CN115192565A

CN115192565A - 3-甲磺酰基丙腈在制备治疗帕金森病药物中的应用

Info

Publication number: CN115192565A
Application number: CN202210768730.0A
Authority: CN
Inventors: 孙诚; 李立; 马瑾瑜
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-10-18

Abstract

本发明涉及3‑甲磺酰基丙腈(Dapansutrile)在制备治疗帕金森病药物中的应用。本发明研究发现，经灌胃给予帕金森模型小鼠3‑甲磺酰基丙腈，可以显著改善小鼠的运动功能障碍，降低黑质部位小胶质细胞和星形胶质细胞活化，提高黑质部位酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元数量，增加纹状体部位多巴胺水平。提示3‑甲磺酰基丙腈具有开发成治疗帕金森病药物的应用前景。

Description

3-甲磺酰基丙腈在制备治疗帕金森病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及3-甲磺酰基丙腈在制备治疗帕金森病药物中的应用。

背景技术

帕金森(Parkinson’s disease，PD)是一种神经退行性病变，在老年人群中发病率高，平均发病年龄为60岁左右。临床调查数据显示，我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质部位多巴胺能神经元的变性死亡，由此引起纹状体中多巴胺含量显著性减少。目前，导致多巴胺能神元变性死亡的机制还不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与了这一过程。PD临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。目前，临床药物治疗主要为左旋多巴制剂。但长期使用该药物可引起多种不适，如胃肠方面的副作用(表现为恶心、呕吐、厌食及便秘)，心血管方面的副作用(如直立性低血压、心律失常)，以及睡眠障碍和精神症状(如焦虑不安、妄想、幻觉)。并且，药物治疗只能缓解PD相关症状，不能阻止病情的进展，也无法治愈疾病。因此，研究并发现具有治疗PD潜力的新化合物具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术不足，公开了一种新的药物应用，可将3-甲磺酰基丙腈或其药学可接受的盐用于制备治疗帕金森病药物。

本发明具体技术方案如下：3-甲磺酰基丙腈或其药学可接受的盐在制备治疗帕金森病药物中的应用。

3-甲磺酰基丙腈结构如下：

所述药物包括3-甲磺酰基丙腈或其药学可接受的盐和药学上可接受的载体。所述药物可以为口服或注射制剂。

所述药物还包括其它治疗帕金森病的药物，例如盐酸罗匹尼罗，雷沙吉兰，复方左旋多巴制剂中的一种或几种。

本发明优点：

现有技术下，3-甲磺酰基丙腈(3-(Methylsulfonyl)propanenitrile，又名OLT1177，Dapansutrile)是一种NLRP3炎性小体抑制剂，具有抗炎活性，可用于缓解疼痛。本发明用神经毒素MPTP对小鼠进行腹腔注射处理，剂量为20mg/kg/day，连续处理7天，诱导帕金森病模型小鼠。随后用OLT1177(Dapansutrile)进行干预，给药方式为灌胃，剂量为100mg/kg/day，连续给药7天。干预结束后进行相关检测，包括动物行为学检测，形态学检测及生化检测。研究结果表明3-甲磺酰基丙腈干预后可延长帕金森模型小鼠在转棒上的停留时间，显著缩短帕金森模型小鼠完成爬杆的时间，可显著提高帕金森模型小鼠黑质区TH的表达以及TH阳性神经元的数量。利用免疫荧光法对小鼠黑质部位Iba-1(小胶质细胞标志蛋白)和GFAP(星形胶质细胞标志蛋白)的表达进行检测结果显示，3-甲磺酰基丙腈可显著抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化，小鼠纹状体中多巴胺含量也有明显降低。提示3-甲磺酰基丙腈具有开发成治疗帕金森病药物的应用前景。

附图说明

图1为3-甲磺酰基丙腈对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的药物干预及相关检测流程图。图2为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠在转棒上的停留时间(^*p<0.05,^**p<0.01)。

图3为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的爬杆时间(^**p<0.01,^***p<0.001)。

图4为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况(^**p<0.01,^***p<0.001，标尺＝200μm)。

图5为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质部位Iba-1(小胶质细胞标志蛋白)的表达情况(采用免疫荧光法进行检测，所用抗体为anti-Iba-1。^**p<0.01,^***p<0.001，标尺＝50μm)。

图6为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质部位GFAP(星形胶质细胞标志蛋白)的表达情况(采用免疫荧光法进行检测，所用抗体为anti-GFAP。^***p<0.001，标尺＝50μm)。

图7为给予3-甲磺酰基丙腈后，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠纹状体中多巴胺含量(^**p<0.01,^***p<0.001)。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1.帕金森模型小鼠制备

12周龄C57BL/6J雄性小鼠，采用腹腔注射神经毒素MPTP(N-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine)方法诱导PD模型小鼠。在给药前三天，每天对小鼠进行转棒，爬杆等一系列的行为学训练。尽量挑选运动能力在同一水平的小鼠，避免个体差异造成的影响，分为两组。一组为生理盐水组，另一组为MPTP组。接着对其行腹腔注射MPTP(20mg/kg/day)，连续注射一周，再进行行为学评估。与对照小鼠(注射同等体积的生理盐水)相比，行为学具有显著下降的小鼠被认为是诱导成功的PD模型小鼠，用于后续实验。

实施例2.给药处理

3-甲磺酰基丙腈(OLT1177，Dapansutrile)溶于玉米油。采用灌胃给药方式处理小鼠，给药剂量为100mg/kg/day，连续给药7天。对照组及单独MPTP组小鼠给予同等体积的玉米油。

