CN115197156B - 一种双功能化蛋白交联剂及其制备和应用 - Google Patents
一种双功能化蛋白交联剂及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的一种双功能化蛋白交联剂及其制备和应用属于交联质谱技术领域，所述双功能化蛋白交联剂是以两个1‑甲基脲唑基团和一个电化学可还原裂解S‑S键为骨架结构的双功能化化学交联剂—4,4'‑(二硫代二基双(乙烷‑2,1‑二基))双(1‑甲基‑1,2,4‑三唑烷‑3,5‑二酮)；制备方法包括化合物2～化合物4的合成、DBMT的合成等，所述双功能化蛋白交联剂可用于构建蛋白质三维结构，步骤包括化学交联反应、酶解反应、电化学还原、质谱测试、质谱数据分析、确定蛋白质三维结构信息等。本发明DBMT合成步骤简单，原料价格低廉环保，交联反应条件温和。
Description
技术领域
本发明属于交联质谱技术领域，具体涉及一种特异性交联酪氨酸和组氨酸的双功能化交联剂的制备及其在蛋白质三维结构鉴定中的应用。
背景技术
蛋白质及蛋白质复合物作为生物体生命活动的主要承担者，它们在相互作用时，通过结构变化来调节、评估这些结构的变化极为重要(Trends Biochem Sci.2018,43(11),908-920)。关于蛋白复合物的分析，绘制蛋白质构象折叠变化、理解蛋白质之间相互作用和蛋白质结构动力学，对理解生物系统、揭示疾病发生发展机制、筛选疾病相关的生物标志物以及寻找药物的靶标具有重大意义。
交联质谱技术(Cross-linking mass spectrometry,XL-MS)已成为解析蛋白质结构和研究蛋白质及蛋白质复合物相互作用的有力技术和重要工具，此技术通过质谱分析由化学交联剂通过共价键紧密连接的氨基酸侧链官能团，确定发生交联的氨基酸位点(Analytical Chemistry 2018,90(1),144-165)。X射线晶体学和核磁共振光谱学传统解析蛋白质结构方法的分辨率可以达到原子水平。但是这两种方法都需要大量的蛋白质，而且对X射线晶体学而言获取质量很高的大分子量蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常困难的，交联质谱中酶切步骤的存在使得质谱直接分析的是蛋白质水解后的多肽，因此蛋白质组装本身的质量是不受限制的(Angewandte Chemie International Edition,2018,57(22),6390-6396)。与传统的蛋白质结构解析和相互作用研究技术相比，交联质谱技术具有分析速度快、通量高、成本低、对蛋白质样品的量和纯度要求低以及可捕获弱相互作用等优势(Prog Biochem Biophys,2014,41(11):1109-1125)。交联质谱技术通过化学交联反应将两个氨基酸共价连接，如果两个交联位点在同一个蛋白质上，则说明两个交联位点在蛋白质的三维结构中的距离小于交联剂的臂长，交联剂的臂长则有助于分析蛋白质的结构，如果两个交联位点处于两个不同的蛋白质或多肽上，则说明两个蛋白质或多肽的交联位点区域离的很近，彼此之间很可能存在相互作用关系。因此，无论蛋白质中还是蛋白质复合物中，无论在体内还是体外，化学交联技术均可以很好的确定其结构信息和相互作用关系。
然而，该技术目前也面临诸多挑战。其中最为严峻的是交联碎片复杂，交联质谱数据的解析率和交联位点数目的鉴定普遍偏低(Nat Commun,2019,10(1):3404)。所以，设计开发可裂解交联剂来简化交联碎片，丰富交联位点的鉴定和提高交联质谱数据的解析就变得极为重要。近些年，可裂解的交联剂受到广大研究者的青睐，国内外很多团队的研究人员设计合成了多种包含不同反应基团的交联剂。Juri Rappsilbe团队设计了含有苯甲酮的非选择性交联剂(sulfo-SBP)(Analytical Chemistry 2017,89(10),5319-5324)，可以与很多个氨基酸发生反应，然而，无法特异性的对目标氨基酸进行修饰；Andrea Sinz团队研发了“零长度”质谱可裂解的偶氮内酯类CDI交联剂(Angewandte Chemie-InternationalEdition 2017,56(46),14551-14555)；Meng-Qiu Dong团队研发了ArGO和KArGO交联剂，因为此交联剂含有芳香乙二醛，可以与含有胍基的精氨酸R反应(Nature Communications2019,10(1),3911)。