组织内MMP-1、COX-2蛋白降低，差异有统计学意义。TUNEL分析结果显示MCZT治疗可以改善皮肤组织凋亡情况。

附图说明

图1为MCZT纳米粒的合成和结构示意图。

图2为纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的粒径和形貌特征。A：纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的TEM图片，图中的标尺为100nm；B：DLS检测纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的粒径和Zeta电位；C：纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的SEM图片，图中的标尺为500nm。

图3为纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的Zeta电位分析。

图4为纳米粒ZIF-8、ZIF-8T、MZ、CZ、MCZ及MCZT的XRD分析。

图5为纳米粒ZIF-8、MAL、CAT、TRPV1mAb、MCZ及MCZT的FT-IR分析。

图6：(A)便携式溶解氧仪测定纳米粒中CAT产氧量；(B)纳米粒中CAT产氧能力气泡图。

图7：(A)纳米材料MCZT对HFF-1细胞活力的影响，不同浓度MCZT与HFF-1细胞共同孵育24h；(B)光疗仪LED对HFF-1细胞活力的影响，不同剂量的NIR光照射HFF-1细胞后孵育24h；(mean±SD，n＝3)。

图8为UVA光照对HFF-1细胞的影响。A：不同的UVA光照剂量(1.25，2.5，5，10，15，20，25，30J/cm²)照射HFF-1细胞对HFF-1细胞活力的影响；B：不同的UVA光照剂量(5，6，7，8，9，10J/cm²)照射HFF-1细胞；C：UVA(6J/cm²)照射前后的HFF-1细胞透射电镜拍摄结果；D：不同的UVA光照剂量(5，6，7，8，9，10J/cm²)照射HFF-1细胞对HFF-1细胞形态的影响。(mean±SD，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs control组)。

图9为UVA、L-MCZT和H-MCZT对HFF-1细胞的影响。(A)倒置荧光显微镜拍摄HFF-1细胞SA-β-Gal染色前后的荧光变化；(B)UVA、L-MCZT和H-MCZT对HFF-1细胞活死的影响；(C)UVA、L-MCZT和H-MCZT对HFF-1细胞存活率的影响；(D)SA-β-Gal染色对应的衰老阳性细胞比例；(mean±SD，n＝3，**P<0.01，***P<0.001vs control组，^#P<0.05，^###P<0.001vs UVA组)。

图10为CLSM检测HFF-1细胞对MCZT的靶向摄入。

图11为CLSM检测MCZT在HFF-1细胞内产生ROS的能力。

图12为Elisa检测MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞老化相关炎症因子分泌的影响；(A)HFF-1细胞造模和给药前后IL-6表达的变化量；(B)HFF-1细胞造模和给药前后IL-8表达的变化量；(C)HFF-1细胞造模和给药前后IL-1β表达的变化量；(D)HFF-1细胞造模和给药前后TNF-α表达的变化量；(mean±SD，n＝3，***P<0.001vs control组，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs UVA组)。

图13为MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞凋亡的影响。流式细胞实验检测凋亡率；(mean±SD，n＝3，^##P<0.01vs control组，*P<0.05，**P<0.01vs UVA组)。

图14为MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞中COX-2、MMP-1蛋白水平的影响；WB实验检测COX-2、MMP-1蛋白条带，定量分析COX-2/GADPH和MMP-1/GADPH的相对表达量；(mean±SD，n＝3，^##P<0.01vs control组，*P<0.05，**P<0.01vs UVA组)。

图15为不同剂量UVA对裸鼠背部皮肤光老化的影响

图16：(A)MCZT介导的PDT对光老化裸鼠背部皮肤的影响及局部放大图；(B)MCZT在裸鼠光老化模型中介导PDT的HE染色变化；(C)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中含水量的影响；(D)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中HA表达量的影响；(E)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中HAS1表达量的影响；(mean±SD，n＝3，^##P<0.01vs control group and*P<0.05,**P<0.01vs model group.)。

图17为MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中炎症和氧化应激指标的影响；(A)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中IL-6表达量的影响；(B)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中IL-1β表达量的影响；(C)Elisa验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中TNF-α表达量的影响。(D)紫外分光光度法检测MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中SOD表达量的影响；(E)紫外分光光度法验证MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中GSH-PX表达量的影响；(F)紫外分光光度法检测MCZT纳米粒对紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤组织中MDA表达量的影响；(mean±SD，n＝3，^##P<0.01vs control group and*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.)。

具体实施方式

下面通过具体实验例对本发明作进一步详细说明。

一、材料

1.1细胞株

人皮肤成纤维细胞HFF-1 上海中乔新舟生物科技有限公司

1.2试剂

六水合硝酸锌上海麦克林生化科技有限公司

2-甲基咪唑上海麦克林生化科技有限公司

5-氨基酮戊酸甲酯盐酸盐上海麦克林生化科技有限公司

TRPV1 MonoclonalAntibody 武汉三鹰生物技术有限公司

二、方法

2.1纳米材料的制备

2.1.1 ZIF-8的制备

电子天平称取100mg的Zn(NO₃)₂·6H₂O、1.94g的2-甲基咪唑(2-MIM)，量筒量取10ml双蒸水(DI)，采用“一锅装”法，将Zn(NO₃)₂·6H₂O、2-甲基咪唑依次放入50ml茄型瓶中，加入10ml双蒸水，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上搅拌5min，随后，将茄型瓶置于阴凉干燥处静置3h，于离心机上离心水洗3次，每次10000rpm×10min，倒掉上清液，取沉淀，向沉淀中加入DI，制成10ml样品，4℃冰箱保存。所得样品为纳米材料载体ZIF-8，即2-甲基咪唑锌盐，又叫沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8。

2.1.2 MAL@ZIF-8的制备

称取100mg的Zn(NO₃)₂·6H₂O溶解于1ml DI中，称取1.945g的2-MIM，30mg的MAL溶解于9ml DI中，待2-MIM和MAL在50ml茄型瓶中充分溶解后将1ml的Zn(NO₃)₂·6H₂O快速倒入茄型瓶中搅拌5min，随后将茄型瓶置于阴凉干燥处静置3h，于离心机上离心水洗3次，每次10000rpm×10min，倒掉上清液，取沉淀，向沉淀中加入DI，制成10ml样品，4℃冰箱保存。

2.1.3 CAT@ZIF-8的制备

称取100mg的Zn(NO₃)₂·6H₂O溶解于1ml DI中，称取1.945g的2-MIM，15mg的CAT溶解于9ml DI中，待2-MIM和CAT在50ml茄型瓶中充分溶解后将1ml的Zn(NO₃)₂·6H₂O快速倒入茄型瓶中搅拌5min，随后将茄型瓶置于阴凉干燥处静置3h，于离心机上离心水洗3次，每次10000rpm×10min，收集上清液(用作计算包封率的使用)，取沉淀，向沉淀中加入DI，制成10ml样品，即为CAT@ZIF-8原液，4℃冰箱保存。

