CN115184115B - 一种用微孔板混制药物微平板的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物学与植物病理学技术，具体是一种采用微孔板、在制备微平板的辅助装置的工作条件下，将微少量的药物样品液与水琼脂混合，制备成含有药物的琼脂微平板。辅助装置包括主装置与副装置两大部分，主要构件包括控温体A，混样用微孔板预热构件B，药物样品预热构件C，载玻片预热玻璃板构件D，微型温箱E2。药物微平板的制备方法主要步骤如下：1)药物样品准备，2)混样用水琼脂准备，3)枪头配备，4)启动辅助装置的副装置进入工作状态，5)启动辅助装置的主装置进入工作状态：6)样品预热，7)载玻片预热，8)吸取样品液，9)吸取水琼脂，10)样品液与水琼脂混合，11)获得药物微平板。本发明的优点：1)一个96孔微孔板可以制备96种样品的微平板；2)需要药物样品的总量微少；3)取得的药物微平板便于后续的生物测定和显微镜观察。

Description

一种用微孔板混制药物微平板的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物学与植物病理学技术，具体是一种用微孔板混制药物微平板的制备方法。

技术背景

有害微生物引起的植物病害可引起巨大的经济损失及生态破坏，当前及今后相当长时期内，植物病害防治的主要手段仍然是农药防治。探索和挖掘生物源药物是农药防治的重要方向。当在众多的微生物源或植物源样本中寻找筛选具有抑制活性的样本，其初级筛测阶段若能以很少的代谢液(或组织液)即可检测识别抑制活性作用，将能提高筛测效率，及扩大筛测范围。在生物源药物的研究过程中，探索分析有益微生物培养过程产生的代谢产物对有害微生物的抑制作用，当前的分析检测技术往往需要终止一些培养瓶的培养，以便能将培养产物进行过滤，从而制备足够的检测样品，而本领域技术人员最希望不用终止培养过程而直接从培养瓶中抽取微量的样品进行生物测定。在发现微生物(或植物)能产生抑制活性的代谢产物(或植物组织液)，但抑制活性成分仍然未知的情况下，一般需要进行活性物的分离分析，在分离活性物过程中，往往需要对少量的分离样品进行生物活性跟踪检测。显然，生物源农药的研发工作，需要有微量或少量药物样品检测的技术支持。

当前本领域检测药物对有害微生物的抑制活性的常规技术方法主要是平板培养测定方法，该方法的技术要点是，先将药物与水琼脂混合制成含药培养平板，再在含药平板上移植入有害微生物，并在适当条件下培养，通过观察比较有害微生物在平板上的生长量，而达到测算药物的抑制活性。该方法的基本技术是含药培养平板的制备，而当前含药培养平板制备的常规技术是，将药物样品与水琼脂在三角瓶中混合后，在常规培养皿中倒制成含药培养平板。这样的含药培养平板制备技术方法虽然简单成熟，但有一明显的特征，就是待测药物样品往往需要达到几十毫升以上的样品量，这与前述本领域希望的微量或少量样品的检测技术难以匹配，因此成了当前含药培养平板制备技术的重要弊病。

发明内容

本发明的目的是提供一种用微孔板，将微少量的药物样品液与水琼脂混合，制备成含药微平板的方法。

本发明设计和采用制备药物微平板的辅助装置的技术条件，解决上述技术问题，解决的技术方案如下：

1.设计一种制备药物微平板的辅助装置，主要构件包括辅助装置的主装置和辅助装置的副装置两大部件。辅助装置适配在超净工作台上应用。

辅助装置的主装置的主要构件包括控温体A、混样用微孔板预热构件B、药物样品预热构件C、载玻片预热玻璃板构件D。

控温体A主要构件包括盆状容器A1、水体A2、水体电热控温构件A3、水体水面盖板A4。水体电热控温构件A3能将水体自动加热并稳定水体温度至65℃的工作状态，水体水面盖板A4能防止水体的快速蒸发与降温。

混样用微孔板预热构件B主要包括微孔板B1、微孔板垫架B2，微孔板B1有一半厚度浸埋入水体A2中。药物样品预热构件C主要包括样品管C1、和样品管管架C2，样品管C1的管身直接浸埋入水体A2中。载玻片预热玻璃板构件D主要包括玻璃板D1，玻璃板托架D2，部分玻璃板D1浸埋入水体A2中。

