CN115226882B - 复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方法及应用 - Google Patents

复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方法及其应用，所述复合纳米颗粒溶液包括将质量/体积比为0.5％～6.0％的鲅鱼蛋白溶液、质量/体积比为大于0％，且不高于1.2％的原花青素溶液按体积比1：1～1：2混合，并调节pH至2.0～6.0后得复合纳米颗粒溶液。本发明方法得到的乳液油相比例为70％～85％，稳定性强，能够有效稳定虾青素；所制备的Pickering乳液具有良好的粘弹性和烹饪稳定性，在鱼糜制品中的最大黏附率能够达到47.89％，这为提高鱼糜制品的营养和功能提供了一种简单有效的方法。

Description

复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方 法及应用
技术领域
本发明涉及食品和生物制剂技术领域，更具体地说，涉及一种复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方法及其应用。
背景技术
高内相Pickering乳液(皮克林乳液)是由具有高内相(内相分数≥74％)的固体微粒稳定的乳液液滴的集合，其中包括水包油(O/W)和油包水(W/O)两种。O/W高内相Pickering乳液广泛用于医药产品、护理产品和食品。与传统的Pickering乳液相比，高内相Pickering乳液可以用少量固体颗粒稳定剂(约2％)代替大量人工合成表面活性剂(5-50％)，并实现更稳定的乳液状态。
固体颗粒稳定剂可以采用如蛋白质、淀粉、纤维素和多酚等，其优点是更加天然和绿色。最近，Pickering乳液被广泛用于负载水溶性差的功能性活性物质。使用的固体颗粒稳定剂包括扇贝性腺分离蛋白、大豆油蛋白卵磷脂混合物和小麦麸质纳米颗粒黄原胶。然而，由这些固体颗粒稳定剂制备的Pickering乳液的内相分数较低，负载的活性物质含量有限。因此，为了装载更多的营养因子，有必要设计固体颗粒稳定的高内相Pickering乳液。
发明内容
本申请人经过研究发现，制备高内相Pickering乳液需要良好的亲水/疏水平衡作为稳定剂。经过研究发现，鲅鱼蛋白与原花青素组合而成的固体颗粒稳定剂可以有效作为制备高内相Pickering乳液的亲水/疏水平衡稳定剂。
鲅鱼蛋白是从海洋经济鱼类西班牙鲅鱼中提取的蛋白质。消费者之所以喜欢它，是因为它营养丰富，而且价格低廉。鲅鱼蛋白含有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，可降低阿尔茨海默病和前列腺癌的风险。与植物蛋白(大豆蛋白和玉米醇溶蛋白)相比，鲅鱼蛋白作为动物蛋白很容易被人体吸收。
鲅鱼蛋白自身具有较好的亲水性，若作为亲水/疏水平衡需要，则需要一种物质来减轻其亲水性并增强乳化性能。
原花青素是一类具有重要开发价值的植物酚类化合物。有些是从葡萄籽中提取的，原花青素是有效预防心血管疾病的营养抗氧化剂。然而目前在Pickering乳液中对原花青素的应用研究均停留在单一地将其视为一种水溶性生物活性物质并包埋于Pickering乳液中，而忽视了其与特定蛋白质的特殊亲和性，而这恰恰能够改良特定蛋白质的亲水性，使得特定蛋白质具有稳定高内相Pickering乳液的能力。这类特定蛋白质不同于现有常规使用的大豆蛋白等，从本研究来看，需要达到与原花青素有亲水/疏水平衡稳定效果的特定蛋白质需要较好的亲水性，而鲅鱼蛋白的亲水性值则与原花青素达到了有效的平衡状态。
此外，由原花青素组成的界面膜还是一种有效的抗脂质氧化屏障，有助于保护油相内的脂溶性生物活性物质发生氧化变质。
也因此，本发明提供一种复合纳米颗粒溶液、高内相Pickering乳液、鱼糜制品、制备方法及应用，以解决现有技术制备的Pickering乳液的相分数较低、负载的活性物质含量有限及稳定性差等问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种复合纳米颗粒溶液，包括将质量/体积比为0.5％～6.0％的鲅鱼蛋白溶液、质量/体积比为大于0％，且不高于1.2％的原花青素溶液按体积比1：1～1：2混合，并调节pH至2.0～6.0后得复合纳米颗粒溶液。
在另一方面，本申请还提供第二种方案，即前述所述的复合纳米颗粒溶液在稳定虾青素上的应用。
可选的，将前述所述的复合纳米颗粒溶液与溶解有质量/体积比为2.5％～5％虾青素的大豆油混合并剪切乳化得虾青素稳定的高内相Pickering乳液。
在另一方面，本申请还提供第三种方案，即鱼糜制品，将前述所得虾青素稳定的高内相Pickering乳液与鱼糜按质量比为10～50％混合，得鱼糜制品。
在另一方面，本申请还提供第四种方案，包括将前述所述的复合纳米颗粒溶液与油脂按体积比为1：9～3：7混合，剪切乳化后得高内相Pickering乳液。
可选的，所述油脂包括大豆油或鱼油。
可选的，所述剪切乳化的转速为8000～12800rpm，时间为1～5min。
