CN115210259A - 抗ccr7抗体在与btk抑制剂和/或bcl2抑制剂的组合疗法中治疗血液恶性肿瘤的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新用途和方法，包括与CCR7受体结合的抗体或其抗原结合片段，作为与BTK抑制剂和/或Bcl‑2抑制剂的新组合疗法用于治疗过度增殖性血液恶性肿瘤，优选B细胞淋巴瘤，例如CLL。所述组合可用作一线治疗，或用于之前未使用BTK抑制剂和/或Bcl‑2抑制剂治疗的初始患者，或用于患有BTK抑制剂和/或Bcl‑2抑制剂难治性/复发性疾病的患者。所述抗体和抗原结合片段能够在离体或体外选择性耗竭表达CCR7的恶性细胞并且能够削弱/阻断所述肿瘤细胞向CCR7配体的迁移。这些效果与先前或目前使用BTK抑制剂和/或Bcl‑2抑制剂进行的治疗无关。同样，所述抗体的效果在患有复发性/难治性病症的患者中不受影响。公开了所述抗体作为单一疗法或作为与BTK抑制剂和/或Bcl‑2抑制剂的组合在耗竭、杀死和削弱/阻断表达CCR7细胞的肿瘤细胞的迁移和活化中的用途，因此提供了治疗过度增殖性血癌的替代疗法。
Description
发明领域
本发明一般涉及医学和药学领域，尤其涉及肿瘤学领域。
背景技术
过度增殖性病症的有效治疗是肿瘤学领域的一个持续目标。通常，癌症是由控制细胞分裂、分化和凋亡细胞死亡的正常过程的失调引起的，其特征在于恶性细胞的增殖，由于这种失调恶性细胞具有无限生长、局部扩散和全身转移的潜力，这可能包括信号转导途径的异常。
Bruton's酪氨酸激酶(BTK)是细胞质酪氨酸激酶Tec家族的成员，密切参与调节B系淋巴样细胞的存活、活化、增殖和分化等多种信号转导途径。BTK是多种抗凋亡信号转导分子和网络的上游激活物，包括转录5(STAT5)蛋白的信号转导物和激活物、磷脂酰肌醇(PI)3-激酶/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)途径靶标，及核因子kappa B(NF-κB)。此外，BTK通过其激酶和pleckstrin同源性(PH)结构域与死亡受体Fas相关联，并阻止Fas与具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)的相互作用，这对于在凋亡信号期间通过Fas的半胱天冬酶-8/FLICE募集和激活至关重要。这种通过BTK的削弱阻止了在Fas连接后促凋亡诱导死亡信号转导复合物(DISC)的组装。
BTK在B细胞前体(BCP)-急性淋巴细胞白血病(ALL，儿童和青少年最常见的癌症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的恶性细胞中大量表达。因此，BTK已成为治疗B系白血病和淋巴瘤的重要分子靶点。
临床上有许多BTK抑制剂。第一个获批的分子是依鲁替尼(ibrutinib)(在WO2008/039218中公开的1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮)。依鲁替尼目前用于治疗B细胞癌，如套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和
巨球蛋白血症。依鲁替尼被用作需要治疗和新诊断的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的一线治疗，也可用于复发CLL。依鲁替尼进一步用于治疗
巨球蛋白血症，并作为套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤和慢性移植物抗宿主病的二线治疗。最近，阿卡替尼(Acalabrutinib)已被FDA批准用于治疗套细胞淋巴瘤(www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-new-treatment-adults-ma ntle-cell-lymphoma)。
在包括CLL和MCL在内的各种淋巴瘤中均报告了对依鲁替尼的原发性(先天性)和继发性(获得性)耐药性(Kaur,2017,Ann Hematol.doi:10.1007/s00277-017-2973-2)。因此，各种专利出版物建议使用依鲁替尼作为与其它治疗方式的组合治疗的一部分(参见例如US2017239351、WO 2017/023815 A1、US 2018/0153892 A1、US2017360796、US2015105409、US 2017354655、US 2017224819和2016/0303130)。
B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)是一种位于线粒体外膜的抗凋亡蛋白，在促进细胞存活和抑制促凋亡蛋白的作用中发挥着重要作用。这种蛋白属于Bcl-2家族，该家族包括两组高度保守的蛋白(抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白)。这两组蛋白质之间的稳态平衡是细胞调节细胞死亡和细胞存活所必需的(Scheffold et al.,Recent Results Cancer Res.2018；212:215-242.doi:10.1007/978-3-319-91439-8_11；Moia et al.,Expert Rev Hematol.2018May；11(5):391-402.doi:10.1080/17474086.2018.1456332.)。
Bcl-2蛋白的上调已在多种血液恶性肿瘤中得到充分证明。例如，在CLL患者中，Bcl-2蛋白水平升高可能是Bcl-2基因启动子表观遗传失调的结果，或者主要是由于基因座13q14缺失。这个缺失的区域包括两个Bcl-2阻抑物，即microRNA 15a和16-1，其与基因的mRNA结合并抑制Bcl-2蛋白的翻译(Scheffold et al.,2018，同上；Moia et al.,2018，同上)。
在过去几年中，已经开发出靶向抗凋亡Bcl-2蛋白的新疗法。维奈托克(Venetoclax)(ABT-199)被FDA批准为具有17p缺失的CLL的二线治疗(Deeks,2016,Drugs.doi:10.1007/s40265-016-0596-x)。尽管在用维奈托克治疗的CLL患者中获得了有希望的结果(Moia et al.,2018，同上)，但一些研究报告了最终形成维奈托克耐药性。Zhaoet al.(Cancer Cell.2019；35(5):752-766.e9.doi:10.1016/j.ccell.2019.04.005)发现在维奈托克治疗期间，一些细胞群失去了含有Bcl-2基因的染色体18的区域，这有助于这些细胞群的存活。Tahir et al.(BMC Cancer.2017；17(1):399.doi:10.1186/s12885-017-3383-5.)和Chiron et al.(Oncotarget.2015；6(11):8750-9)在几个细胞系中独立鉴定了另一种基于抗凋亡MCL-1和BCL-XL蛋白的上调以及抗凋亡BAX、BIM和NOXA蛋白的下调的维奈托克耐药性的机制。在MCL病例中，通过增加凋亡阈值额外实现维奈托克耐药性。最后，Chiron et al.(2015；同上)还报道了病理细胞和基质之间的CD40-CD40L相互作用也可能通过有效激活介导BCL-XL上调的经典和替代NF-κB途径来规避维奈托克活性。
人CC基序受体7(在下文称作“CCR7”)是一种七个跨膜结构域的G蛋白偶联受体(GPCR)，最初发现其通过EBV感染以淋巴细胞选择性方式表达(Birkenbach et al.,1993,J.Virol.67:2209-2220)。CCR7选择性结合名为CCL19和CCL21的两种趋化因子。在内稳态和炎症中，CCR7在初始T和B淋巴细胞、中枢记忆T细胞(TCM)、天然杀伤细胞(NK细胞)的一些亚群、半成熟和成熟DC以及浆细胞样DC上表达(Forster R,et al,.Cell 1999；99:23–33.；Comerford I,et al.Cytokine Growth Factor Rev.2013Jun；24(3):269-83)。在这些白细胞亚群中，CCR7控制迁移、组构和激活。
Alfonso-Pérez et al.(J Leukoc Biol.2006Jun；79(6):1157-65)公开了抗人CCR7抗体介导针对CLL细胞的有效的补体依赖性细胞毒性(CDC)，同时保留来自相同患者的正常T淋巴细胞，并且所述抗体在应答CCR7的生理配体时阻断CLL细胞的体外迁移。因此，WO2007/003426公开了使用抗人CCR7抗体治疗表达CCR7受体的肿瘤，包括血液肿瘤，例如CLL和MCL。
Patrussi et al.(Cancer Res.2015Oct 1；75(19):4153-63)公开了依鲁替尼治疗CLL细胞导致表面CCR7显著下调，在此基础上预计不会将抗CCR7抗体与依鲁替尼组合以提高其治疗效果。
此外，De Rooij et al.(Blood,2012；119(11):2590-4)报告了原代CLL细胞进行的依鲁替尼治疗损害由CCR7激活介导的整联蛋白介导的粘附和/或迁移。因此可以设想的是，依鲁替尼会减少CLL和B细胞淋巴瘤细胞向产生其配体的次级淋巴器官(SLO)的归巢。也就是说，预计组合靶向CCR7的抗体与依鲁替尼不会改善对恶性细胞向SLO迁移的治疗抑制。此外，由于靶细胞表面CCR7的丧失，由抗体触发的靶细胞杀伤不太可能。
除了BTK抑制剂之外，B细胞恶性肿瘤(以及尤其是CLL)可以用B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白抑制剂治疗，Bcl-2蛋白是一种已知抑制细胞凋亡的致癌蛋白(Gentile et al.,Expert Opin Investig Drugs.2017；26(11):1307-1316)。长期以来，普遍认为在癌症中CCR7在T细胞免于凋亡的保护中发挥作用(Kim et al.,Clin Cancer Res.2005；11(21):7901-10)。此外，在这个研究中，通过多色流式细胞术进行的评估将这些细胞中较高水平的Bcl-2与较高的CCR7表达明显关联起来，并且CCR7的激活导致P3K/Akt的磷酸化和随后Bcl-2表达的增加。因此可以想象的是，通过用Bcl-2抑制剂治疗患者会降低CCR7诱导的抗凋亡作用，从而排除这些化合物与抗CCR7抗体的组合。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供克服现有技术方法的缺点的药物和治疗方法，用于预防和治疗血液恶性肿瘤，特别是B细胞恶性肿瘤，例如CLL。具体而言，本发明的一个目的是提高在这种B细胞恶性肿瘤中的存活率。
在第一方面，本发明涉及用于治疗过度增殖性血液病症的抗CCR7抗体，其中所述病症以下中的至少一种：a)用Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂和B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制剂中的至少一种治疗的病症；b)在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种治疗后复发的病症；及c)对于用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种进行的治疗难治的病症。在治疗中，抗CCR7抗体可以与BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种同时、分开或依次施用。根据本发明治疗的过度增殖性血液病症优选是其中过度增殖细胞是B细胞谱系的细胞的病症，其中所述病症更优选是B细胞血液恶性肿瘤，最优选是淋巴瘤或白血病。优选地，根据本发明治疗的血液恶性肿瘤是选自以下组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、高危CLL、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危SLL、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、
巨球蛋白血症(WM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特淋巴瘤(BL)、毛细胞白血病(HCL)、Richter转化和T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)。
用于根据本发明的治疗中的抗CCR7抗体的IC50优选不超过100nM，以通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体抑制CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少之一。所述抗CCR7抗体进一步优选抑制CCR7依赖性细胞内信号传导而没有显著的激动(agonistic)作用。用于根据本发明的治疗的优选抗-CCR7抗体对人CCR7的N-末端胞外结构域的Kd比参考抗-CCR7抗体的Kd高不超过20倍，其中所述参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。所述抗CCR7抗体优选是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。用于根据本发明的治疗的优选嵌合、人源化或人抗CCR7抗体是具有抗人CCR7抗体的HVR的抗体，所述抗人CCR7抗体的重链可变域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQID NO:2。
用于根据本发明的治疗的优选BTK抑制剂是依鲁替尼、泽布替尼(zanabrutinib)或阿卡替尼，而用于根据本发明的治疗的优选Bcl-2抑制剂是维奈托克或纳维托克(navitoclax)。
根据本发明治疗的过度增殖性血液病症优选地是未经治疗(treatment-
)的患者的病症，更优选所述过度增殖性血液病症是未接受过用BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种进行的治疗的患者的病症。
在一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症是这样的过度增殖性血液病症，其对用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂进行的治疗而言是难治的和/或在用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂治疗之后复发，其中所述化疗剂优选是氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、idelalisib、抗CD20抗体或抗CD52抗体中的一种或多种，其中所述抗CD20抗体优选为利妥昔单抗(rituximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinituzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)或奥法木单抗(ofatumumab)，其中所述抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗(alemtuzumab)。
在另一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症是这样的过度增殖性血液病症，其对用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种进行的治疗而言难治的和/或在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种治疗后复发。
发明描述
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本领域技术人员会认识到与本文所述的那些相似或等同的许多方法和材料，可以用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
为了本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括其复数指示物，除非上下文另有明确规定。例如，施用一种药物或一种药剂的方法包括施用多个分子(例如，10个、100个、1000个、1万个、10万个、百万个或更多个分子)以及多种药物或药剂。
如本文所用，术语“和/或”表示一种或多种所述的情况可以单独发生或与至少一种所述的情况组合地发生，直至所有所述的情况都发生。
如本文所用，“至少”一个特定值表示该特定值或更多。例如，“至少2”被理解为与“2或更多”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、...等。
如本文所用，“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长为特征。癌症也称为恶性肿瘤。
如本文所用，“组合”意指提供第一药物和另一(第二、第三)药物的所有施用形式。除非另有说明，这些药物可以同时、分开或依次以及以任何顺序施用。组合施用的药物在所述药物被递送到的个体中具有协调的生物活性。
如本文所用，“同时”施用是指同时施用超过一种药物，但不一定通过相同的施用途径或以一种组合制剂的形式施用。例如，一种药物可以口服提供，而另一种药物可以在患者去医院就诊期间静脉内提供。分开施用包括以分开的形式和/或在分开的时间点施用药物，但同样，不一定通过相同的施用途径。依次表示施用第一药物后立即或及时施用第二药物。
如本文所用，“包含”及其变化用语以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。其还涵盖更具限制性的“由…组成”。
如本文所用，可用于本公开的方法的“组合物”、“产品”或“组合”包括适用于各种施用途径的那些，包括但不限于静脉内、皮下、皮内、真皮下、节结内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、口服、经鼻腔、局部(包括含服和舌下)、经直肠、经阴道、气雾剂和/或肠胃外或粘膜应用。根据本公开或发明的组合物、制剂和产品通常包含药物(单独或组合)和一种或多种合适的药学可接受的赋形剂。
如本文所用，“有效量”是指相对于未治疗的患者而言改善疾病症状所需的药剂的量。用于实践本发明以治疗性处置癌症的活性剂的有效量取决于施用方式、个体的年龄、体重和一般健康状况。最终，主治医师或兽医会决定适当的量和给药方案。这样的量被称为“有效”量。因此，在本公开内容的语境中，与对疾病或病症“有效”的药物的施用有关，表示以临床上适当的方式施用对于至少有统计学意义的部分患者产生有益效果，例如症状的改善、治愈、减少至少一种疾病体征或症状、延长生命、提高生活质量或通常被熟悉治疗特定类型疾病或病症的医生认为是积极的其它效果。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，且特别涵盖例如单一抗CCR7单克隆抗体，包括拮抗剂，中和抗体，全长或完整单克隆抗体，具有多表位特异性的抗CCR7抗体组合物，多克隆抗体，多价抗体，单链抗CCR7抗体和抗CCR7抗体的片段(见下文)，包括Fab、Fab’、F(ab)’2和Fv片段、diabody、单结构域抗体(sdAb)，只要其表现出所需生物学和/或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。抗体可以是人的和/或人源化的。
术语“抗CCR7抗体”或“结合CCR7的抗体”是指能以足够的亲和性结合CCR7的抗体，使得所述抗体可用作靶向CCR7的诊断和/或治疗剂。优选地，抗CCR7抗体与不相关的非CCR7蛋白的结合程度比抗体与CCR7结合程度低约10％，如通过放射免疫测定(RIA)或ELISA所测量。在某些实施方案中，结合CCR7的抗体具有≤1mM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CCR7抗体结合在不同物种的CCR7中保守的CCR7表位。本文中应进一步理解，如本文所用的术语“抗CCR7抗体”包括结合CCR7的抗体片段。
“分离的抗体”是已经鉴别且与其天然环境的组分分离和/从其天然环境的组分回收的抗体。
基本的4链抗体单元是一种异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成(IgM抗体由5个基本的异源四聚体单元以及称为J链的额外的多肽组成，及因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成多价组件，其包含2-5个伴随J链的基本的4链单元)。在IgG的情况中，4链单元通常为约150,000Daltons。每个L链通过共价二硫键与H链连接，而取决于H链的同种型，两个H链通过一个或多个二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫键桥。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后是针对每个α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及针对μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。将VL与VH对齐，且将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。相信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，见例如Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr andTristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,page 71and Chapter 6。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链归属于两种明显不同类型之一，称为κ和λ。根据其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归属于不同类别或同种型。现有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其重链分别称作α、δ、ε、γ和μ。γ和α类别基于CH序列和功能的相对较小差异进一步分为亚类，例如人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分，及包含抗原结合位点。
