CN115212317A - 一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体及其制备方法，所述骨靶向脂质体的表面修饰有酸性寡肽，其修饰密度n为1～5，单位为摩尔比mol％。本发明的骨靶向脂质体通过在脂质体表面修饰具有骨靶向作用的D型谷氨酸六肽，并优化其在脂质体表面修饰的密度，以筛选出具有最强骨靶向活性的脂质体制剂，使其在骨组织分布增加。随着酸性寡肽修饰密度的增高，脂质体与羟基磷灰石结合能力增强；然而，修饰产生的高负电荷刺激单核吞噬系统吞噬，降低脂质体血滞留。但高密度酸性寡肽修饰(5mol％)赋予脂质体突出的HA结合活性，可完全弥补其血滞留弱的不足，从而实现最高的骨靶向递送。

Description

一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体及其制备方法。
背景技术
由于渐进的社会老龄化，骨疾病(如骨质疏松症和骨肿瘤)构成了主要的公共健康问题。对于骨疾病的治疗，需要口服和注射大剂量药物才能使其以有效浓度到达骨组织部位。然而，如此高浓度的药物在血液循环中可能会对其他正常组织造成严重的不良影响。纳米载体可将药物靶向递送到骨组织部位并最大限度地减少全身毒性来提高骨疾病的治疗效果，从而受到广泛关注。
因此，开发一种具有主动靶向骨组织功能的纳米递药系统具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提出了一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体，所述骨靶向脂质体的表面修饰有酸性寡肽，其修饰密度n为1～5，单位为摩尔比mol％。
优选地，所述酸性寡肽为D型Glu6。
在本发明所述的技术方案中，通过在脂质体表面修饰具有骨靶向作用的酸性寡肽，例如以D型谷氨酸六肽(Glutamic hexapeptide，简称Glu6)为代表的酸性寡肽，优化其在脂质体表面修饰的密度，以筛选出具有最强骨靶向活性的脂质体制剂，使其在骨组织分布增加。
需要指出的是，用酸性寡肽配体修饰的脂质体显示出理想的骨靶向能力。然而，随着酸性寡肽修饰密度的增加，脂质体可能表现出更强的羟基磷灰石((Hydroxyapatite，简称HA)结合活性，但血液药代动力学较差，这对脂质体在骨组织中的分布产生相反的影响。因此，只是简单增加酸性寡肽的修饰密度，并不能很好地获得理想的具有骨靶向活性的脂质体，且如今也很少有研究系统地考察酸性寡肽修饰密度如何影响脂质体骨靶向活性。
基于此，本案发明人构建了一个脂质体库，该脂质体具有相同的脂质成分和相当的粒径，但具有不同的Glu6修饰密度，由此获得最佳的范围的Glu6的修饰密度。然而，如上所述，虽然高密度Glu6修饰可赋予脂质体更强的HA结合活性，但会使脂质体荷高负电荷，从而刺激巨噬细胞吞噬，增强脂质体在肝脏和脾脏的摄取，削弱脂质体血滞留。最终，生物分布实验表明了双重因素的作用结果，即具有修饰密度在1～5mol％的Glu6修饰的脂质体，由于其优异的HA结合活性完全克服了血液药代动力学的不足，在骨组织中产生了Glu6密度依赖的骨组织分布。其中，5mol％Glu6修饰引起最强的骨组织分布。此外，溶血试验进一步表明，优化的骨靶向脂质体(5mol％Glu6修饰的脂质体，即简称5％e-Lip)通过系统注射给药时，具有良好生物相容性。
第二方面，本发明提出了一种制备上述的骨靶向脂质体的方法，包括将HSPC、胆固醇和不同投料比的DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-DGlu6溶解于有机溶剂，振摇均匀，真空旋转蒸发形成磷脂薄膜，抽真空过夜，加入PBS，水浴旋转至薄膜水化脱落，得到不同Glu6修饰密度的脂质体混悬液，再用带有聚碳酸酯膜的挤出器挤压获得粒径为100nm的骨靶向脂质体。
优选地，所述DSPE-PEG2000-DGlu6通过以下方式获得：
以Fmoc合成策略合成得到DCys-DGlu6；
通过DSPE-PEG2000-Mal与DCys-DGlu6的巯基-马来酰亚胺加成反应，获得DSPE-PEG2000-DGlu6。
优选地，所述有机溶剂为氯仿与甲醇以3:1的体积比混合。
优选地，HSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-DGlu6以以下摩尔比溶解：56.5：38.5：5-x：x，其中x表示DSPE-PEG2000-DGlu6的摩尔比，且x＝1、2、3、4、5。