辅助装置的副装置的主要构件包括枪头盒E1、和自制电热微型温箱E2，枪头盒E1的盒身嵌埋在微型温箱E2的上盖板下面。

2.利用前述设计的一种制备药物微平板的辅助装置，制备含有药物的微平板的一种制备方法，主要技术是，将辅助装置放入超净工作台，用微孔板作为药物与琼脂的混合器具，用玻璃板作载玻片的预热板，在水体为65℃的技术体系中制备药物微平板，制备方法步骤如下：

1)药物样品准备：将药物研发工作中取得的少量药物样品移入灭菌的样品管C1内。

2)混样用水琼脂准备：混样用水琼脂配比为：琼脂40g、水1000ml，加热熔化后维持在90℃以上的水浴中。

3)枪头配备：使用量级为200μl的常规枪头，先将该枪头尖头切去一小段，然后将截去尖头的枪头按常规方式装入枪头盒、灭菌和烘干，再把该枪头盒的盒身嵌埋入微型温箱E2的上盖板。

4)启动辅助装置的副装置进入工作状态：正常启动运行超净工作台，将主装置和副装置都放置入超净工作台内部的工作桌面，通电启动加热副装置微型温箱E2至70℃的工作状态，维持运行至使枪头盒E1内的枪头处于与微型温箱E2的温度平衡的工作状态。

5)启动辅助装置的主装置进入工作状态：在通电启动副装置之后，取一个灭菌状态的微孔板，平置在主装置的微孔板垫架B2架上，然后通电启动主装置，电加热主装置水体A2至温度达到65℃的工作状态，维持运行至使微孔板B1的温度、载玻片预热玻璃板D1的温度与水体A2的温度到达动态平衡的工作状态。

6)取步骤1)的药物样品管C1插入浮架在水体A2水面上的样品管管架C2的管孔，在水体A2中预热。

7)取灭菌载玻片平放于载玻片预热玻璃板D1的板面上预热。

8)用移液枪套上步骤4)工作状态的枪头，从步骤6)的预热样品管内吸取100μl样品液，注入步骤5)的工作状态的微孔板B1的空白微孔，形成一个微孔样品液。

9)用移液枪套上步骤4)工作状态的枪头，吸取步骤2)的混样用水琼脂30μl，注入步骤8)的微孔样品液内，并保持移液枪头在样品液内，反复吸液排液动作，洗涤下枪头内的残余琼脂，取得样品液与水琼脂混合的混样液。

10)用已调整吸液量为150μl的移液枪，套上步骤4)工作状态的枪头，将枪头插入步骤9)的混样液内，作反复吸液排液动作，使得混样液中的样品液与水琼脂充分均匀混合。

11)将步骤10)的均匀混样液全部吸入枪头，转到步骤7)的预热载玻片，在载玻片的不同位点上，以点滴形式排出移液枪的混样液到载玻片面上，并用枪头将排出的液点拨动平展，使得每个液点形成一个薄层琼脂微块，然后将该载玻片转到常温保湿的无菌器皿内放置，薄层琼脂微块冷凝后，即成为药物微平板。

本发明的优点

1)一个(96孔)微孔板可以制备96种样品的微平板。

2)本发明可以将0.1ml的药物样品液混制成多个药物微平板，需要药物样品的总量微少。

3)基于载玻片制备的含药微平板，便于后续的生物测定和显微镜观察。

附图说明

图1是辅助装置的主装置的正面观示意图。图中A是控温体构件，B是混样用微孔板预热构件，C是药物样品预热构件，D是载玻片预热玻璃板构件。

图2是控温体A的侧面结构示意图。图中，A1是盆状容器，A2是水体，A3是水体电热控温构件，A4是水体水面盖板。

图3是辅助装置的主装置中各个构件并列的侧面结构示意图及其与控温体水体的空间关系示意图。图中，A1是控温体的盆状容器，A5是控温体盆状容器的底平面线，A6是控温体的水体表面的水平线。B是混样用微孔板预热构件，B1是微孔板，B2是微孔板垫架。C是药物样品预热构件，C1是样品管，C2是样品管管架。D是载玻片预热玻璃板构件，D1是玻璃板，D2是玻璃板托架。