2.1.4 MAL-CAT@ZIF-8的制备

实验步骤同2.1.3，将2-MIM、MAL、CAT和Zn(NO₃)₂·6H₂O通过“一锅装”法制备得到MAL-CAT@ZIF-8原液，4℃冰箱保存。

2.1.5 MAL-CAT@ZIF-8/T的制备

称取1mg经冷冻干燥机干燥后的MAL-CAT@ZIF-8于50ml茄型瓶中，加入5ml DI，在超声波清洗器中超声5min，随后加入40μl的TRPV1mAb(浓度1000μg/ml)，冰浴条件下搅拌4h，用10ml离心管收集样品，4℃冰箱保存。

2.2纳米材料的表征

2.2.1扫描电子显微镜(SEM)测试

将样本从4℃冰箱拿出，取1ml样本于10ml EP管中，稀释10倍成10ml的拍摄样品，置于涡旋混匀仪涡旋3min，然后将样品放入超声波清洗器中超声30min，取100μl滴于载玻片上，放入70℃鼓风干燥箱中干燥。

2.2.2透射电子显微镜(TEM)测试

吸取样品原液适当稀释后滴加到铜网上，吸附10min后，用滤纸小心吸去多余溶液，随后滴加少量醋酸双氧铀染色1min，室温下晾晒后，于透射电子显微镜下观察纳米粒形貌，并通过Nano Measurer 1.2软件测量其粒径，取平均值。

2.2.3动态光散射仪(DLS)测试

取100μl的样品原液，加入900μl DI稀释，采用malvern激光粒度仪检测粒子的水合粒径，每个样品检测3次，取平均值(粒径)。

取100μl的样品原液，加入900μl DI稀释，采用malvern激光粒度仪检测材料的Zeta电位，每个样品检测3次，取平均值(电位)。

2.2.4傅里叶变换红外吸收光谱(FT-IR)测试

分别取纳米材料溶液各2ml，高速离心，真空干燥。取固体粉末约2mg样品研磨。再与KCl粉末充分研磨，扫描范围4000-400cm^-1，用傅里叶变换红外光谱仪检测并分析。

2.2.5 X-射线衍射(XRD)分析

准备冷冻干燥的样品，样品的晶形结构和结晶性能采用X-衍射分析仪进行表征，采用Cukα靶；衍射角度20°-65°；X射线管的工作电压为40kV，工作电流为40mA。

2.2.6 MAL包封率测定

1)MAL乙酰丙酮荧光衍生法标准曲线的绘制

配制MAL-PBS浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5mg/ml的标准溶液各2mL。乙酰丙酮试剂的配制：乙酰丙酮：无水乙醇：蒸馏水＝3:2:15(v:v:v)；10％甲醛溶液的配制：37％甲醛：蒸馏水＝10:27(v:v)；

实验分十组平行反应，每组各加3.5mL乙酰丙酮试剂，0.5mL10％甲醛溶液，0-5mg/mL的MAL-PBS标准溶液0.5mL于10mL茄型瓶中，100℃反应30min，反应结束后冷却至室温，取0.5mL于比色皿中，通过荧光分光光度计测试其荧光强度。(Ex＝405nm，狭缝宽度为5nm，电压800V)。

2)MAL包封率测定

收集纯化过程中的上清液，取0.5mL，按上述MAL标曲测定步骤测定样品荧光强度，带入回归方程，计算上清液中游离MAL的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离MAL质量。

MAL包封率(EE1)＝(投药量1-游离MAL质量)/投药量1*100％。

2.2.7 CAT包封率测定

本实验选用过氧化氢酶(Catalase，CAT)试剂盒(钼酸铵比色法)测定CAT含量，进而计算出纳米材料的CAT包封率。

2.2.8纳米材料中TRPV1mAb含量测定

按照TRPV1 Elisa试剂盒说明书步骤测定纳米材料中TRPV1mAb的载药量。

2.2.9纳米粒的CAT产氧能力

参照便携式溶解氧分析仪说明书，测定不同溶液中氧气含量，比较H₂O₂、CAT、MZT、MCZT不同溶液催化H₂O₂的产氧能力。

分别配制1mM CAT溶液、1mM MZT溶液和1mM MCZT溶液，向上述溶液中加入一定量的H₂O₂使其终浓度为0.1mM，放入2mL离心管中，同时另取1个2mL的离心管加入0.1mM H₂O₂。将离心管并列放置，拍摄气泡图比较不同溶液中气泡的多少。

2.3人皮肤成纤维细胞(HFF-1)的培养

HFF-1细胞为贴壁生长细胞，将细胞接种于DMEM高糖培养基中，并添加10％的胎牛血清和抗生素(100IU/mL的青霉素-链霉素)，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

2.4 CCK-8实验检测HFF-1细胞活力

2.4.1纳米材料对HFF-1细胞的生物相容性实验(CCK-8法)

本实验采用CCK-8法检测探针对HFF-1细胞的毒性。取对HFF-1细胞以3-5×10⁴cells/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，在培养箱中培养(37℃，5％CO₂)。将纳米材料储备液用DMEM高糖培养基稀释成不同浓度(0μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml)，待用。向每孔中替换100μL不同浓度的MCZT纳米材料，继续培养24h。培养结束后，每孔中加入10μL的CCK-8溶液再培养1h，酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)值。最终处理数据，根据公式计算，绘制曲线。

2.4.2最适光疗仪光照(LED)条件的筛选(CCK-8法)

本实验采用CCK-8法检测LED不同光照剂量对HFF-1细胞的毒性。在体外光老化成纤维细胞模型中，本实验采用MAL-PDT方法治疗光老化。本实验使用的武汉亚格光电技术有限公司的LED-IB LED红外治疗仪额定功率为100mw/cm²，本实验将红外治疗仪置于细胞上13cm处，经过复旦张江公司使用相关仪器检测，实际功率为70mw/cm²。红光照射剂量＝实际照射功率*照射时间，根据预设辐照剂量可确定照射时间，如照射剂量为2.5J/cm²时，2.5J/cm²＝70mw/cm²*35s，照射剂量为5J/cm²时，5J/cm²＝70mw/cm²*70s，照射剂量为10J/cm²时，10J/cm²＝70mw/cm²*140s，以此类推。