在另一方面，本申请还提供第五种方案，即前述所述的复合纳米颗粒溶液的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将鲅鱼与水按质量/体积比为1:(8～12)混合、并通过碱提、酸沉、精制从悬浮液中提出鲅鱼蛋白上清液，通过冻干上清液获得鲅鱼蛋白；
S2、将鲅鱼蛋白和水配制成质量/体积比为0.5％～6.0％的鲅鱼蛋白溶液；
S3、将原花青素和水配制成质量/体积比为大于0％，且不高于1.2％的原花青素溶液，按体积比为1：1～1：2将步骤S2所得鲅鱼蛋白溶液加入到所得原花青素溶液中进行混合；
S4、调节鲅鱼蛋白-原花青素混合溶液的pH值至2.0～6.0，获得复合纳米颗粒溶液。
可选的，所述碱提为使用2M NaOH将悬浮液的pH值调节至10.0～11.0；在25～37℃下搅拌2h后，在4℃下以13000～15800×g离心30min，提取上清液。
可选的，所述酸沉为使用2M HCl将上清液的pH值调节至4.0～5.0，并在4℃下以8000～11000×g离心15min，获得蛋白质沉淀。
可选的，所述精制为将获得的蛋白沉淀溶解在去离子水中，调节pH值至6.5～7.5，在4℃下搅拌12h，然后在4℃下以8000～11000×g离心10min。
前述质量/体积比为采用固体的质量与液体的体积所得的比例，具体可为g/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明的复合纳米颗粒溶液可以有效制备出稳定虾青素等活性物质的高内相Pickering乳液，所得高内相Pickering乳液具有较强的贮藏稳定性，在1个月的贮藏过程中未出现乳析现象和破乳现象，可以有效包埋疏水性物质。
(2)本发明的复合纳米颗粒溶液能够利用较少的乳化剂稳定内相高达85％的油脂，所得高内相Pickering乳液具备较强的凝胶特性，制备过程中所利用的原料绿色天然，在食品和医药等方面具有广阔的应用前景。
(3)本发明的复合纳米颗粒溶液所制备得到的高内相Pickering乳液能够有效提高虾青素等在不同环境条件下的稳定性。
(4)本发明的复合纳米颗粒溶液制备得到的高内相Pickering乳液具有良好的粘弹性和烹饪稳定性，在鱼糜制品中的最大黏附率能够达到47.89％，这为提高鱼糜制品的营养和功能提供了一种简单有效的方法。
附图说明
图1是实施例1鲅鱼蛋白和原花青素的Zeta电位；
图2是实施例2鲅鱼蛋白-原花青素的透射电子显微镜图像；
图3是对比例2鲅鱼蛋白的透射电子显微镜图像；
图4是实施例3鲅鱼蛋白-原花青素的三相接触角；
图5是对比例3鲅鱼蛋白的三相接触角；
图6是实施例4由含有不同比例原花青素的鲅鱼蛋白-原花青素稳定的Pickering乳液的外观照片，以及对比例4由鲅鱼蛋白稳定的Pickering乳液的外观照片；
图7是实施例5由不同浓度鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的微观图片；
图8是对比例5由不同浓度鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液的微观图片；
图9是实施例6由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的低温扫描电子显微镜图像；
图10是对比例6由鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液的低温扫描电子显微镜图像；
图11是实施例7由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的含有不同比例油脂的高内相Pickering乳液的外观照片，以及由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的含有不同比例油脂的高内相Pickering乳液在贮藏4周后的外观照片；
图12是对比例7由鲅鱼蛋白稳定的含有不同比例油脂的高内相Pickering乳液的外观照片，以及由鲅鱼蛋白稳定的含有不同比例油脂的高内相Pickering乳液在贮藏4周后的外观照片；
图13是实施例8由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：储能模量(G’)和损耗模量(G”)随频率的变化，以及对比例7由鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：储能模量(G’)和损耗模量(G”)随频率的变化；
图14是实施例9由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：粘度随剪切速率的变化，以及对比例8由鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：粘度随剪切速率的变化；