术语“可变的”是指可变结构域的某些节段在抗体序列中有很大差异的事实。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，所述可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上并不是均匀分布的。相反，V区由15-33个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的序列片段组成，其由长度为7-25个氨基酸的称为“高变区”(HVR)的具有极度可变性的较短区域分隔。各个天然重链和轻链的可变结构域包含四个FR，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，形成环状连接，且在某些情况中形成β-折叠结构的部分。每个链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并与来自另一个链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但呈现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
用于本发明目的的“裸抗体”是未与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；diabody；线性抗体(见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点及因此保留结合抗原的能力。
Fc片段包含由二硫键连接在一起的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区域也是在某些类型细胞上发现的由Fc受体(FcR)识别的部分。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的天然发生的突变之外，这个群体包含的各个抗体是相同的。与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。单克隆抗体的优势在于其可以不被其它抗体污染而合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述技术。
本文所述单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一个物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其呈现出希望的生物活性(参见美国专利号4,816,567；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化的”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体，其包含最少的源自非人抗体的序列。在大多数情况中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被具有所需抗体特异性、亲和性和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基(供体抗体)置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的一些构架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体包含两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，以及所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc的至少一部分。进一步的详细描述见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也见于如下文献综述及其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.,1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions,23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.,5:428-433(1994)。
术语“高变区”、“HVR”在本文中使用时是指抗体可变结构域的区域，其在序列中是高变的和/或形成负责抗原结合的结构上确定的环。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1、H2、H3)和三个在VL中(L1、L2、L3)。许多高变区描绘在使用中并且包含在本文中。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如当根据Kabat编号系统编号时，在VL中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的大约残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如根据Chothia编号系统编号时，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，及VH中的残基26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如当根据IMGT编号系统编号时，VL中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)及VH中的残基27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc,M.P.et al.Nucl.AcidsRes.27:209-212(1999),Ruiz,M.et al.Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。任选地，当根据Honneger,A.and Plunkthun,A.J.(Mol.Biol.309:657-670(2001))编号时，抗体在如以下一或多点具有对称插入：在VL中的28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)及在VH中的28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)。本发明抗体的高变区/CDR优选根据IMGT编号系统定义和编号。
“构架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“阻断”抗体或“拮抗”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
如本文所用，“激动抗体”是模拟感兴趣的多肽的至少一种功能活性的抗体。
“结合亲和性”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配对体(例如抗原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和性”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和性。分子X对其配对体Y的亲和性通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和性可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些方法。低亲和性抗体通常与抗原结合缓慢且倾向于易于解离，而高亲和性抗体通常与抗原结合更快且倾向于保持更长时间结合。本领域已知多种测量结合亲和性的方法，其中任何一种均可用于本发明的目的。具体的示例实施方案在下文描述。
“Kd”或“Kd值”可以通过使用表面等离子共振测定法，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃用固定的抗原CM5芯片在～10-50个共振单位(RU)进行测量。简而言之，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)根据供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。在以5μl/min的流速注射前，将抗原用10mM醋酸钠(pH4.8)稀释为5μg/ml(～0.2μM)，以获得大约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/min流速在具有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中注射抗体或Fab的两倍系列稀释液(0.78nM-500nM)。缔合率(kon)和解离率(koff)是使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)通过同时拟合缔合和解离传感图计算的。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比率。见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J.Mol Biol 293:865-881。如果通过上述表面等离子体共振测定法的结合率超过106M-1S-1，则可以使用荧光猝灭技术确定结合率，其测量在PBS、pH7.2中20nM的抗抗原抗体(Fab形式)在25℃在存在增加浓度的抗原的条件下的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在在分光计中例如配备截流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌红色比色皿的8000-系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量。
根据本发明的“结合率”或“缔合的比率”或“缔合比率”或“kon”也可以用上述相同的表面等离子体共振技术使用上述BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)确定。
“结合”感兴趣抗原例如多肽CCR7抗原靶标的抗体，是一种以足够亲和性结合抗原的抗体，由此所述抗体在靶向表达所述抗原的细胞或组织中可用作治疗剂，且与其它蛋白质不发生明显交叉反应。在这种实施方案中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)所确定，抗体与“非靶”蛋白的结合程度比抗体与其特定靶蛋白的结合低大约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位是指与非特异性相互作用相比可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过确定分子的结合相比于对照分子的结合进行测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与对照分子竞争而确定，所述对照分子与靶标相似，例如过量的未标记靶标。在这种情况中，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以例如通过分子对于靶的Kd呈现(其可以如上所述确定)，所述Kd为至少约10-4M、或者至少约10-5M、或者至少约10-6M、或者至少约10-7M、或者至少约10-8M、或者至少约10-9M、或者至少约10-10M、或者至少约10-11M、或者至少约10-12M、或更大。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指这样的结合，其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，且其随着抗体同种型而变化。示例的抗体效应子功能包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为是从Cys226位的氨基酸残基或Pro230位的氨基酸残基至其羧基末端的段。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的第447位残基)可以例如在抗体的生产或纯化期间被去除，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸被去除。因此，完整抗体的组分可以包含去除所有K447残基的抗体群、没有去除K447残基的抗体群，以及具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。这种效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用例如在本文的定义中所公开的各种测定法进行评估。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合使得这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括示于Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于这种测定的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地或额外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在如Clyneset al.(USA)95:652-656(1998)中揭示的动物模型中评估。WO 2000/42072(Presta)描述了与FcR结合增强或减弱的抗体变体。也见例如Shields et al.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)所述。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR及执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII及执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的示例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源例如从血液中分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一个成分(C1q)与结合其同源抗原的(适当亚类的)抗体结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro et al.(1996,J.Immunol.Methods 202:163)所述。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的抗体)和增加或降低的C1q结合能力的抗体变体在例如美国专利No.6,194,551B1和WO 1999/51642中描述。也见例如Idusogie et al.(2000,J.Immunol.164:4178-4184)所述。增加C1q结合并从而增加CDC活性的一种这样的取代是E333A取代，其可有利地应用于本发明的抗体中。
“序列相同性”在本文中定义为通过序列对比确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还指氨基酸序列或核酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，通过这种序列串之间的匹配确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二多肽的序列进行对比而确定的。“相同性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算。术语“序列相同性”或“序列相似性”是指当两个(多)肽或两个核苷酸序列最佳比对时，优选是在整个长度上(至少是对比中最短的序列)及使匹配数最大化及缺口数最小化，例如通过使用默认参数的程序ClustalW(1.83)、GAP或BESTFIT，其共享至少一定百分比的序列相同性，如本文别处所定义。GAP使用Needleman和Wunsch整体比对算法在两个序列的整个长度上比对，最大化匹配数及最小化缺口数。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，并且缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，且对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。比对本发明的蛋白质序列的优选多重比对程序是ClustalW(1.83)，使用blosum矩阵和默认设置(缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05)。序列比对和序列相同性百分比评分可以使用计算机程序确定，例如得自Accelrys Inc.,9685ScrantonRoad,San Diego,CA 92121-3752 USA的GCG Wisconsin Package，Version 10.3，或使用开源软件，例如EmbossWIN version 2.10.0中的程序“needle”(使用整体Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述针对GAP相同的参数，或使用默认设置(对于“needle”和“water”以及对于蛋白质和DNA比对，默认的缺口开放罚分均是10.0，且默认缺口延伸罚分均是0.5；默认评分矩阵对于蛋白质是Blossum62及对于DNA是DNAFull)。当序列具有明显不同的总长度时，优选局部比对，例如使用Smith Waterman算法的那些比对法。或者，可以通过搜索公共数据库，使用如FASTA、BLAST等算法确定相似性或相同性百分比。
发明详述
本发明是基于出人意料的发现，即与先前报道的BTK抑制剂例如依鲁替尼能够下调或诱导慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞中CCR7受体的完全丧失(因此排除了在这类患者中使用抗CCR7抗体)相反，本发明人研究了一个大队列CLL样品，发现用依鲁替尼治疗和未治疗的CLL患者之间的CCR7表达水平没有(或只有轻微)差异。此外，与未治疗的对照患者相比，难治/复发患者的CCR7表达水平相似或甚至更高。此外，本发明人出人意料地发现BTK抑制剂仅示出轻微减少CLL细胞中CCR7迁移，而抗CCR7抗体完全阻断了这个过程。最后，他们发现使用抗CCR7抗体有效杀死来自接受BTK抑制剂治疗的患者和来自BTK抑制剂复发/难治性病症患者的CLL细胞。
在相同的CLL患者队列中，本发明人观察到在用Bcl-2抑制剂如维奈托克治疗后CLL患者中CCR7表达被保持，并证实这些患者中的抗CCR7体外治疗导致CCR7功能的抑制并诱导靶细胞杀伤。
这开辟了使用针对CCR7的单克隆抗体(mAb)，即识别CCR7受体中的表位并且优选能够抑制CCR7依赖性细胞内信号传导以及能够在体内杀死和/或阻断CCR7+肿瘤细胞的迁移、活化、增殖和/或传播的抗体，用于与BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中至少一种组合治疗CLL和其它过度增殖性血液病症以及用于治疗使用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种治疗后复发的或对这种治疗变为难治的这种病症的可能性。
因此，第一方面，本发明涉及抗CCR7抗体，其用于治疗过度增殖性血液病症。所述过度增殖性血液病症优选为以下中的至少一种：a)用Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂治疗的病症；b)用B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制剂治疗的病症；c)用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂组合治疗的病症；d)在用BTK抑制剂治疗后复发的病症；e)在用Bcl-2抑制剂治疗后复发的病症；f)在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂组合治疗后复发的病症；g)对于用BTK抑制剂进行的治疗难治的病症；h)对于用Bcl-2抑制剂进行的治疗难治的病症；和i)对于用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂进行的组合治疗难治的病症。
因此，在一个实施方案中，所述过度增殖性血液病症用BTK抑制剂和抗CCR7抗体组合治疗。在另一个实施方案中，所述过度增殖性血液病症用Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体组合治疗。在另一个实施方案中，所述过度增殖性血液病症用BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体组合治疗。在所述治疗中，所述抗CCR7抗体可以与所述BTK抑制剂和/或所述Bcl-2抑制剂同时、分开或依次施用。
根据本发明治疗的过度增殖性血液病症是“个体”或“患者”中的病症，其中这些术语“个体”或“患者”是指归类为哺乳动物的所有动物并且包括但不限于灵长类动物和人类。待治疗的个体优选是男性或女性人类，并且可以是任何年龄或种族。个体或患者的治疗包括一线或二线或三线治疗。
如本文所用的术语“组合”被理解为是指组合疗法(与单一疗法相反)，其中治疗包括使用或施用抗CCR7抗体以及使用或施用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种。因此，在根据本发明的组合疗法中，组合的组分可以同时、分开或依次施用。因此可以将组合的组分配制成单一组合物，或者可以将所述组分配制在至少两个单独的制剂中。所述组合可以是单一产品，包括单一组合物或包括配制在至少两个单独制剂中的组分。或者，所述组合可以是来自一个或多于一个供给者的至少两种不同的产品。