同时，专利CN107129455A报道了一种多功能化学交联剂的制备方法，在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，用于后续的测序。尽管有很多交联剂可以交联赖氨酸(Journal of Proteomics 2020,218)、谷氨酸(Analytical Chemistry 2018,90(2),1195-1201；Analytical Chemistry 2018,90(4),2805-2809)、天冬氨酸和半胱氨酸(AcsApplied Materials&Interfaces 2016,8(36),23463-23476；Journal of the AmericanSociety for Mass Spectrometry 2019,30(1),139-148)，因为极性的原因，赖氨酸丰富位于蛋白质的表面，使得高反应活性交联酪氨酸的NHS酯等应用型交联剂受到XL-MS的广泛关注，但是，NHS酯半衰期时间很短，交联反应时间却很长，且在水中易水解，因此有必要开发选择性靶向其他利用率要低的氨基酸的交联剂。甲状腺中通过酪氨酸对的碘化和偶联，并通过甲状腺球蛋白(Thyroglobulin、TG)水解完成甲状腺激素合成(Nature 2020,578(7796),627-630)，TG激素位点的酪氨酸足够接近并暴露，才允许TG合成，酪氨酸的邻近性、灵活性和溶剂暴露是激素生成位点的关键特征，酪氨酸对受到其刚性α-螺旋主链的限制，有些偶联反应不能有效发生。Rh2(AcO)4(AcO-＝CH3COO-)与组氨酸的配位是评估其作为潜在抗癌剂的功效的因素(Journal of Inorganic Biochemistry 2021,224)，得知组氨酸的咪唑环基团在Rh2(AcO)4(L-HHis)2·2H2O中是轴向配位有助于对这种潜在抗癌剂的后续了解和应用。选择性地靶向交联蛋白质中的酪氨酸残基和组氨酸残基并且确定其三维构型是非常有应用意义的。基于电点击化学原理，可以成功地实现蛋白质中酪氨酸的标记(Journal of the American Chemical Society,2018,140,17120)。在1O2存在的条件下选择性标记蛋白质和多肽中的组氨酸(H)(Journal of the American Chemical Society2021,143(20),7726-7731)。
发明内容
本发明的目的在于，基于点击电化学标记酪氨酸和1O2存在的条件下选择性标记组氨酸的可行性，设计、合成一种新颖且简单的双功能交联剂4,4'-(二硫代二基双(乙烷-2,1-二基))双(1-甲基-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮)，简称为DBMT，来促进酪氨酸和组氨酸的鉴定。具有交联很少被报道的酪氨酸和组氨酸的双功能化交联剂第一次被设计合成并应用于交联质谱技术分析(XL-MS)，这势必会丰富并提升XL-MS探究蛋白质、蛋白质复合物的结构和相互作用甚至蛋白质动力学的应用。
本发明的具体的技术方案如下：
一种双功能化蛋白交联剂，其特征在于，是以两个1-甲基脲唑基团和一个电化学可还原裂解S-S键为骨架结构的双功能化化学交联剂—4,4'-(二硫代二基双(乙烷-2,1-二基))双(1-甲基-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮)，记为DBMT，结构式为：
一种双功能化蛋白交联剂的制备方法，有以下步骤：
步骤一：化合物2的合成
在惰性气氛下，在反应瓶中，将三乙胺加入到硫酸甲基肼和无水DCM的混合物中,室温下搅拌20min,三乙胺用来中和硫酸甲基肼中的硫酸，随后，将中和后的混合物转移到-60℃冷却浴中，将氯甲酸乙酯缓慢加入到混合物中，撤走冷却浴，室温下反应11h，所得混合物用水萃取一次，用稀NaHCO3萃取两次，将有机层干燥，蒸发溶剂，得到化合物2；按摩尔比，三乙胺:硫酸甲基肼:氯甲酸乙酯＝4:1.3:1；
步骤二：化合物3的合成