由于本实验需要对不同实验组分别进行不同剂量的LED光照处理，故每个分组必须分别使用独立的96孔板，以此来避免不同光照剂量对其他组别造成影响。

HFF-1细胞于96孔板中接种培养后，用LED光疗仪进行不同剂量的光照(0J/cm²，2.5J/cm²，5J/cm²，10J/cm²，15J/cm²，20J/cm²，25J/cm²，30J/cm²)，继续培养24h。培养结束后，加入CCK-8溶液并测定OD值。

根据LED光照对细胞活力的影响，确定最适LED光照条件。

2.4.3最适UVA辐照致HFF-1细胞老化条件的摸索(CCK-8法)

1)在紫外线照射实验中，使用SS-01AUVB紫外线光疗仪作为光源，其波长为365nm。采用UVA和UVB型紫外线辐照计测量辐照功率。

为了使电流稳定，将紫外灯提前10min打开进行预热。紫外灯辐照量受照射距离的影响，本实验经摸索，固定照射功率为12.5mw/cm²。

辐照剂量＝辐照功率*辐照时间，根据预设辐照剂量可确定照射时间，如辐照剂量为1.25J/cm²时，1.25J/cm²＝12.5mw/cm²*100s，照射剂量为2.5J/cm²时，2.5J/cm²＝12.5mw/cm²*200s，照射剂量为5J/cm²时，5J/cm²＝12.5mw/cm²*400s，以此类推。在用96孔板进行实验时，要用锡箔纸做好避光处理。

2)实验步骤同2.4.2，根据本发明组前期研究经验确定UVA辐照的剂量为0J/cm²，1.25J/cm²，2.5J/cm²，5J/cm²，10J/cm²，15J/cm²，20J/cm²，25J/cm²，继续培养24h。

根据UVA辐照对细胞活力的影响，确定最适光老化细胞造模条件。

2.4.4 CCK-8实验检测HFF-1细胞活力的变化

根据上述最适光老化造模和给药条件的筛选结果，将细胞进行分组。

1)各组均更换不含血清的DMEM高糖培养基，Control组继续培养24h，UVA组、UVA+L-MCZT组、UVA+H-MCZT组用辐照剂量为6J/cm²处理后，继续用不含血清的DMEM高糖培养基培养24h；

2)随后Control组和UVA组更换不含血清的DMEM高糖培养基继续培养，UVA+L-MCZT组、UVA+H-MCZT组分别更换含纳米材料终浓度为2μg/ml、8μg/ml的不含血清的DMEM高糖培养基继续培养；

3)2h后UVA+L-MCZT组、UVA+H-MCZT组用光动力治疗仪LED光照治疗，随后各组继续培养24h。

其余步骤同2.4.2。

2.5倒置相差显微镜观察HFF-1细胞形态的变化

将生长良好的HFF-1细胞进行分组，具体分组情况同实验步骤2.4.4。培养24h后，吸弃培养基，PBS洗涤细胞3次，加入1mL不含血清的DMEM高糖培养基后置于Olympus倒置相差显微镜下拍照。

2.6活死细胞染色法检测HFF-1细胞活死变化

1)制备工作液(12μM CalceinAM，8μM PI)：取出钙黄素AM和PI试剂原液，室温平衡30min；2)细胞处理过程同实验步骤2.5；3)吸弃细胞培养上清液，用PBS温和洗涤贴壁细胞，吸弃PBS；4)加入足量的上述工作液，保证没过单层细胞；5)室温孵育30min；6)对于贴壁的HFF-1细胞，吸出染色工作也终止孵育；7)荧光显微镜下观察标记细胞。

2.7激光共聚焦显微镜检测HFF-1细胞对香豆素-6标记的纳米材料的摄取

1)按前述方法制备香豆素-6标记的，不含MAL的纳米粒C-6-CAT@ZIF-8(CCZ)、C-6-CAT@ZIF-8/T(CCZT)；2)将生长状态良好的HFF-1细胞进行分组：CCZ组、UVA+CCZ组、CCZT组、UVA+CCZT、CPZ+CCZT组和UVA+CPZ+CCZT组；3)各组均更换不含血清的DMEM高糖培养基，UVA+CCZ组、UVA+CCZT组用辐照剂量为6J/cm²处理后，继续用不含血清的DMEM高糖培养基培养24h；4)随后各组分别加入0.8μg/mL的对应纳米材料，每组设置3个重复实验，放入细胞培养箱中继续培养4h，弃去培养基，加入PBS清洗三次，除去游离的纳米粒，加入新鲜培养基，培养4h；5)使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜进行荧光成像拍照。采用Olympus软件(FV10-ASW)进行细胞图像和数据的分析。

2.8激光共聚焦荧光成像检测HFF-1细胞ROS生成量的变化

1)按前述方法制备MZT、MCZT；2)将生长状态良好的HFF-1细胞进行分组：MZT组、UVA+MZT组、MCZT组、UVA+MCZT组；3)各组均更换不含血清的DMEM高糖培养基，UVA+MZT组组、UVA+MCZT组用辐照剂量为6J/cm²处理后，继续用不含血清的DMEM高糖培养基培养24h；4)随后各组分别加入对应纳米材料，每组设置3个重复实验，放入细胞培养箱中继续培养2h；5)2h后各组用光动力治疗仪LED光照治疗，随后各组继续培养24h；6)24h后取出培养皿，吸弃培养基，用PBS清洗3次，每组加入10μLDCFH-DA染料，轻轻混匀，培养箱内避光孵育30min；7)用DMEM培养基清洗细胞3次，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA染料；8)激光共聚焦显微镜拍照，后续进行图像和数据分析。

2.9 SA-β-gal染色法测定HFF-1细胞中SA-β-gal的活性

1)在48孔板中接种HSFs细胞，接种密度为2×10⁴/孔，培养箱中过夜培养。2)弃掉细胞培养基，用PBS轻轻洗涤细胞1次，按照之前所述方法进行细胞处理，处理完毕后放入培养箱继续培养。3)弃掉培养基，用4％多聚甲醛室温固定15min。4)弃掉多聚甲醛，用PBS洗涤细胞3次，每次3min。5)弃掉PBS，每孔加入200μL配制好的染色工作液，在37℃条件下避光孵育0.5h。6)弃掉染料，用PBS洗涤细胞2次，倒置荧光显微镜下观察并拍摄图片，表达SA-β-gal的细胞被荧光探针染色，呈现绿色。该实验重复3次。