在一些实施方案中，根据本发明，优选用抗CCR7抗体与BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种的组合治疗的过度增殖性血液病症是未经治疗的患者，例如先前未接受治疗或至少先前未接受化学治疗的患者的病症，其中化学治疗具有如下定义的广泛含义。更优选地，未经治疗的患者是在组合施用抗CCR7抗体与BTK抑制剂的情况下未接受过用Bcl-2抑制剂进行的先前治疗的患者，或者是在组合施用抗CCR7抗体与Bcl-2抑制剂的情况下未接受过用BTK抑制剂进行的先前治疗的患者。因此，“未接受过先前治疗”在本文中应理解为个体在开始相应的组合治疗之前没有接受过用相应的抑制剂进行的治疗。用抗CCR7抗体与BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种组合治疗未经治疗的患者可降低患者对所述治疗的一种组分变为难治性和复发的风险。
在一些实施方案中，根据本发明、优选用抗CCR7抗体与BTK-抑制剂和Bcl-2-抑制剂中的至少一种组合治疗的过度增殖性血液病症，是至少未经BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种治疗的患者。然而，至少未经BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种治疗的患者可以是对用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种之外的化疗剂进行的治疗而言难治的和/或在用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种之外的化疗剂治疗后复发的患者。
因此，在一些实施方案中，所述患者是对用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种之外的化疗剂进行的治疗而言难治的和/或在用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种之外的化疗剂治疗后复发。在本文中应理解，术语“其它化疗剂”具有广泛的含义，其包括生物治疗剂，例如抗体和其它蛋白质、反义分子、基因治疗载体和细胞治疗。
在一些实施方案中，“其它化疗剂”选自：有丝分裂抑制剂，烷化剂，抗代谢物，蒽环类，长春花生物碱，植物生物碱，氮芥，蛋白酶体抑制剂，嵌入抗生素(intercalatingantibiotics)，生长因子抑制剂，细胞周期抑制剂，生物反应调节剂，抗激素，血管生成抑制剂，抗雄激素，DNA相互作用剂，嘌呤类似物，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，微管蛋白相互作用剂，激素药剂，胸苷酸合成酶抑制剂，非BTK酪氨酸激酶抑制剂，P13K-δ酪氨酸激酶抑制剂，EGF抑制剂，VEGF抑制剂，CDK抑制剂，SRC抑制剂，c-Kit抑制剂，Her1/2抑制剂，myc抑制剂，抗肿瘤抗体，针对生长因子受体的单克隆抗体，蛋白激酶调节剂，放射性同位素，免疫疗法，糖皮质激素及其组合。
在一些实施方案中，“其它化疗剂”是选自以下中的抗癌剂：DNA相互作用剂，例如顺铂或多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂，例如依托泊苷；拓扑异构酶I抑制剂，例如CPT-11或拓扑替康(topotecan)；天然存在的或合成的微管蛋白相互作用剂，例如紫杉醇、多西他赛(docetaxel)或埃博霉素(epothilones)(例如伊沙匹隆(ixabepilone))；激素药剂，例如他莫昔芬(tamoxifen)；胸苷酸合酶抑制剂，例如5-氟尿嘧啶；和抗代谢物，例如甲氨蝶呤；其它酪氨酸激酶抑制剂，例如易瑞沙(Iressa)和OSI-774；血管生成抑制剂，EGF抑制剂；VEGF抑制剂；CDK抑制剂；SRC抑制剂；c-Kit抑制剂；Her1/2抑制剂和针对生长因子受体的单克隆抗体，例如爱必妥(erbitux)(EGF)和赫赛汀(herceptin)(Her2)；其它蛋白激酶调节剂及其组合。可用于本发明方法的其它抗癌剂为肿瘤学领域的技术人员所已知。
在一些实施方案中，“其它化疗剂”选自：蛋白酶体抑制剂，硼替佐米(Bortezomib)
卡非佐米(Carfilzomib)(PR-171)，PR-047，双硫仑，乳胞素，PS-519，eponemycin，阿克拉霉素(aclacinomycin)，CEP-1612，MG-132，CVT-63417，(-)-7-methylomuralide，(+/-)-7-methylomuralide，PS-341，乙烯基砜三肽抑制剂，利托那韦(ritoavir)，PI-083，来那度胺(lenalidomide)及其组合。
在一些实施方案中，“其它化疗剂”是化疗剂的组合，例如“CHOP”(一种组合，其包括(i)环磷酰胺类，例如环磷酰胺(cytoxan)，(ii)多柔比星或其它拓扑异构酶II抑制剂例如阿霉素，(iii)长春新碱(vincristine)或其它长春花生物碱类(vincas)例如长春碱(oncovin)；和(iv)类固醇，例如氢化可的松或泼尼松龙)；“R-CHOP”(包括利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松的组合)；“ICE”(包括异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷的组合)；“R-ICE”(包括利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷的组合)；“R-ACVBP”(利妥昔单抗、多柔比星、环磷酰胺、长春地辛(vindesine)、博来霉素和泼尼松的组合)；“DA-EPOCH-R”(剂量调整后的依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松和利妥昔单抗的组合)；“R-苯达莫司汀”(苯达莫司汀(bendamustine)和利妥昔单抗的组合)；“GemOx或R-GemOx”(森西他滨(semcitabine)和奥沙利铂(oxaliplatin)的组合，有或无利妥昔单抗)；和“DHAP”(包括地塞米松、阿糖胞苷和顺铂的组合)。
在一个优选的实施方案中，“其它化疗剂”是氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、idelalisib、抗CD20抗体、抗CD52抗体或其组合，其中所述抗CD20抗体优选是利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或奥法木单抗，其中所述抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗。
在本发明的另一个实施方案中，过度增殖性血液病症对用BTK抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用BTK抑制剂治疗后复发，其中所述BTK抑制剂优选如下文所定义。如本文所示例的，过度增殖性血液病症可能对用BTK抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用BTK抑制剂治疗后复发，所述BTK抑制剂是例如依鲁替尼、阿卡替尼和泽布替尼。根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，当BTK抑制剂用作治疗所述病症的唯一药剂(即用作单一治疗)时，所述病症对用所述BTK抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用所述抑制剂治疗复发。或者，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，当BTK抑制剂与另一种化疗剂组合使用(即用作组合治疗)时，所述病症对用所述BTK抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用所述抑制剂治疗后复发。所述其它化疗剂可以是如上文定义的“其它化疗剂”。在优选的实施方案中，“其它化疗剂”是氟达拉滨、环磷酰胺、idelalisib、抗CD20抗体或抗CD52抗体中的一种或多种，其中所述抗CD20抗体优选是利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或奥法木单抗，其中抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗。在另一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，其对于连续治疗而言是难治的和/或在连续治疗后复发，每次治疗用不同的化疗剂或其组合并且其中所述治疗之一包括使用BTK抑制剂(在单一或组合治疗中)。在该实施方案中，所述不同的化疗剂或其组合可以是如上文定义的“其它化疗剂”。
在本发明的又一实施方案中，所述过度增殖性血液病症对用Bcl-2抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用Bcl-2抑制剂治疗后复发，其中所述Bcl-2抑制剂优选如下文所定义。如本文所示例的，过度增殖性血液病症可能对用Bcl-2抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用Bcl-2抑制剂治疗后复发，所述Bcl-2抑制剂例如是维奈托克。根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以这样的病症，当Bcl-2抑制剂用作治疗所述病症的唯一药剂(即用作单一治疗)时，所述病症对用所述Bcl-2抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用所述Bcl-2抑制剂治疗后复发。或者，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，当Bcl-2抑制剂与另一种化疗剂组合使用(即用作组合治疗)时，所述病症对用所述Bcl-2抑制剂进行的治疗而言是难治的和/或在用所述Bcl-2抑制剂治疗后复发。所述其它化疗剂可以是如上文定义的“其它化疗剂”。在优选的实施方案中，“其它化疗剂”是氟达拉滨、环磷酰胺、依鲁替尼、idelalisib、抗CD20抗体或抗CD52抗体中的一种或多种，其中所述抗CD20抗体优选是利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或奥法木单抗，其中所述抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗。在另一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，其对于连续治疗而言是难治的和/或在连续治疗后复发，每次治疗用不同的化疗剂或其组合并且其中所述治疗之一包括使用Bcl-2抑制剂(在单一或组合治疗中)。在该实施方案中，所述不同的化疗剂或其组合可以是如上文定义的“其它化疗剂”。
在本发明的另一个实施方案中，所述过度增殖性血液病症对用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合进行的治疗而言是难治的和/或在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合治疗后复发，其中所述BTK抑制剂和所述Bcl-2抑制剂优选如下文所定义。如本文所示例，过度增殖性血液病症可能对用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合治疗而言是难治的和/或在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂组合治疗后复发，所述BTK抑制剂例如是依鲁替尼、阿卡替尼和泽布替尼，所述Bcl-2抑制剂例如是维奈托克。根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，当用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合用作治疗所述病症的唯一组合(即在治疗中未使用其它药物)时，所述病症对用这些抑制剂的组合进行的治疗而言是难治的和/或在用这些抑制剂的组合治疗后复发。或者，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，当BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂与另一种化疗剂组合使用(即用作组合治疗)时，所述病症对用所述BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合进行的治疗而言是难治的和/或在所述BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合治疗后复发。所述其它化疗剂可以是如上文定义的“其它化疗剂”。在优选的实施方案中，“其它化疗剂”是氟达拉滨、环磷酰胺、idelalisib、抗CD20抗体或抗CD52抗体中的一种或多种，其中所述抗CD20抗体优选是利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或奥法木单抗，其中所述抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗。在另一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症可以是这样的病症，其对连续治疗而言是难治的和/或在连续治疗后复发，每次治疗用不同的化疗剂或其组合并且其中所述治疗之一包括使用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的组合(本身或与另一种化疗剂组合)。在该实施方案中，不同的化疗剂或其组合可以是如上文定义的“其它化疗剂”。
根据本发明治疗的过度增殖性血液病症是其中过度增殖细胞优选表达CCR7受体的病症。特别是当抗CCR7抗体至少与BTK抑制剂同时、分开或依次施用时，所述过度增殖细胞优选表达Bruton酪氨酸激酶。特别是当抗CCR7抗体至少与Bcl-2抑制剂同时、分开或依次施用时，所述过度增殖细胞优选表达B细胞淋巴瘤2蛋白。在一些实施方案中，所述过度增殖细胞表达或过表达CD20和CD52中的至少一种。在另一个实施方案中，所述过度增殖细胞已经失去或减少了至少CD20的表达，因为在一些患者中，所述过度增殖细胞上的CD20表达在BTK治疗后下调，而CCR7仍然表达。
在一个实施方案中，根据本发明治疗的过度增殖性血液病症是其中所述过度增殖细胞是B细胞谱系的细胞的病症。在一些实施方案中，与过度B细胞增殖相关的病症是癌症。在一些实施方案中，所述病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是B细胞血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，所述B细胞血液恶性肿瘤是淋巴瘤或白血病。
在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤选自：急性淋巴细胞性白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，急性单核细胞性白血病(AMoL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，高危CLL，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，高危SLL，多发性骨髓瘤(MM)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FL)，
巨球蛋白血症(WM)，弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)，边缘区淋巴瘤(MZL)，伯基特淋巴瘤(BL)，毛细胞白血病(HCL)，Richter转化和T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)。
在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FL)，弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)，边缘区淋巴瘤(MZL)和T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)。
在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤选自：伯基特淋巴瘤，非伯基特高级别B细胞淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)，免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，前B淋巴母细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞性淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，浆细胞瘤，纵隔(胸腺)大B细胞性淋巴瘤，血管内大B细胞性淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤和淋巴瘤样肉芽肿。
抗-CCR7抗体
用于本发明的抗CCR7抗体或其抗原结合片段可以是特异性结合CCR7的任何抗原结合蛋白。结合CCR7的本发明的抗原结合蛋白优选是上文定义的最广义的抗CCR7抗体，包括例如抗CCR7抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体。本发明的抗CCR7抗体优选是分离的抗体。优选地，本发明的抗CCR7抗体结合灵长类动物CCR7，更优选结合人CCR7。人CCR7的参考氨基酸序列是例如NP_001288643、NP_001288645、NP_001288646、NP_001288647、NP_001829、NP_001288642和NP_031745。这个序列的氨基酸1-24包含膜易位信号肽，其在表达期间被切割掉。人CCR7的氨基酸25-59构成N末端胞外结构域，这个结构域在Y32和Y41位包含硫酸化酪氨酸残基。已知与上述参考序列相比具有一个或多个氨基酸取代的人CCR7的各种等位基因变体。本发明中的“人CCR7”包括这些等位基因变体，至少具有胞外结构域和CCR7功能的变体范围。用于本发明的抗CCR7抗体优选特异性结合CCR7(优选人CCR7)的N-末端胞外结构域。
用于本发明的抗CCR7抗体优选是中和抗体，其通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体抑制CCR7依赖性胞内信号传导、CCR7依赖性功能和/或CCR7受体内在化。抗CCR7抗体优选对于通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体抑制CCR7依赖性胞内信号传导和/或CCR7受体内在化具有不高于150、100、80、50、30、25、20、15、10、5或3nM的IC50，例如可以在如本发明实施例所述的测定中确定的。可选地，抗体的最大IC50是参照在相同测定中测试时参考抗CCR7抗体的IC50来定义的。因此，优选本发明的抗CCR7抗体具有的IC50比参考抗CCR7抗体的IC50高出不超过10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，其中参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
本发明的抗CCR7抗体优选抑制如上所述的CCR7依赖性胞内信号传导CCR7，而没有显著的激动作用，更优选地没有可检测的激动作用，例如可以在如本文实施例中所述的测定中确定的。
用于本发明的抗CCR7抗体优选对CCR7(优选人CCR7)的N-末端胞外结构域具有最小亲和性。抗体的最小亲和性在本文中优选参照在相同测定中测试时参考抗CCR7抗体的Kd来定义。因此，优选本发明的抗CCR7抗体对于人CCR7的N末端胞外结构域具有的Kd比参考抗CCR7抗体对于人CCR7的N末端胞外结构域的Kd高出不超过100、50、20、10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，其中参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列是SEQID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。在本文中应理解，其Kd与参考Kd相比高出不超过10倍的抗体是其亲和性与参考抗体的亲和性相比低不少于10倍的抗体。因此，如果参考抗体具有的Kd为1×10-9M，则所讨论的抗体的Kd为1×10-8M或更低。
具有一种或多种上述定义的特征及适用于本发明的抗CCR7抗体的实例包括例如US 8,865,170、WO 2009/139853、US 20150344580(WO2013184200),US2016031997,US2017342155(WO 2014/151834)和US 2018237529(WO 2017/025569)中描述的单克隆抗体，所有这些均通过引用并入本文。
用于本发明的优选抗CCR7抗体是特异性结合包含氨基酸序列“ZxLFE”或由氨基酸序列“ZxLFE”组成的表位的抗体，其中Z是硫酸化酪氨酸，且x可以是任何氨基酸，且F可以是被疏水氨基酸置换。因此，本发明的抗体优选特异性结合在人CCR7的N-末端胞外结构域中的第41-45位包含氨基酸序列“ZTLFE”或由氨基酸序列“ZTLFE”组成的表位。所述抗体优选特异于人CCR7。这种优选的抗CCR7抗体优选对于人CCR7或对包含“ZTLFE”表位的合成抗原、优选对如本文实施例中所述的合成抗原SYM1899至少具有最小亲和性。因此，优选地，抗CCR7抗体具有的Kd为1×10-8M、5×10-9M、2×10-9M、1.8×10-9M、1×10-9M、1×10-10M或1×10-11M或更小，优选对于合成抗原SYM1899。可选地，抗体的最小亲和性参照在相同测定中测试时参考抗CCR7抗体的Kd来定义。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体具有的对于人CCR7或包含“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实施例中所述的合成抗原SYM1899)的Kd，比参考抗CCR7抗体对抗原的Kd高出不超过10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，其中参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。在本文中应理解，其Kd比参考Kd高出不超过10倍的抗体是其亲和性比参考抗体的亲和性低不少于10倍的抗体。因此，如果参考抗体的Kd为1×10-9M，则所讨论的抗体的Kd为1×10-8M或更小。