优选地，所述水浴温度为37℃，水浴时间为30min。
优选地，将脂质体混悬液依次通过100nm和50nm聚碳酸酯膜在挤出器中进行挤出。
第三方面，本发明提出了一种骨靶向脂质体药物，所述骨靶向脂质体药物包括上述的骨靶向脂质体，以及包裹在所述骨靶向脂质体内的活性药物分子；
优选地，所述活性药物分子选自以下的至少其中之一：治疗骨质疏松、肿瘤骨转移、骨折愈合障碍、骨折、骨缺损修复、骨质增生以及异位骨化的药物。
第四方面，本发明提出了骨靶向脂质体药物在制备治疗骨病的药物中的应用；
优选地，所述骨病选自骨质疏松、肿瘤骨转移、骨折愈合障碍、骨折、骨缺损修复、骨质增生以及异位骨化。
第五方面，本发明提出了一种药物制剂，所述药物制剂含有上述的骨靶向脂质体药物，所述药物制剂为液体制剂，所述液体制剂为注射剂。
与现有技术相比，本发明具有如下所述的优势以及有益效果：
本发明的酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体，首次研究和阐明了酸性寡肽修饰密度对脂质体骨靶向活性的影响规律。即随着酸性寡肽修饰密度的增高，脂质体与HA结合能力增强，修饰产生的高负电荷刺激单核吞噬系统(Mononuclear phagocyte system，简称MPS)中巨噬细胞对其吞噬，降低其血滞留。但高密度酸性寡肽修饰(5mol％)赋予脂质体突出的HA结合活性，可完全弥补其血滞留弱的不足，从而实现最高的骨靶向递送。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本发明中DCys-DGlu6的合成流程示意图；
图2为本发明中DCys-DGlu6在220nm处梯度洗脱的HPLC色谱图和DCys-DGlu6的质谱图，其中A为HPLC色谱图，B为质谱图，显示了相对分子质量：895.3；
图3为本发明中DSPE-PEG2000-DGlu6合成过程示意图；
图4为本发明中DSPE-PEG2000-Mal和DSPE-PEG2000-DGlu6的MALDI-TOF-MS谱图，其中A为DSPE-PEG2000-Mal，B为DSPE-PEG2000-DGlu6；
图5为本发明中具有不同Glu6修饰密度脂质体的制备与表征，其中A显示了DiD标记的具有不同Glu6修饰密度脂质体的制备流程示意图，B显示了脂质体粒径，C显示了Zeta电位；
图6为本发明中不同Glu6修饰密度的脂质体与HA的结合能力，分别通过体内IVIS光谱成像系统和酶标仪检测不同Glu6修饰密度的脂质体与HA结合的荧光图像和定量分析，其中A为荧光图像，B显示了定量分析；
图7为本发明中具有不同Glu6修饰密度脂质体在巨噬细胞Raw264.7摄取。其中，A显示了DiD标记的具有不同Glu6修饰密度脂质体与Raw264.7孵育4h后的代表性流式细胞术直方图，B显示了来自图A的平均荧光强度(MFI)半定量结果，C显示了在与图A相同的处理后，Raw264.7细胞的代表性共聚焦图像，比例尺：10μm；
图8为本发明中Lip和nP-Lip与50％FBS孵育48h的吸收值(570nm)变化；
图9为本发明中Lip中DiD在100％FBS中的泄漏；
图10为本发明中具有不同Glu6修饰密度脂质体的血液药代动力学行为。其中，A显示了将DiD标记的各脂质体处方静脉注射至SD大鼠后其血浆DiD浓度-时间曲线，B和C分别为通过非隔室模型计算所得的药代动力学参数半衰期(t1/2)和药时曲线下面积(AUC)；
图11为本发明中具有不同Glu6修饰密度脂质体的体内生物分布，其中A为将具有不同Glu6修饰密度脂质体静脉注射至C57BL/6小鼠，24h后，定量测定其在各组织的生物分布，测量结果表示为μg DiD/g组织，右上角为股骨和胫骨生物分布的放大直方图；B为将nP-Lip、Lip和5％e-Lip静脉注射到C57BL/6小鼠，24h后，观察其在小鼠主要组织分布的荧光成像；
图12为本发明中肝和脾中常驻巨噬细胞对5％e-Lip的摄取，将DiD标记的非修饰Glu6的脂质体(Lip)、5％e-Lip和非PEG化的脂质体(nP-Lip)尾静脉注入C57BL/6小鼠体内，在24h后观察肝脏和脾脏内的DiD荧光的分布。其中，A显示了肝脏中DiD标记脂质体与F4/80抗体标记巨噬细胞的分布，B显示了使用ImageJ软件计算A图的皮尔逊(共定位)相关系数，C显示了脾脏中DiD标记脂质体与F4/80抗体标记巨噬细胞的分布，D显示了使用ImageJ软件计算C图的皮尔逊(共定位)相关系数；