图15是实施例10由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：储能模量(G’)与触变恢复时间的关系，以及对比例9由鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液的流变特性：储能模量(G’)与触变恢复时间的关系；
图16是实施例11在光照和室温条件下，由鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例11在光照和室温条件下，由鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例11在光照和室温条件下，由油脂封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率；
图17是实施例12在黑暗和室温条件下，由鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例12在黑暗和室温条件下，由鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例12在黑暗和室温条件下，由油脂封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率；
图18是实施例13在光照和4℃条件下，由鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例13在光照和4℃条件下，由鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例13在光照和4℃条件下，由油脂封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率；
图19是实施例14在黑暗和4℃条件下，由鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例14在黑暗和4℃条件下，由鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率，以及对比例14在黑暗和4℃条件下，由油脂封装的虾青素在28天的贮藏时间内的保留率；
图20是实施例15掺杂鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液的鱼糜在离心之后的外观照片，以及对比例15掺杂鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液的鱼糜在离心之后的外观照片，以及对比例15掺杂油脂的鱼糜在离心之后的外观照片和油脂在鱼糜中的外观照片；
图21是实施例16鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液在95℃条件下加热30min前后的外观照片，以及对比例16鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液在95℃条件下加热30min前后的外观照片；
图22是实施例17掺杂鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液的鱼糜在离心并在95℃条件下加热30min之后的外观照片，以及对比例17掺杂鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液的鱼糜在离心并在95℃条件下加热30min之后的外观照片，以及对比例17掺杂油脂的鱼糜在离心并在95℃条件下加热30min之后的外观照片。
具体实施方式
本发明下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明。
本申请以下实施例所采用的高内相Pickering乳液的制备方法，主要包括以下步骤：
S1、冷冻的鲅鱼在解冻之后，并溶解。将混合物均匀化，并通过碱提、酸沉、精制从悬浮液中提取鲅鱼蛋白上清液，通过冻干上清液获得鲅鱼蛋白；
S2、将鲅鱼蛋白和去离子水配制鲅鱼蛋白溶液；
S3、将原花青素和去离子水配制原花青素溶液，将步骤S2所得鲅鱼蛋白溶液加入到步骤S3所得原花青素溶液中进行混合；
S4、调节鲅鱼蛋白/原花青素混合溶液的pH值；
S5、将步骤S4所得的鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒溶液和油脂混合，通过剪切乳化得到鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒稳定的高内相Pickering乳液。
步骤S1所述解冻的条件为4℃，10～14h。
所述溶解的条件为8～12倍(v/w)去离子水；所述碱提为使用2M NaOH将悬浮液的pH值调节至10.0～11.0。在25～37℃下搅拌2h后，在4℃下以13000～15800×g离心30min，提取上清液。
所述酸沉为使用2M HCl将上清液的pH值调节至4.0～5.0，并在4℃下以8000～11000×g离心15min，获得蛋白质沉淀。