图4是辅助装置的副装置的结构示意图。图中，E1是枪头盒，E2是电热微型温箱，E2-1是微型温箱的上盖板。

图5是用移液枪吸取混样液，点滴在载玻片面上的示意图，图中长方形框表示载玻片，灰黑色圆斑表示混样液的液滴。

图6是采用本发明一种用微孔板混制药物微平板的制备方法，取大蒜组织液与琼脂混合，并在普通载玻片上滴展形成的6个药物微平板。

具体实施方式

在药物样品量微少的情况下，将微少的药物样品液与微量的水琼脂进行常规混合，水琼脂往往还未来得及与药物样品液混合，就已经凝固在移液器具内，导致无法开展工作，显然，在常规技术条件下，很难制备微少样品的含药平板。本发明巧妙设计一套制备微平板用的辅助装置，建立恰当的混样技术条件体系，能将微量的药物样品液与微量的高浓度水琼脂进行有效均匀混合，并在载玻片上形成薄层展开，取得含有药物的微平板。

制备微平板的辅助装置包括主装置和副装置两大部分，主装置与副装置两者均能适配在超净工作台上应用。

辅助装置的主装置的主要构件包括控温体A、混样用微孔板预热构件B、药物样品预热构件C、载玻片预热玻璃板构件D，如图1所示。

控温体A主要构件包括盆状容器A1、容器内盛装水体A2、水体电热控温构件A3、水体水面盖板A4，如图2所示。水体电热控温构件A3能将水体自动加热并稳定水体温度至65℃的工作状态，水体水面盖板A4能防止水体的快速蒸发与降温。

混样用微孔板预热构件B主要包括微孔板B1、微孔板垫架B2，如图3的B图所示。微孔板为常规生物测试用微孔板，如96孔微孔板，利用微孔板的微孔进行样品与琼脂混合。微孔板垫架B2埋入控温体内水体A2的水中，能将微孔板B1托垫成平稳状态，微孔板B1有一半的厚度浸埋于水体A2中，使得微孔板的微孔底部能快速平衡到水体A2的温度。

药物样品预热构件C主要包括样品管C1、和样品管管架C2，如图3的C图所示，样品管管架C2上面有管孔，并浮在控温体的水体A2的水面上，样品管C1宜采用1.5ml的小离心管；样品管C1插入管架C2的管孔后，样品管身直接浸入水体A2的水中，使得样品管及管内的样品液能快速平衡到水体A2的温度。

载玻片预热玻璃板构件D主要包括载玻片预热玻璃板D1、和玻璃板托架D2，如图3的D图所示。玻璃板托架D2浸埋在控温体的水体A2中，能将玻璃板D1平稳托住；玻璃板D1由3块厚度为1cm的普通玻璃板叠加构成，最底下的玻璃板有一半的厚度浸埋于水体A2中，该块玻璃板能快速平衡到水体A2的温度，但上方两块玻璃板的阻热传导，能导致最上方玻璃板表面的温度降低到42℃左右。

辅助装置的副装置为枪头预热装置，主要包括枪头盒E1、和自制电热微型温箱E2，如图4所示，微型温箱E2能自动加热和稳定温度在70℃。枪头盒E1的盒身嵌埋在微型温箱E2的上盖板E2-1下面，能与温箱内部温度平衡；而枪头盒E1的盒盖完全露在温箱E2的外面，可以不用打开微型温箱E2而任意开盒取用枪头。

主装置与副装置为相互独立的装置，无物理上的硬连接关系，两者均可自由置入超净工作台内部桌台上，并在超净工作台的工作运行状态下实施本发明的有关操作，保证制备获得的含药微平板处于无菌状态。

利用上述设计的制备药物微平板的辅助装置，制备含有药物的微平板的制备方法技术是，将辅助装置放入超净工作台，用微孔板作为药物与琼脂的混合器具，用玻璃板作载玻片的预热板，在水体为65℃的技术体系中制备药物微平板，制备方法步骤如下：

1.药物样品准备：可以用普通小离心管作为样品管，将药物研发工作中取得的少量药物样本移入灭菌的样品管C1内。

2.混样用水琼脂准备：混样用水琼脂配比为：琼脂40g、水1000ml，常规高温灭菌后备用，使用前加热熔化。该水琼脂熔化后很粘稠，加热煮沸容易产生大量气泡，且气泡很难消退，由于当前的常规手段微波加热能快速熔化琼脂，并造成大量气泡，因此，可在微波加热水琼脂至接近沸腾时转入沸水加热，避免水琼脂中形成大量气泡。当水琼脂完全熔化后，维持在90℃以上的水浴中，并放置在操作者伸手可及的位置范围。