2.10流式细胞实验检测HFF-1细胞的凋亡

6孔板中接种培养HFF-1细胞，将细胞进行分组：Control组、UVA组、UVA+L-MCZT组、UVA+H-MCZT组，各组细胞处理方法同步骤2.5。

1)孵育24h后，取出6孔板，小心吸弃培养基，PBS洗涤；2)每孔加入不含EDTA胰酶消化细胞，轻轻吹打；3)每孔加入2ml含血清培养基终止胰酶消化；4)细胞计数，取5×10⁵-1×10⁶个细胞移至离心管，1000rpm，4℃离心10min，弃掉上清，如此重复三次；5)将细胞重悬于500μl Binding Buffer并移至流式管中；6)加入5μlAnnexinV-FITC后摇匀混合液，用锡箔纸包裹流式管于室温中孵育约20min；7)上机前5min加入5μl PI；8)在1h内完成流式细胞仪检测，储存并分析数据。

2.11ELISA方法检测HFF-1细胞中相关炎症因子表达水平的变化

参考试剂盒说明书，运用Elisa方法检测MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞老化相关炎症因子分泌情况的影响。检测样本为各处理组HFF-1细胞培养分泌的上清液。

2.12 Western Blot检测HFF-1细胞中蛋白的表达

按照Western Blot半干转标准操作流程对COX-2、MMP-1表达量进行定量分析。1)细胞的造模、给药处理：按照实验步骤2.4.4对各组细胞进行处理；2)HFF-1细胞中蛋白的提取和定量采用BCA法进行；3)样本加热变性；4)Western Blot检测过程；5)分析：Image J软件进行定量分析。

2.13建立皮肤光老化裸鼠模型

实验动物健康雌性5周龄BALA/c裸鼠24只，体重(18±2)g，购于浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号：20211015Abzz0619000482，SPF级适应性饲养一周，给予饲料和灭菌水自由喂养，每周定时换垫料，无不良因素影响，生活环境相对稳定。

2.13.1自制小鼠皮肤光老化动物模型装置

自制的一种构建小鼠皮肤光老化动物模型装置：内置8W长波紫外线(UVA)灯管4支，发射光谱320～400nm，峰值365nm，8W中波紫外线(UVB)灯管2支，发射光谱280～320nm，峰值312nm；UVA和UVB型紫外线辐照计。

2.13.2实验动物造模、分组及给药

紫外线照射将48只雌性BALA/c裸鼠随机分为Control组、4w组、8w组、12w组(Model组)、给药组(MAL组、CZT组、L-MCZT组和H-MCZT组)，每组6只，Control组裸鼠不做任何处理，Model组及其他给药组裸鼠置于小鼠皮肤光老化动物模型装置中，准备水、鼠粮、垫料，所有鼠自由活动。调整造模装置的裸鼠箱高度，使灯管距离背部皮肤30cm处。日光灯管装置中含UVA强度为1.1mW/cm²，UVB强度为0.12mW/cm²，照射剂量＝照射强度×照射时间，自第1周开始照射Model组，3次/周(周一、周三、周五)，每次照射前灯管预热15min，照射20min，设定第1周照射剂量为最小红斑量(MED)，第2-4周照射剂量较前一周增加一个MED，至第5周开始至12周维持4个MED直至实验结束，即第2-4周每次照射时间分别为20、40、60min，自第5周开始每次80min，共照射12周(UVA辐照强度累计为166.32J/cm²，UVB辐照强度累计为18.14J/cm²)。

光老化照射后，各给药组(MAL组、CZT组、L-MCZT组和H-MCZT组)分别在光老化照射的背部给予凝胶涂抹：新鲜配制5％凝胶，将0.25g对应的凝胶涂抹在相应组小鼠背部皮肤上，涂抹点位于小鼠背部表面直径约2cm处，涂抹区域用聚氨酯敷料覆盖。

在涂抹期间及涂抹后，将小鼠保持在黑暗中，3h后用LED照射，照射前，用0.9％无菌生理盐水清洗该区域，然后用辐照仪对辐照强度进行测量，将小鼠皮肤暴露于峰值为635nm的LED灯下，将总剂量为20J/cm²的光照射给每组的所有小鼠。

随时观察裸鼠一般精神状态，饮食情况和背部皮肤变化，并做好拍照记录。照射完成后第4周、8周、12周取材观察。取材时，配置0.4％水合氯醛5ml，消毒裸鼠腹部皮肤，以0.1ml/10g腹腔麻醉，麻醉完成后，取对照组及实验组裸鼠背部全层皮肤组织约1.0cm×1.0cm，分为两份保存，一份固定于多聚甲醛溶液中，一份保存于-80℃冰箱。

2.14 HE染色

取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑及皮肤组织，浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片机切为5μm厚度的切片并脱蜡处理，随即用苏木素-伊红染液染色5min，中性树胶封片，置于显微镜下观察。

2.15 Masson染色

取出4％多聚甲醛固定的小鼠的皮肤组织，1)石蜡切片脱蜡至水，2)染液染色，3)切片放入2％冰醋酸短暂浸泡洗涤，无水乙醇脱水；4)中性树胶封片；5)倒置相差显微镜观察，拍照分析。

2.16免疫组化

取出4％多聚甲醛固定的小鼠的皮肤组织，1)石蜡切片脱蜡至水；2)抗原修复；3)阻断内源性过氧化物酶活性；4)血清封闭；5)加一抗；6)加二抗；7)DAB显色；8)复染细胞核；9)脱水封片；10)倒置相差显微镜镜检，每个组织样本随机选取切片3张，每张切片200倍下进行图像采集观察，Image J对切片图像进行分析，计算Collagen 1、Collagen 3、COX-2、MMP-1的平均光密度值。

2.17氧化应激相关指标的检测

按照丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和总超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒说明书步骤检测皮肤组织中MDA、GSH-PX、SOD含量。

2.18炎症相关指标的检测

按照ELISA试剂盒说明书，该实验重复3次。

2.19皮肤组成成分含量的检测

2.19.1 ELISA方法检测透明质酸(HA)表达水平的变化

具体实验方法参考试剂盒说明书。

2.19.2 ELISA方法检测透明质酸合酶1(HAS1)表达水平的变化

具体实验方法参考试剂盒说明书。

2.19.3皮肤含水量的检测

具体实验方法参照皮肤水分检测仪说明书进行。

2.20 TUNEL染色检测皮肤组织凋亡

取出4％多聚甲醛固定的小鼠的皮肤组织，1)石蜡切片脱蜡至水；2)修复；3)破膜；4)DAPI复染细胞核；6)封片；7)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

三、结果

1纳米粒MCZT的制备

如图1所示，本发明采用“一锅法”成功制备具有核-壳-壳结构的纳米粒MCZT。MAL和CAT分布于纳米粒内部，ZIF-8作为载体构成纳米粒内壳，最外层则包被有TRPV1mAb作为外壳。