所述精制为将获得的蛋白沉淀溶解在去离子水中，调节pH值至6.5～7.5，在4℃下搅拌12h，然后在4℃下以8000～11000×g离心10min。
步骤S2所述鲅鱼蛋白和去离子水的质量/体积比为0.5％～6.0％w/v。
步骤S3所述原花青素和去离子水的质量/体积比为0～1.2％w/v。
所述鲅鱼蛋白溶液和原花青素溶液的体积比为1：1～1：2。
步骤S4所述pH值范围为2.0～6.0。
步骤S5所述鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒溶液和油脂的体积比为1：9～3：7。
所述油脂包括大豆油和鱼油。
所述剪切乳化的条件为8000～12800rpm，1～5min。
所制备得到的高内相Pickering乳液能够有效封装虾青素并达到稳定虾青素的效果，同时，所制备的高内相Pickering乳液具有良好的粘弹性和烹饪稳定性，在鱼糜制品中的最大黏附率能够达到47.89％，这为提高鱼糜制品的营养和功能提供了一种简单有效的方法。
实施例1
准确称量0.01g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，配置成1mg/mL的鲅鱼蛋白溶液。将鲅鱼蛋白溶液平均分装成5份，并分别将pH调节为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0。
准确称量0.01g原花青素溶解于10mL去离子水中，配置成1mg/mL的原花青素溶液。将原花青素溶液平均分装成5份，并分别将pH调节为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0。
利用Zeta电位分析仪将上述配置的不同pH的溶液进行测定，实验条件为25℃，得到图1。
本实施例测定了不同pH条件下鲅鱼蛋白和原花青素表面带电情况，鲅鱼蛋白的Zeta电位从23.53±2.31mV(pH 2.0)逐渐降低至-16.23±1.27mV(pH 6.0)。同样，原花青素的Zeta电位从12.00±0.70mV(pH 2.0)降至-7.60±0.10mV(pH 6.0)。鲅鱼蛋白和原花青素在pH 4.0附近具有相反的电荷。因此，可以推断，在pH值为4.0时，鲅鱼蛋白和原花青素之间存在静电吸引。
本实例中应用的鲅鱼蛋白和原花青素在pH值为4.0时能够通过静电吸引相互结合，形成鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒。
实施例2
准确称量0.01g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，配置成鲅鱼蛋白溶液，准确称量0.01g原花青素溶解于5mL去离子水中，并加入鲅鱼蛋白溶液中，调节pH到4.0，配置成1mg/mL的鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒溶液。取一滴鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒溶液滴在超薄碳膜上，并用磷钨酸复染。
使用透射电子显微镜在200kV电压下观察鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒的微观形态，得到图2。
对比例2
准确称量0.01g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，配置成1mg/mL的鲅鱼蛋白溶液。取一滴鲅鱼蛋白溶液滴在超薄碳膜上，并用磷钨酸复染。
使用透射电子显微镜在200kV电压下观察鲅鱼蛋白的微观形态，得到图3。
综合图2和图3，透射电镜图像用于观察鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒和鲅鱼蛋白的结构。鲅鱼蛋白的形状大致为三维球形。原花青素打开了鲅鱼蛋白的空间结构，并以其自身为“桥梁”，从而将多个鲅鱼蛋白桥接成大型鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒。鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒较大的粒径和较致密的三维网络结构有助于在高内相Pickering乳液的油水界面形成稳定的界面膜，可以有效减少油水之间的物质交换。
综上所述，鲅鱼蛋白-原花青素复合纳米颗粒独特的微观结构使其有可能成为一种新型的食品级高内相Pickering乳液稳定剂。
实施例3及对比例3
分别利用鲅鱼蛋白-原花青素和鲅鱼蛋白压缩制备成厚度约为2mm，直径为1cm的圆片。然后将圆片浸没在冷大豆油中，并使用滤纸去除圆片上多余的玉米油，然后将4μL的水轻轻滴在圆片上。使用DSA 25液滴形状分析仪测量三相接触角(θOW)，获得图4和图5。
图4反映了鲅鱼蛋白-原花青素的θOW为89.6°，具有良好的亲水/疏水平衡，这有利于其稳定高内相Pickering乳液。
图5反映了鲅鱼蛋白的θOW为59.0°，具有较强的亲水性。