图13为本发明中5％e-Lip的溶血实验，红细胞分别在37℃下与超纯水(H2O)，PBS，Lip，5％e-Lip(L)和5％e-Lip(H)孵育2h，离心后，分别用数码相机和显微镜对上清悬浮液(A)和红细胞沉淀(C)进行拍摄，并计算Lip，5％e-Lip(L)和5％e-Lip(H)的溶血率(B)。PBS和H2O分别作为阴性和阳性对照，标尺，10μm。5％e-Lip(L):0.6mg/mL的低浓度的5％e-Lip；5％e-Lip(H):1.8mg/mL的高浓度的5％e-Lip。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在纳米颗粒中，脂质体是类似生物膜结构的双分子层囊泡。组成脂质体的双层结构是由磷脂成分分散到水中形成的，这些疏水性尾部倾向于聚集以避免与水接触，并且亲水性头部暴露于水一侧。这种特殊的双层结构使得脂质体可在内部水相中负载亲水性药物和磷脂双层中负载疏水性药物。脂质体是临床上接受度最高的药物递送载体，具有良好生物相容性和生物降解性，且其表面易于修饰靶向配体，能够包载药物、疫苗、基因和显像剂，同时具有无毒性和非免疫原性等优点，是用于靶向药物递送的最常见的纳米载体。
需要指出的是，本案主要创新性在于在纳米载体表面优化最佳修饰密度，因为修饰了Glu6利于其骨靶向，然而Glu6的修饰使脂质体带负电荷，降低血滞留，不利于其骨靶向，因此为了平衡药动学与骨靶向的矛盾，优化出一个最佳的Glu6修饰密度以达到最大的骨靶向能力。
HA占骨骼晶体成分70％以上，因此成为骨靶向的理想靶标。双磷酸盐(Bisphosphonates，BPs)、酸性寡肽和四环素等阴离子配体由于与HA上的钙离子具有高结合能力，具有骨归巢特性，已被广泛用作骨靶向配体。以往研究表明BPs和四环素修饰的脂质体表现出优异的骨靶向作用。然而，BPs与骨结合后会长时间保留在骨骼中，导致颌骨坏死，而四环素可能会抑制儿童骨骼生长。相比之下，酸性寡肽没有长期的毒副作用，易于合成和化学修饰，并且可在其氨基酸序列中加入响应序列以及其他靶向配体。
然而，使用酸性寡肽配体修饰脂质体以达到骨靶向活性是一把双刃剑。一方面，高密度酸性寡肽修饰促进脂质体与HA的结合，促进了脂质体在骨组织中的分布。另一方面，高密度酸性寡肽修饰引起的脂质体表面高负电荷也刺激了MPS中巨噬细胞的吞噬，从而导致脂质体从血液中快速消除，进而制约脂质体在骨组织中分布。因此，需要对酸性寡肽的修饰密度进行优化，以实现最优的脂质体骨靶向递送。
为了优化脂质体表面酸性寡肽修饰密度，本案发明人构建了一个脂质体库，这些脂质体具有相同的脂质成分和相当的粒径，但具有不同的酸性寡肽修饰密度。本文采用脂质体处方为：HSPC/胆固醇/DSPE-PEG2000(56.5:38.5:5,mol/mol))，其具有长循环特性，因而有助于实现骨靶向递送，本案通过对其表面进行了骨靶向配体Glu6的修饰，选用了5个修饰密度，分别为1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％，优化出最佳的骨靶向修饰密度(最终为5mol％)。Glu6作为一种酸性寡肽的代表，将其修饰于脂质体表面。将DGlu6的氨基端共价连接DCys，以引入游离巯基(-SH)，生成DCys-DGlu6，从而使DCys-DGlu6能够通过巯基-马来酰亚胺加成反应与DSPE-PEG2000-Mal连接，以合成DSPE-PEG2000-DGlu6。制备的不同Glu6修饰密度的脂质体主要由HSPC、胆固醇和不同投料比的DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-DGlu6自组装形成。荧光染料1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花菁,4-氯苯磺酸盐1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-Chlorobenzenesulfonate Salt，DiD)具有两个十八烷基“疏水尾”，可以结合到脂质双层中，常用于脂质体研究。因此，本案发明人将DiD包载到具有可调的Glu6修饰密度的脂质体中，以示踪其在体外和体内的递送。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其他适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅说明本发明而不用于限制发明的范围。