用于本发明的抗CCR7抗体优选以具有最大上限的koff率常数结合人CCR7或包含“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实施例中所述的合成抗原SYM1899；SEQ ID NO:3)。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体具有1×10-3、1×10-4或1×10-5s-1或更小的koff率常数。可选地，抗体的最大koff率常数通过参照在相同测定中测试时参考抗CCR7抗体的koff率常数来定义。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体结合人CCR7或包含“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实施例中所述的合成抗原SYM1899)，其koff率常数比参考抗CCR7抗体对抗原的koff率常数高出不超过10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，其中参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQID NO:2。
用于本发明的一种这样的优选抗体是具有参考小鼠抗人CCR7抗体的HVR的抗体，所述参考小鼠抗人CCR7抗体的重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其HVR如在US2018237529中定义，所述专利通过引用并入本文。
用于本发明的抗CCR7抗体可以是嵌合抗体，例如小鼠-人抗体。然而，优选所述抗体是人源化抗体或人抗体。
用于本发明的人源化抗体优选在施用该抗体的个体中引起针对该抗体的很少或没有免疫原性应答。例如，用于本发明的人源化抗体在宿主个体中引发和/或预期引发与原始小鼠抗体相比明显降低水平的人抗小鼠抗体应答(HAMA)，所述原始小鼠抗体例如包含SEQ ID NO:1和2的序列。优选地，人源化抗体引发和/或预期引发最小人抗小鼠抗体应答(HAMA)或不引发和/或预期不引发人抗小鼠抗体应答(HAMA)。最优选地，本发明的抗体引发处于或低于临床可接受水平的抗小鼠抗体应答。
可以基本上按照Winter及同事所述方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过将高变区序列取代为人抗体的相应序列进行人源化。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些构架区(FR)残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。用于产生人源化抗体的轻链和重链人可变结构域的选择对于降低保持对抗原的特异性和亲和性的免疫原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。与啮齿动物序列最接近的人序列随后被接受为人源化抗体的人构架区(FR)(Suns et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol,196:901(1987))。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))。
更重要的是抗体是人源化的，其保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，根据优选方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程来制备人源化抗体。根据上述任一本发明实施方案，人源化抗CCR7抗体优选包含重链恒定区，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区。根据上述任一本发明实施方案的人源化抗CCR7抗体，优选包含具有至少一种效应子功能的功能性Fc区，所述效应子功能选自：C1q结合、补体依赖性细胞毒性；Fc区结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用。
用于本发明的优选人源化抗体是这样的抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，如例如US2018237529中所述。用于本发明的更优选的人源化抗体是这样的抗体，其重链可变域的氨基酸序列为SEQID NO:4，其轻链可变域的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，并且其重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:10，如例如US 2018237529中所述，并在本文中称为“CAP-100”。
作为对于人源化的另一种方案，可以产生人抗体。“人抗体”是指通过任何已知的标准方法产生的完全包含人轻链和重链以及恒定区的抗体。例如，可以获得转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后在不产生内源性免疫球蛋白的情况下能产生全人抗体库。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区PH基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列导致在免疫后产生人抗体。见例如Jakobovits et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,90:255 1(1993)；Jakobovitset al.,Nature,362:255-258(1993)所述。可选地，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))可用于从供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V结构域基因框内克隆进丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要包被蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面展示为功能性抗体片段。由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体功能性质的选择也会导致选择出编码表现出这些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行；关于其的综述见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-57 1(1993)。人抗体也可以由在体外活化的B细胞或其免疫系统用人细胞重建的SCID小鼠产生。一旦获得人抗体，其编码DNA序列可被分离、克隆及导入合适的表达系统即细胞系(优选来自哺乳动物的细胞系)中，其随后表达并将其释放至从中可以分离抗体的培养基中。
用于本发明的用途的优选人抗体是这样的抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:6且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:7或8，如例如US2016031997(WO 2014/151834)中所述，或者是US 20150344580(WO2013/184200)中描述的任一种人抗CCR7抗体，例如R707抗体，其重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:11且其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。用于本发明的其他优选人抗体是这样的人抗体，其包含US2013195869(WO2012043533)和WO2018142322中描述的抗CCR7抗体的所有VH区。
用于包含在本发明内的用途的结合CCR7受体的抗体的功能性片段保留了其所源自的全长抗体的至少一种结合功能和/或调节功能。优选的功能性片段保留相应全长抗体的抗原结合功能(例如结合哺乳动物CCR7受体的能力)。特别优选的功能性片段保留了抑制哺乳动物CCR7受体的一种或多种功能性特征的能力，例如结合活性和/或阻断信号传导活性，和/或刺激细胞应答。例如，在一个实施方案中，功能性片段可以抑制CCR7与其一种或多种配体的相互作用和/或可以抑制一种或多种受体介导的功能。
在一些实施方案中，本发明的抗CCR7抗体包含轻链和/或重链抗体恒定区。可以使用本领域已知的任何抗体恒定区。轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重链恒定区，例如人α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重链恒定区。本发明的抗CCR7抗体因此可以具有任何同种型的恒定区，即包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区以及IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。本领域已知从感兴趣的抗体中衍生不同亚类或同种型的抗体的技术，即亚类转换。因此，例如IgG抗体可以源自IgM抗体，且反之亦然。这种技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质的新抗体，也表现出与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物学性质。可以采用重组DNA技术。这种方法中可以使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如编码希望的同种型抗体恒定结构域的DNA。也见Lantto et al.(2002,Methods Mol.Bio1.178:303-16)。因此，本发明的抗CCR7抗体包括这样的抗体，其包含例如本文公开的一个或多个可变结构域序列及具有希望的同种型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgD)，以及其Fab或F(ab’)2片段。此外，如果需要IgG4，也可能需要如Bloom等人(1997,Protein Science 6:407)所述在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)，以减轻可能导致IgG4抗体的异质性的H链内二硫键形成的倾向。
本发明的抗CCR7抗体优选包含具有至少一种效应子功能的功能性Fc区，所述至少一种效应子功能选自：C1q结合、补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用。
可以修饰本发明的抗CCR7抗体以改善效应子功能，例如以增强抗体的ADCC和/或CDC。这可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸取代而实现。本发明抗体的Fc区中的优选取代是增加C1q结合及由此增加CDC活性的取代，例如在Idusogie et al.(2000,J.Immunol.164:4178-4184)中描述。增加C1q结合的Fc区中优选取代是E333A取代。
加入糖蛋白例如抗体的氨基酸主链的糖基是由几种单糖或单糖衍生物形成，得到在不同哺乳动物或组织的细胞中产生的同一抗体可以不同的组合物。此外，已经表明糖基的不同组成可以影响抗体介导抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的效力。因此，可以通过研究来自不同来源的抗体的糖基化模式来改善这些性质。这种方法的一个示例如Niwa et al.(2004,Cancer Res,64(6):2127-33)所述。
可选地或额外地，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在这个区域中允许形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。见Caron et al.(1992,J.Exp Med.176:1191-1195)和Shopes,(1992,Immunol.148:2918-2922)。也可以如Wolff et al.(1993,CancerResearch 53:2560-2565)所述使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。可选地，可以对具有双Fc区的抗体进行工程化，并从而可具有增强的补体裂解和ADCC能力。见Stevenson et al.(1989,Anti-Cancer Drug Design 3:2 19-230)。为了延长抗体的血清半衰期，可以例如US 5,739,277所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指负责IgG分子的体内血清半衰期延长的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
本发明优选的抗CCR7抗体包含人同种异型G1m17,1的重链恒定区(见Jefferisand Lefranc(2009)MAbs Vol.1Issue 4,pp 1-7)，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。更优选地，本发明的抗体中人同种异型G1m17,1的重链恒定区包含E333A取代，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
用于本发明的抗CCR7抗体可以通过多种常规技术中的任何一种来制备。其通常使用本领域已知的任何技术在重组表达系统中产生。见例如Shukla and
(2010,“Recent advances in large-scale production of monoclonal antibodies andrelated proteins”,Trends in Biotechnol.28(5):253–261)，Harlow and Lane(1988)“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY，及Sambrook and Russell(2001)"Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY。本领域已知的任何表达系统均可用于制备本发明的重组多肽。通常，将宿主细胞用包含编码希望的多肽的DNA的重组表达载体转化。
BTK抑制剂
本发明涉及包含Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂(称为BTK抑制剂)的新组合。这种抑制剂在本领域中广为人知，并且可商购用于治疗B细胞癌，如套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和
巨球蛋白血症。可商购的BTK抑制剂的一个实例是依鲁替尼，也称为Imbruvica(商品名)，其是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮。
BTK抑制剂的活性可以使用磷化学物质的固定化金属测定法(IMAP)来测量。IMAP是一种基于磷酸化肽底物的亲和性捕获的均相荧光偏振(FP)测定。IMAP使用荧光素标记的肽底物，该底物在被蛋白激酶磷酸化后，与用三价金属络合物衍生的所谓IMAP纳米颗粒结合。结合导致肽的分子运动速率改变，并导致所观察到的有关附着于底物肽的荧光素标记的FP值增加。
BTK抑制也可以在B细胞系例如Ramos细胞中确定或在原代细胞测定中确定，例如来自哺乳动物例如人、猴、大鼠或小鼠的PBMC或全血；或来自猴、大鼠或小鼠的分离的脾细胞。可以测量抗IgM诱导的MIP1β产生(Ramos、PBMC、脾细胞)、H2O2诱导的BTK和PLCv2磷酸化(Ramos细胞)、或抗IgM诱导的B细胞增殖、或原代B细胞(PBMC和脾细胞)上CD86表达，由此研究BTK活性的抑制。在激活FCER诱导的脱粒、细胞因子产生和CD63诱导的细胞表面表达后，也可以在人、猴、大鼠或小鼠肥大细胞上测定对BTK活性的调节。此外，可以在用M-CSF处理后分化为破骨细胞及用RANKL激活的CD14+单核细胞上测定对BTK活性的调节。BTK抑制剂的活性可以在体内给药后在小鼠脾细胞中进行研究。在典型的实验中，可以在施用化合物后3小时处死小鼠。可以从经处理的小鼠中提取脾脏用于分离脾细胞。可以将脾细胞铺板在96孔培养板中并用抗IgM刺激，无需进一步添加化合物。BTK抑制剂对抗IgM诱导的B细胞刺激和抑制可以通过B细胞增殖、MIP1β产生或CD19+脾细胞B细胞上的CD86表达来测量。本领域技术人员已知其它测定，例如使用WO2013010869中描述的小鼠胶原诱导的关节炎模型，或使用WO2013010869中描述的大鼠OVX模型。
优选的BTK抑制剂对BTK是选择性的或对BTK基本上是选择性的。更优选地，BTK抑制剂对Src家族激酶是选择性的，或对BTK和如下所述的激酶具有选择性，所述激酶在酪氨酸激酶的与BTK中半胱氨酸481的氨基酸序列位置同源的氨基酸序列位置具有半胱氨酸残基。BTK抑制剂可以与该半胱氨酸形成共价键，或者可以以其他方式与之相互作用。
BTK抑制剂通常包含具有两个或多个氮原子的环系统，此外还有其它亲和元素。在优选的实施方案中，BTK抑制剂具有通式(1)：
其中
Q1和Q2各自独立地为N或C-R4，其中优选Q1和Q2之一为N或CH，而另一个为C-R4，
R1表示取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的杂环稠环、或取代或未取代的炔基，
R2表示氢原子、卤素原子、取代或未取代的低级烷基、或取代或未取代的烷氧基，
R3表示取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环、或取代或未取代的杂环稠环，
R4表示氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的氨基、或卤素原子，以及
R5表示氢原子、取代或未取代的低级烷基，或者R1和R5可以组合以形成饱和或不饱和的5至6元环，从而形成多重稠环，
或者BTK抑制剂具有通式(2)：
其中
Q3是氨基或低级烷基，优选氨基或甲基，
X是CH、N、O或S；
Y是C(R11)、N、O或S；
Z是CH、N或键；
A是CH或N；
B1是N或C(R12)；
B2是N或C(R13)；
B3是N或C(R14)；
B4是N或C(R15)；
R6是C(═O)R16、S(═O)R17、S(═O)2R18或任选由R19取代的(C1-6)烷基；
R7是H、(C1-3)烷基或(C3-7)环烷基；
R8是H、(C1-6)烷基或(C3-7)环烷基)；或R7和R8与它们所连接的N和C原子一起形成任选被一个或多个氟、羟基、(C1-3)烷基、(C1-3)烷氧基或氧代取代的(C3-7)杂环烷基；
R9是H或(C1-3)烷基；
R10是H、卤素、氰基、(C1-4)烷基、(C1-3)烷氧基、(C3-6)环烷基，其中任意烷基任选被一个或多个卤素取代；或R10是(C6-10)芳基或(C2-6)杂环烷基；
R11是H或(C1-3)烷基；或R10和R11一起可以形成(C3-7)环烯基或(C2-6)杂环烯基，各自任选被(C1-3)烷基或者一个或多个卤素取代；
R12是H、卤素、CF3、(C1-3)烷基或(C1-3)烷氧基；
R13是H、卤素、CF3、(C1-3)烷基或(C1-3)烷氧基；或R12和R13与它们所连接的碳原子一起形成(C6-10)芳基或(C1-9)杂芳基；
R14是H、卤素、(C1-3)烷基或(C1-3)烷氧基；
R15是H、卤素、(C1-3)烷基或(C1-3)烷氧基；
R16独立地选自(C1-6)烷基、(C2-6)烯基和(C2-6)炔基，其中每个烷基、烯基或炔基任选地被选自下组的一个或多个取代基取代：羟基、(C1-4)烷基、(C3-7)环烷基、[(C1-4)烷基]氨基、二[(C1-4)烷基]氨基、(C1-3)烷氧基、(C3-7)环烷氧基、(C6-10)芳基和(C3-7)杂环烷基；或R16是(C1-3)烷基-C(O)-S-(C1-3)烷基；或R16是任选由选自卤素和氰基的一个或多个取代基取代的(C1-5)杂芳基；
R17和R18独立地选自(C2-6)烯基和(C2-6)炔基，两者任选地被选自下组的一个或多个取代基取代：羟基、(C1-4)烷基、(C3-7)环烷基、[(C1-4)烷基]氨基、二[(C1-4)烷基]氨基、(C1-3)烷氧基、(C3-7)环烷氧基、(C6-10)芳基和(C3-7)杂环烷基；或任选被选自卤素和氰基的一个或多个取代基取代的(C1-5)杂芳基；和
R19独立地选自卤素、氰基、(C2-6)烯基和(C2-6)炔基，两者任选地被选自下组的一个或多个取代基取代：羟基、(C1-4)烷基、(C3-7)环烷基、(C1-4)烷基氨基、二[(C1-4)烷基]氨基、(C1-3)烷氧基、(C3-7)环烷氧基、(C6-10)芳基、(C1-5)杂芳基和(C3-7)杂环烷基；条件是：
X、Y、Z中的0至2个原子可以同时为杂原子；当选自X、Y中的一个原子为O或S时，则Z为键，且选自X、Y的另一个原子不能为O或S；当Z为C或N时，则Y为C(R11)或N，且X为C或N；B1、B2、B3和B4中的0至2个原子为N；
或者BTK抑制剂具有通式(3)：
其中
实线/虚线表示单键或双键；
X1是CR20或N；
X2是CR21或N；
X3是CR22或N；其中X1、X2和X3中没有一个、有一个或两个是N；
Y1和Y2独立地选自CH和N；
Y3是C或N；
Y4是CR25、N或NH；其中Y1、Y2、Y3和Y4中的一个或两个是N；
R20、R21和R22独立地选自H、F、CI、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH，以及任选由F、CI、CN、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、-OCH3、-OCH2CH3和-OCH2CH2OH取代的C1-3烷基；