原花青素是一种水溶性多酚，具有强亲水性。然而当鲅鱼蛋白与原花青素结合后，鲅鱼蛋白的亲水性急剧削弱，鲅鱼蛋白-原花青素具有良好的亲水/疏水平衡，这一结果是超出常规预期的。
实施例4及对比例4
准确称量5份0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，分别准确称取0g，0.03g，0.06g，0.09g，0.12g原花青素溶解于5mL去离子水中，然后将配置的原花青素溶液与鲅鱼蛋白溶液混合，得到鲅鱼蛋白-0％原花青素溶液，鲅鱼蛋白-20％原花青素溶液，鲅鱼蛋白-40％原花青素溶液，鲅鱼蛋白-60％原花青素溶液，鲅鱼蛋白-80％原花青素溶液。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取5mL溶液。并将上述溶液分别和5mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白-原花青素Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。将上述Pickering乳液贮藏7天后得到外观图6。
图6反映了原花青素浓度对鲅鱼蛋白-原花青素乳化能力的影响。当原花青素浓度为0％和20％时，由于鲅鱼蛋白的强亲水性，下层析出大量浑浊的水相。油水界面形成的颗粒不稳定，底层水相中存在乳化剂。室温贮存7天后，鲅鱼蛋白-0％原花青素和鲅鱼蛋白-20％原花青素稳定的Pickering的乳液层高度较低。乳液层高度随着原花青素浓度的增加而增加，主要是因为原花青素逐渐改变了鲅鱼蛋白的亲水性。当原花青素浓度为40％时，形成的鲅鱼蛋白-原花青素具有良好的亲水/疏水平衡和良好的乳化能力。综上，鲅鱼蛋白-40％原花青素复合纳米颗粒具有良好的乳化能力，具备稳定高内相Pickering乳液的潜力。
实施例5
准确称量0.05g，0.10g，0.15g，0.20g，0.25g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.02g，0.04g，0.06g，0.08g，0.10g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液一一对应地加入到鲅鱼蛋白溶液中。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取2mL溶液。并将上述溶液分别和8mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
采用荧光倒置显微镜观察乳液的微结构，得到图7。
对比例5
准确称量0.05g，0.10g，0.15g，0.20g，0.25g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取2mL溶液。并将上述溶液分别和8mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
采用荧光倒置显微镜观察乳液的微结构，得到图8。
综合图7和图8，总结了不同浓度的颗粒稳定剂对高内相Pickering乳液制备的影响。当粒子稳定剂的浓度较低(例如，0.5％)时，高内相Pickering乳化液滴具有较大的粒径，这被认为是不稳定的结构。随着颗粒稳定剂浓度的增加，高内相Pickering乳液液滴的大小显著减小。此外，当颗粒稳定剂浓度为1.5％时，鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液液滴较小且均匀。这是因为该浓度下的鲅鱼蛋白-原花青素足以在油水界面形成均匀、致密的网络结构，这使得较小的乳化液滴难以融合并形成较大的乳化液滴。这些发现证明了鲅鱼蛋白-原花青素在高内相Pickering乳液稳定微观结构中的重要作用。
实施例6
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取2mL溶液。并将上述溶液分别和8mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
取少量制备的乳液样品，通过低温扫描电子显微镜图像观察乳液的微观结构，得到图9。
对比例6
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中。
之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
取少量制备的乳液样品，通过低温扫描电子显微镜图像观察乳液的微观结构，得到图10。
综合图9和图10，鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液液滴之间存在融合现象，而鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液液滴保持一定距离。这可能是因为鲅鱼蛋白-原花青素是具有刚性结构的较大纳米粒子，与乳化液滴相连，使液滴难以完全接触和融合。
实施例7