实施例1
1、DCys-DGlu6的合成
根据标准Fmoc合成策略(图1)合成DCys-DGlu6。简言之，将DCys-DGlu6的氨基酸依次共价连接至树脂，使用20％哌啶/DMF脱除Fmoc保护。连接完成后，在TFA溶液中孵育2.5h，除去树脂，收集滤液，加入冰乙醚沉淀滤液，以获得DCys-DGlu6粗肽。使用制备高效液相色谱(High performance liquid Chromatography，HPLC)进一步纯化粗肽，获得纯DCys-DGlu6，并通过HPLC和质谱(Mass Spectrometry，MS)鉴定合成的DCys-DGlu6。
将DGlu6的氨基端连接DCys，以引入游离巯基(-SH)，从而使DGlu6能够通过巯基-马来酰亚胺加成反应与DSPE-PEG2000-Mal缀合，以合成DSPE-PEG2000-DGlu6。根据标准Fmoc合成策略合成DCys-DGlu6。并通过HPLS/MS鉴定其是否成功合成。通过HPLC和液相质谱测定，证实了DCys-DGlu6的成功合成(图2)。
2、DSPE-PEG2000-DGlu6的合成
DSPE-PEG2000-DGlu6通过DSPE-PEG2000-Mal和DCys-DGlu6的巯基-马来酰亚胺加成反应(图3)而得。简言之，将DCys-DGlu6和DSPE-PEG2000-Mal(4:1，mol/mol)溶解于ACN/H2O(2:1，v/v)溶液，搅拌条件下，加入0.2M磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)(pH＝7.4)和6M盐酸胍溶液(pH＝7.0)，冲氮气置换氧气，在室温下氮气氛围下反应2h。将反应液转移至透析袋(MWCO：1000Da)中，在纯水中透析，以除去未反应的DCys-DGlu6多肽。将透析袋中反应产物DSPE-PEG2000-DGlu6进行冷冻干燥，即得。
通过基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪检测DSPE-PEG200-Mal和DSPE-PEG200-DGlu6的质/荷比。从图4可知，DSPE-PEG2000-Mal的质/荷比约为3158.3，DSPE-PEG2000-DGlu6的质荷比约为4053.1。二者的质/荷比的差值约为894.8，这与DCys-DGlu6的相对分子质量(895.3，图2B)一致，从而证实了DSPE-PEG2000-DGlu6的成功合成。
3、具有不同Glu6修饰密度脂质体的制备与表征
本发明中采用薄膜水化法制备具有不同Glu6修饰密度的脂质体。简言之，将脂质成分HSPC/胆固醇/DSPE-PEG2000/DSPE-PEG2000-DGlu6按摩尔比56.5：38.5：5-x：x(x代表DSPE-PEG2000-DGlu6的摩尔比)溶于氯仿/甲醇(3:1，v/v)，加入100mL的圆底烧瓶，置旋转蒸发仪上，真空条件下旋转蒸发30min，以形成磷脂薄膜。抽真空下过夜，除去残留有机溶剂。加入PBS溶液，于37℃水浴，旋转30min至薄膜水化脱落，得脂质体混悬液。将脂质体混悬液依次通过100nm和50nm聚碳酸酯膜在挤出器中进行挤出，以缩小其粒径，直至粒径达到100nm左右。当DSPE-PEG2000-Glu6的摩尔比为0、1、2、3、4、5时，将脂质体分别命名为Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip。制备脂质成分为HSPC/胆固醇(56.5:38.5，mol/mol)的非PEG化脂质体(nP-Lip)，作为可被巨噬细胞吞噬的阳性对照。
将含总脂质含量1mol％的DiD混入脂质成分，并溶于氯仿/甲醇(3:1，v/v)，按上述方法处理，即可制得DiD标记的脂质体。将制得的脂质体保存于4℃冰箱。
将Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip等脂质体分散于去离子水中，使用马尔文粒径仪测定其光散射粒径和zeta电位。
本发明的脂质体处方成分如下表1：
