CN115215927A - 一种含长链巯基臂的链霉亲和素及制备方法 - Google Patents

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钱永常
来灿钢
钟达
林定
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Hangzhou Neuropeptide Biological Science And Technology Inc Ltd
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Abstract

本发明公开了一种含长链巯基臂的链霉亲和素及制备方法，属于生物医药领域。该含长链巯基臂的链霉亲和素的制备方法包括以下步骤：1)将所述的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素溶于适当的缓冲液中，在过量的还原剂作用下暴露半胱氨酸残基后，分离去除过量的还原剂；2)步骤1)所得的溶液，与过量的交联剂反应后，分离去除过量的交联剂；3)步骤2)所得的溶液，在过量的还原剂作用下暴露巯基，分离去除过量的还原剂，即可获得含长链巯基臂的链霉亲和素。本申请制备的含长链巯基臂的链霉亲和素解决了半胱氨酸型重组核心链霉亲和素与载体的键合效率低的问题。

Description

一种含长链巯基臂的链霉亲和素及制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种含长链巯基臂的链霉亲和素及制备方法。
背景技术
链霉亲和素(streptavidin，SA)是一种来源于阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)的四聚体蛋白质，与亲和素有相似的生物学特性，可以高度特异性地与四分子的生物素(biotin)相结合。由于SA不含糖基，因此SA的非特异性结合水平远比亲和素低。基于SA与biotin之间的高亲和力以及多级放大效应，SA-biotin系统已被广泛应用于酶联免疫吸附实验、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备等生物技术领域。
重组核心链霉亲和素(Recombinant Core Streptavidin，r-cSA)与天然的链霉亲和素相比，去除了与活性无关的氨基酸序列，仅保留核心127aa序列，稳定性、溶解性等方面均优于天然SA。半胱氨酸型重组核心链霉亲和素在r-cSA的C端添加了1个半胱氨酸，其巯基可以定向地与载体共价键合，现已成为本领域最常用的链霉亲和素之一。但是受巯基的空间位阻的影响，半胱氨酸型重组核心链霉亲和素的键合效率较低。因此，有待开发小位阻的巯基修饰重组链霉亲和素。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种含长链巯基臂的链霉亲和素，其结构如式I所示。
Figure BDA0003749988260000011
其中，
SA为半胱氨酸型重组核心链霉亲和素；
E选自：C1-C10直链烷基、C3-C10支链烷基、C3-C8的环状烷基、C6-C10的芳香基或-(CH2CH2O)n-，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
优选地，所述E选自以下片段：
Figure BDA0003749988260000012
本发明的目的之二在于提供上述含长链巯基臂的链霉亲和素的制备方法，其包括如下步骤：
1)将所述的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素溶于适当的缓冲液中，在过量的还原剂作用下暴露半胱氨酸残基后，分离去除过量的还原剂；
2)步骤1)所得的溶液，与过量的交联剂反应后，分离去除过量的交联剂；
3)步骤2)所得的溶液，在过量的还原剂作用下暴露巯基，分离去除过量的还原剂，即可获得含长链巯基臂的链霉亲和素。
所述适当的缓冲液为pH为4.0～10.0的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或枸橼酸缓冲液；
所述还原剂为2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐；
所述交联剂包含式II结构的分子：
Figure BDA0003749988260000021
其中，E选自：C1-C10直链烷基、C3-C10支链烷基、C3-C8的环状烷基、C6-C10的芳香基或-(CH2CH2O)n-，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
本发明的目的之三在于提供上述含长链巯基臂的链霉亲和素在酶联免疫吸附实验(Elisa)、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备中的应用。
本发明的目的之四在于提供上述制备方法制备得到的含长链巯基臂的链霉亲和素在酶联免疫吸附实验(Elisa)、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本申请制备的含长链巯基臂的链霉亲和素解决了半胱氨酸型重组核心链霉亲和素与载体的键合效率低的问题。
附图说明
图1为实施例1中交联剂A的核磁共振氢谱图。
图2为实施例2中SDS-PAGE鉴定结果图。
图3为实施例2中含长链巯基臂的链霉亲和素C的MALDI-TOF/TOF鉴定结果图。
图4为实施例2中对照的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素的MALDI-TOF/TOF鉴定结果图。
图5为实施例3中SDS-PAGE鉴定结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供交联剂A的制备方法：
交联剂A的结构式如下：
Figure BDA0003749988260000031
