CN115181671A - 产油微藻的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产油微藻的培养方法，包括如下步骤：配制含酚培养液，所述含酚培养液中的酚浓度为150‑200mg/L，pH为7.0‑7.1；将所述含酚培养液与藻液混合后进行培养，培养过程中的温度为26‑28℃；所述藻液中的藻细胞密度为0.6‑0.7*107cells/mL；所述培养阶段的初始光照强度为8.3‑9.2μmol·m‑2S‑1；当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为10.3‑15.2μmol·m‑2S‑1，继续培养；监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。本发明中的产油微藻的培养方法，采用低浓度的酚类物质对产油微藻的生长进行胁迫，在一定酚浓度下增加了乙酰辅酶A羧化酶的活性，从而提高了脂肪酸的合成速率，使藻细胞体内油脂含量增加。

Description

产油微藻的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物培养和废水处理技术领域，具体涉及一种产油微藻的培养方法、该培养方法在微藻产油中的应用以及在处理含酚废水中的应用。
背景技术
近年来，在工业的快速发展下，废水的产生量迅速增加。含酚废水作为工业废水，其来源广泛，如石油废水、造纸废水和橡胶废水等。含酚废水毒性高、化学性质稳定、难降解，废水中的酚类化合物进入水环境后对生物产生毒害作用，并随着食物链的迁移进入人体，使人体细胞中的蛋白质变性，甚至造成蛋白质凝固，对人体造成严重损伤。含酚废水中苯酚不仅毒性最大，而且含量最高。在我国含酚废水已被列为最具危害的废水之一。因此，含酚废水的处理迫在眉睫。
微藻作为第三代产油原料，与第一代生物柴油原料-大豆、油菜以及第二代产油原料-烟草种子相比，具有生长周期短、适应能力强、固碳能力强、占地面积小和产油量高等优点。
产油微藻中的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)是一种光合自养型的单细胞生物，可以利用太阳光、水和CO2在光合作用下将太阳能储存在体内，并释放出氧气，该藻的光合能力高出其他植物数倍。斜生栅藻属于绿藻门，绿球藻目，真集结亚目，栅藻科，栅藻属，该属广泛分布于湖泊、河流之中。藻细胞上下细小，为纺锤状，细胞壁平滑。图1为斜生栅藻在高倍显微镜下放大1000倍的照片，照片来自于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。
斜生栅藻具有代谢速度快、环境耐受性强、光合效率高等特点，由于其固碳能力强，被广泛应用于烟道气中CO2的去除。另外，斜生栅藻在极端环境下表现出极强的适应能力，可在各种温度和pH下生长且生长过程中，斜生栅藻的细胞表面会分泌大量的胞外聚合物，使细胞具有较强的粘附性，从而附着在水体中的生物群落表面形成藻类生物膜，吸收水体中的有机物，因此可以被用于污水处理。
酚类化合物属极性、可离子化、弱酸性的有机化合物，具有毒性大、难降解性等特点，是一种原生质毒物，对一切生命个体都有毒杀作用，能使蛋白质凝固。长期饮用被酚污染的水可引起慢性积累性中毒，饮用水中的酚浓度即使只有0.002mg/L，也会影响人体健康。酚对水生生物、农作物都有一定的毒害，如水中含酚0.1-0.2mg/L时，鱼肉即有臭味不能食用；浓度增加到1mg/L，会影响鱼类产卵；浓度增加到6.5-9.3mg/L时，鱼类就会大量死亡。基于上述原因，目前还没有出现将产油微藻如斜生栅藻应用于含酚废水处理中的技术方案。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种产油微藻的培养方法，利用含酚培养液进行产油微藻的培养，能够应用于含酚废水的处理中，解决了含酚废水的处理问题的同时提高产油微藻的生物量和油脂产率。
为了达到上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种产油微藻的培养方法，包括如下步骤：
配制含酚培养液，所述含酚培养液中的酚浓度为150-200mg/L，pH为7.0-7.1；
将所述含酚培养液与藻液混合后进行培养，培养过程中的温度为26-28℃；所述藻液中的藻细胞密度为0.6-0.7*107cells/mL；