3.枪头配备：制备操作主要使用200μl量级的枪头，由于200μl枪头的尖头口孔径微小，粘稠度高的水琼脂无法顺畅地通过，因而，用刀片之类的切割工具，将该枪头尖头切去约5-8mm，从而取得较大孔径的枪头开口，保证水琼脂能较顺畅的通过。将截去尖端的枪头按常规方式装入枪头盒灭菌和烘干，再嵌埋入微型温箱E2的上盖板。

4.启动辅助装置的副装置进入工作状态：正常启动运行超净工作台，将主装置和副装置都放置入超净工作台内部的工作桌面，通电启动加热副装置微型温箱E2至70℃的工作状态，并维持该工作状态运行30分钟以上，使得枪头盒E1内的枪头处于与微型温箱E2的温度平衡的工作状态。

5.启动辅助装置的主装置进入工作状态：在通电启动副装置之后，取一个灭菌状态的微孔板，平置于主装置的微孔板垫架B2架上，然后通电启动主装置，电加热主装置水体A2至温度达到65℃的工作状态，并维持该工作状态运行20分钟以上，使得微孔板B1底部与水体A2的温度到达平衡，并处于工作状态；也使得载玻片预热玻璃板D1的板面温度维持平衡在42℃左右的工作状态。

6.取步骤1的药物样品管C1插入浮架在水体A2水面上的样品管管架C2的管孔，样品管的管身浸入水体A2中，预热5分钟以上。

7.取灭菌载玻片平放于载玻片预热玻璃板D1的板面上，预热5分钟以上。

8.用移液枪套上步骤4工作状态的枪头，从步骤6的预热样品管内吸取100μl样品液，注入步骤5的工作状态的微孔板B1的空白微孔，形成一个微孔样品液。

9.用移液枪套上步骤4工作状态的枪头，吸取步骤2的混样用水琼脂30μl，注入步骤8的微孔样品液内，并保持移液枪头在样品液内，反复吸液排液动作5次左右，洗涤下枪头内的残余琼脂，取得样品液与水琼脂混合的混样液。

10.用已调整吸液量为150μl的移液枪，套上步骤4工作状态的枪头，将枪头插入步骤9的混样液内，作反复吸液排液动作5次左右，使得混样液中的样品液与水琼脂充分均匀混合。

11.将步骤10已均匀混合的混样液全部吸入枪头，转到步骤7的预热载玻片，在载玻片的不同位点上，以点滴形式排出移液枪的混样液到载玻片面上，如图5所示，并用枪头将排出的液点拨动平展，使得每个液点形成一个薄层琼脂微块，然后将该载玻片转到常温保湿的无菌器皿内放置，薄层琼脂微块冷凝后，即成为药物微平板，通常一次混样液能在载玻片上点注形成5-10个药物微平板。

药物微平板的制备工作完成后，断电停止辅助装置的运行工作，将辅助装置有关构件清洁、凉干，恰当收存备用。

本发明设计在常温为25℃的实验室内具体实施。主要技术是采用微孔板作混样器材，用普通玻璃板作载玻片的预热板，辅助装置的主装置设计为65℃的水体，辅助装置的副装置设计为70℃的微型温箱。整套辅助装置整合了混样用器材预热、样品预热、枪头预热、载玻片预热的热平衡技术，这样的技术体系既能避免温度过高造成微孔板微孔内的混样液、以及载玻片上展开的微平板的水分快速蒸发，也能防止操作过程中的琼脂冷凝。由于混样液的总量(130μl)较微少，上述制备方法步骤的步骤10的吸液与排液混样操作均容易产生气泡，需要注意观察与控制吸液与排液动作的快慢，以利于取得无气泡的琼脂微平板。

方法步骤的步骤8至步骤11操作针对的是微少量的样品液与水琼脂，并在较高温度条件下操作，因而需要操作连贯、操作过程避免长时间停顿，这样既能降低操作过程中水琼脂的冷凝机率，也能减少混样液的水分蒸发散失。实际操作可以采取使用3支固定吸液量的移液枪，分别调整固定为吸取100μl药物样品液、30μl水琼脂、150μl用于混样液的混匀操作，这样可以避免单独使用一支移液枪而需要中途调整吸液量的停顿。

实施例1

取1ml大蒜组织研磨提取液(提取比例：大蒜1g，水5ml)作药物样品液。采用本发明的一种用微孔板混制药物微平板的制备方法的制备方法，将药物样品液与水琼脂混合制备含大蒜组织液的微平板，结果能取得没有气泡的、含大蒜组织液的微平板，如图6所示。