参考文献Journal of Physical Chemistry B,2004,108,16508-16517进行制备，具体制备过程如下：在盐酸胱胺(230mg，1mmol)和二丙基乙胺(514uL，3mmol)的CH2Cl2(10ml)的搅拌悬浮液中，加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(310mg，1mmol)的CH2Cl2(5ml)溶液。反应混合物搅拌16h后，TLC(乙酸乙酯)检测反应程度。反应完全后，过滤去除沉淀，减压蒸馏除去滤液中的溶剂，得到固液混合物。用柱色谱纯化，得到白色固体78mg。核磁共振氢谱鉴定结果如图1所示，由图1可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：6.69(s,4H),6.33(t,J＝5.4Hz,2H),3.57(q,J＝6.3Hz,4H),3.51(t,J＝7.2Hz,4H),2.83(t,J＝6.4Hz,4H),2.21(t,J＝7.5Hz,4H),1.71-1.57(m,8H),1.36-1.28(m,4H)。
实施例2
本实施例提供含长链巯基臂的链霉亲和素的制备过程：
(1)半胱氨酸型重组核心链霉亲和素的还原：将8mg的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素(由杭州纽龙生物科技有限公司提供)溶于1mL PBS缓冲液中(pH＝7.4)，加入80μL的二硫苏糖醇的PBS溶液(59mg/mL，pH＝7.4)，室温翻转混合30min后，搅拌透析，除去过量的二硫苏糖醇，即得还原后的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素溶液。
(2)取0.25mL上述还原后的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素溶液，分别加入2、4、8、16μL的交联剂A(实施例1制备)的DMSO溶液(16mg/mL)，室温翻转混合24h，搅拌透析除去过量的交联剂A，即得链霉亲和素交联物B，其SDS-PAGE鉴定如图2所示。
图2中，M为蛋白质分子量标准，泳道1、2、3、4分别代表加入2、4、8、16μL交联剂A的溶液。在加入了16μL交联剂的泳道4中，存在大量分子量约为26kDa的式B所示的二聚体条带，证明交联成功。此外，分子量约为13kDa的条带可能为式B1所示的副产物。B和B1在后续的还原反应中均被还原成含长链巯基臂的链霉亲和素C。
Figure BDA0003749988260000041
(3)上述链霉亲和素交联物B，加入20μL的二硫苏糖醇的PBS溶液(59mg/mL，pH＝7.4)，室温翻转混合30min后，搅拌透析，除去过量的二硫苏糖醇，即得含长链巯基臂的链霉亲和素C。
Figure BDA0003749988260000042
MALDI-TOF/TOF鉴定结果如图3、4所示。其中，图3为含长链巯基臂的链霉亲和素C，图4为未修饰的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素(按照本实施例的第(1)步制备)。由图4可知，链霉亲和素在MALDI-TOF/TOF的条件下会以二聚、三聚、四聚的形式存在。通过对比图3和图4的分子量可知，长链巯基臂成功地接到了链霉亲和素上，且产品质量分布均一。
实施例3
本实施例提供含长链巯基臂的链霉亲和素与PEG的键合方法：
取实施例2制备的含长链巯基臂的链霉亲和素C进行蛋白定量，另取未修饰的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素(按照实施例2的第(1)步制备)作为对照，每mg半胱氨酸型重组核心链霉亲和素加入0.1mg PEG(20kD)。翻转混匀1h后，每毫升溶液加入3μL乙醇胺，翻转混匀。SDS-PAGE鉴定如图5所示。
图5中，M为蛋白质分子量标准，泳道1为未修饰的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素与PEG的键合结果，泳道2为含长链巯基臂的链霉亲和素C与PEG的键合结果，66kD附近的条带代表未与PEG键合的链霉亲和素。泳道2的66kD条带显著少于泳道1的66kD条带，说明经长链巯基臂修饰后，链霉亲和素与PEG的键合效率显著提高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种含长链巯基臂的链霉亲和素，其特征在于，所述含长链巯基臂的链霉亲和素的结构式如I所示，
Figure FDA0003749988250000011
其中，
SA为半胱氨酸型重组核心链霉亲和素；
E选自：C1-C10直链烷基、C3-C10支链烷基、C3-C8的环状烷基、C6-C10的芳香基或-(CH2CH2O)n-，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
2.根据权利要求1所述的含长链巯基臂的链霉亲和素，其特征在于，所述E选自以下片段：
Figure FDA0003749988250000012
3.一种权利要求1或2所述含长链巯基臂的链霉亲和素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将所述的半胱氨酸型重组核心链霉亲和素溶于适当的缓冲液中，在过量的还原剂作用下暴露半胱氨酸残基后，分离去除过量的还原剂；
2)步骤1)所得的溶液，与过量的交联剂反应后，分离去除过量的交联剂；
3)步骤2)所得的溶液，在过量的还原剂作用下暴露巯基，分离去除过量的还原剂，即可获得含长链巯基臂的链霉亲和素；
所述交联剂包含式II结构的分子：
Figure FDA0003749988250000013
其中，E选自：C1-C10直链烷基、C3-C10支链烷基、C3-C8的环状烷基、C6-C10的芳香基或-(CH2CH2O)n-，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述适当的缓冲液为pH为4.0～10.0的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或枸橼酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述还原剂为2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
6.权利要求1或2所述的含长链巯基臂的链霉亲和素在酶联免疫吸附实验、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备中的应用。
7.权利要求3-5中任一项所述的制备方法制备得到的含长链巯基臂的链霉亲和素在酶联免疫吸附实验、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备中的应用。
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