2纳米粒MCZT的表征

2.1纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的粒径和形貌特征

本发明使用TEM、SEM和DLS观察和分析了MCZT及中间体MCZ、ZIF-8纳米粒的形态和粒径大小，如图2所示，TEM、SEM结果显示所合成的ZIF-8纳米颗粒形貌呈菱形十二面体，大小均一，分散性良好，粒径为100nm左右，结果与DLS实验结果(106nm)相符；TEM、SEM结果显示，MCZ纳米粒形貌未发生明显改变，呈多面体，大小、形态均匀，分散性良好。粒径为110nm左右，结果与DLS实验结果(106nm)相符；TEM、SEM结果显示，MCZT纳米粒可见包裹，呈明显的壳核结构，形貌为球形纳米粒子团簇，大小、形态均匀。粒径为120nm左右，结果与DLS实验结果(122nm)相符。

2.2纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的Zeta电位分析

本发明使用DLS对纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT进行了Zeta电位分析，如图3所示，基于沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8中Zn²⁺的存在，其表面电势为25.5mV，符合材料理化性质；且在包埋MAL、CAT后，电位下降为7.71mV，证明客体材料的成功包覆；最后，对材料表面修饰带有-COO^-的抗体蛋白(TRPV1mAb)后，电势转变为-10.09mV，表明TRPV1mAb被成功修饰到ZIF-8表面。该结果与前面TEM、SEM、DLS结果呼应，进一步论证此靶向纳米载药体系的成功合成。

2.3纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的XRD分析

如图4，XRD结果显示ZIF-8在2θ＝7.11°、12.5°、17.75°和26.4°处的衍射图中的尖峰与文献中报道的峰完全一致，MZ、CZ、MCZ、MCZT的分子尺寸与ZIF-8的微孔尺寸完美匹配。因此可以设想，MAL、CAT能通过原位自组装的方法嵌入到ZIF-8微孔中，TRPV1mAb亦能吸附在ZIF-8表面，形成主客体复合物MCZT，具有相同的X射线衍射峰，说明其结构依然保持稳定，主客体包埋和包覆过程并未对其晶体结构产生明显影响，晶格保持完整，没有改变，强度略有改变，峰值未改变。与ZIF-8物象完全一致，所有样品具有相同的拓扑结构、形貌、理化性质。

2.4纳米粒ZIF-8、MCZ及MCZT的FT-IR分析

本实验采用FTIR分析了纳米粒ZIF-8、ZIF-8T、MZ、CZ、MCZ及MCZT的红外吸收光谱，如图5所示，ZIF-8：在2981cm^-1和2937cm^-1处的吸收带分别对应于咪唑环的芳香族和脂肪族C-H的伸缩振动(苯环上的C-H伸缩振动在3110-3010cm^-1，烷烃C-H的伸缩振动在2960-2850cm^-1)。在1587cm^-1出现的峰值与C＝N基团的伸缩振动有关(1900-1350cm^-1)。在1100～1400cm^-1之间出现的峰值来自于C-N的伸缩振动(在1400cm^-1左右)。

MAL：在1726cm^-1的吸收带对应羰基C＝O和酯(伸缩振动在1750-1680cm^-1，酯1735cm^-1左右)。在3439cm^-1的吸收带对应一级胺的伸缩振动(3490-3400cm^-1)。

CAT：在1662cm^-1的吸收带对应二级酰胺(1680cm^-1左右)。

TRPV1mAb：1045cm^-1处出现的吸收带对应抗体的包覆。

MAL、CAT、TRPV1mAb加入复合材料后，出现了MAL、CAT、TRPV1mAb的特征峰，间接说明MAL、CAT成功包载在ZIF-8中，而TRPV1mAb成功负载在ZIF-8表面。

2.5纳米粒MCZT的MAL包封率研究

本实验采用乙酰丙酮荧光衍生荧光分光光度计法得到MAL含量的标准曲线：A₁＝128.62C₁+120.76，R²＝0.9968，MAL在0～5mg/mL的浓度范围内线性关系良好。并按MAL标曲测定步骤测定MAL-CAT@ZIF-8样品荧光强度，随后带入回归方程，计算上清液中游离MAL的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离MAL质量。MAL包封率(EE₁)＝(投药量1-游离MAL质量)/投药量*100％，经计算得到MAL包封率为12.8％。

2.6纳米粒MCZT的CAT包封率研究

本实验选用过氧化氢酶试剂盒(钼酸铵比色法)测定CAT含量，进而计算出纳米材料MCZT的CAT包封率。

表1MCZ纳米粒样本的CAT含量测定(mean±SD，n＝3)

CAT标准曲线y＝0.2x+0.0013，R²＝1

x：体系中过氧化氢酶浓度变化值(μmol/mL)

y：吸光值差值，根据表1所得检测数据，代入反应公式，得出CAT包封率为17.03％。

2.7纳米粒MCZT的TRPV1mAb载药量研究

经小鼠转化受体电位阳离子通道亚家族V成员1抗体(TRPV1mAb)ELISA检测试剂盒检测，将试剂盒测得含量数据代入线性方程y＝6.113x-0.374，R²＝0.994，得到TRPV1mAb载药量：4％，如此高的载药量说明TRPV1mAb几乎全部包覆在ZIF-8表面，这与SEM、TEM电镜下所见结果保持一致。

2.8便携式溶解氧计测定纳米粒中CAT产氧能力

H₂O₂分解产生的氧气能够溶解于水溶液中，因此可以通过检测水溶液中溶解氧含量的变化来判断MCZT纳米粒的产氧能力。如图6A所示，H₂O₂组和H₂O₂+MZT组未见溶解氧水平的明显变化，说明MZT不能催化H₂O₂并产生氧气。H₂O₂+CAT组和H₂O₂+MCZT组溶解氧浓度较H₂O₂组和H₂O₂+MZT组明显升高，表明H₂O₂+CAT组和H₂O₂+MCZT组均能快速、大量生成O₂，差异有统计学意义(P<0.01)。此结果说明，CAT被成功地包裹在MCZT纳米粒中，且具有良好的酶催化活性。气泡图的结果与便携式溶氧仪所测结果一致，结果见图6B。

3纳米粒MCZT和LED光照的生物相容性验证

3.1纳米粒MCZT的生物相容性

在进行纳米材料MCZT用于体外HFF-1细胞内治疗光老化实验之前，必须先对其进行细胞毒性实验，确定对细胞无损伤的合适给药浓度，以应用于后续细胞实验。如图7所示，在不同浓度(0.5,1,2,4和8,16,32μg/ml)纳米粒MCZT孵育24h后，HFF-1细胞的存活率与Control组相比没有明显变化(P>0.05)。说明纳米粒MCZT在0-32μg/ml范围内对HFF-1细胞基本没有毒性，具有良好的生物相容性。因此，确定纳米粒MCZT在HFF-1细胞中的使用浓度为2,8μg/ml。