R23选自H、F、CI、CN、-CH2OH、-CH(CH3)OH、-C(CH3)2OH、-CH(CF3)OH、-CH2F、-CHF2、-CH2CHF2、-CF3、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHC(O)CH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、环丙基、环丙基甲基、1-羟基环丙基、咪唑基、吡唑基、3-羟基-氧杂环丁烷-3-基、氧杂环丁烷-3-基和氮杂环丁烷-l-基；
R24选自C1-2烷基、-CH2OH、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CN和-CH2CH2OH；或两个R24基团形成3-、4-、5-或6-元碳环或杂环；
或者R24基团和R27基团形成3-、4-、5-或6-元碳环或杂环；
n为0、1、2、3或4；
R25选自H、Cl、C1-2烷基、-CH2CH2OH、-CH2F、-CHF2、-CF3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、C1-2烷氧基和-OCH2CH2OH；
R26是通式(326)所示的部分：
其中
实线/虚线表示单键或双键；
Q4是-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、–CH＝N-或-NH-,
Q5、Q6和Q7各自独立地是C或N；
Q8是C、S、N或C(卤素)；
Q9是-CH2-、-CH2CH2-、-C(CH3)2-、-C(卤素)2CH2-或C4-6环烷基，例如连接在两个不相邻(优选在位置1和位置3)碳原子上的环戊基；
R27选自H、-CH3、-S(O)2CH3、环丙基、氮杂环丁烷-3-基、氧杂环丁烷-3-基和吗啉-4-基；
Z是CR28或N；以及
R28选自H、F、CI、C1-2烷基、-CH2CH2OH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、C1-2烷氧基和-OCH2CH2OH；
或者BTK抑制剂具有通式(4)：
其中
实线/虚线表示单键或双键；
Q10、Q11、Q12和Q13各自独立地为N或NH(取决于化合价)，或C或CH(取决于化合价)，其中Q10、Q11、Q12和Q13中的至少一个为N或NH且至少一个为C或CH；
Q14是NH2或CH3；
La是CH2、O、NH或S；
Ar为取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳基；
Y是选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基的任选取代的基团；
Z是C(═O)、OC(═O)、NR29C(═O)、C(═S)、S(═O)x、OS(═O)x或NR29S(═O)x，其中x为1或2；
R29是H或(C1-6)烷基；以及
R30和R31各自独立地是H；或者R30和R31一起形成键；
或者BTK抑制剂具有通式(5)：
其中
Q15是NH2或CH3；
Lb表示O、S、SO、SO2、NH、C(O)、CH2O、OCH2、CH2或CH(OH)；
R32表示卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷基或C1-4卤代烷氧基；
环1表示4至7元环状基团，其可以被1至5个取代基取代，每个取代基各自独立地选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、腈、C1-4卤代烷基和C1-4卤代烷氧基，其中当环1上存在两个或更多个取代基时，这些取代基可以与这些取代基所结合的环1中原子一起形成4至7元环状基团；
环2表示4至7元饱和杂环，其可被1至3个KR33取代；
K表示键、C1-4亚烷基、C(O)、C(O)CH2、CH2C(O)、C(O)O或SO2；
R33表示C1-4烷基、C2-4烯基或C2-4炔基，其各自可以被1至5个各自独立地选自NR34R35、卤素、CONR36R37、CO2R38和OR39的取代基取代；
R34和R35各自独立地表示H、或可以被OR40或CONR41R42取代的C1-4烷基；R34和R35可以与它们结合的氮原子一起形成4至7元含氮饱和杂环，其可以被氧代基或OH取代；
R36和R37各自独立地表示H、C1-4烷基或苯基；
R38、R40、R41和R42各自独立地表示H或C1-4烷基；
R39表示H、C1-4烷基、苯基或苯并三唑基；
nn表示0至4的整数；
m表示从0至2的整数；以及
当n为2或更大的数时，任意R32均可以彼此相同或可以彼此不同；
或者BTK抑制剂具有通式(6)：
其中
实线/虚线是单键或双键；
环A是5元杂芳基或5,6元双环杂芳基，其中CONH2连接于5元杂芳基，其各自任选被一个或多个A’取代；
A’是-NHR40或R44；
R40是H、-R41、-R41-R42-R43、-R41-R43或-R42-R43；
R41是芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基或与杂环烷基稠合的杂芳基，其各自任选被一个或多个R1’或R1”取代；
每个R1’独立地为卤素、硝基、氰基、低级烷基磺酰胺基、S(O)2或氧代基；
每个R1”独立地是低级烷基、环烷基、杂环烷基、低级烷氧基、氨基或酰胺基，其各自任选地被一个或多个R1”’取代；
每个R1”’独立地是羟基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或杂环烷基；
R42是-C(＝O)、-C(＝O)O、-C(＝O)NR2’、-NHC(＝O)O、-C(R2’)2、O、-C(＝NH)NR2>或-S(＝O)2；
每个R2’独立地为H或低级烷基；
R43为H或R44；
R44是低级烷基、低级卤代烷基、低级烷氧基、氨基、低级烷基氨基、低级二烷基氨基、芳基、芳烷基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、双环环烷基、双环杂环烷基、螺环烷基或螺杂环烷基，其各自任选被一个或多个的低级烷基、卤素、低级烷基氨基、低级二烷基氨基、羟基、羟基低级烷基、低级烷氧基、卤素、硝基、氨基、酰胺基、酰基、氰基、氧代基、胍基、羟基氨基、羧基、氨基甲酰基、氨基甲酸酯、卤代低级烷氧基或卤代低级烷基取代，其中两个低级烷基基团可以一起形成环；
Q'是CH或N；
X2是CH、N或N(X3)；
X3是低级烷基；
Y5是H、卤素或低级烷基；
Y6是Y6a、Y6b、Y6c或Y6d；
Y6a是H或卤素；
Y6b是低级烷基，其任选被一个或多个选自低级卤代烷基、卤素、羟基、氨基、氰基和低级烷氧基的取代基取代；
Y6c是低级环烷基，其任选被一个或多个选自低级烷基、低级卤代烷基、卤素、羟基、氨基、氰基和低级烷氧基的取代基取代；
Y6d是氨基，其任选被一个或多个低级烷基、烷氧基低级烷基或羟基低级烷基取代；
Y7是H、卤素或低级烷基；
Y8是H、卤素、低级烷基、低级卤代烷基、低级烷氧基或低级羟基烷基；以及Y9是H、低级烷基、或低级羟基烷基；
或者BTK抑制剂具有通式(7)：
其中
A2独立地选自N或CR49；
R45是H、L2a-(取代或未取代的烷基)、L2a-(取代或未取代的环烷基)、L2a-(取代或未取代的烯基)、L2a-(取代或未取代的环烯基)、L2a-(取代或未取代的杂环)、L2a-(取代或未取代的杂芳基)、或L2a-(取代或未取代的芳基)，其中L2a是键、O、S、S(＝O)、S(＝O)2、C(＝O)、取代或未取代C1-6亚烷基、或取代或未取代的C2-6亚烯基；
R46和R47独立地选自H、低级烷基和取代的低级烷基；
R48是L3a-Xa-L4a-G，其中，
L3a是任选存在的，并且当其存在时是键、或任选取代的选自亚烷基、杂亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、烷基亚芳基、烷基亚杂芳基或烷基亚杂环烷基的基团；
Xa是任选存在的，并且当其存在时是键、O、C(═O)、S、S(═O)、S(═O)2、NH、NR53、NHC(O)、C(O)NH、NR53C(O)、C(O)NR53、S(═O)2NH、NHS(═O)2、S(═O)2NR53、NR53S(═O)2、OC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NR53、NR53C(O)O、C(H)═NO、ON═CH、NR54C(O)NR54、杂亚芳基、亚芳基、NR54C(═NR55)NR54、NR54C(═NR55)、C(═NR55)NR54、OC(═NR55)或C(═NR55)O；
L4a是任选存在的，并且当其存在时是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚烯基、取代或未取代的亚炔基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂环烯；
或L3a、Xa和L4a一起形成含氮杂环、或任选取代的选自烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基或烷基杂环烷基的基团；
G选自：
其中Rb是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基；以及R51和R52中的任一个是H；
R50是H，取代或未取代的C1-4烷基，取代或未取代的C1-4杂烷基，C1-8烷基氨基烷基，C1-8羟基烷基氨基烷基，C1-8烷氧基烷基氨基烷基，取代或未取代的C3-6环烷基，取代或未取代的C1-8烷基C3-6环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的C2-8杂环烷基，取代或未取代的杂芳基，C1-4烷基(芳基)，C1-4烷基(杂芳基)，C1-8烷基醚，C1-8烷基酰胺或C1-4烷基(C2-8杂环烷基)；
或R50和R52是H；
R51是H、取代或未取代的C1-4烷基、取代或未取代的C1-4杂烷基、C1-8烷基氨基烷基、C1-8羟基烷基氨基烷基、C1-8烷氧基烷基氨基烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的C1-8烷基C3-6环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的C2-8杂环烷基、取代或未取代的杂芳基、C1-4烷基(芳基)、C1-4烷基(杂芳基)、C1-8烷基醚、C1-8烷基酰胺或C1-4烷基(C2-8杂环烷基)；
或R51和R52一起形成键；
R49是H、卤素、-L6a-(取代或未取代的C1-3烷基)、-L6a-(取代或未取代的C2-4烯基)、-L6a-(取代或未取代的杂芳基)或-L6a-(取代或未取代芳基)，其中L6a是键、O、S、S(═O)、S(═O)2、NH、C(O)、NHC(O)O、OC(O)NH、NHC(O)或C(O)NH；
R53选自H、取代或未取代的低级烷基及取代或未取代的低级环烷基；
每个R54独立地为H、取代或未取代的低级烷基、或取代或未取代的低级环烷基；或两个R54基团可以一起形成5-、6-、7-或8-元杂环；或
R54和R55可以一起形成5-、6-、7-或8-元杂环；或
R55选自H、S(═O)2R56、S(═O)2NH2、C(O)R56、CN、NO2、杂芳基或杂烷基；
或者BTK抑制剂具有通式(8)：
其中
X4表示CH或N，
R56表示NH2、CONH2或H，
R57表示Hal、Ar1b或Het1b，
R58表示NR60[C(R60)2]nHet2b、NR60[C(R60)2]nnnCyc、Het2b、O[C(R60)2]nnnAr2b、NR60[C(R60)2]nnnAr2b、O[C(R60)2]nnnHet2b、NR60(CH2)pNR60R61、O(CH2)pNR60R61或NR60(CH2)pCR62R63NR60R61，
R59表示H、CH3或NH2，
R60表示H或具有1、2、3或4个C原子的烷基，
R61表示N(R60)2CH2CH＝CHCONH、Het3bCH2CH＝CHCONH、CH2＝CHCONH(CH2)nnn、Het4b(CH2)nnnCOHet3b-二基-CH2CH＝CHCONH、HC≡CCO、CH3C≡CCO、CH2＝CH-CO、CH2＝C(CH3)CONH、CH3CH＝CHCONH(CH2)nnn、N≡CCR52R53CONH(CH2)nnn、Het4bNH(CH2)pCOHet3b-二基-CH2CH＝CHCONH、Het4b(CH2)pCONH(CH2CH2O)p(CH2)pCOHet3b-二基-CH2CH＝CHCONH、CH2＝CHSO2、AbCH＝CHCO、CH3CH＝CHCO、Het4b(CH2)pCONH(CH2)pHet3b-二基-CH2CH＝CHCONH、Ar3bCH＝CHSO2、CH2＝CHSO2NH或N(R60)CH2CH＝CHCO，
R62、R63一起表示具有2、3、4或5个C原子的亚烷基，
Ar1b表示苯基或萘基，其各自是未取代的或由R61、Hal、(CH2)nnnNH2、CONHAr3b、(CH2)nnnNHCOAb、O(CH2)nnnAr3b、OCycb、Ab、COHet3b、OAb和/或OHet3b(CH2)单取代、二取代或三取代，
Ar2b表示苯基、萘基或吡啶基，其各自是未取代的或由R61、Hal、OAr3b、(CH2)nnnNH2、(CH2)nnnNHCOAb和/或Het3b单取代、二取代或三取代，
Ar3b表示苯基，其是未取代的或由OH、OAb、Hal、CN和/或Ab单取代、二取代或三取代，
Het1b表示具有1至4个N、O和/或S原子的单环或双环的饱和的、不饱和的或芳族杂环，其是未取代的或由R61、O(CH2)nnnAr3b和/或(CH2)nnnAr3b单取代、二取代或三取代，
Het2b表示具有1至4个N、O和/或S原子的单环或双环的饱和杂环，其可以是未取代的或由R61、Het3b、CycbSO2、OH、Hal、COOH、OAb、COAb、COHet3b、CycbCO、SO2和/或＝O单取代、二取代或三取代，
Het3b表示具有1至4个N、O和/或S原子的单环的不饱和的、饱和的或芳族杂环，其可以是未取代的或由Hal、A和/或＝O单取代、二取代或三取代，
Het4b表示具有1至4个N、O和/或S原子的双环或三环的不饱和的、饱和的或芳族杂环，其可以是未取代的或由Ab、NO2、Hal和/或＝O单取代、二取代、三取代或四取代，
Cycb表示具有3、4、5或6个C原子的环状烷基，其是未取代的、被R61和/或OH单取代或二取代的，并且其可以包含双键，
Ab表示C1-10烷基，其中1至7个H原子可以被F和/或Cl替换和/或其中一个或两个不相邻的CH2和/或CH-基团可以被O、NH和/或被N替换，
Hal表示F、CI、Br或I，
nnn表示0、1、2、3或4，
p表示1、2、3、4、5或6，
或者BTK抑制剂具有通式(9)：
其中
实线/虚线是单键或双键；
Xc—Yc—Zc是N—C—C且存在R65，或者是C—N—N且不存在R65；
R64是3至8元的含N环，其中N是未被取代的或被R67取代；
R65是H或低级烷基，特别是甲基、乙基、丙基或丁基；或
R64和R65与它们所连接的原子一起形成4至8元环，优选5至6元环，选自环烷基、饱和或不饱和杂环、芳基和杂芳基环，其是未取代的或被至少一个取代基Lc-R67取代；
R66在每种情况下独立地为卤素、烷基、S-烷基、CN或OR68；
v是1、2、3或4，优选1或2；
Lc是键、NH、杂烷基或杂环基；
R67是COR69、CO2R69或SO2R69，其中R69是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基；
R68是H或未取代或取代的杂烷基、烷基、环烷基、饱和或不饱和的杂环基、芳基或杂芳基，
或者BTK抑制剂具有通式(10)：
其中
环G是包含0至3个杂原子N、S或O的5元或6元芳环；
每个W独立地是-(CH2)-或-C(O)-；
Ld是键、CH2、NR81、O或S；
实线/虚线为单键或双键，且当是双键时，R74和R76不存在；
md为0，或1至4的整数；
mm为0，或者1至4的整数，其中当mm大于1时，每个R71可以不同；
pd为0，或1至2的整数，其中当pd是0时，md不是零，以及当pd大于1时，每个R75和每个R76可以不同；
R70、R73、R74、R75和R76各自独立地为H、卤素、杂烷基、烷基、烯基、环烷基、芳基、饱和或不饱和杂环基、杂芳基、炔基、-CN、-NR82R83、OR82、-COR82、-CO2R82、-CONR82R83、-C(＝NR82)NR83R84、-NR82COR83、-NR82CONR83R84、-NR82CO2R83、-SO2R82、-NR82SO2NR83R84或-NR82SO2R83，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、杂芳基、芳基和饱和或不饱和杂环基任选地被至少一个取代基R85取代，其中(R83和R84)或(R83和R85)或(R85和R86)或(当pd为2时，R85和R85)可以与它们所连接的原子一起形成选自环烷基、饱和或不饱和杂环、芳基和杂芳基环的环，其任选被至少一个取代基R85取代；
R71是卤素、烷基、-S-烷基、-CN、-NR82R83、-OR82、-COR82、-CO2R82、-CONR82R83、-C(＝NR82)NR83R84、-NR82COR83、-NR82CONR83R84、-NR82CO2R83、-SO2R82、-NR82SO2NR83R84或-NR82SO2R83；
R81是H或低级烷基；
R82、R83和R84各自独立地为H、杂烷基、烷基、烯基、炔基、环烷基、饱和或不饱和杂环基、芳基或杂芳基；其中(R82和R83)和/或(R83和R84)各自可以与它们所连接的原子一起形成选自环烷基、饱和或不饱和杂环、芳基和杂芳基环的环，其任选被至少一个取代基R85取代；
R85是卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基、氧代基、-CN、-OR86、-NR86R87、-COR86、-CO2R86、-CONR86R87、-C(＝NR86)NR87R88、-NR86COR87、-NR86CONR86R87、-NR86CO2R87、-SO2R86、-SO2芳基、-NR86SO2NR87R88或-NR86SO2R87，其中R86、R87和R88独立地是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基，其中(R86和R87)和/或(R87和R88)可以与它们所连接的原子一起形成选自环烷基、饱和或不饱和杂环、芳基和杂芳基环的环，
或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(1)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(2)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(3)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(4)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐，更优选依鲁替尼。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(5)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(6)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(7)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(8)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(9)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂是具有如上定义的可变部分的通式(10)或其立体异构体、互变异构体或药学可接受的盐。
多种药学可接受的盐可以由BTK抑制剂形成，包括：通过使例如依鲁替尼与有机酸反应形成的酸加成盐，所述有机酸包括脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷双酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸、氨基酸等，包括例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等；通过使例如依鲁替尼与无机酸反应形成的酸加成盐，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等。BTK抑制剂的HCl加成盐是优选的。
优选的卤素是氟、氯和溴，更优选氟和溴，最优选氟。取代或未取代的芳基的芳基部分优选为具有6至14个碳原子的芳基，其具体实例包括苯基、萘基和茚基。取代或未取代的杂环的杂环部分优选为脂环族杂环基团或芳族杂环基团。脂环族杂环基团包括例如3至8元杂环基，其具有至少一个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子。其具体实例包括吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基和硫代吗啉基。芳族杂环基团包括例如5元或6元单环芳族杂环基，其具有至少一个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子。其具体实例包括咪唑基、吡唑基、噻吩基、噻唑基和吡啶基。取代或未取代的杂环稠环的杂环稠环部分包括例如稠合的杂环基，其是3至8元的稠环双环基团，并且具有至少一个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子。其具体实例包括四氢异喹啉基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异喹啉基和邻苯二甲酰亚胺。取代或未取代的低级烷基的低级烷基部分可以是具有1至3个碳原子的任何线性、支链和环状烷基，并且其具体实例包括甲基、异丙基和环丙基。取代或未取代的烷氧基的烷氧基部分可以是具有1至3个碳原子的任何线性、支链或环状烷基，并且其具体实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和环丙氧基。取代或未取代的氨基可以更具体地是具有1至3个碳原子的任何线性、支链或环状烷基的氨基，其具体实例包括氨基、甲基氨基和二甲基氨基。其优选是氨基。取代或未取代的炔基的炔基部分可以是具有2至6个碳原子的线性或支链基团，其具体实例包括乙炔基、炔丙基、2-丁炔基。取代或未取代的炔基的取代部分可以是任何取代或未取代的芳基环、取代或未取代的杂环或取代或未取代的杂环稠环，其具体实例包括芳基。