所述培养阶段的初始光照强度为8.3-9.2μmol·m-2S-1；当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为10.3-15.2μmol·m-2S-1，继续培养；
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
根据本发明的一些实施方面，所述含酚培养液中的酚浓度为150～180mg/L，优选为150mg/L。
根据本发明的一些实施方面，所述产油微藻为斜生栅藻。本发明的一些实施例中所采用的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus FACHB-12)，购于中国科学院水生生物研究所藻种库。
根据本发明的一些实施方面，所述含酚培养液为酚类物质和BG11培养液混合后形成；所述酚类物质为苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚中的一种或多种。
在一些实施例中采用的BG11培养液的配方为：NaNO3 1500mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 36mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，柠檬酸6mg/L，EDTA1mg/L，Na2CO3 20mg/L，MnCl2·4H2O 2.86g/L，ZnSO4·7H2O 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g/L。
根据本发明的一些实施方面，采用反应器进行产油微藻的培养；所述反应器包括容器、设置在所述容器底部的曝气管、用于向所述曝气管内送入气体的导管以及设置在所述容器内的第一光板和第二光板，所述曝气管设置在所述第一光板和第二光板之间的下方位置；所述第一光板和第二光板用于将所述容器内的空间分为上升区和下降区；所述上升区位于所述第一光板和第二光板之间。且曝气管的曝气段的长度小于第一光板和第二光板之间的距离，以将第一光板和第二光板之间形成上升区。同时，两个光板的宽度均等于容器的宽度，两个光板的长度均需要小于液位的高度，两个光板的底部与容器底部之间的距离需大于或等于5cm，两个光板的顶部与液位面之间的距离大于或等于5cm以形成循环。两个光板沿竖直方向设置，且平行于容器的宽度方向。
根据本发明的一些实施方面，所述藻液为将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培，以1:5的体积比扩培至500mL BG11培养液的1L的锥形瓶中后形成。即扩培后形成的藻液中藻细胞密度为0.6-0.7*107cells/mL，优选为0.65*107cells/mL。
具体的，配制好的BG11培养液经高压蒸汽灭菌锅在120℃下灭菌30min，待其冷却后再倒入藻液。冷却过程中为避免杂菌污染，应将培养液、锥形瓶放置于超净工作台紫外灯照射条件下。将藻液放入光照振荡培养箱进行培养，温度设为(27±0.1)℃，光照强度设为2200Lx，黑夜、白天时间周期比12h:12h。实验选用对数增长期藻种。为避免斜生栅藻贴壁或沉底，每天早晚手摇一次。传代培养的时间周期为11-15天。藻种的培养以及扩培都需要在无菌环境下操作，在该过程中所使用的量筒、移液枪枪头和锥形瓶等仪器均需在严格灭菌后使用，整个操作过程应在超净工作台进行。
根据本发明的一些实施方面，采用HCl溶液和NaOH溶液调节含酚废水的pH。
根据本发明的一些实施方面，培养结束后得到的藻细胞的含油率大于90％；油脂的积累量大于0.1g/L。
本发明还提供了一种微藻的产油方法，采用如上所述的产油微藻的培养方法对产油微藻进行培养；培养结束后，将收集的藻细胞进行离心和干燥，并进行提取之后得到油脂。
本发明还提供了一种含酚废水的处理方法，采用如上所述的产油微藻的培养方法，将产油微藻在含酚废水中进行培养以处理含酚废水。单独的将产油微藻的斜生栅藻应用于处理含酚废水中，控制含酚废水中的酚浓度为低于或等于200mg/L即可，因为斜生栅藻能够较好的生长且能够有效降解酚类物质。但是在结合含酚废水的处理的同时进行斜生栅藻的培养和产油，以达到效果的最优化，那么需要控制加入产油微藻时含酚废水中的酚浓度为150-200mg/L，pH为7.0-7.1；控制加入的藻液的藻细胞密度为0.6-0.7*107cells/mL。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明中的产油微藻的培养方法，采用低浓度的酚类物质对产油微藻的生长进行胁迫，在一定酚浓度下增加了乙酰辅酶A羧化酶的活性，从而提高了脂肪酸的合成速率，使藻细胞体内油脂含量增加。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明优选实施例中的斜生栅藻在1000倍镜下的放大图片；