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取3mL，2mL，1.5mL，1mL溶液。并将上述溶液分别和7mL，8mL，8.5mL，9mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的高内相Pickering乳液拍照后存放4周，再次拍照，获得外观图11。
对比例7
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中。
之后调节所得溶液pH为4.0，分别取3mL，2mL，1.5mL，1mL溶液。并将上述溶液分别和7mL，8mL，8.5mL，9mL大豆油混合剪切乳化，分别得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的高内相Pickering乳液拍照后存放4周，再次拍照，获得外观图12。
综合图11和图12，观察Pickering乳液在照片中是否有明显的油相分离，有助于评估颗粒稳定剂的乳化性能和制备的Pickering乳液的贮存稳定性。图中，鲅鱼蛋白稳定油分80％的高内相Pickering乳液。当高内相Pickering乳液的油分增加到85％时，在瓶底发现少量乳化部分，油相分离。油分进一步增加到90％，倒置的样品瓶中没有透明乳液。这些结果表明，鲅鱼蛋白最高能稳定80％的高内相Pickering乳液。鲅鱼蛋白-原花青素可以稳定高内相Pickering乳液，油分数高达85％，并且倒置的样品瓶中没有明显的油相分离。在4℃下储存4周后，经鲅鱼蛋白稳定的80％油分的高内相Pickering乳液没有明显的油相分离，表明经鲅鱼蛋白稳定的80％油分的高内相Pickering乳液具有稳定的结构。由含有85％油分的鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液也没有油相分离，这表明原花青素的引入提高了鲅鱼蛋白的乳化性能，因此鲅鱼蛋白-原花青素可以稳定具有较高内相的高内相Pickering乳液。
实施例8及对比例8
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
使用流变仪在25℃下进行小振幅振荡测量(储能模量(G’)和损耗模量(G”)随频率的变化)，获得图13。
图13显示了储能模量(G’)和损耗模量(G”)随频率的变化。在测试频率范围内，不同纳米粒子稳定的高内相Pickering乳液的G’始终高于相应的G”。这些结果表明，高内相Pickering乳液具有良好的凝胶特性。高含油率使得填充密度更大，乳液结构更致密。鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的G’和G”明显高于鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液，这可能是由于引入了原花青素，这使得鲅鱼蛋白在界面层上桥接在一起。这种桥接也可能发生在乳化液滴之间，因此鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液具有很强的凝胶特性。
实施例9和对比例9
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
使用流变仪在25℃下进行小振幅振荡测量(粘度随剪切速率的变化，在1Pa下，频率扫描范围为0.1至10Hz)，获得图14。
图14显示了鲅鱼蛋白和鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液的剪切稀释。与鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液相比，鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液剪切变稀现象不明显。这表明带正电荷的鲅鱼蛋白和带负电荷的原花青素之间的静电络合增强了乳液液滴之间的粘度。原花青素的引入使鲅鱼蛋白-原花青素能够以更高的粘度稳定高内相Pickering乳液。
实施例10和对比例10
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
使用流变仪在25℃下进行小振幅振荡测量(高内相Pickering乳液的三段触变性(高应变＝100％，低应变＝0.1％))，获得图15。
三阶段触变性分析表明，由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液具有更高的回复性较于鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液。
实施例11及对比例11
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering封装的虾青素，鲅鱼蛋白高内相Pickering封装的虾青素，大豆油封装的虾青素放置于光照，室温条件下贮藏28天，期间使用紫外分光光度计测定虾青素保留率，得到图16。
实施例12及对比例12