在惰性气氛下，将碳酸二苯酯加入到耐压管中在80℃熔化，随后加入步骤一制备的化合物2反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物3；按摩尔比，碳酸二苯酯:化合物2＝1:2；
步骤三：化合物4的合成
将三乙胺加入到胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液中，室温下搅拌10min，在惰性气氛下，将步骤二制备的化合物3在耐压管中加热至80℃，随后将三乙胺和胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液加入到耐压管中，反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物4；按摩尔比，三乙胺:胱胺二盐酸盐:化合物3＝3:1:2；
步骤四：DBMT的合成
在惰性气氛下，在圆底烧瓶中，将步骤三制备的化合物4添加到KOH的无水乙醇的溶液中，将混合物78℃回流12h，将反应混合物冷却至室温并用HCl溶液酸化至pH为2，除去溶剂并将固体用甲醇重新溶解，滤出沉淀，将溶液真空浓缩，得到所述双功能化蛋白交联剂；按摩尔比，化合物4:KOH＝1:5。
一种双功能化蛋白交联剂的应用，其特征在于，是用于构建蛋白质三维结构，1-甲基脲唑基团在“电点击化学”条件下与酪氨酸特异性交联，在“光反应化学”条件下与组氨酸特异性交联，使用上述化学交联剂DBMT与蛋白质通过“电点击化学”和“光反应化学”的方式进行化学交联反应，将交联的蛋白酶解产物进行质谱鉴定，初步判断蛋白中被修饰的肽段，在源内CID作用下，交联肽段进一步产生特征碎片离子，根据交联肽段的MS2碎裂质谱图确定蛋白质中的交联位点，同时，通过电化学还原的方式，使得交联产物中S-S键发生优先碎裂，具体步骤为：
(1)化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将待鉴定的蛋白质和DBMT溶解于100mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63V的电压下室温反应4h，反应使用三电极系统为石墨工作电极、铂对电极和饱和甘汞参比电极；其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.40，浓度为10mM体积比为1:1的MES-乙腈的缓冲液中，加入光催化剂Rose Bengal，0℃下，白光照射11h，所述的蛋白质为血管紧张素II、泛素蛋白或牛血清白蛋白；按摩尔比，待鉴定的蛋白质:DBMT:光催化剂＝1:10:10；
(2)酶解反应：当交联蛋白为泛素蛋白和牛血清白蛋白时，在按照步骤(1)进行交联反应后还要的产物进行酶解，使用溶解于1％乙酸溶液的胰蛋白酶，37℃下孵育4h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为50:1；
(3)电化学还原：在电化学电池上施加-3V的电压，还原步骤(1)交联的血管紧张素II或步骤(2)酶解的泛素蛋白和牛血清白蛋白，随后将样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液处理至最终半胱氨酸/烷基化物的摩尔比为1:50，并在室温下孵育2h，电化学还原是在由铅工作电极WE，Ag/AgCl参比电极RE和不锈钢辅助电极AE组成的薄层电化学电池中进行，电解池由50μm的Teflon垫圈组成，体积约7μL，样品溶液以4μL/min的流速通过电化学池；
(4)质谱测试：将上述交联产物和电化学还原产物使用液相色谱-质谱联用仪进行分析，在进行质谱分析之前，使用C18反相柱进行液相分离，MS2谱图是通过碰撞诱导解离产生的，能量为15eV；
(5)质谱数据分析：通过对交联酶切后肽段的质量比未修饰肽段的质量差异来判断交联位点；
(6)确定蛋白质三维结构信息：对得到的质谱数据进行分析整理，利用GaussianView 6软件和PyMOL 2.3软件分别计算交联剂的间隔长度和蛋白中酪氨酸、组氨酸的Cα-Cα欧氏距离，得到蛋白质三维结构信息。
本发明具有如下优点：
1、DBMT合成步骤简单，原料价格低廉环保，交联反应条件温和，在接近生理pH值条件进行。
2、本发明实现使用单一交联剂研究多肽和蛋白中的酪氨酸和组氨酸的距离和三维构型，确定交联位点，促进了基于酪氨酸和组氨酸的应用型研究。