3.2光疗仪LED光照对HFF-1细胞的细胞毒性研究

在进行光疗仪的LED光照用于体外HFF-1细胞光动力治疗实验之前，必须先对其进行细胞毒性实验，确定对细胞无损伤的合适LED光照剂量，以应用于后续细胞实验。如图7所示，在不同剂量(2.5,5,10,15和20,25,30J/cm²)LED光照处理后，HFF-1细胞的存活率与Control组相比没有明显变化(P>0.05)。说明在0-30J/cm² LED光照剂量范围内对HFF-1细胞基本没有毒性，具有良好的生物相容性。因此，确定LED光照在HFF-1细胞中的使用剂量为20J/cm²。

4 CCK-8筛选最佳UVA光照造模和给药条件

为了摸索最佳UVA光照造模条件，根据本发明组前期研究基础，先用较大的0-25J/cm²光照剂量范围。使用UVA辐照的剂量为0J/cm²，1.25J/cm²，2.5J/cm²，5J/cm²，10J/cm²，15J/cm²，20J/cm²，25J/cm²，随后细胞继续培养24h。实验结果显示(图8A)，5J/cm²及以上的UVA辐照剂量照射HFF-1细胞24h后，与Control组相比细胞活力明显下降(P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001)。从5J/cm²到10J/cm²细胞活性出现断崖式下降，所以需要进一步缩小光照剂量范围，使用UVA辐照的剂量为0J/cm²，5J/cm²，6J/cm²，7J/cm²，8J/cm²，9J/cm²，10J/cm²，随后细胞继续培养24h。实验结果显示(图8B)，5-10J/cm²的UVA辐照剂量照射HFF-1细胞24h后，与Control组相比细胞活力明显下降(P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001)。

随后，对UVA(6J/cm²)照射前后的HFF-1细胞进行透射电镜扫描拍照，结果如图8C，正常成纤维细胞呈细长梭状，细胞膜表面有许多小突起，可见微绒毛和胞浆皱折，线粒体形态正常，膜结构完整，基质均匀，嵴规则。成纤维细胞经照射后，细胞膜表面小突起减少，线粒体肿胀，膜结构不清楚，基质不均匀，排列紊乱，细胞浆内出现空泡，核膜内折。

倒置相差显微镜观察HFF-1细胞形态结果显示(图8D)，Control组细胞呈放射状长梭形，随着辐照剂量增大，细胞形态变得扁平，体积变大，过度伸展，出现脱颗粒现象，细胞收缩成团，形态不良，部分细胞崩解、碎裂，出现凋亡现象，脱落漂浮于培养基中，增殖变缓，密度逐渐下降，辐照剂量越大，细胞毒性越强，与前面CCK-8检测UVA辐照后细胞活性结果一致。

结合本发明人前期的工作经验，最终选择细胞增殖活性在60％左右(接近一半)的6J/cm²作为造模剂量。

5纳米粒MCZT对体外光老化细胞的治疗效果研究

5.1 HFF-1细胞造模和治疗前后细胞活力变化

为了验证HFF-1细胞体外光老化模型的成功建立以及纳米粒MCZT对光老化细胞的治疗作用，本论文首先利用CCK-8实验对HFF-1细胞造模和治疗前后的细胞活力变化进行检测。由图9C实验结果显示，与Control组相比，UVA组细胞活力明显降低(P<0.01)，L-MCZT组与UVA组相比，细胞活力未见上升；而H-MCZT组与UVA组相比，细胞活力明显上升(P<0.05)。

与Control组相比，UVA组照射后细胞活性受到明显抑制，对UVA照射后的细胞进行不同剂量纳米药物的光动力治疗，药物浓度较低时，随着药物浓度增加，细胞增殖活性变强，在图中表现为高浓度组细胞活性高于低浓度组。

5.2 HFF-1细胞造模和治疗前后细胞活死变化

在活/死细胞染色实验中，活细胞被染成绿色，而死细胞被染成红色。实验结果显示(图9B)，与Control组相比，UVA照射后活细胞明显减少，死细胞明显增多，对UVA照射后的细胞进行不同剂量纳米药物的光动力治疗随着药物浓度增加，活细胞逐渐增多，死细胞逐渐减少。而当药物浓度较高时(H-MCZT组)，活细胞数量急剧下降，细胞大量死亡。该实验所得结果与上述CCK-8结果一致。这表明，MCZT可以通过介导PDT作用治疗老化的HFF-1细胞，且纳米粒MCZT浓度越高，PDT作用越明显。

5.3 HFF-1细胞造模和治疗前后细胞的老化

本实验通过β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色来验证6J/cm²UVA辐射和MCZT孵育2h并进行PDT治疗后成纤维细胞的衰老变化情况。如图9A和9D所示，染色的老化细胞在Control组中所占比例很低；UVA辐照后显著升高了SA-β-Gal阳性细胞表达的比例，约为94.44％；与UVA辐照组对比，光老化的HFF-1经低剂量纳米粒(L-MCZT+LED)组处理后，染色阳性细胞数量减少，下降至77.76％；当药物浓度升高，即H-MCZT+LED组处理后，染色阳性细胞数量明显减少，阳性率约为27.50％，这意味着MCZT+LED治疗可以在一定程度上减少SA-β-Gal表达，减缓HFF-1细胞光老化进程。

6 HFF-1细胞对C-6-CAT@ZIF-8/T(CCZT)的摄入

由于PphIX的发射波长范围较宽(Ex＝407nm，Em＝635nm)，易对CLSM检测的结果产生干扰，因此将一种绿色荧光染料香豆素-6(Ex＝466nm，Em＝504nm)包埋在纳米颗粒中合成纳米粒CCZT，来模拟MCZT对细胞的定位，以避免PphIX荧光对纳米粒细胞内定位检测的干扰。由图10可知，当材料表面没有修饰抗体TRPV1mAb时，C-6-CAT@ZIF-8(CCZ)组的荧光强度高于UVA+CCZ组，而当纳米粒表面修饰TRPV1mAb时，UVA+CCZT组细胞内可以见到明显的绿色荧光且荧光强度明显高于CCZT组。然而，当我们用辣椒卓平(CPZ)提前封闭HFF-1细胞上的TRPV1受体后，纳米粒表面的TRPV1mAb无法与HFF-I细胞表面的TRPV1受体结合，UVA+CPZ+CCZT组细胞内绿色荧光强度明显降低，差异有统计学意义。这表明相比正常细胞，UVA照射组细胞对CCZT材料具有更好的摄取能力，结果显示纳米粒具有良好的特异性靶向能力，能够与老化的HFF-1细胞膜上的TRPV1受体结合，靶向并进入光老化的HFF-1细胞。

