CN115181762A - 用于制造丙酸盐产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过发酵制造丙酸盐产物的方法，该方法包括以下步骤：‑借助产丙酸微生物在发酵培养基中发酵选自糖和乳酸盐的碳源，以提供包含丙酸盐的第一发酵液，‑从第一发酵液中回收产丙酸微生物，‑对已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液进行脱水步骤以形成第一丙酸盐产物，‑用从第一发酵液中回收的产丙酸微生物将包含丙三醇的碳源在无机碱性盐的存在下发酵，以提供包含丙酸盐的第二发酵液，‑对第二发酵液进行包括至少一个沉淀步骤的纯化步骤，以形成第二丙酸盐产物。根据本发明的方法允许有效制造丙酸盐产物。

Description

用于制造丙酸盐产物的方法

本申请是申请日为2016年3月17日、申请号为201680016068.6、发明名称为“用于制造丙酸盐产物的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及经由发酵方法制造丙酸盐产物的方法。

背景技术

丙酸可通过使用微生物发酵碳源来制造。例如，Zhu等人(《生物资源技术》，2010年101卷，第8902至8902页(Bioresource Technology 101(2010)8902-8902))描述一种用于制造丙酸钙的发酵方法，其中使用产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)来发酵丙三醇。在发酵期间加入氢氧化钙以中和发酵期间生成的酸，致使丙酸钙的形成。

丙酸盐对于许多用途是有吸引力的。例如，它们用于饲料和食物保存方面是有吸引力的，其中它们提供长期持久的广谱活性。在这方面，最重要的盐是钙盐、钠盐、钾盐和铵盐。认为钙盐是尤其令人感兴趣的。丙酸盐可以以溶液、或以固体盐的形式使用。

已经发现在经由发酵制备丙酸盐中发生的问题在于发酵过程的复杂性，既关于能够发酵的碳源，也关于发酵期间形成的副产物。在本领域中需要将丙酸盐的高产率与微生物的有效生长以及获得高纯度丙酸盐产物的可能性相结合的用于制造丙酸盐的发酵方法。

发明内容

本发明提供解决这种问题的方法。

本发明涉及一种通过发酵制造丙酸盐产物的方法，该方法包括以下步骤：

-借助产丙酸微生物在发酵培养基中发酵选自糖和乳酸盐的碳源，以提供包含丙酸盐的第一发酵液，

-从第一发酵液中回收产丙酸微生物，

-对已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液进行脱水步骤以形成第一丙酸盐产物，

-用从第一发酵液中回收的产丙酸微生物将包含丙三醇的碳源在无机碱性盐的存在下发酵，以提供包含丙酸盐的第二发酵液，

-对第二发酵液进行包括至少一个沉淀步骤的纯化步骤，以形成第二丙酸盐产物。

在根据本发明的方法中，存在两个连续的发酵步骤。在第一发酵步骤中，选自糖和乳酸盐的碳源在丙酸盐产物料流的形成下发酵。该步骤在本文中还可称为糖发酵步骤。然后，将在糖发酵步骤中得到的微生物回收并且用于发酵包含丙三醇的碳源，以形成另外的丙酸盐产物料流。两种丙酸盐产物料流分开处理。

通过应用两种不同的发酵(即，基于糖的发酵和基于丙三醇的发酵)并且分开处理所得的料流，已经发现可从两种类型发酵的有利效果获益。更具体地，已经发现，糖发酵可引起有效的细胞生长，这使得生物质的产率高。然而，由于存在大量的乙酸根阴离子，所得的产物可能相对难以纯化。相比之下，丙三醇发酵产生能够纯化成高纯度丙酸盐产物的产物。然而，丙三醇发酵仅引起有限的生物质形成。通过以规定的方式组合发酵，获得有效的方法。以下将讨论根据本发明的方法的另外优点。

具体实施方式

以下将更详细地讨论根据本发明的方法。

根据本发明的方法的第一步骤是借助产丙酸微生物在发酵培养基中发酵选自糖和乳酸盐的碳源，以提供包含丙酸盐的第一发酵液。

用于制造丙酸盐的发酵方法在本领域是已知的并且这里不需要进一步阐释。使用技术人员的普遍已知的知识来选择合适发酵方法(包括发酵条件)和合适微生物在技术人员的能力范围内。在微生物的选择上，应注意选择能够发酵糖或乳酸盐(在根据本发明的方法的第一发酵步骤中)以及丙三醇(在根据本发明的方法的第二发酵步骤中)的生物体。