3、本发明提出的双功能交联策略，标志着新一代双功能化交联剂(Y-H)的诞生，有助于进一步理解蛋白质的三维结构、相互作用和结构动力学，对交联质谱分析研究多肽、蛋白质以及蛋白质复合物做了完善和补充。
附图说明
图1基于特异性靶向酪氨酸和组氨酸双功能化交联剂(DBMT)交联策略。
图2识别到的血管紧张素II质谱数据。
图3识别到的泛素蛋白的质谱数据点。
图4泛素蛋白的三维结构和交联位点。
图5牛血清白蛋白的三维结构和交联位点。
具体实施方式
实施例1
本实施例公开了DBMT(化合物5)交联剂的制备方法，包含四个步骤，反应路线如下：
第一步：化合物2的合成
在惰性气氛下，在反应瓶中，将11.8mL三乙胺(4eq.,2mmol)加入到3.748g硫酸甲基肼(1.3eq.,0.65mmol)和无水DCM的混合物中,室温下搅拌20min,添加三乙胺的目的是中和硫酸甲基肼中的硫酸。随后，将中和后的混合物转移到-60℃冷却浴中，将2.170g氯甲酸乙酯(1eq.,0.5mmol)缓慢加入到混合物中，撤走冷却浴，室温下反应11h。所得混合物用水萃取一次，用稀NaHCO3萃取两次。将有机层干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂，得到产物2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(q,J＝7.1Hz,2H),4.01(s,2H),3.11(s,3H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).
第二步：化合物3的合成
在惰性气氛下，将0.642g碳酸二苯酯(1eq.,3mmol)加入到15mL耐压管中在80℃熔化，随后加入0.709g化合物2(2eq.,6mmol)反应3h。通过硅胶柱色谱法(EtOAc/石油醚溶液1:6)进行纯化，得到化合物3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(t,J＝7.7Hz,2H),7.22(t,J＝7.2Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,2H),4.22(dd,J＝13.9,6.9Hz,2H),3.24(s,3H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H).
第三步：化合物4的合成
将167.5μL三乙胺(3eq.,1.2mmol)加入到0.09g胱胺二盐酸盐(1eq.,0.4mmol)的无水CH3OH(2mL)溶液中，室温下搅拌10min，添加三乙胺的目的是中和胱胺二盐酸盐中的盐酸。在惰性气氛下，将0.190g化合物3(2eq.,0.8mmol)在15mL耐压管中加热至80℃，随后将三乙胺(3eq.,1.2mmol)和胱胺二盐酸盐(1eq.,0.4mmol)的无水CH3OH(2mL)溶液加入到耐压管中，反应3h。通过硅胶柱色谱法(CH3OH/CH2Cl2溶液1:25)进行纯化，得到化合物4。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.13(s,2H),4.17(q,J＝7.1Hz,4H),3.55(t,J＝6.2Hz,4H),3.18(s,6H),2.84(t,J＝6.4Hz,4H),1.27(t,J＝7.1Hz,6H).
第四步：化合物5的合成(DBMT)
在惰性气氛下，在100mL圆底烧瓶中，将0.067g化合物4(1eq.,0.15mmol)添加到中的28mg KOH(5eq.,0.75mmol)和无水乙醇(20mL)的溶液中，将混合物78℃回流12h。将反应混合物冷却至室温并用HCl(5N)溶液酸化至pH为2。除去溶剂并将固体用甲醇重新溶解。滤出沉淀，将溶液真空浓缩，得到化合物5。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.58(s,2H),3.67(t,J＝6.6Hz,4H),3.01(s,6H),2.96(t,J＝6.6Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ154.34(s),153.77(s),38.07(s),35.25(s),33.23(s).