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液封装的虾青素，鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液封装的虾青素，大豆油封装的虾青素放置于黑暗，室温条件下贮藏28天，期间使用紫外分光光度计测定虾青素保留率，得到图17。
实施例13及对比例13
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering封装的虾青素，鲅鱼蛋白高内相Pickering封装的虾青素，大豆油封装的虾青素放置于光照，4℃条件下贮藏28天，期间使用紫外分光光度计测定虾青素保留率，得到图18。
实施例14及对比例14
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL溶解有虾青素的大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将制备的鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering封装的虾青素，鲅鱼蛋白高内相Pickering封装的虾青素，大豆油封装的虾青素放置于黑暗，4℃条件下贮藏28天，期间使用紫外分光光度计测定虾青素保留率，得到图19。
综合实施例11～14及对比例11～14，得出以下结论：在不同光照和温度环境条件下，对虾青素在三种封装系统中28天的保留时间进行了测试。如图8所示，在28天的储存期内，虾青素的保留率呈下降趋势。4℃和黑暗储存条件有效地提高了虾青素在三种封装系统中的保留率。主要原因是虾青素在贮藏过程中容易被紫外线分解，高温会加速虾青素的氧化。储存28天后，虾青素在光照和4℃下的保留率如下：鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液(46.10％)>鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液(26.85％)>大豆油(16.03％)。虾青素在高内相Pickering乳液内的滞留量相对较高。这是由于油相表面的粒子稳定剂(鲅鱼蛋白和鲅鱼蛋白-原花青素)提供了物理屏障，降低了透光率，从而抑制了虾青素的降解。此外，鲅鱼蛋白-原花青素比鲅鱼蛋白更有利于虾青素的保留。主要原因是原花青素的引入使鲅鱼蛋白-原花青素形成了更密集的网络结构。鲅鱼蛋白-原花青素的网络结构形成了一个界面层，界面层中的颗粒间隙较小。因此，透光率降低，虾青素的光降解速度减慢。在黑暗和4℃条件下储存28天后，虾青素的保留率如下：鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液(83.36％)>鲅鱼蛋白稳定的高内相Pickering乳液(71.51％)>大豆油(62.18％)。虾青素在大豆油中的保留率最低。主要原因是大豆油中的虾青素与空气有较大的接触面积，促进氧气的传递。虾青素在高内相Pickering乳液内的保留率较高。这也是因为油相表面的粒子稳定剂提供了物理屏障，阻止油相虾青素与水相溶解氧之间的接触。此外，鲅鱼蛋白-原花青素的致密网络结构减少了油相和水相之间的接触面积。由鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液中虾青素的最高保留率可能与原花青素的强大抗氧化活性有关。原花青素以“自我牺牲”的方式与水相中的部分溶解氧结合，这大大降低了虾青素在油相中的氧化降解概率。综上所述，基于虾青素的优异保护作用，鲅鱼蛋白-原花青素稳定的高内相Pickering乳液可以作为虾青素的有效负载系统。
实施例15及对比例15
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
通过粉碎鲅鱼肉，添加质量比为2％的食盐制备鱼糜。准确称量3份10.0g鱼糜中，并分别加入5.0g鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液，5.0g鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液，5.0g大豆油。鱼糜样品离心(3000×g，15分钟)，进行图像采集，分离游离油并计算黏附率，然后进行核磁共振成像测试，分析信号强度。最终获得图20。
图20的结果显示，鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液和鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液黏附率显著高于大豆油的黏附率。对鱼糜进行核磁共振成像和总信号强度分析的结果显示，添加高内相Pickering乳液的鱼糜中油质子的总信号强度显著高于添加大豆油的鱼糜中油质子的总信号。这表明，高内相Pickering乳液在鱼糜中具有较高的黏附率，这将有利于高内相Pickering乳液以简单黏附的形式在鱼糜制品中的应用，提高鱼糜制品的营养价值。