Claims (2)

1.一种制备药物微平板的辅助装置，其特征是，主要构件包括辅助装置的主装置和辅助装置的副装置两大部件；辅助装置适配在超净工作台上应用；

辅助装置的主装置的主要构件包括控温体(A)、混样用微孔板预热构件(B)、药物样品预热构件(C)、载玻片预热玻璃板构件(D)；

控温体(A)主要构件包括盆状容器(A1)、水体(A2)、水体电热控温构件(A3)、水体水面盖板(A4)；水体电热控温构件(A3)能将水体自动加热并稳定水体温度至65℃的工作状态，水体水面盖板(A4)能防止水体的快速蒸发与降温；

混样用微孔板预热构件(B)主要包括微孔板(B1)、微孔板垫架(B2)，微孔板(B1)有一半厚度浸埋入水体(A2)中；药物样品预热构件(C)主要包括样品管(C1)、和样品管管架(C2)，样品管(C1)的管身直接浸埋入水体(A2)中；载玻片预热玻璃板构件(D)主要包括玻璃板(D1)，玻璃板托架(D2)，部分玻璃板(D1)浸埋入水体(A2)中；

辅助装置的副装置的主要构件包括枪头盒(E1)、和电热微型温箱(E2)，枪头盒(E1)的盒身嵌埋在微型温箱(E2)的上盖板下面。

2.利用权利要求1的一种制备药物微平板的辅助装置，制备含有药物的微平板的一种制备方法，其特征是，将辅助装置放入超净工作台，用微孔板作为药物与琼脂的混合器具，用玻璃板作载玻片的预热板，在水体为65℃的技术体系中制备药物微平板，制备方法步骤如下：

1)药物样品准备：将药物研发工作中取得的少量药物样品移入灭菌的样品管(C1)内；

2)混样用水琼脂准备：混样用水琼脂配比为：琼脂40g、水1000ml，加热熔化后维持在90℃以上的水浴中；

3)枪头配备：使用量级为200μl的常规枪头，先将该枪头尖头切去一小段，然后将截去尖头的枪头按常规方式装入枪头盒、灭菌和烘干，再把该枪头盒的盒身嵌埋入微型温箱(E2)的上盖板；

4)启动辅助装置的副装置进入工作状态：正常启动运行超净工作台，将主装置和副装置都放置入超净工作台内部的工作桌面，通电启动加热副装置微型温箱(E2)至70℃的工作状态，维持运行至使枪头盒(E1)内的枪头处于与微型温箱(E2)的温度平衡的工作状态；

5)启动辅助装置的主装置进入工作状态：在通电启动副装置之后，取一个灭菌状态的微孔板，平置在主装置的微孔板垫架(B2)架上，然后通电启动主装置，电加热主装置水体(A2)至温度达到65℃的工作状态，维持运行至使微孔板(B1)的温度、载玻片预热玻璃板(D1)的温度与水体(A2)的温度到达动态平衡的工作状态；

6)取步骤1)的药物样品管(C1)插入浮架在水体(A2)水面上的样品管管架(C2)的管孔，在水体(A2)中预热；

7)取灭菌载玻片平放于载玻片预热玻璃板(D1)的板面上预热；

8)用移液枪套上步骤4)工作状态的枪头，从步骤6)的预热样品管内吸取100μl样品液，注入步骤5)的工作状态的微孔板(B1)的空白微孔，形成一个微孔样品液；

9)用移液枪套上步骤4)工作状态的枪头，吸取步骤2)的混样用水琼脂30μl，注入步骤8)的微孔样品液内，并保持移液枪头在样品液内，反复吸液排液动作，洗涤下枪头内的残余琼脂，取得样品液与水琼脂混合的混样液；

10)用已调整吸液量为150μl的移液枪，套上步骤4)工作状态的枪头，将枪头插入步骤9)的混样液内，作反复吸液排液动作，使得混样液中的样品液与水琼脂充分均匀混合；

11)将步骤10)的均匀混样液全部吸入枪头，转到步骤7)的预热载玻片，在载玻片的不同位点上，以点滴形式排出移液枪的混样液到载玻片面上，并用枪头将排出的液点拨动平展，使得每个液点形成一个薄层琼脂微块，然后将该载玻片转到常温保湿的无菌器皿内放置，薄层琼脂微块冷凝后，即成为药物微平板。