表1具有不同Glu6修饰密度的脂质体处方成分
Figure BDA0003719702790000091
本专利中所制备脂质体具有的可比较的粒径大小(图5B)和相同的脂质组分，从而确保了其药代动力学行为主要取决于其表面性质，即Glu6修饰密度。谷氨酸(Glu，e)的等电点为3.22，这意味着Glu6在中性pH下荷负电。如图5C所示，随着Glu6的修饰密度从0至5mol％的逐渐增加，脂质体的Zeta电位从-6.98至-29.13mV依次降低，说明有更多荷负电的Glu6修饰到脂质体表面。证明了不同Glu6修饰密度脂质体的制备成功。
实施例2
1、Glu6修饰密度对脂质体HA结合率的影响
取1mL DiD浓度为1.5μg/mL的Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip和5％e-Lip溶液，分别加入10mg HA。在37℃下磁力搅拌6h，5000g离心10min，收集沉淀，用PBS重悬，将其分别加入48孔板中，通过IVIS成像系统观察其荧光强弱。
使用酶标仪测定收集的上清液中荧光强度(DiD，激发/发射波长＝630/670nm)，根据标准曲线计算与HA结合前及结合后溶液中脂质体浓度，上清液中脂质体浓度的降低百分比对应于HA结合率，计算公式如下：
HA结合率(％)＝[(C结合前-C结合后)/C结合前]×100
其中C结合前表示初始脂质体浓度，而C结合后表示与HA结合后上清液中脂质体浓度。
图6结果证明了最高的Glu6修饰密度(5mol％)赋予脂质体最强的HA结合活性。
2、具有不同Glu6修饰密度脂质体的Raw264.7细胞摄取
将指数生长期的小鼠巨噬细胞系Raw264.7以2×105个细胞/孔的密度接种于12孔板，在培养箱中孵育12h。除去培养基，将已与胎牛血清(FBS)在37℃预孵育1h的DiD标记的Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip溶液用DMEM高糖培养基稀释10倍，分别加入12孔板中，孵育4h。除去培养基，PBS洗涤3次。将细胞混悬于1mL PBS中。使用流式细胞仪测量Raw264.7细胞对DiD标记的Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip的摄取。
将指数生长期的Raw264.7细胞以1×105个细胞/皿的密度接种于共聚焦培养皿中，在培养箱中培养12h，除去培养基。将已与FBS在37℃预孵育1h的DiD标记的Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip溶液用DMEM高糖培养基稀释10倍，分别加入共聚焦皿中。孵育4h，除去培养基，PBS洗涤3次。使用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次。加入DAPI染色2min，PBS冲洗3次。于激光共聚焦荧光显微镜下观察脂质体在Raw264.7的摄取。
图7结果表明高密度Glu6(4或5mol％)修饰由于可赋予脂质体表面高负电荷(分别为-21.47和-29.13mV)，从而可促进巨噬细胞对脂质体的吞噬。
3、脂质体的血清稳定性考察
参考文献报道方法进行脂质体血清稳定性考察。将Lip和nP-Lip溶于含50％FBS的PBS溶液中，脂质终浓度为100μg/mL，在37℃下孵育。于预设时间点，通过酶标仪在560nm处测定混悬液吸光度值，以考察脂质体聚集程度。
图8结果表明Lip的血液稳定性良好。
4、脂质体中DiD在血清中泄露性考察
为了考察脂质体包载的DiD在血液循环中的渗漏性，将载有DiD的脂质体溶解于100％FBS中(脂质体终浓度为100μg/mL)，在37℃下孵育，全程避光。分别在0、5、15及30min、1、2、4、8、12、24及48h，通过酶标仪测定DiD荧光强度(DiD，激发/发射波长＝630/670nm)。因为游离DiD在水溶液中几乎不发荧光，由此，可通过DiD荧光强度衰减情况判断其泄漏情况。
图9结果表明DiD泄漏少，可示踪脂质体体内递送。
5、具有不同Glu6修饰密度脂质体的药代动力学行为考察