7 MCZT在HFF-1细胞内介导PDT产生ROS的能力

如图11所示，用DCFH-DH荧光探针对细胞内的ROS水平进行检测，MZT+LED组HFF-1细胞几乎没有荧光，与MZT+LED组相比，UVA+MZT+LED组荧光强度略有增强，这说明UVA照射所致的氧化应激可使细胞的ROS含量增加；与MZT+LED组相比，MCZT+LED组荧光强度略有增强，这说明CAT药物干预后可使细胞的ROS含量增加；与上述三组相比，UVA+MCZT+LED组荧光强度进一步增强，这说明纳米粒中CAT能够进入细胞并产生足够的ROS，发挥了PDT作用。

9 MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞老化相关炎症因子分泌的影响

为研究HFF-1细胞光老化状态下炎症因子的变化及纳米粒MCZT介导的PDT是否可以调控炎症因子的表达进而改善光老化状态，随后，本实验通过Elisa方法对光老化HFF-1细胞中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平进行了检测。

Elisa检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α实验结果显示(图12A、图12B、图12C、图12D)，与Control组相比，UVA组HFF-1细胞中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平均显著上升(bothP<0.001)；而与UVA组相比，L-MCZT组HFF-1细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量显著下调(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，IL-8的含量无显著性差异；同时，与UVA组相比，H-MCZT组HFF-1细胞中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的含量均显著下调(P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001)。以上结果说明，UVA光照可显著上调HFF-1细胞中促炎症因子的表达，而纳米粒MCZT介导的PDT可抑制HFF-1细胞中促炎症因子的表达，且高浓度MCZT介导的PDT抑制效果更为明显。

10 MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞凋亡的影响

流式细胞实验检测各组HFF-1细胞凋亡情况，实验结果如图13所示，与Control组相比，UVA组细胞凋亡率明显上升(P<0.01)，而与UVA组相比，L-MCZT组和H-MCZT组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05，P<0.01)，且H-MCZT组下降趋势更为明显。由此可知，UVA辐照会诱导HFF-1细胞凋亡，MCZT介导的PDT可减轻UVA诱导的细胞凋亡，且该效应呈剂量依赖性。

11 MCZT介导的PDT对UVA诱导的HFF-1细胞COX-2、MMP-1蛋白表达的影响

为研究HFF-1细胞光老化状态下COX-2和MMP-1蛋白表达的变化及纳米粒MCZT介导的PDT是否可以调控COX-2和MMP-1蛋白的表达进而改善光老化状态，随后，本实验通过WB对光老化HFF-1细胞中COX-2和MMP-1蛋白的表达水平进行了检测。WB实验结果显示，与Control组相比，UVA组HFF-1细胞中COX-2和MMP-1的表达水平都显著上升(bothP<0.01)；与UVA组相比，L-MCZT组HFF-1细胞中COX-2的表达没有明显变化，MMP-1的表达显著下降(P<0.05)；与UVA组相比，H-MCZT组HFF-1细胞中COX-2和MMP-1蛋白的表达均显著减少(bothP<0.01，图14)。

12小鼠皮肤光老化动物模型的建立

如图15所示，Control组小鼠皮肤色泽正常、光滑、弹性好，背部皱纹相对较少，而经过4周紫外线(UVA+UVB)照射后，与对照组裸鼠相比，背部皮肤轻微褶皱，皮肤颜色加深；紫外线照射8周后，皮肤表面脱屑和干燥的现象逐渐增加，皮肤粗糙，皱纹加深，皮肤水肿；紫外线照射12周后，皮肤更加粗糙增厚、弹性丧失、粗深皱纹、毛细血管扩张、脱屑及皮革样外观等光老化表现。由此可以看出裸鼠光老化造模模型的成功，且本实验自制的小鼠皮肤光老化装置可成功应用于裸鼠皮肤光老化造模。后续PDT治疗实验将在紫外线辐照12周的小鼠基础上进行。

13 MCZT纳米粒在裸鼠光老化模型中的生物安全性评价

对治疗及观测期间以及治疗结束后主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)的组织病理学进行研究。实验结果显示，同Control组相比，在Model组、MAL、CZT给药组以及高低剂量MCZT纳米粒治疗组，小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑的病理切片中没有显示出明显的病理学变化。这些结果表明MCZT治疗裸鼠光老化时，无明显的系统毒性，具有良好的生物安全性和潜在的临床转化价值。

14 MCZT纳米粒在裸鼠光老化模型中介导PDT的药效评价

14.1 MCZT介导的PDT对光老化裸鼠背部皮肤的影响

如图16A和局部放大图所示，Control组小鼠皮肤色泽正常、光滑、弹性好，背部皱纹相对较少；与Control组相比，Model组小鼠皮肤更加粗糙增厚、弹性丧失、粗深皱纹、毛细血管扩张、脱屑、失水严重及皮革样外观等光老化表现；与Model组相比，MAL组和CZT组无明显变化；而经L-MCZT和H-MCZT治疗后，与Model组裸鼠相比，光老化现象均有所改善。

14.2 MCZT在裸鼠光老化模型中介导PDT的HE染色变化

倒置相差显微镜下观察HE染色结果可得：Control组裸鼠表皮层细胞排列整齐，分布均匀，表皮、真皮分界清楚，真皮胶原纤维呈波浪状排列，血管正常，细胞成分及数量适中；与Control相比，Model组镜下可见表皮不规则增厚，真皮胶原纤维变性，排列紊乱，胶原束增粗、卷曲、断裂、疏密分布不均，可见毛细血管扩张，附属器增生，炎性细胞浸润；与Model组相比，MAL和CZT治疗组未见明显改善效果；而L-MCZT和H-MCZT组病理特征明显缓解(图16B)。

14.3 MCZT在裸鼠光老化模型中介导PDT的皮肤组成成分变化

胶原蛋白、透明质酸、水分是真皮层中的主要组成部分，当紫外线照射后，会产生显著的变化。过量的紫外线照射会引起皮肤光老化现象，这一现象最先表现在皮肤的水分缺失。如图16C、16D、16E所示，与Control组相比，紫外线照射(Model组)导致透明质酸、透明质酸合酶1、含水量显著的降低(bothP<0.01)；与Model组相比，纳米材料涂抹组中，H-MCZT组的透明质酸、透明质酸合酶1、含水量显著上升(bothP<0.01)；而除了含水量研究中，L-MCZT组含水量指标有一定改善(P<0.05)，其余指标中所有MAL、CZT组和L-MCZT组的透明质酸、透明质酸合酶1、含水量都基本不发生变化。以上结果说明，紫外线光照可显著抑制裸鼠皮肤组织中透明质酸、透明质酸合酶1、含水量的表达，而低剂量纳米粒MCZT对上述组织成分的改善情况作用不明显，高剂量纳米粒MCZT可改善裸鼠皮肤上述组织成分的表达。