在根据本发明的方法的第一步骤中使用的碳源选自糖和乳酸盐。合适的糖和糖的来源的实例包括葡萄糖、蔗糖、葡萄糖浆、淀粉、水解淀粉、纤维素、水解纤维素、糖蜜、木糖、木质纤维素水解物、乳糖和乳清。合适的乳酸盐来源是乳酸钠、乳酸钾、乳酸铵、乳酸镁、乳酸钙和乳酸。在乳酸盐来源中，优选使用乳酸钙，因为这将引起作为本发明的优选产物的丙酸钙的形成。从生产的角度来看，可优选葡萄糖、乳酸盐和蔗糖。从可用性的角度来看，可优选糖蜜和淀粉等来源。

至少当碳源选自糖时，发酵是在无机碱性盐的存在下进行的。存在这种碱性盐以确保在发酵期间pH不会由于丙酸的制造而降低到不可接受的程度。在碳源是乳酸盐的情况下，不一定总是需要添加无机碱，因为乳酸盐转化为不具有pH效应的丙酸盐。尽管如此，同样在这种情况下，可加入无机碱用于pH调节。

合适的碱包括钙、镁、钠和钾的氢氧化物、氧化物和碳酸盐，引起形成分别含有丙酸钙、丙酸镁、丙酸钠或丙酸钾的发酵液。在根据本发明的方法中，优选使用碱性钙盐，因为这引起形成作为根据本发明的优选产物的丙酸钙。合适的碱性钙盐包括钙的氢氧化物、氧化物和碳酸盐。

下一个步骤是从如此形成的第一发酵液中除去微生物。该步骤可在已经形成用于以下丙三醇发酵步骤的足够的生物质时进行。因为微生物将用于另外的发酵，所以应注意在保持生物体活力的条件下分离微生物。考虑到这一点，微生物的除去可以以本领域已知的方式进行，例如经由过滤步骤或离心步骤进行。

在糖发酵中，生物质的重量已经增加，其中回收的生物质的量通常为最初加入的生物质重量的至少10倍、特别是至少20倍、有时甚至至少100倍。在本说明书中，除非另有明确指示，否则生物质的重量以干重计。

对于从第一发酵液中除去微生物，其优选以相对高的产率进行。对此有两个原因。首先，意图将生物质在随后的丙三醇发酵中使用。此外，剩余在发酵液中的生物质可能(例如以对产物颜色不利影响的形式)影响通过该发酵液制造的产物的性质。已经考虑优选除去生物质，使得所得的产物的浊度为至多1000NTU、特别是至多500NTU、更具体地为至多200NTU。优选至多100NTU的浊度。

在根据本发明的方法的另一个步骤中，对已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液进行脱水步骤以形成第一丙酸盐产物，特别是丙酸钙产物。该脱水步骤能够以多种方式进行。

在第一实施方式中，对已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液的全部进行脱水步骤。在这种情况下，形成第一丙酸盐产物，其包含存在于已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液中的所有物质，包括剩余营养物质。该干燥步骤能够以本领域已知用于脱水的方式进行，包括喷雾干燥、转鼓真空干燥、薄膜干燥例如搅拌薄膜干燥、机械搅拌干燥、喷雾造粒和冷冻干燥。

所得的产物是丙酸盐(特别是丙酸钙)的固体材料、特别是固体颗粒材料，其中丙酸盐含量范围为30-70wt.％、特别是40-60wt.％，其中剩余部分包含其他羧酸盐、特别是琥珀酸盐和/或乙酸盐中的一种或多种，以及由例如生物质和残留培养基/营养组分产生的其他组分。在一个实施方式中，所得的产物包含范围为3-20wt.％、特别是8-15wt.％、更特别是10-13wt.％的乙酸盐和/或量为0-10wt.％、特别是3-6wt.％的琥珀酸盐。优选的是，丙酸钙、琥珀酸钙和乙酸钙构成总的第一丙酸钙产物的至少85wt.％、特别是至少90wt.％、更特别是在90wt.％至98wt.％之间。在上文中，百分比计算为阴离子(乙酸根、琥珀酸根、丙酸根)在总无水固体材料中的占比。

需注意，在喷雾干燥之前在发酵液中可能包括其他组分，例如附加羧酸盐比如乳酸盐或乙酸盐，载体如麦芽糖糊精、淀粉、乳固体、乳清、面粉或其他功能性成分如绿茶提取物、乳酸链球菌肽和迷迭香提取物。如果期望制造具有特定组成的产物，这可为有吸引力的。