利用本发明的双功能化交联剂(DBMT)交联策略如附图1所示。
实施例2
对模型多肽血管紧张素II进行交联鉴定
(1)化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将血管紧张素II(1eq.,0.2mM)和DBMT(10eq.,2mM)溶解于100mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63V的电压下室温反应4h。其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.40，浓度为10mM的MES和乙腈(体积比为1:1)的缓冲液中，加入光催化剂Rose Bengal(10eq.,2mM)，0℃下，白光照射11h。
(2)将上述交联产物使用Agilent 1290Infinity液相色谱-Bruker micrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSn)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS2谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV，质谱数据如图2所示。
(3)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3.0V的电压来裂解交联后的血管紧张素II样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50
(4)使用步骤(2)中相同方法进行分析测试。
(5)质谱数据分析：如果交联酶切后肽段的质量比未修饰肽段的质量高346.07Da，则认为交联到该肽段上的酪氨酸且是链端交联肽；同样，如果交联肽段的质量比未修饰肽段的质量高362.07Da，则认为交联到该肽段上的组氨酸且是链端交联肽。链间交联和链内交联肽是DBMT中两个脲唑基团均分别与肽段中的酪氨酸和组氨酸发生反应的结果，肽段质量将增加360.07Da。顾名思义，若两步交联反应发生在一个肽段中的酪氨酸和组氨酸，则被认为是链内交联；若一个DBMT分子连接的酪氨酸和组氨酸位于两个肽段中，则被认为是链间交联；经过电化学还原并烷基化后，如果交联蛋白的质量比未修饰蛋白的质量高125×n+298.07Da(其中“n”是半胱氨酸残基的数量)，则被认为是链端或链间交联酪氨酸的结果；如果交联蛋白的质量比未修饰蛋白的质量高125×n+314.07Da，则被认为是链端或链间交联组氨酸的结果。同时，如果交联蛋白的质量比未修饰蛋白的质量高125×n+612.14Da，则认为这是链内交联的结果。
上述数据的结果表明，通过使用DBMT作为双功能化交联剂对血管紧张素II进行电点击化学和光反应化学交联反应，共鉴定到1对链间交联位点信息，实现了对血管紧张素II中酪氨酸和组氨酸的特异性交联。
实施例3
对泛素蛋白进行三维结构鉴定
(1)化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将泛素蛋白(1eq.,0.2mM)和DBMT(10eq.,2mM)溶解于100mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63V的电压下室温反应4h。其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.4，浓度为10mM的MES和乙腈(体积比为1:1)的缓冲液中，加入光催化剂Rose Bengal(10eq.,2mM)，白光照射11h。
(2)使用溶解于1％乙酸溶液的胰蛋白酶对上述溶液进行酶解反应，37℃下孵育4h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为50：1。
(3)将上述酶解产物使用Agilent 1290Infinity液相色谱-Bruker micrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSn)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS2谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV。质谱分析数据如图3所示。
(4)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3.0V的电压来裂解交联和酶解后的泛素蛋白样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50。
(5)使用步骤(3)中相同方法进行分析测试。
(6)质谱数据分析：与血管紧张素II相同。(7)用Gaussian View 6软件计算DBMT交联剂的间隔长度和酪氨酸和组氨酸侧链贡献的距离。泛素蛋白的Cα-Cα欧式距离由PyMOL2.3软件对PDB文件(网站：http：//www.rcsb.org/)进行计算。泛素蛋白三维结构和交联位点如图4所示。
上述数据的结果表明，通过使用DBMT作为双功能化交联剂对泛素蛋白进行电点击化学和光反应化学交联反应，共鉴定到1对交联位点信息，实现了对泛素蛋白中酪氨酸和组氨酸的特异性交联。
实施例4
对牛血清白蛋白进行三维结构鉴定