实施例16及对比例16
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
将上述两种高内相Pickering乳液置于95℃环境中30min，对其外观进行图像采集，获得图21。
图21结果显示，在95℃下加热30分钟后，完整的凝胶结构保留在两种高内相Pickering乳液中。在鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液中未观察到可见油相，而在鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液中观察到可见油相，这说明鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液具有更强的热稳定性，适合应用于鱼糜产品。
实施例17及对比例17
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于5mL去离子水中，准确称量0.06g原花青素溶解于5mL去离子水中，将原花青素溶液加入到鲅鱼蛋白溶液中。之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL大豆油混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
准确称量0.15g鲅鱼蛋白溶解于10mL去离子水中，之后调节所得溶液pH为4.0，取2mL溶液。并将上述溶液和8mL混合剪切乳化，得到鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液。其中剪切乳化的转速为12800rpm，时间为2min。
通过粉碎鲅鱼肉，添加质量比为2％的食盐制备鱼糜。准确称量3份10.0g鱼糜中，并分别加入5.0g鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液，5.0g鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液，5.0g大豆油。鱼糜样品离心(3000×g，15分钟)，然后，将鱼糜样品在95℃水浴中加热30分钟，进行图像采集，再次分离上层的游离油并计算黏附率，并进行核磁共振成像测量，分析信号强度。最终获得图22。
图22的结果显示，鲅鱼蛋白高内相Pickering乳液和鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液黏附率分别达到46.62％和47.89％，显著高于大豆油的黏附率。对鱼糜进行核磁共振成像和总信号强度分析的结果显示，加热后，添加高内相Pickering乳液的鱼糜中油质子的总信号强度显著高于添加大豆油的鱼糜中油质子的总信号。综上，加热后，鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液在鱼糜中依然具有较高的黏附率，这意味着含有鲅鱼蛋白-原花青素高内相Pickering乳液的鱼糜适用于高温水煮的烹饪方式。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.复合纳米颗粒溶液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、将鲅鱼与水按质量/体积比为1:（8~12）混合、并通过碱提、酸沉、精制从悬浮液中提出鲅鱼蛋白上清液，通过冻干上清液获得鲅鱼蛋白；
S2、将鲅鱼蛋白和水配制成质量/体积比为0.5%~6.0%的鲅鱼蛋白溶液；
S3、将原花青素和水配制成质量/体积比为大于0%，且不高于1.2%的原花青素溶液，按体积比为1：1~1：2将步骤S2所得鲅鱼蛋白溶液加入到所得原花青素溶液中进行混合；
S4、调节鲅鱼蛋白-原花青素混合溶液的pH值至2.0~6.0，获得复合纳米颗粒溶液。
2.权利要求1所制备得到的复合纳米颗粒溶液。
3.权利要求1所制备得到的复合纳米颗粒溶液在稳定虾青素上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求1所制备得到的复合纳米颗粒溶液与溶解有质量/体积比为2.5%~5%虾青素的大豆油混合并剪切乳化得虾青素稳定的高内相Pickering乳液。
5.鱼糜制品，其特征在于，将权利要求4所得虾青素稳定的高内相Pickering乳液与鱼糜按质量比为10~50%混合，得鱼糜制品。
6.高内相Pickering乳液，其特征在于，包括将权利要求1所制备得到的复合纳米颗粒溶液与油脂按体积比为1：9~3：7混合，剪切乳化后得高内相Pickering乳液。
7.根据权利要求6所述的高内相Pickering乳液，其特征在于，所述油脂包括大豆油或鱼油。
8.根据权利要求6所述的高内相Pickering乳液，其特征在于，所述剪切乳化的转速为8000 ~12800 rpm，时间为1~5 min。
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