在另一个实施方式中，对已经从其中回收产丙酸微生物的第一发酵液进行的步骤通过包括从第一发酵液中沉淀丙酸盐、特别是丙酸钙的方法来进行。可通过浓缩和其他已知措施(例如降低温度或加入降低溶解度的化合物)来开始沉淀，以改善沉淀步骤的产率。沉淀可以在单个步骤中或在多个步骤中分批地或连续地进行。

沉淀的丙酸盐产物、特别是丙酸钙与水性培养基分离。这能够通过本领域中已知的方法完成，包括过滤、离心、倾析等中的一种或多种。选择合适方式在技术人员的能力范围内。如果需要，能够对丙酸盐产物进行洗涤以提高产物纯度。洗涤液(如果使用的话)例如能够为水或丙酸盐溶液。洗涤液能够循环利用以获得高产率。能够根据需要干燥固体丙酸钙产物。

在该实施方式中，可以沉淀所有类型的羧酸盐、特别是体系中存在的羧酸钙盐、特别是与琥珀酸钙(如果存在的话)和/或乙酸钙(如果存在的话)组合的丙酸钙。在这种情况下，可获得最终产物，例如其中丙酸盐(特别是丙酸钙)含量的范围为30-80wt.％、特别是40-70wt.％，乙酸盐(特别是乙酸钙)的范围为3-20wt.％、特别是8-15wt.％、更特别是10-13wt.％，以及琥珀酸盐(特别是琥珀酸钙)的量为0-10wt.％、特别是3-6wt.％。优选的是，以这种方式获得的丙酸钙、琥珀酸钙和乙酸钙构成总的第一丙酸钙产物的至少85wt.％、特别是至少90wt.％、更特别是至少95wt.％。在上文中，百分比计算为阴离子(乙酸根、琥珀酸根、丙酸根)在总无水固体材料中的占比。

还可以从第一发酵液顺序地沉淀琥珀酸盐和丙酸盐，这能够经由例如用于从包含丙酸盐和琥珀酸盐的混合物制造固体丙酸盐的方法来完成，该方法包括以下步骤：

-提供包含琥珀酸根阴离子和丙酸根阴离子的水性培养基，

-以使得大部分琥珀酸根离子转化为固体琥珀酸盐而大部分丙酸根离子保留在溶液中的量将无机可溶性盐提供在水性培养基中，

-将包含大部分丙酸根离子的水性培养基与固体琥珀酸盐分离，

-增加水性培养基中盐的浓度，以将大部分丙酸根离子转化为固体丙酸盐，

-将固体丙酸盐与水性培养基分离。

如上所述，将产丙酸微生物从第一发酵液中回收。在根据本发明的方法的下一个步骤中，用从第一发酵液回收的产丙酸微生物将含有丙三醇的碳源在碱性盐的存在下发酵，以提供包含丙酸盐的第二发酵液。

用于从包含丙三醇的碳源开始制造丙酸的发酵方法在本领域是已知的并且这里不需要进一步阐释。使用技术人员的普遍已知的知识来选择合适发酵方法(包括发酵条件)在技术人员的能力范围内。

在该发酵步骤中使用的碳源包括丙三醇。已经发现，使用丙三醇作为碳源使得可以获得一种生成与相对少量的乙酸盐组合的相对高量的丙酸盐、特别是丙酸钙的发酵方法。这是有吸引力的，因为丙酸盐和乙酸盐的分离通常是复杂的。以在发酵期间提供的碳源的总量计，碳源优选包含至少70wt.％、更特别是至少80wt.％、还更特别是至少90wt.％的丙三醇。

在发酵步骤期间加入碱以抵消由于产生羧酸而发生的pH降低。

合适的碱包括钙、镁、钠和钾的氢氧化物、氧化物和碳酸盐，引起形成分别含有丙酸钙、丙酸镁、丙酸钠或丙酸钾的发酵液。在根据本发明的方法中，优选使用碱性钙盐，因为这引起形成作为根据本发明的优选产物的丙酸钙。合适的碱性钙盐包括钙的氢氧化物、氧化物和碳酸盐。

在两个发酵步骤中使用的碱性盐可相同或不同。出于效率的原因，可优选在选自糖和乳酸盐的碳源的发酵中所提供的碱性盐和在包含丙三醇的碳源的发酵中所提供的碱性盐是相同阳离子的盐。特别优选使用钙盐。