15胶原相关指标的变化

倒置相差显微镜下观察Masson染色结果可得：Control组胶原纤维呈波浪状紧密排列，整齐有序，分布均匀；与Control组相比，Model组真皮层变薄，网状层纤维束断裂，胶原纤维变性，含量减少，排列紊乱，疏密分布不均；与Model组相比，MAL和CZT组未见明显差异；而L-MCZT和H-MCZT组与Control组相比，胶原纤维恢复紧密排列，整齐有序，分布均匀。

免疫组化结果显示，与Control组相比，Model组光老化小鼠背部皮肤内Collagen1和Collagen 3表达量均有大量减少；与Model组相比，MAL和CZT给药涂抹后，Collagen 1和Collagen 3表达量未见显著变化；而L-MCZT和H-MCZT给药涂抹后，Collagen 1和Collagen3表达量显著上升。

16炎症和氧化应激相关指标的变化

16.1炎症相关指标的变化

为研究光老化状态下炎症因子的变化及纳米粒MCZT是否可以调控炎症因子的表达进而改善光老化状态，随后，本实验通过Elisa方法对光老化裸鼠皮肤组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平进行了检测。

Elisa检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α实验结果显示(图17A、图17B、图17C)，与Control组相比，Model组裸鼠皮肤组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平均显著上升(bothP<0.01)；与Model组相比，MAL组和CZT组裸鼠皮肤组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平几乎没有变化；而与Model组相比，L-MCZT组和H-MCZT组裸鼠皮肤组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量显著下调(bothP<0.05，P<0.01)。以上结果说明，紫外线光照可显著上调裸鼠皮肤组织中促炎症因子的表达，而纳米粒MCZT可抑制裸鼠皮肤组织中促炎症因子的表达，与前面所做的实验结果一致，纳米粒MAL和CZT对光老化裸鼠皮肤组织中促炎症因子没有影响。

16.2氧化应激相关指标的变化

为研究光老化状态下氧化应激指标的变化及纳米粒MCZT是否可以调控氧化应激指标进而改善光老化状态，本实验通过紫外分光光度法对光老化裸鼠皮肤组织中GSH-PX、MDA和SOD的表达水平进行了检测。

紫外分光光度检测SOD实验结果显示(图17D)，与Control组相比，Model组裸鼠皮肤组织中SOD的表达水平显著减少(P<0.01)；与Model组相比，MAL组和CZT组裸鼠皮肤组织中SOD的表达水平几乎没有变化；而与Model组相比，L-MCZT组和H-MCZT组裸鼠皮肤组织中SOD的含量显著上升(P<0.05，P<0.01)。以上结果说明，紫外线光照可显著抑制裸鼠皮肤组织中SOD的表达，而纳米粒MCZT可改善裸鼠皮肤组织中SOD的降低，值得注意的是，纳米粒MAL和CZT对光老化裸鼠皮肤组织中SOD几乎不产生效果。

紫外分光光度检测实验结果显示(图17E)，与Control组相比，Model组裸鼠皮肤组织中GSH-PX的表达水平显著下降(P<0.01)；与Model组相比，MAL组和CZT组裸鼠皮肤组织中GSH-PX的表达水平几乎没有变化；而与Model组相比，L-MCZT组和H-MCZT组裸鼠皮肤组织中GSH-PX的含量显著上升(P<0.05，P<0.01)。以上结果说明，紫外线光照可显著降低裸鼠皮肤组织中GSH-PX的表达，而纳米粒MCZT可以显著改善裸鼠皮肤组织中GSH-PX的降低，更为重要的是，纳米粒MAL和CZT对光老化裸鼠皮肤组织中GSH-PX几乎不产生效果。

紫外分光光度检测MDA实验结果显示(图17F)，与Control组相比，Model组裸鼠皮肤组织中MDA的表达水平显著上升(P<0.01)；与Model组相比，MAL组和CZT组裸鼠皮肤组织中MDA的表达水平几乎没有变化(P>0.05)；而与Model组相比，L-MCZT组和H-MCZT组裸鼠皮肤组织中MDA的含量显著上升(P<0.05，P<0.01)。以上结果说明，紫外线光照可显著上调裸鼠皮肤组织中MDA的表达，而纳米粒MCZT可抑制裸鼠皮肤组织中MDA的上调，值得注意的是，纳米粒MAL和CZT对光老化裸鼠皮肤组织中MDA几乎不产生效果。

17皮肤中COX-2和MMP-1免疫组学指标变化

免疫组化结果显示，与Control组相比，Model组光老化小鼠背部皮肤内COX-2和MMP-1均有大量表达；与Model组相比，MAL和CZT给药涂抹后，COX-2和MMP-1表达量未见显著变化；而L-MCZT和H-MCZT组与Control组相比，COX-2和MMP-1表达量明显恢复正常。

18皮肤组织凋亡变化

我们采用TUNEL法进一步评估MCZT介导的PDT在光老化裸鼠背部对细胞凋亡的影响。与Control组皮肤组织相比，Model组皮肤组织凋亡现象严重；与Model组相比，MAL组和CZT组皮肤组织凋亡现象未见明显改善；而L-MCZT和H-MCZT组皮肤组织凋亡现象明显改善。

Claims

1.一种介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒，其特征在于，该纳米粒呈核-壳-壳结构，MAL和CAT分布于纳米粒内部，ZIF-8作为载体构成纳米粒内壳，最外层包被有TRPV1mAb作为外壳，其中MAL为甲基氨基酮戊酸，CAT为过氧化氢酶，ZIF-8为2-甲基咪唑锌盐，TRPV1mAb为辣椒素受体I型单抗。

2.根据权利要求1所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒，其特征在于，该纳米粒的粒径为115～125nm。

3.一种根据权利要求1所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将锌盐溶解于双蒸水中，所得溶液备用；

4.根据权利要求3所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的锌盐、2-甲基咪唑、MAL、CAT的用量分别为：

5.根据权利要求4所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的锌盐、2-甲基咪唑、MAL、CAT的用量分别为：

6.根据权利要求3所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的锌盐选自如下的一种或两种以上：硝酸锌、硫酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、乙酸锌。

7.根据权利要求3所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述MAL-CAT@ZIF-8加入双蒸水后，在超声波清洗器中超声4～8min，然后再加入TRPV1mAb进行反应。

8.根据权利要求3所述介导光动力抑制皮肤光老化的自产氧纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中MAL-CAT@ZIF-8与TRPV1mAb的质量比为1：(0.03～0.05)。

9.权利要求1所述的自产氧纳米粒在制备预防或治疗皮肤光老化的药物中的应用。