实施例3.小鼠转棒实验

先进行5min加速模式(2-20rpm)对小鼠进行转棒训练，目的是尽量使小鼠停留在杆上的时间达到相同水平，每天训练2次，总共3天。在3-甲磺酰基丙腈(OLT1177)处理之后，对小鼠进行行为检测，转棒仪开始，则会自动记录时间和转速。记录每只小鼠在转棒上的停留时间。转棒实验结果如图2所示。结果表明，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠在转棒上的停留时间明显变短；OLT1177(Dapansutrile)干预后可延长帕金森模型小鼠在转棒上的停留时间。

实施例4.小鼠爬杆实验

制作一个直径1cm，长50cm并且顶端固定有一个直径为1.5cm的软木小球的杆，并且缠上纱布以增加摩擦，将杆竖直放置，将小鼠放到自制爬杆顶端的小球上，然后记录动物从开始运动到完全转为头向下直到返回到杆底部的时间，每次检测间隔5分钟，共检测3次取平均值。在尾静脉注射之前三天，每天在同样时间对小鼠进行爬杆训练，把差异较大的小鼠剔除以减小实验误差。

爬杆实验结果如图3所示。结果表明，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠在完成爬杆的时间更长。OLT1177(Dapansutrile)干预后可显著缩短帕金森模型小鼠完成爬杆的时间。

实施例5.黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)表达形态学分析

利用组织化学方法分别对对照组、单独MPTP组以及OLT1177+MPTP组黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞进行染色，主要操作步骤如下：

1.取材的小鼠脑组织放于4％多聚甲醛中，放于4℃冰箱24小时；

2.1X PB配制20％，30％蔗糖，依次脱水24小时，如组织未沉入底部适当将时间延长；3.脱水脑组织切片处理，调节厚度为12μm，37℃烘箱过夜，-20℃保存；

4.染色前60℃烘片2小时，PBS洗3次，每次5分钟；

6.封闭液封闭，37℃，30分钟；PBS洗2次，内源性过氧化氢酶阻断剂5分钟；

7.PBS洗2次，非特异性染色阻断剂30分钟，37℃烘箱；

8.与TH抗体(1:200)4℃冰箱过夜；

9.PBS洗2次，加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG，37℃，1小时；

10.PBS洗2次，加链霉卵白素-过氧化物酶，37℃，1小时；

11.PBS洗2次，进行DAB显色；

12.酒精脱水，依次为50％酒精，70％酒精，80％酒精，95％酒精两道，100％酒精两道，每道5分钟；

13.无水乙醇和二甲苯，二甲苯透明三道，每道5分钟，中性树脂封片后用显微镜观察拍照。TH阳性神经元数量用Stereo Investigator软件统计分析。

结果如图4所示。结果显示，MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质区TH表达明显降低。OLT1177(Dapansutrile)干预后可显著提高帕金森模型小鼠黑质区TH的表达以及TH阳性神经元的数量。

实施例6.黑质部位小胶质细胞及星形胶质细胞活化检测

分别取对照组、单独MPTP组以及OLT1177+MPTP组小鼠黑质部位组织切片在37℃烘片24小时，用PBS洗1遍；在组织上滴加适量的封闭液，室温封闭2小时；根据选择的抗体以合适的稀释比例滴加一抗(anti-Iba-1,1:200；anti-GFAP,1:200)，4℃过夜；回收一抗，将片子用PBS洗3遍，5min/遍；根据选择的抗体以合适的稀释比例滴加二抗，37℃孵育2小时；弃去二抗，将片子用PBS洗3遍，5min/遍；滴加荧光封片液，封片。用荧光显微镜进行观察、拍照。荧光强度用ImageJ软件进行量化。

结果如图5和图6所示。结果显示，OLT1177(Dapansutrile)干预可显著降低帕金森病模型小鼠黑质部位Iba-1和GFAP的表达，说明OLT1177(Dapansutrile)干预可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化。

实施例7.纹状体部位多巴胺含量检测

分别取50mg对照组、单独MPTP组以及OLT1177+MPTP组小鼠纹状体组织，置于200μl0.6M高氯酸(HClO₄)中进行匀浆。随后将组织裂解样品进行离心(15分钟，14000g，4℃)，上清用于检测多巴胺含量。多巴胺含量检测用高压液相(HPLC)方法进行检测。HPLC色谱条件：电化学检测器(美国Waters公司，2696)，反相C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为A(50mM磷酸缓冲液，内含300mg/L辛烷磺酸钠，pH3.9)：B(甲醇)＝90:10等度洗脱，流速为1ml/min，柱温40℃。用外标法计算多巴胺的含量。

结果如图7所示。结果显示MPTP诱导的帕金森病模型小鼠纹状体中多巴胺含量明显降低，OLT1177(Dapansutrile)干预后可显著提高帕金森病模型小鼠纹状体中多巴胺的含量。

Claims

1.3-甲磺酰基丙腈或其药学可接受的盐在制备治疗帕金森病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物包括3-甲磺酰基丙腈或其药学可接受的盐和药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为口服或注射制剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物还包括其它治疗帕金森病的药物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述其它治疗帕金森病的药物选自盐酸罗匹尼罗，雷沙吉兰，复方左旋多巴制剂中的一种或几种。

6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于所述药物能够改善帕金森病所致的运动功能障碍，降低小胶质细胞和星形胶质细胞活化，提高酪氨酸羟化酶阳性神经元数量以及提高多巴胺水平。