在优选的实施方案中，BTK抑制剂具有在任何化学上可能的位置上的一个、两个或多个任何种类的取代基，作为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的杂环稠环、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的烷氧基、或取代或未取代的氨基的取代基。当上述基团具有2个或更多个取代基时，各个取代基可以相同或不同，所述取代基的实例包括卤素原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的氨基、硝基、氰基、羟基、取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的氨基甲酰基、羧基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基和取代或未取代的酰氨基。可以通过组合R5和R1以形成饱和或不饱和的5至6元环而形成的多重稠环包括例如具有如氮原子、硫原子和氧原子的杂原子的3至8元的稠环杂环基团。其具体实例包括氧代异喹啉基、氧代二氢异喹啉基、氧代酞嗪基和氧代噻吩并吡咯基。
(C1-2)烷基是指具有1至2个碳原子的烷基，其是甲基或乙基，(C1-3)烷基是指具有1至3个碳原子的支链或非支链烷基，其是甲基、乙基、丙基或异丙基；(C1-4)烷基是指具有1至4个碳原子的支链或非支链烷基，其是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基，优选(C1-3)烷基；(C1-5)烷基是指具有1至5个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和异戊基，优选(C1-4)烷基。(C1-6)烷基是指具有1至6个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、正戊基和正己基。优选(C1-5)烷基，最优选(C1-4)烷基。
(C1-2)烷氧基是指具有1至2个碳原子的烷氧基，所述烷基部分的定义同上；(C1-3)烷氧基是指具有1至3个碳原子的烷氧基，所述烷基部分的定义同上；优选(C1-2)烷氧基。(C1-4)烷氧基是指具有1至4个碳原子的烷氧基，所述烷基部分具有与先前定义相同的含义。优选(C1-3)烷氧基，最优选(C1-2)烷氧基。
(C2-4)烯基是指具有2至4个碳原子的支链或非支链烯基，例如乙烯基、2-丙烯基、异丁烯基或2-丁烯基。(C2-6)烯基是指具有2至6个碳原子的支链或非支链烯基，例如乙烯基、2-丁烯基和正戊烯基，最优选(C2-4)链烯基。
(C2-4)炔基是指具有2至4个碳原子的支链或非支链炔基，例如乙炔基、2-丙炔基或2-丁炔基；(C2-6)炔基是指具有2至6个碳原子的支链或非支链炔基，例如乙炔基、丙炔基、正丁炔基、正戊炔基、异戊炔基、异己炔基或正己炔基。优选(C2-4)炔基。
(C3-6)环烷基是指具有3至6个碳原子的环烷基，其是环丙基、环丁基、环戊基或环己基；(C3-7)环烷基是指具有3至7个碳原子的环烷基，其是环丙基、环丁基、环戊基，环己基或环庚基；(C2-6)杂环烷基是指具有2至6个碳原子、优选3至5个碳原子和一个或两个选自N、O和/或S的杂原子的杂环烷基基团，其可以通过杂原子(如果可行)或碳原子连接；优选的杂原子是N或O；还优选的是哌啶、吗啉、吡咯烷和哌嗪；最优选的(C2-6)杂环烷基是吡咯烷；如果可行，杂环烷基可以通过杂原子连接；(C3-7)杂环烷基是指具有3至7个碳原子、优选3至5个碳原子和一个或两个选自N、O和/或S的杂原子的杂环烷基。优选的杂原子是N或O；优选的(C3-7)杂环烷基是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、高哌啶基或吗啉基；更优选的(C3-7)杂环烷基是哌啶、吗啉和吡咯烷；如果可行，杂环烷基可以通过杂原子连接；
(C3-7)环烷氧基是指通过环碳原子连接到环外氧原子的具有3至7个碳原子的环烷基，其含义同上；
(C6-10)芳基是指具有6至10个碳原子的芳族烃基，例如苯基、萘基、四氢萘基或茚基；优选的(C6-10)芳基是苯基；
(C1-5)杂芳基是指具有1至5个碳原子和1至4个选自N、O和/或S的杂原子的取代或未取代的芳族基团；(C1-5)杂芳基可以是任选取代的；优选的(C1-5)杂芳基为四唑基、咪唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、噻吩基或呋喃基，更优选的(C1-5)杂芳基为嘧啶基；(C1-9)杂芳基是指具有1至9个碳原子和1至4个选自N、O和/或S的杂原子的取代或未取代的芳族基团；(C1-9)杂芳基可以是任选取代的；优选的(C1-9)杂芳基为喹啉、异喹啉和吲哚；
[(C1-4)烷基]氨基是指被含有1至4个碳原子的烷基(其含义同上)单取代的氨基；优选的[(C1-4)烷基]氨基是甲基氨基；二[(C1-4)烷基]氨基是指由烷基二取代的氨基，每个烷基含有1至4个碳原子并且与前面定义的含义相同；优选的二[(C1-4)烷基]氨基是二甲基氨基；(C1-3)烷基-C(O)-S-(C1-3)烷基是指烷基-羰基-硫-烷基，每个烷基具有1至3个碳原子，含义如前所述；(C3-7)环烯基是指具有3至7个碳原子、优选5至7个碳原子的环烯基；优选的(C3-7)环烯基是环戊烯基或环己烯基；最优选环己烯基；(C2-6)杂环烯基指具有2至6个碳原子、优选3至5个碳原子和1个选自N、O和/或S的杂原子的杂环烯基；优选的(C2-6)杂环烯基是氧杂环己烯基和氮杂环己烯基。当在取代基的定义中指出所述取代基的“所有烷基”任选被取代时，这也包括烷氧基的烷基部分。
根据形成的环或部分，指定原子的化合价被保留；例如，氮，如果存在于X或Y中，则可以带有氢。术语“取代的”是指指定原子上的一个或多个氢被选自指定基团的基团替换，条件是不超过指定原子在现有情况下的正常化合价，并且所述取代获得一种稳定的化合物。仅当这种取代基和/或可变部分的组合获得稳定的化合物时，才允许使用这种组合。“稳定的化合物”或“稳定的结构”定义为坚固到足以经受住从反应混合物中分离至可用的纯度并配制成含有有效活性药物成分的药物产品的化合物或结构。术语“任选取代的”是指用指定的基团、残基或部分任选取代。
通式(1)的BTK抑制剂及其合成描述于EP2824099、WO2013161848、US8450335、US8609679和WO2013063401。优选的通式(1)的BTK抑制剂选自下文所示的表1的化合物1、下文所示的表1的化合物2及EP2824099的表1-1至1-27中公开的化合物，更优选下文所示的表1中的化合物1或2。
通式(2)的BTK抑制剂及其合成描述于WO2013010869、US2017136014和US2017095471。优选的通式(2)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物3、4、5或6以及WO2013010869的第9页第9行至第11页第10行公开的化合物，优选表1的化合物3、4(阿卡替尼)、5或6。
通式(3)的BTK抑制剂及其合成描述于WO2013067260中。优选的通式(3)的BTK抑制剂具有如WO2013067260第24页对于R7所示的R26。优选的通式(3)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物7和WO2013067260的表1和2中公开的化合物，优选下文所示的表1的化合物4。
通式(4)的BTK抑制剂及其合成描述于US2015352116中。优选的通式(4)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物8，(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮，1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，(S)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮，优选下文所示的表1的化合物8。化合物8是依鲁替尼。
通式(5)的BTK抑制剂及其合成描述于US2015125446、WO2013/081016、WO2011/152351和US2017136014。优选的通式(5)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物9和WO2013/081016、WO2011/152351中公开的化合物，优选表1的化合物9。
通式(6)的BTK抑制剂及其合成描述于WO2012156334中。优选的通式(6)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物10和WO2012156334的权利要求8中公开的化合物，优选表1的化合物10。
通式(7)的BTK抑制剂及其合成描述于US2016303130、US2017209462、US2016022684、WO2013191965和WO2017023815中。优选的通式(7)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物8或11，(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮，1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，(S)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮，以及WO2013191965第43页开始的实施方案L中公开的化合物，优选表1的化合物8或11。
通式(8)的BTK抑制剂及其合成描述于WO2012170976中。优选的通式(8)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物12，以及WO2012170976的权利要求9中公开的化合物，优选下文所示的表1的化合物12。
通式(9)的BTK抑制剂及其合成描述于US2017/0136014。优选的通式(9)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物13。
通式(10)的BTK抑制剂及其合成描述于WO2014173289。优选的通式(10)的BTK抑制剂是下文所示的表1的化合物14和15，以及WO2014173289的第[0643]段的表3中公开的化合物，优选下文所示的表1的化合物14和15。
在优选的实施方案中，所述BTK抑制剂选自表1。
表1：用于本发明的优选BTK抑制剂
在一些实施方案中，所述BTK抑制剂选自依鲁替尼，泽布替尼(BGB-3111)，PCI-45292，PCI-45466，AVL-101/CC-101(Avila Therapeutics/Celgene Corporation)，AVL-263/CC-263(Avila Therapeutics/Celgene Corporation)，AVL-292/CC-292(AvilaTherapeutics/Celgene Corporation)，AVL-291/CC-291(Avila Therapeutics/CelgeneCorporation)，CNX 774(Avila Therapeutics)，BMS-488516(Bristol-Myers Squibb)，BMS-509744(Bristol-Myers Squibb)，CGI-1746(CGI Pharma/Gilead Sciences)，CGI-560(CGI Pharma/Gilead Sciences)，CTA-056，GDC-0834(Genentech)，HY-11066(以及CTK4I7891，HMS3265G21，HMS3265G22，HMS3265H21，HMS3265H22，439574-61-5，AG-F-54930)，ONO-4059(Ono Pharmaceutical Co.，Ltd.)，ONO-WG37(Ono Pharmaceutical Co.，Ltd.)，PLS-123(Peking University)，RN486(Hoffmann-La Roche)，HM71224(HanmiPharmaceutical Company Limited)或LFM-A13。在优选的实施方案中，所述BTK抑制剂是依鲁替尼、泽布替尼(BGB-3111)或阿卡替尼(表1的化合物4)，最优选依鲁替尼。
Bcl-2抑制剂
如本文所用，术语“Bcl-2抑制剂”是指选择性靶向、降低或抑制Bcl-2的至少一种活性的化合物。B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白家族是线粒体(也称为“内在”)凋亡途径的关键调节剂。参见Denial,N.N.and Korsmeyer,S.J.Cell(2004)116,205-219。Bcl-2的错误调节与多种癌症有关，特别是血液系统癌症，如滤泡淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病。Adams,J.M.and Cory,S.Science(1998)281,1322-1326。如本文所用，“Bcl-2”是指B细胞淋巴瘤2，一种抗细胞凋亡蛋白，其涉及多种类型的癌症，包括慢性淋巴细胞性白血病、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌。现有靶向和选择性Bcl-2抑制剂，包括奥利美生(oblimersen)、纳维托克(navitoclax)和维奈托克。在优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂是靶向Bcl-2的反义寡核苷酸，或小分子。在更优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂是小分子。在其它更优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂是靶向Bcl-2的反义寡核苷酸。在优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂不是抗体。
反义寡核苷酸Bcl-2抑制剂
靶向Bcl-2的反义寡核苷酸可以降低Bcl-2的活性，从而起到Bcl2抑制剂的作用。优选的实例是奥利美生和PNT2258。在更优选的实施方案中，反义寡核苷酸Bcl-2抑制剂是奥利美生。在其它更优选的实施方案中，反义寡核苷酸Bcl-2抑制剂是PNT2258。在优选的实施方案中，反义寡核苷酸Bcl-2抑制剂被封装在脂质体制剂中，更优选在如Tolcher etal.,2013,DOI:10.1007/s00280-013-2361-0中所述的智能微粒(smarticle)中。
反义DNA或RNA链是非编码链并与编码链(其是产生相应RNA或蛋白质的模板)互补。反义药物是与mRNA杂交并使其失活的短RNA序列，从而阻止蛋白质的形成。人淋巴瘤细胞增殖(具有t(14；18)易位)被靶向Bcl-2mRNA的起始密码子区域的反义RNA如奥利美生抑制。体外研究鉴别了与Bcl-2mRNA的前6个密码子互补的奥利美生(也称为Genasense)。反义寡核苷酸在淋巴瘤的I/II期试验中显示出成功的结果。优选的反义寡核苷酸抑制剂在Diasand Stein(2002,Eur.J.Pharm.Biopharm.)DOI:10.1016/S0939-6411(02)00060-7中讨论。PNT2258是反义寡核苷酸Bcl-2抑制剂的脂质体制剂，已经由ProNAi Therapeutics,Inc.开发(参见例如Ebrahim et al.,2016,DOI:10.18632/oncotarget.9872或Tolcher et al，上文引用)。
小分子Bcl-2抑制剂
抑制Bcl-2的小分子的实例是ABT-737和纳维托克(ABT-263)及维奈托克(ABT-199)。Abbott Laboratories开发了ABT-737和纳维托克，其是一组BH3模拟小分子抑制剂(SMI)的一部分，靶向Bcl-2家族蛋白，但不靶向A1或Mcl-1。由于其对于Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w的亲和性更高，因此优于以前的Bcl-2抑制剂。体外研究表明，来自B细胞恶性肿瘤患者的原代细胞对ABT-737敏感，ABT-737是优选的Bcl-2抑制剂。ABT-737不直接诱导细胞凋亡；其增强细胞凋亡信号的作用，并在小细胞肺癌和淋巴瘤细胞系中引起基于单药机制的细胞杀伤。在动物模型中，其提高了存活率，导致肿瘤消退并治愈了很高百分比的小鼠。在使用患者异种移植物的临床前研究中，ABT-737显示出治疗淋巴瘤和其他血癌的功效。
Abbvie开发了高选择性抑制剂维奈托克(ABT-199)，其抑制Bcl-2，但不抑制Bcl-xL或Bcl-w。临床试验研究了维奈托克(一种旨在阻断Bcl-2蛋白功能的BH3模拟药物)对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的影响(Roberts et al.,2016,doi:10.1056/NEJMoa1513257)。据报道反应良好，未观察到血小板减少症，这使得维奈托克成为一种高度优选的Bcl-2抑制剂。其于2016年4月被美国FDA批准作为与17-p缺失相关的CLL的二线治疗。2018年6月，FDA扩大了对任何患有CLL或小淋巴细胞性淋巴瘤(无论是否存在17p缺失)的批准，仍作为二线治疗。
在优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂具有通式B1：
其中可变部分的定义(由带有数字和/或字母上标的字母表示)如WO2011149492的权利要求1所提供。这些化合物及其合成从WO2011149492中获知。优选的通式B1化合物具有如WO2011149492的第76页第19行至第85页第26行所定义的可变部分，更优选如第84页第28行至第93页第2行所定义。
在优选的实施方案中，通式B1的Bcl-2抑制剂具有通式B2：
其中可变部分的定义(由带有数字和/或字母上标的字母表示)如EP2435432B1的[0007]中所提供，更优选如EP2435432B1的权利要求2所提供。这种Bcl-2抑制剂及其制备从EP2435432B1已知。优选的通式B2的化合物为EP2435432B1的[0008]中所述的化合物或其药学上可接受的盐；更优选的通式B2的化合物为EP2435432B1的[0009]至[0028]中所述的化合物或其药学上可接受的盐；最优选的通式B2化合物是4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺或其治疗上可接受的盐，及4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[(反式-4-羟基-4-甲基环己基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺或其治疗上可接受的盐。在优选的实施方案中，通式B2的化合物是4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺或其治疗上可接受的盐。在优选的实施方案中，通式B2的化合物是4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[(反式-4-羟基-4-甲基环己基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺或其治疗上可接受的盐。
在优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂是ABT-199(维奈托克)、ABT-737、ABT-263(纳维托克)或PNT2258。在一个更优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂是维奈托克或PNT2258。在其它优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂选自4-(4-{[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基}-1-哌嗪基)-N-[(4-{[(2R)-4-(4-吗啉基)-1-(苯硫基)-2-丁烷基]氨基}-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基)磺酰基]-苯甲酰胺(纳维托克或ABT-263)；tetrocarcin A；抗霉素(antimycin)；棉酚(优选(-)-醋酸棉酚，称作AT101)；奥巴克拉(obatoclax)(优选地，奥巴克拉是其甲磺酸盐)；2-氨基-6-溴-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-4H-色烯-3-羧酸乙酯(HA 14-1)；奥利美生；Bak BH3肽；4-[4-[(4’-氯[1,T-联苯]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-A/-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737)；2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4’-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6)-四氢-[1,T-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-N-((3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基))苯基)磺酰基)苯甲酰胺(维奈托克)；及S55746(BCL201)，或其药学可接受的盐。S55746从在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者的临床试验中获知(见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02920697)。