一旦发酵已经达到所期望程度，就对第二发酵液进行包括至少一个沉淀步骤的纯化步骤，以形成第二丙酸钙产物。

通常，首先对第二发酵液进行生物质除去步骤，该步骤能够以本领域已知的方式进行。参照以上针对从第一发酵液中除去生物质所阐述的内容。对于上述步骤，认为优选将生物质除去，使得所得产物的浊度至多为1000NTU、特别是至多500NTU、更具体地为至多200NTU。优选至多100NTU的浊度。已经发现生物质的存在可干扰在根据本发明的方法中的进一步的沉淀步骤。如果需要，可将在该步骤中分离的生物质提供至第二基于丙三醇的发酵。

对已经从其中除去生物质的所得发酵液进行至少一个沉淀步骤，以形成第二丙酸盐产物。

在沉淀步骤之前，如果需要的话，可将培养基与吸附剂、特别是活性炭吸附剂接触以除去杂质。

沉淀步骤能够如上所述地进行。可通过培养基的浓缩和/或通过其他已知措施(例如降低温度或加入降低溶解度的化合物)来开始沉淀，以改善沉淀步骤的产率。参考以上对于沉淀步骤所阐述的内容。将沉淀的丙酸盐产物、特别是丙酸钙与水性培养基分离。这能够通过本领域中已知的方法完成，包括过滤、离心、倾析等中的一种或多种。选择合适方式在技术人员的能力范围内。如果需要，能够对丙酸盐产物进行洗涤以提高产物纯度。洗涤液(如果使用的话)例如能够为水或丙酸盐溶液。洗涤液能够循环利用以获得高产率。能够根据需要干燥固体丙酸盐产物。

在一个实施方式中，除了丙酸盐之外，还沉淀其他羧酸盐、特别是琥珀酸盐和/或乙酸盐。特别是体系中存在的羧酸钙可一起沉淀、特别是与琥珀酸钙(如果存在的话)和/或乙酸钙(如果存在的话)组合的丙酸钙。在这种情况下，可获得最终产物，例如其中丙酸盐(特别是丙酸钙)含量的范围为50-90wt.％、特别是60-80wt.％、更特别是70-80wt.％，乙酸盐(特别是乙酸钙)的范围为0-5wt.％、特别是0-2wt.％，以及琥珀酸盐(特别是琥珀酸钙)的量为0-20wt.％、特别是0-10wt.％、更特别是0-5wt.％。优选的是，以这种方式获得的丙酸钙、琥珀酸钙和乙酸钙构成总的第一丙酸钙产物的至少85wt.％、特别是至少90wt.％、更特别是至少95％。在上文中，百分比计算为阴离子(乙酸根、琥珀酸根、丙酸根)在总无水固体材料中的占比。

还可以从第二发酵液顺序地沉淀琥珀酸盐和丙酸盐，这能够经由例如用于从包含丙酸盐和琥珀酸盐的混合物制造固体丙酸盐的方法来完成，该方法包括以下步骤：

-提供包含琥珀酸根阴离子和丙酸根阴离子的水性培养基，

-以使得大部分琥珀酸根离子转化为固体琥珀酸盐而大部分丙酸根离子保留在溶液中的量将无机可溶性盐提供在水性培养基中，

-将包含大部分丙酸根离子的水性培养基与固体琥珀酸盐分离，

-增加水性培养基中盐的浓度，以将大部分丙酸根离子转化为固体丙酸盐，

-将固体丙酸盐与水性培养基分离。

技术人员将清楚，除非本文所述的各种实施方式和优选方式呈现为相互排斥的替代方式，否则能够将它们进行组合。

本发明将通过以下实施例来进行阐释，但不限于此。

实施例1：葡萄糖发酵，然后丙三醇发酵

用产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)培养物接种包含5kg培养基的发酵罐。培养基含有80g/kg葡萄糖和52g/kg YEP(酵母膏，50％干固体)。发酵罐在30℃、pH为6.5下运行。通过加入Ca(OH)₂溶液控制pH。在±45小时后，停止发酵。发酵液以5000RPM离心。该微生物存在于离心步骤的沉积物中。

在该步骤中，生物质的量从最初添加的20克增加至收获的150克，两者均以干重计。

将24克生物质加入到包含1kg培养基的发酵罐中，该培养基含有80g/kg丙三醇和52g/kg YEP。发酵罐在30℃、pH为7.0下运行。通过加入Ca(OH)₂溶液控制pH。

发酵产生1.2克丙酸钙/千克培养基/小时的容积生产率。以丙酸盐克数/克丙三醇计，发酵的总产率为72wt.％。

实施例2：葡萄糖发酵液的后处理

与实施例1第一段中所述类似地进行葡萄糖发酵。通过如实施例1中所述的离心从葡萄糖发酵液中分离生物质。使用旋转蒸发器，首先在大气压下、然后在真空干燥1000克剩余的发酵液。6小时后，获得干燥产物。