为了考察具有不同Glu6修饰密度脂质体的药代动力学行为，将21只SD大鼠(200±20g)随机分为7组(n＝3)，分别尾静脉注射DiD标记的Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip。其中，DiD剂量为0.3mg/kg。于注射后的5、15及30min，1、2、4、10及24h，分别使用毛细管从大鼠眼底静脉丛取血约100μL，并分别加入预先使用抗凝剂润洗的1.5mL离心管中。3500rpm离心10min，收集上清血浆。移取20μL血浆，加入180μL含有0.1％TritonX-100的异丙醇溶液，混匀，超声10min。10000g离心10min，收集上清，使用酶标仪测量其荧光强度(DiD，激发/发射波长＝630/670nm)。根据标准曲线计算每个时间点的DiD浓度，绘制药时曲线，通过DAS 2.0软件以非隔室模型计算药动学参数。
图10结果表明高密度Glu6(4或5mol％)修饰削弱了脂质体血滞留。
6、具有不同Glu6修饰密度脂质体的体内生物分布
为了考察具有不同Glu6修饰密度脂质体的生物分布，将21只8周龄C57BL/6雌鼠随机分为7组(n＝3)，分别尾静脉注射Lip、1％e-Lip、2％e-Lip、3％e-Lip、4％e-Lip、5％e-Lip和nP-Lip。其中，DiD剂量为0.48mg/kg。24h后，将小鼠安乐死，收集其心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、双侧股骨/胫骨等主要器官。
将收集的器官用PBS洗涤，以除去粘附的血液，滤纸吸干水分，称重。将双股骨和双胫骨在液氮中冻存10min，然后将心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和冻存的双股骨和双胫骨分别放入1.5mL的离心管中，放入磁珠，加入1mL含有0.1％TritonX-100的异丙醇溶液。其中，肝脏因为体积较大，放在2个1.5mL的离心管中，共加入1.5mL含有0.1％TritonX-100的异丙醇溶液。使用组织匀浆机在60Hz功率下破碎120s，然后，将样品置于4℃冰箱，孵育过夜。10000g离心10min，收集上清，使用酶标仪(DiD，激发/发射波长＝630/670nm)测量荧光强度值。根据标准曲线计算DiD浓度，脂质体的生物分布表示为μg DiD/g组织。
将9只8周龄的C57BL/6雌鼠随机分为3组(n＝3)，分别尾静脉注射Lip、5％e-Lip和nP-Lip，其中，DiD剂量为0.48mg/kg。注射24h后，将小鼠安乐死，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、双侧股骨/胫骨。在IVIS活体成像系统下观察这些器官的荧光强度。
图11结果表明骨靶向脂质体在骨组织的分布随Glu6修饰密度增加而增强，且5％e-Lip具有最高的骨靶向活性。
6、5％e-Lip在肝和脾中常驻巨噬细胞的摄取考察
为了评估肝脏和脾脏中常驻巨噬细胞对5％e-Lip的吞噬作用，将9只8周龄的C57BL/6雌鼠随机分为3组(n＝3)，分别尾静脉注射Lip、5％e-Lip和nP-Lip。其中，DiD剂量为0.48mg/kg。在注射后24h，将小鼠安乐死，取出肝脏和脾脏。PBS洗涤以除去粘附的血液，进行组织脱水，O.C.T.包埋。通过冰冻切片机进行肝脏和脾脏切片，厚度为10μm。
冷冻切片免疫荧光染色步骤：
(1)冰冻切片固定：将冰冻切片从冰箱取出复温，晾干水分，4％多聚甲醛固定1h。待4％多聚甲醛完全干后，于PBS(pH＝7.4)中脱色，在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(2)抗体修复：将组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液中(pH＝6.0)，于微波炉内进行抗原修复。中火8min，停火8min，转中低火7min。自然冷却后将玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)画圈：切片甩干，用组化笔在组织周围画圈，以防止抗体流失。
(4)封闭：在圈内滴加血清孵育30min，进行封闭。
(5)孵一抗：轻轻甩去封闭液，在切片上滴加一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发。
(6)孵二抗：将玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