(1)化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将牛血清白蛋白(1eq.,0.2mM)和DBMT(10eq.,2mM)溶解于100mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63V的电压下室温反应4h。其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.4，浓度为10mM的MES和乙腈(体积比为1:1)的缓冲液中，加入光催化剂Rose Bengal(10eq.,2mM)，白光照射11h。
(2)使用溶解于1％乙酸溶液的胰蛋白酶对上述溶液进行酶解反应，37℃下孵育4h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为50：1。
(3)将上述酶解产物使用Agilent 1290Infinity液相色谱-Bruker micrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSn)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS2谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV。
(4)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3.0V的电压来裂解交联和酶解后的牛血清白蛋白样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50。
(5)使用步骤(3)中相同方法进行分析。
(6)质谱数据分析：与血管紧张素II相同。(7)用Gaussian View 6软件计算DBMT交联剂的间隔长度和酪氨酸和组氨酸侧链贡献的距离。牛血清白蛋白的Cα-Cα欧式距离由PyMOL 2.3软件对PDB文件(网站：http：//www.rcsb.org/)进行计算。牛血清白蛋白三维结构和交联位点如图5所示。
Claims (1)
1.一种双功能化蛋白交联剂的应用，其特征在于，所述双功能化蛋白交联剂，是以两个1-甲基脲唑基团和一个电化学可还原裂解S-S键为骨架结构的双功能化化学交联剂4,4'-（二硫代二基双（乙烷-2,1-二基））双（1-甲基-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮），记为DBMT，用于构建蛋白质三维结构，1-甲基脲唑基团在“电点击化学”条件下与酪氨酸特异性交联，在“光反应化学”条件下与组氨酸特异性交联，使用上述化学交联剂DBMT与蛋白质通过“电点击化学”和“光反应化学”的方式进行化学交联反应，随后进行质谱鉴定，初步判断蛋白中被修饰的肽段，在源内CID作用下，交联肽段进一步产生特征碎片离子，根据交联肽段的MS2碎裂质谱图确定蛋白质中的交联位点，同时，通过电化学还原的方式，使得交联产物中S-S键发生优先碎裂，具体步骤为：
（1）化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将待鉴定的蛋白质和DBMT溶解于100 mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63 V的电压下室温反应4 h，反应使用三电极系统为石墨工作电极、铂对电极和饱和甘汞参比电极；其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.40，浓度为10 mM体积比为1:1的MES-乙腈的缓冲液中，加入光催化剂Rose Bengal，0 ℃下，白光照射11 h，所述的蛋白质为血管紧张素II、泛素蛋白或牛血清白蛋白；按摩尔比，待鉴定的蛋白质: DBMT: 光催化剂=1:10:10；
（2）酶解反应：当交联蛋白为泛素蛋白或牛血清白蛋白时，在按照步骤（1）进行交联反应后还要对产物进行酶解，使用溶解于1％乙酸溶液的胰蛋白酶，37°C下孵育4 h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为50:1；
（3）电化学还原：在电化学电池上施加-3 V的电压，还原步骤（1）交联的血管紧张素II或步骤（2）酶解的泛素蛋白和牛血清白蛋白， 随后将样品用100 mM N-乙基马来酰亚胺溶液处理至最终半胱氨酸/烷基化物的摩尔比为1:50，并在室温下孵育2 h，电化学还原是在由铅工作电极WE，Ag / AgCl参比电极RE和不锈钢辅助电极AE组成的薄层电化学电池中进行，电解池由50 µm的Teflon垫圈组成，体积为7 µL，样品溶液以4 µL / min的流速通过电化学池；
（4）质谱测试：将上述步骤（1）交联的血管紧张素II或步骤（2）酶解的泛素蛋白和牛血清白蛋白和电化学还原产物使用液相色谱-质谱联用仪进行分析，在进行质谱分析之前，使用C18反相柱进行液相分离，MS2谱图是通过碰撞诱导解离产生的，能量为15 eV；
（5）质谱数据分析：通过对交联酶切后肽段的质量比未修饰肽段的质量差异来判断交联位点；
（6）确定蛋白质三维结构信息：对得到的质谱数据进行分析整理，利用Gaussian View6软件和PyMOL 2.3软件分别计算交联剂的间隔长度和蛋白中酪氨酸、组氨酸的Cα-Cα欧氏距离，得到蛋白质三维结构信息；
所述DBMT的结构式为：
。
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