如使用GC所测定，发酵液包含以下有机酸。

表1：发酵液中有机酸的GC

干燥步骤后的固体产物具有以下组成：

表2：固体产物的组成

组分
		丙酸[％(w/w)]	36
乙酸[％(w/w)]	9.2
		琥珀酸[％(w/w)]	4.2
钙[％(w/w)]	18.2
		水[％(w/w)]	16.5
其他固体	余量

该实施例说明脱水以形成第一丙酸钙产物的步骤。在商业操作中，脱水步骤将通过其他方法例如喷雾干燥进行，但可获得类似结果。

实施例3：丙三醇发酵液的后处理

与实施例1的第二段类似地获得的丙三醇发酵液处理如下：

以5000RPM对通过丙三醇发酵获得的发酵液进行离心。离心步骤的沉积物是微生物。对上清液进一步处理。

向上清液中以0wt.％/克丙酸钙、0.1wt.％/克丙酸钙、或10wt.％/克丙酸钙的量加入活性炭。将加入活性炭的发酵液在60℃保持1小时。使用0.2微米过滤器通过真空过滤除去活性炭。

由下表可以看出，活性炭处理不引起丙酸钙从体系中除去：

通过蒸发水来浓缩培养基，从纯化的发酵培养基中沉淀出固体丙酸钙。在大气压下在150℃油浴中，蒸发于102℃至103℃(培养基温度)进行。如从雾度(haze)的形成能够看出，在约两个小时后，发生成核作用。在该时间点，将油浴的温度降低至120℃，以降低结晶期间的蒸发速率。将一些冷油加入到油浴中以加速温度的降低。在成核起始约1小时后，停止蒸发。

使用真空过滤或离心分离晶体与液体。

活性炭处理引起用于蒸发步骤的起始材料的颜色显著淡化。此外，在蒸发步骤期间，溶液变暗。相比于已经进行蒸发步骤的样品，这种效应对于没有进行蒸发步骤的样品更显著。这可从下表中的APHA值看出。

从进行活性炭处理的样品获得的固体产物也具有比从未进行活性炭处理的样品获得的产物好得多的颜色。

产物的组成如下：

1：在80℃的MC损失代表材料的含水量，其通过将材料在80℃温度的烘箱中保持16小时来测定。

从上表可以看出，使用离心机进行固液分离比使用真空漏斗给出更好的结果。该结果对于商业规模运作的相关性是有限的。

将湿产物在80℃干燥16小时以形成干燥产物。

Claims (10)

1.一种用于通过发酵制造丙酸盐产物的方法，其包括以下步骤：

-借助产丙酸微生物在发酵培养基中发酵选自糖和乳酸盐的碳源，以提供包含丙酸盐的第一发酵液，

-从所述第一发酵液中回收产丙酸微生物，

-对已经从其中回收产丙酸微生物的所述第一发酵液进行脱水步骤以形成第一丙酸盐产物，

-用从所述第一发酵液中回收的所述产丙酸微生物将包含丙三醇的碳源在无机碱性盐的存在下发酵，以提供包含丙酸盐的第二发酵液，

-对所述第二发酵液进行包括至少一个沉淀步骤的纯化步骤，以形成第二丙酸盐产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一发酵液和所述第二发酵液中生成的丙酸盐是相同阳离子盐并且优选为丙酸钙。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中选自糖和乳酸盐的所述碳源选自葡萄糖、乳酸盐和蔗糖。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在发酵选自糖和乳酸盐的碳源的所述步骤中，生物质的重量以如下方式增加：回收的生物质的量通常为最初加入的生物质的重量的至少10倍、特别是至少20倍、有时甚至至少100倍。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对已经从其中回收产丙酸微生物的所述第一发酵液的全部进行脱水步骤。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中对已经从其中回收产丙酸微生物的所述第一发酵液进行的所述步骤通过包括从所述第一发酵液沉淀丙酸盐、特别是丙酸钙的方法来进行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以所述发酵期间提供的碳源的总量计，包含丙三醇的所述碳源包含至少70wt.％、更特别是至少80wt.％、还更特别是至少90wt.％的丙三醇。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中首先对所述第二发酵液进行生物质除去步骤。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中除了丙酸盐之外，还沉淀其他羧酸盐、特别是琥珀酸盐和/或乙酸盐。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中琥珀酸盐和丙酸盐从所述第二发酵液中顺序地沉淀。