(7)DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
(8)封片：玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干，用抗荧光淬灭剂封片。
将切片于荧光显微镜下观察，采集图像，使用ImageJ软件计算皮尔逊相关系数。
图12结果表明5mol％酸性寡肽修饰密度可显著增强脂质体肝脾摄取。
7、5％e-Lip的生物相容性评价
取8周龄C57BL/6雌鼠的血液，置于抗凝剂润洗的1.5mL的离心管中；3500rpm离心10min，收集红细胞沉淀，PBS洗涤3次，直至离心后的上清液无色。分别取20μL红细胞沉淀，加入980μL去离子水(阳性对照)、PBS(阴性对照)、Lip(最终脂质浓度：0.6mg/mL)、低浓度5％e-Lip(最终脂质浓度：0.6mg/mL)和高浓度5％e-Lip(最终脂质浓度：1.8mg/mL)，37℃孵育2h。将混悬液以3500rpm离心5min，收集上清液。使用酶标仪在570nm处测量吸光度值，采用以下公式计算溶血率：
溶血率(％)＝[(ODtest-ODneg)/(ODpos-ODneg)]×100
其中ODtest、ODneg和ODpos分别代表脂质体样品、阴性和阳性对照的吸光度值。
使用数码相机对上清液进行拍照，以确定其颜色变化。将处理过的红细胞沉淀用PBS重悬，并在倒置相差显微镜下观察细胞形态。
图13结果表明5％e-Lip通过系统给药具有良好生物相容性。
综上所述，通过研究Glu6修饰密度对脂质体的HA结合能力、巨噬细胞吞噬作用、药代动力学行为和骨组织分布的影响，并试图筛选出最佳的Glu6修饰密度，以实现脂质体的最高骨靶向活性。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种酸性寡肽修饰的骨靶向脂质体，其特征在于，所述骨靶向脂质体的表面修饰有酸性寡肽，其修饰密度n为1～5，单位为摩尔比mol％。
2.根据权利要求1所述的骨靶向脂质体，其特征在于，所述酸性寡肽为D型Glu6。
3.一种制备如权利要求1～2任意一项所述的骨靶向脂质体的方法，其特征在于，包括将HSPC、胆固醇和不同投料比的DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-DGlu6溶解于有机溶剂，振摇均匀，真空旋转蒸发形成磷脂薄膜，抽真空过夜，加入PBS，水浴旋转至薄膜水化脱落，得到不同Glu6修饰密度的脂质体混悬液，再用带有聚碳酸酯膜的挤出器挤压获得粒径为100nm的骨靶向脂质体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿与甲醇以3:1的体积比混合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，HSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-DGlu6分别以以下摩尔比溶解：56.5：38.5：5-x：x，其中x表示DSPE-PEG2000-DGlu6的摩尔比，且x＝1、2、3、4、5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水浴温度为37℃，水浴时间为30min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将脂质体混悬液依次通过100nm和50nm聚碳酸酯膜在挤出器中进行挤出。
8.一种骨靶向脂质体药物，其特征在于，所述骨靶向脂质体药物包括权利要求1～2任意一项所述的骨靶向脂质体，以及包裹在所述骨靶向脂质体内的活性药物分子；
优选地，所述活性药物分子选自以下的至少其中之一：治疗骨质疏松、肿瘤骨转移、骨折愈合障碍、骨折、骨缺损修复、骨质增生以及异位骨化的药物。
9.如权利要求8所述的骨靶向脂质体药物在制备治疗骨病的药物中的应用；
优选地，所述骨病选自骨质疏松、肿瘤骨转移、骨折愈合障碍、骨折、骨缺损修复、骨质增生以及异位骨化。
10.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有权利要求8所述的骨靶向脂质体药物，所述药物制剂为液体制剂，所述液体制剂为注射剂。
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