维奈托克的结构式为C45H50ClN7O7S(4-(4-{[2-(2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己基-2H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺))。维奈托克与Bcl-2的两个疏水口袋结合，并在维奈托克的氮杂吲哚氮与BLC-2的Asp103和Arg107之间形成氢键。这种静电相互作用阻止了Bcl-2对BAK和BAX的抑制作用，因此这些蛋白质可以启动内在的细胞凋亡途径(Scheffold et al.,2018，同上；Moia et al.,2018，同上)。尽管这种药物以高亲和性选择性结合Bcl-2，但其也以显著较低的亲和性结合促凋亡的BCL-XL和BCL-W，然而没有报道对促凋亡蛋白MCL-1具有活性(Scheffold et al.,2018，同上；Moia et al.,2018，同上)。
优选的Bcl-2的结构如下表所示。这些化合物已为本领域所知。
在优选的实施方案中，Bcl-2抑制剂选自上表中的化合物1至11，更优选地其选自化合物1、2、3、4、5、6、7、9和10，甚至更优选地其选自化合物1、2、3、4、5、6、7和10，更优选地其选自化合物1、2、3、4和5，最优选地选自化合物1、2和5。
在优选的实施方案中，将Bcl-2抑制剂或包含这种Bcl-2抑制剂的组合物施用至少一个周期5天；甚至更优选地，这种Bcl-2抑制剂是小分子，最优选是维奈托克。
药物组合物
在另一方面，本发明涉及包含本文定义的抗CCR7抗体(或其抗原结合片段)、本文定义的BTK抑制剂和本文定义的Bcl-2抑制剂中的至少一种的药物组合物，其用于根据本发明的用途。所述药物组合物优选至少包含所述BTK抑制剂、所述Bcl-2抑制剂和所述抗CCR7抗体或这些活性成分的药学衍生物或前药中的至少一种，以及药学上可接受的载体、辅剂或载具，用于向个体施用。所述药物组合物可通过向有需要的个体施用有效量的组合物而用于下文所述的治疗方法中。术语“个体”在本文中与术语“接受者”可互换使用，且如本文所用，是指归类为哺乳动物的所有动物，包括但不限于灵长类动物和人。所述个体优选地是任何年龄或种族的男人或女人。对患者的治疗一线、二线或三线的治疗
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用方式相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(见例如“Handbookof Pharmaceutical Excipients”,Rowe et al eds.7th edition,2012,www.pharmpress.com)。本领域熟知这种介质和试剂对于药物活性物质的用途。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则均考虑其在组合物中的用途。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒性的，且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯(alkyl parabens)，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的平衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明的抗体可以与所述BTK抑制剂和所述Bcl-2抑制剂一起配制在相同的药物组合物中，或者每种活性剂可以配制在其自己的药物组合物中。优选的施用途径决定每种活性剂的优选制剂。由于肠胃外途径是抗体的优选施用途径，而至少一些BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂的优选给药途径是口服，因此所述抗体优选配制在与所述抑制剂不同的药物组合物中。所述抗体和所述BTK-和Bcl-2抑制剂中至少一种的施用可以同时或依次进行，并且以任一顺序均可以是有效的。
补充的活性化合物也可以加入到本发明的药物组合物中。因此，在特定实施方案中，本发明的药物组合物还可包含被治疗的特定适应症需要的一种以上的活性化合物，优选不会不利影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。例如，可需要进一步提供化疗剂、细胞因子、镇痛剂或免疫调节剂，例如免疫抑制剂或免疫刺激剂。除此之外，这种其它活性剂的有效量取决于药物组合物中存在的本发明抗体的量、疾病或病症或治疗的类型等。
在一个实施方案中，本发明的抗体与将保护所述化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，所述免于从体内快速消除的载体例如控释制剂，包括植入体和微囊化释放系统，例如脂质体。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。脂质体悬浮液，包括靶向脂质体也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利4,522,811或US 2011305751所述，其通过援引加入本文。
本发明的抗体(或其片段)的施用途径可以是口服、肠胃外、吸入或局部。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、动脉内、淋巴管内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。优选肠胃外施用的静脉注射形式。“全身施用”是指口服、静脉内、腹膜内和肌内施用。当然，治疗性或预防性作用所需的抗体量根据所选抗体、所治疗病况的性质和严重程度以及患者而变化。此外，抗体可以通过脉冲输注适当地施用，例如以递减剂量的抗体。优选通过注射给药，最优选静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的药物组合物可以是适合肠胃外施用的形式，例如合适单位剂型的无菌溶液、悬浮液或冻干产品。适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性情况中)或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的且应该是易于注射程度的流动状态。其在生产和储存条件下必须是稳定的，且必须防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其例如包含例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其合适混合物。可以通过使用如卵磷脂包被、通过在分散的情况中维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现防止微生物的作用。在一些情况中，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过根据需要将活性化合物(例如BTK抑制剂和/或Bcl-2抑制剂或抗CCR7抗体)以需要量与上文列举的成分的一种或组合掺入适当的溶剂中，然后过滤除菌来制备。通常，分散体是通过将活性化合物掺入到无菌载具中而制备，所述无菌载具包含基本分散介质和上文列举的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
在一个特定实施方案中，所述药物组合物通过静脉内(IV)或皮下(SC)施用。可以使用足够的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。所提及的制剂是使用本领域熟知的及在各种来源中更详细描述的制备可肠胃外施用的组合物的标准方法制备，包括例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(Ed.Allen,L.V.22nd edition,2012,www.pharmpress.com)。
特别有利的是以易于施用和均匀剂量的单位剂型配制药物组合物，即肠胃外组合物。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含经计算与所需的药物载体组合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物(本发明的抗体)。本发明的单位剂型的规格由活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及合成这种用于治疗个体的活性化合物的领域中固有的限制支配且直接取决于活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及合成这种用于治疗个体的活性化合物的领域中固有的限制。
通常，本发明抗体的有效施用量将取决于所选化合物的相对功效、所治疗病症的严重程度和患者的体重。然而，活性化合物通常将每天施用一次或多次，例如每天1、2、3或4次，其典型的每日总剂量范围为0.001-1,000mg/kg体重/天，优选约0.01-100mg/kg体重/天，最优选约0.05-10mg/kg体重/天。更具体地，用于根据本发明的用途，抗CCR7抗体优选以1-1000、2-500、5-200、10-100、20-50或25-35mg/kg体重/天的剂量施用，优选以每1、2、4、7、14或28天一次的剂量数施用。
除了向患者施用抗体之外，本申请考虑通过基因疗法施用抗体。WO 96/07321涉及使用基因疗法产生胞内抗体。
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明的抗体和药物组合物可以与其它药物一起使用以提供组合疗法。所述其它药物可以构成同一组合物的部分，或者作为在同时或不同时间施用的分开的组合物提供。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，涉及某元件时使用的英文不定冠词“a”或“an”不排除存在多个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元件。因此，不定冠词“a”和“an”通常表示“至少一个”。
当与数值(例如约10)关联使用时，单词“约”或“大约”优选表示该数值可以是比给定数值(10)多或少0.1％的值。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均以其全部内容通过引用并入本文。
通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
附图简述
图1：用BTK抑制剂治疗的患者维持CCR7表达。
在用BTK抑制剂治疗的CLL患者中，CCR7表达略微减少(依鲁替尼)或不变(阿卡替尼或泽布替尼)。在外周血样本的原代CLL细胞中测定CCR7和CD20的表达，所述外周血样本来自未经治疗的患者(n＝125)、接受依鲁替尼治疗的患者(OT，n＝44)、患有对依鲁替尼复发/难治性疾病的患者(RR，n＝16)、接受阿卡替尼治疗的患者(ACALA，n＝5)、或接受泽布替尼治疗的患者(ZANA，n＝4)。A)根据荧光的相对中值强度(RMIF，相对于不相关的同种型对照)分析表面CCR7(或CD20)的表达。B)根据表达所述受体的恶性细胞的比例分析表面CCR7(或CD20)的表达。
图2：恶性细胞中的CCR7表达很高，与当前或以前的治疗无关。
A)该图示出一名代表性的初始(未经治疗的)CLL患者、一名接受依鲁替尼(OT)的代表性CLL患者、一名未能接受依鲁替尼(RR)的代表性CLL患者和一名接受维奈托克的代表性CLL患者的CCR7表达。在每名患者中，CCR7表达被公开为与匹配的不相关对照相比的频率直方图。标记区域基于这些不相关无关对照而放置。每个直方图示出用抗CCR7-PE标记的细胞的荧光强度。还示出了CCR7阳性细胞(在标记内)的比例。B)开始使用BTK抑制剂依鲁替尼治疗的四名CLL患者中CCR7和CD20表达的变化。对于每位患者，示出了依鲁替尼施用前(N)和施用后(Y)的CCR7表达(测定为RMIF)。
图3：CCR7表达在接受Bcl-2抑制剂治疗的患者中得以维持。
CCR7表达在来自用维奈托克治疗的患者的基本上所有CLL细胞中得以维持。在CLL细胞中测定CCR7和CD20的表达，该CLL细胞来自未经治疗的患者(n＝125)或接受维奈托克治疗的患者(OT，n＝11)的外周血样本。A)根据荧光的相对中值强度(RMIF，相对于不相关的同种型对照)分析表面CCR7(或CD20)的表达。B)根据表达所述受体的恶性细胞的比例分析表面CCR7和CD20的表达。
图4：依鲁替尼治疗(体内)不中和CLL细胞中由CCR7介导的迁移。
A)在得自未经治疗的患者(N，n＝7，黑条)的CLL细胞及得自接受依鲁替尼治疗的CLL患者(OT，n＝10，灰条)的细胞中进行迁移指数(输入％)对比分析。迁移是通过将CLL细胞暴露于CCR7配体CCL19(1μg/ml)或CCL21(1μg/ml)来实现的。在趋化性测定中测试迁移，其中将细胞置于空白transwell室中。测定在37℃下进行4小时。不由趋化刺激介导的自发迁移被认为是基础迁移(此时未添加趋化因子)。B)在暴露于CCR7配体CCL19(1μg/ml)或CCL21(1μg/ml)之前，在得自未经治疗的患者(n＝7)的CLL细胞中进行迁移指数(输入％)的对比分析，所述细胞暴露于不同浓度的依鲁替尼终浓度(0-载剂/DMSO；0.01、0.1、1、10μM)1小时。在趋化性测定中测试迁移，其中将细胞置于空白transwell室中。在37℃进行4小时测定(在所有迁移期间都存在依鲁替尼)。不由趋化刺激介导的自发迁移被认为是基础迁移(此时未添加趋化因子)。作为阳性对照，使用未暴露于依鲁替尼的细胞(黑条)。在A和B中，条形表示平均值±平均值标准误差(SEM)。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01。
图5：用0.1μM的依鲁替尼治疗(体外)24小时不中和CLL细胞中由CCR7介导的迁移。
在暴露于CCR7配体CCL19(1μg/ml)或CCL21(1μg/ml)之前，在得自未经治疗的患者(n＝6)的CLL细胞中进行迁移指数(输入％)的对比分析，将CCL细胞与终浓度为0(载剂/DMSO)或0.1μM的依鲁替尼温育24小时。在趋化性测定中测试迁移，其中将细胞置于空白transwell室中。迁移测定在37℃下进行4小时。不由趋化刺激介导的自发迁移被认为是基础迁移(此时未添加趋化因子)。作为阳性对照，使用未暴露于依鲁替尼的细胞(黑条)。条形代表平均值±平均值的标准误差(SEM)。ns，不显著；*，p<0.05。
图6：用抗CCR7抗体CAP-100进行的治疗中和接受BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂治疗的患者的CLL细胞的CCR7介导的迁移。
对于从接受维奈托克(A)的患者获得的CLL细胞或从接受依鲁替尼(B)的患者获得的CLL细胞示出CCR7配体相互作用的特异性阻断，以迁移输入细胞百分比的减少表示。将CLL细胞与不同终浓度(100、10、1、0.1、0.01、0μg/ml)的抗CCR7抗体(CAP-100)一起温育。随后，将细胞置于transwell室中并暴露于1μg/ml的趋化因子CCL19(白条)和CCL21(灰条)。在37℃下对空白transwell室进行迁移测定4小时。基础迁移是自发迁移，不是由趋化刺激介导的——此时不添加趋化因子或mAb。当添加趋化因子但不存在CAP-100时观察到最大迁移(点0)。
图7：依鲁替尼与抗CCR7抗体CAP-100的组合对CCR7配体诱导的迁移的影响。
在对CCR7配体[CCL19(1μg/ml)或CCL21(1μg/ml)；在空白transwell室中]进行趋化性测定之前，在得自未经治疗的患者(n＝5)的CLL细胞中进行迁移指数(输入％)对比分析，将CCL细胞与抗CCR7抗体(CAP-100；10μg/ml)、依鲁替尼(0.1μM)或这两种化合物的组合(CAP-100，10μg/ml；依鲁替尼，0.1μM)一起温育。不由趋化刺激介导的自发迁移被认为是基础迁移(此时未添加趋化因子；白条)。作为阳性对照，使用未与抗CCR7抗体或依鲁替尼预温育的细胞(黑条)。条形代表平均值±平均值的标准误差(SEM)。ns，不显著；*，p<0.05。
图8：来自接受BTK或Bcl-2抑制剂治疗的患者的CLL细胞中的CCR7表达可在结合抗CCR7抗体后有效诱导细胞死亡。
在一名接受依鲁替尼治疗的患者(A)、一名接受泽布替尼治疗的患者(B)、一名接受维奈托克的患者(C)和一名患有对依鲁替尼复发/难治性疾病患者(D)中测定了ADCC活性。在所有情况下，将CLL细胞在存在不相关的匹配同种型对照下温育，或与抗CD20抗体(利妥昔单抗，RTX)或与抗CCR7抗体(CAP-100)温育。在不同的最终浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μg/ml)下测试抗体。为了进行ADCC，以10:1的固定E:T比率使用分离的PBMC(外周血单核细胞)作为效应细胞。基于7-氨基放线菌素D(7-AAD)的掺入，通过流式细胞术测定被ADCC杀死的CLL细胞的百分比。示出了由所述抗体诱导的特异性裂解的比例。
实施例
导言
趋化因子受体CCR7控制某些免疫细胞亚群向淋巴结的迁移，此外它还有助于免疫细胞的组构和激活(Legler et al.,Int J Biochem Cell Biol.2014；54:78-82)。与淋巴起源一致，几种淋巴结受累的血癌表达CCR7(López-Giral et al.,J Leukoc Biol.2004；76(2):462-71)。在这种病症中，CCR7表达与巨大淋巴结病、侵袭性病症和短生存期相关(Legler et al.,2014；同上)。具体而言，在B细胞恶性肿瘤中，CCR7表达有助于延长肿瘤细胞在LN中的驻留，并将肿瘤细胞向可以取得促肿瘤信号的微环境引导(Rehm et al.,Blood,2011；118(4):1020-33)。
最近，一些报道披露，依鲁替尼治疗CLL细胞导致表面CCR7的下调，此外，这还转化为随后的CCR7介导的迁移和CCR7介导的粘附受损(Patrussi et al.,2015；同上75(19):4153-63；de Rooij et al.,2012；同上)。作为这些工作的结果，有人提出由依鲁替尼介导的一种脱靶效应是减少淋巴结迁移，这部分地由CLL细胞中增加的表面CCR7恢复至B细胞中正常表达的水平所导致。类似地，已经报道了关于CCR7和Bcl-2的表达谱的正反馈(Kim etal.,2005；同上)。
基于所描述的发现，预期BTK抑制剂和/或Bcl-2抑制剂与抗CCR7抗体的组合不会改善对恶性细胞向淋巴结(或其它SLO)迁移的治疗性抑制作用。此外，基于先前报道的CCR7表达丧失，旨在靶向CCR7以杀死肿瘤细胞的治疗方法会被排除，并且预计不会提高BTK或Bcl-2抑制剂的个体治疗效果。
在本文中，本发明人记录了BTK或Bcl-2抑制剂对CLL患者中CCR7表达的影响，并进行了几种方法来研究这些化合物是否会对CCR7触发的功能(如迁移)产生负面影响，以及这些化合物由于靶细胞表面缺乏CCR7表达而是否可以阻止由抗CCR7抗体介导的有效靶细胞杀伤。
材料和方法
样品
使用ficoll-paque加上密度梯度离心(Amersham Biosciences)从新鲜捐赠的外周血中分离患者的白血病细胞。将分离的细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中在37℃和5％二氧化碳条件下保持短期培养。正常外周血单核细胞(PBMC)从在ficoll梯度后的成人血沉棕黄层中获得并维持在如上所述的完全培养基中。在所有情况下，患者和健康捐赠者都根据赫尔辛基宣言签署了知情同意书。实验程序得到了Institutional review Board of theHospital de la Princesa的批准。
这项研究包括三种类型的患者样本(n＝196)：
1)未经治疗的患者(即，之前未使用BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂治疗的患者)。
2)依鲁替尼(或其他BTK抑制剂)治疗的患者。
3)依鲁替尼R/R患者。
CCR7表达
CLL细胞中CCR7和CD20表达的流式细胞术分析使用四色单克隆抗体组进行：CD19-APC-H7(BD Biosciences)、CD3-FITC(BD Biosciences)、CD5-APC(BD Biosciences)和CCR7-PE(R&D System)或CD20-PE(R&D Systems)。对CD19+CD3-CD5+CLL群体进行了研究。包括与PE缀合的适当匹配的同种型对照(IC)(R&D Systems)。为了测定受体表达，将106个细胞(在约50μl PB中)与所述抗体在室温(RT)下温育15至20分钟。将细胞用BD FACSTM裂解溶液(BD Biosciences)在RT下裂解10分钟，然后以1,800rpm离心2分钟。然后，用2mlDulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza)洗涤细胞，最后以1,800rpm离心2分钟。在BDFACSCantoTM II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行数据采集。使用BD FACSDIVATM软件分析了最少10,000个CLL细胞。结果表示为CCR7和CD20阳性细胞的百分比[受体％-对照％]以及与IC[MIF(受体)/MIF(对照)]相比CCR7和CD20表达的相对中值荧光强度(RMFI)。
趋化性测定(迁移)
通过在Biocoll分离溶液密度梯度离心机(MerckMillipore)上离心分离PBMC。将PBMC用盐水溶液(Fresenius)洗涤两次并在1200离心10分钟。将细胞悬浮在补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI 1640培养基(GIBCO)中，浓度为5×106个细胞/ml。当需要时，以及在趋化性测定之前，将细胞与以下试剂预温育：a)依鲁替尼，室温1小时；不同的终浓度；b)依鲁替尼，37℃温育24小时；不同的终浓度；b)抗CCR7 mAb，室温0.5小时。趋化性在Transwell室(直径6.5mm，增厚10μm，孔径5μm，Costar)中进行。仅包括来自患者的肿瘤细胞>90％的样本。将悬浮在RPMI-1640、0.1％BSA中的共计5×105个细胞加样于上室，并将趋化因子CCL19或CCL21(1μg/ml，Peprotech)加入下孔中。在37℃和5％CO下4小时后，收集下室中的细胞，并用抗CD3-PE(BD Biosciences)和抗CD5-APC(BD Biosciencies)染色。将迁移的细胞在BD FACSCantoTM II流式细胞仪中计数60秒。根据以下公式计算迁移细胞的百分比(输入％)：100×(下室中的细胞数/加样于上室中的细胞数)。一旦计算了输入％，通过以下公式估算抑制％：抑制％＝[(无mAb的输入％-具有mAb的输入％)×100]/[无mAb的输入％]。此外，结果以相对于每种趋化因子(CK)介导的最大效应的输入％表示，其计算方式为：相对于CK的输入％＝100×(输入％/具有CK的输入％)。
抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)
如SR-HPM-1026中所述进行ADCC测定。简而言之：将靶肿瘤细胞与单独的培养基(RPMI+10％FBS)或在存在IC、利妥昔单抗、阿仑珠单抗或CAP-100抗体下以不同的最终浓度在37℃温育30分钟。洗去未结合的抗体(1800rpm，2分钟/两次)并将细胞以105个细胞/孔铺板在p96 U底平板中。通过ficoll密度梯度离心获得来自健康供体的人PBMC。根据制造商的方案，用钙黄绿素-UV Cell-Tracker(Invitrogen)标记效应细胞，并用重组人IL-2(500UI/ml，StemCell Technologies)刺激。使用不同的效应物:靶标(E:T)比率[10:1用于剂量反应测定，(5:1、25:1、50:1)用于E:T测定]。6小时后，用7AAD、CD3-PE和CD5-APC对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。在Cell-Tracker-CD5+CD3-CLL细胞中特异性裂解的百分比通过掺入7-AAD(BD Pharmingen)确定，并根据以下公式计算：特异性裂解％＝100×(ER-SR)/(MR-SR)。ER、SR和MR代表实验性、自发性和最大细胞死亡。
统计学分析
对于统计学分析，进行如下步骤：
1)用KS和/或Shapiro-Wilk和/或D`Agostino&Pearson正态性检验测试同质性。
2)Bartlett检验用于核验方差的同质性。
3)对于参数变量，使用ANOVA(单因素方差分析，然后是Dunett的多重比较检验)或两样本t检验比较组均值。
4)对于非参数变量，采用Kruskal-Wallis(随后是Dunns多重比较检验)和两样本Mann-Whitney U检验比较组中位数。当分析配对样本时，使用Wilcoxon或Friedman检验。
5)所有数据均使用Graph-Pad Prism 5(GraphPad Software,SanDiego,CA)进行分析。所有检验都是双边的。P<0.05被认为具有统计学意义。除非另有说明，否则为每组提供平均值和标准误差(SEM)。
为了计算EC50值，使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,Inc.)。为此，选择了具有稳健拟合模式(标准斜率)的全局非线性回归、剂量反应刺激等式。
结果
在用BTK或Bcl-2抑制剂治疗的CLL患者中，CCR7的表面表达得以维持。
由于以前的工作报道了用依鲁替尼治疗的CLL细胞中表面CCR7的大量损失，因此本研究的第一个目的是在更大的CLL患者队列中验证这些结果。出于这个原因，我们测量了125份来自未经BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂治疗的患者的样本、44份来自在测定时接受依鲁替尼治疗的患者的样本以及16份来自因发展为复发/难治性疾病而放弃依鲁替尼治疗的患者的样本中的表面CCR7。引人注目的是，我们观察到在用BTK抑制剂治疗期间CCR7表达得以维持。如图1-A-B和图2-A所示，我们观察到接受依鲁替尼作为当前治疗的患者继续表现出明显的表面CCR7表达。一般而言，在接受依鲁替尼治疗的患者中观察到轻微但显著的下调，但仍有约100％的CLL细胞维持表面表达(根据CCR7表达细胞的百分比测定)，并且还保持高表面水平(以RMIF测定)。事实上，接受治疗的患者的表面水平仍然超过200个任意单位。换句话说，表达仍然比阴性的不相关同种型对照高200倍。在接受其它BTK抑制剂(如阿卡替尼或泽布替尼)治疗的患者中，未观察到CCR7细胞表面表达的变化。最后，在依鲁替尼R/R CLL细胞的情况下，CCR7表面水平与未经治疗的患者的相应水平相似(甚至更高)(图1-A-B和图2-A)。
有趣的是，在CD20(一种已知被依鲁替尼治疗而下调或丧失的受体)的情况下，我们证实BTK抑制剂导致CD20表面水平的显著下调。例如，所述治疗导致某些患者的CD20完全丧失，这通过与未经治疗的患者相比CD20阳性细胞比例降低而确定(图1-A-B)。
因此，在图2-B中示出了与开始依鲁替尼治疗的时间(Y)相比，依鲁替尼治疗如何导致四名患者(4/4)的CD20表面水平持续下调，而在CCR7的情况下总体情况基本保持不变，其中一名患者大幅减少(1/4)，另一名患者轻度减少(1/4)，但另外两名患者增加(2/4)。最后，与CCR7显著不同的是，依鲁替尼R/R CLL细胞中的CD20表达甚至低于接受依鲁替尼的患者(图1A和2B)。
在用Bcl-2抑制剂治疗的CLL患者中，CCR7的表面表达得以维持。
在得自接受维奈托克治疗的患者的CLL细胞中，我们观察到大约100％的CLL细胞保持表面表达(以CCR7表达细胞的百分比测定)，并且还保持高表面水平(以RMIF测定)。与依鲁替尼一样，维奈托克治疗的患者的表面水平仍比阴性的不相关同种型对照高约150至250倍(图2-A和图3-A-B)。
BTK抑制剂治疗不中和由CCR7介导的迁移
一旦确定BTK抑制剂不诱导CLL细胞表面CCR7有意义的丧失，我们旨在确认这些化合物通过可能损害CCR7配体诱导的迁移的额外机制对由CCR7介导的功能可能具有负面影响。为此，我们对得自未经治疗(N)的患者与接受依鲁替尼(OT)治疗的患者的CLL细胞的体外趋化反应进行了比较分析(图4-A)。在两组患者中，基础迁移指数相似，并且在两组中，CLL细胞显著朝向CCR7配体迁移。尽管观察到OT组的迁移指数略有下降，但这些值与N组没有显著差异，表明BTK抑制剂对CCR7诱导的迁移仅具有边际效应。此外，OT组的迁移指数没有达到基础水平，表明BTK抑制剂治疗未完全中和CCR7诱导的迁移。
为了进一步证实这一点，我们在transwell室中进行了体外趋化性测定。在这些环境中，在暴露于CCR7配体(黑条)之前，将来自未经治疗的患者的CLL细胞与增加浓度的依鲁替尼(0，0.01，0.1，1，10μM)一起温育1小时。如图4-B所示，依鲁替尼预处理的迁移指数与CCR7配体诱导的对照迁移相当。仅当以0.1μM施用时，依鲁替尼对朝向CCL21的迁移显示出中度(不过不显著)的影响。
由于缺乏依鲁替尼抑制可能与使用的短温育时间(趋化前1小时+趋化测定期间额外4小时)有关，我们决定进行新的实验，将未经治疗的CLL细胞与0.1μM依鲁替尼一起温育24小时，之后测试趋化性。同样，如图5所示，在CCR7介导的CLL细胞朝向CCL19的迁移中没有观察到依鲁替尼的影响，在朝向CCL21的迁移指数中观察到轻微的、不显著的影响。
总之，这些结果表明，由CCR7诱导的CLL细胞迁移不受先前使用依鲁替尼的体内或体外治疗的显著影响。换句话说，由BTK抑制剂介导的作用被证明不足以消除CCR7介导的迁移，而阻断CCR7的制剂对于实现完全中和CCR7介导的向LN的迁移是必要的。尽管如此，在接受依鲁替尼的患者中，抗CCR7作为阻断剂的效用仍未得到解决。此外，如图1-A所示，CCR7表面水平的轻微下调可能会对这组接受依鲁替尼治疗的患者中CAP-100的活性产生负面影响。由于这些原因，我们测试了CAP-100在得自10名接受依鲁替尼治疗的CLL患者的CLL细胞中的中和活性。如图6所示，CAP-100对得自一名接受维奈托克治疗的患者(图6-A)或一名未接受依鲁替尼治疗的患者(图6-B)的CLL细胞显示出明显的剂量反应抑制活性。在这两种情况中，朝向CCL19或CCL21的迁移指数在用10或100μg/ml抗体处理后均达到基础水平。这些结果证实，来自这些患者组的CLL细胞仍然对CCR7配体有反应，并且抗CCR7疗法可能是削弱CCR7诱导的迁移的最佳方式。
我们进一步测试了依鲁替尼与抗CCR7抗体如CAP-100的组合是否对CCR7配体诱导的CLL细胞迁移具有累加或协同的中和作用。为此，在暴露于CCL19或CCL21之前，将来自未经治疗的患者的CLL细胞与作为单一药剂的依鲁替尼(0.1μM)、与作为单一药剂的CAP-100(10μg/ml)以及与两种化合物的组合进行温育。化合物浓度的选择基于先前关于依鲁替尼(图4B)和CAP-100(图6)作为CCR7介导的迁移抑制剂的结果。如图7所示，作为单一疗法的依鲁替尼对CCR7诱导的迁移没有影响，因此证实了图4B和图5所示的结果。正如预期的那样，使用CAP-100治疗可实现将迁移减少至基础水平，从而证实CAP-100是一种有效的抑制由CCR7配体触发的迁移的药剂。当CCL21用作配体时，依鲁替尼与CAP-100的组合表现出由抗CCR7抗体作为单药获得的中和活性的适度但不显著增加，因此表明通过组合两种化合物可以获得潜在的协同作用(图7)。尽管需要进一步验证，但这种效应似乎对CCL21具有特异性，因为当用这种组合处理的CLL细胞暴露于CCL19时，没有观察到类似的结果。
来自接受BTK或Bcl-2抑制剂治疗的患者的CLL细胞中的CCR7表达可在结合抗CCR7抗体后有效诱导细胞死亡。
在基于抗体的疗法中，高靶表面水平对于实现由效应子免疫机制如ADCC、ADCP或CDC介导的有效杀伤活性是必需的。实际上，需要两个抗体与靶紧密结合以成功完成任何列举的机制[12]。我们的表达结果表明，在用BTK抑制剂处理后，表面CCR7水平略有降低，不过没有观察到表达所述受体的肿瘤细胞比例的降低。出于这个原因，我们测定了在接受BTK抑制剂治疗的患者中观察到的RMIF降低是否会对抗CCR7抗体介导的杀伤活性具有负面影响。为此，我们进行了一组ADCC测定，其中将来自接受依鲁替尼治疗(图8A)、接受泽布替尼治疗(图8B)、接受维奈托克治疗(图8C)的患者或来自依鲁替尼R/R患者(图8D)的靶CLL细胞与增加浓度的CAP-100、利妥昔单抗(用作参考治疗性抗体)或IC一起温育，然后将细胞与得自健康供体的效应子免疫细胞一起温育，效应子:靶细胞比率固定为10:1。
如图8所示，CAP-100在所有四组患者中均表现出有效的ADCC活性。值得注意的是，CAP-100的表现优于利妥昔单抗。这些结果证实，在目前的情况下，在接受BTK或Bcl-2抑制剂治疗的患者中观察到的表面CCR7水平的轻微降低对ADCC等抗体介导的免疫效应子机制没有负面影响。这些结果进一步证实了基于BTK抑制剂或Bcl-2抑制剂与抗CCR7抗体如CAP-100的组合的效用。
序列表
<110> 弹射器治疗有限公司; 免疫学及医药品有限责任公司
<120> 抗CCR7抗体在与BTK抑制剂和/或BCL2抑制剂的组合疗法中治疗血液恶性肿瘤的用途
<130> P6083394EP
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Pro Gly Leu Thr Phe Arg Asp Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Ala Tyr Arg Tyr Asp Gly Thr Gly Asp Tyr Ser Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Pro Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> SYM1899: 对应于人CCR7的氨基酸19-49的合成硫酸化肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 吡咯烷酮羧酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 硫酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 硫酸化
<400> 3
Glu Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Asp Asn Thr Thr Val Asp
1 5 10 15
Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys Ser Lys Lys Asp Val Arg Asn Lys
20 25 30
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人源化VH1结构域
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asp Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Val Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Ala Tyr Arg Tyr Asp Gly Thr Gly Asp Tyr Ser Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人源化VK1结构域
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Pro Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成人抗体
<400> 6
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Gly Ser Ser Thr Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成人抗体
<400> 7
Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr Gln
35 40 45
Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn
50 55 60
Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp
65 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Gly Ser Ser Thr Val Ile Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成人抗体
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Val Phe Leu Gln Asp Asn Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 330
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 具有E333A取代的人同种异型G1m(17,1)的合成重链恒定区
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 11
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成人抗体重链
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Pro Arg Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Thr Ile Ser Tyr Thr Pro Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成人抗体轻链
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (15)
1.用于治疗过度增殖性血液病症之用途的抗CCR7抗体，其中所述病症是以下中的至少一种：
a)用Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂和B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制剂中的至少一种治疗的病症；
b)在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种治疗后复发的病症；及
c)对于用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种进行的治疗难治的病症。
2.用于如权利要求1所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗体是与BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂中的至少一种同时、分开或依次施用。
3.用于如权利要求1或2所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述过度增殖性血液病症是其中过度增殖细胞是B细胞谱系的细胞的病症，其中所述病症优选是B细胞血液恶性肿瘤，更优选是淋巴瘤或白血病。
4.用于如权利要求4所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述血液恶性肿瘤选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、高危CLL、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危SLL、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、
巨球蛋白血症(WM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特淋巴瘤(BL)、毛细胞白血病(HCL)、Richter转化和T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)。
5.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗CCR7抗体的IC50不超过100nM，以通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体抑制CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少之一。
6.用于如权利要求5所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗CCR7抗体抑制CCR7依赖性细胞内信号传导而没有显著的激动(agonistic)作用。
7.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗-CCR7抗体对人CCR7的N-末端胞外结构域的Kd比参考抗-CCR7抗体的Kd高不超过20倍，其中所述参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
8.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗CCR7抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.用于如权利要求8所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述抗CCR7抗体是具有抗人CCR7抗体的HVR的抗体，所述抗人CCR7抗体的重链可变域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
10.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼、泽布替尼(zanabrutinib)或阿卡替尼，并且其中所述Bcl-2抑制剂是维奈托克或纳维托克(navitoclax)。
11.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述过度增殖性血液病症是未经治疗
的患者的病症。
12.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述过度增殖性血液病症是未接受过用BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗CCR7抗体中的至少一种进行的治疗的患者的病症。
13.用于如权利要求12所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述过度增殖性血液病症对用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂进行的治疗而言是难治的和/或在用除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂治疗之后复发。
14.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述过度增殖性血液病症对用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂以及除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂中的至少一种进行的治疗而言是难治的和/或在用BTK抑制剂和Bcl-2抑制剂以及除了BTK抑制剂、Bcl-2抑制剂和抗-CCR7抗体以外的化疗剂中的至少一种治疗之后复发。
15.用于如权利要求13或14所述的用途的抗CCR7抗体，其中所述化疗剂是氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、idelalisib、抗CD20抗体或抗CD52抗体中的一种或多种，其中所述抗CD20抗体优选为利妥昔单抗(rituximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinituzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)或奥法木单抗(ofatumumab)，其中所述抗CD52抗体优选是阿仑珠单抗(alemtuzumab)。
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