图2为本发明优选实施例中采用的反应器的结构示意图；
图3为本发明优选实施例中的斜生栅藻在不同酚浓度培养液中生物量、干重和油脂积累量的变化；其中，图3a为斜生栅藻在不同酚浓度培养液中生物量的变化；图3b为斜生栅藻在不同酚浓度培养液中干重的变化；图3c为斜生栅藻在不同酚浓度培养液中油脂含量的变化；
图4为采用本发明中含酚废水的处理方法应用在不同酚浓度废水中苯酚的浓度变化；
附图中，曝气管-1；导气管-2；光板-3，容器-4。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
斜生栅藻具有代谢速度快、环境耐受性强、光合效率高等特点，由于其固碳能力强，被广泛应用于烟道气中CO2的去除。另外，斜生栅藻在极端环境下表现出极强的适应能力，可在各种温度和pH下生长。生长过程中，斜生栅藻的细胞表面会分泌大量的胞外聚合物，使细胞具有较强的粘附性，从而附着在水体中的生物群落表面形成藻类生物膜，吸收水体中的有机物，因此也可以被用于污水处理。光照是影响藻细胞生长及胞内油脂组成的重要因素。光强对微藻生长的影响表现为光强过强或过弱都将制微藻的生长；但随着藻密度的增加，藻液透光性降低，适当的光强可提高细胞生长速率和油脂含量。为尽可能收获较高的生物量和总脂含量，根据斜生栅藻在不同培养条件下的生长特征和总脂积累特点，本发明提出一种采用含酚培养液培养产油微藻的方法。
本实施例中的产油微藻的培养方法，具体包括如下步骤：
1)扩培
本实施例中的产油微藻为斜生栅藻(Scenedesmus obliquus FACHB-12)，购于中国科学院水生生物研究所藻种库，如图1所示。
将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培，以1:5的体积比扩培至500mL BG11培养液中形成藻液，并控制扩培的藻液中藻细胞密度为0.6-0.7*107cells/mL，优选0.65*107cells/mL。如果藻细胞的密度过低，单位藻细胞对应的酚类物质过多，会抑制藻细胞的生长，无法起到有效的作用。若藻细胞的密度过高，一定浓度的酚对单位藻细胞刺激作用有限。因此，无法刺激藻细胞快速生长。
本实施例中采用的BG11培养液的配方为：NaNO3 1500mg/L，K2HPO4·3H2O 40mg/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 36mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，柠檬酸6mg/L，EDTA 1mg/L，Na2CO3 20mg/L，MnCl2·4H2O 2.86g/L，ZnSO4·7H2O 1.81g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g/L。
具体的扩培过程为，将配制好的BG11培养液经高压蒸汽灭菌锅在120℃下灭菌30min，待其冷却后再倒入藻种；将藻液放入光照振荡培养箱进行培养，温度设为(27±0.1)℃，光照强度设为2200Lx，黑夜、白天时间周期比12h:12h。实验选用对数增长期藻种。
BG11培养液冷却过程中为避免杂菌污染，应将培养液、锥形瓶等放置于超净工作台紫外灯照射条件下。为避免斜生栅藻贴壁或沉底，每天早晚手摇一次。传代培养的时间周期为11-15天。藻种的培养以及扩培都需要在无菌环境下操作，在该过程中所使用的量筒、移液枪枪头和锥形瓶等仪器均需在严格灭菌后使用，整个操作过程应在超净工作台上进行。
2)配制含酚培养液
将酚类物质和BG11培养液混合后形成含酚培养液，含酚培养液中的酚浓度为150-200mg/L，pH为7.0-7.1，生物需氧量(COD)浓度为153.0-467.0mg/L。酚类物质为苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚中的一种或多种。可以用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节含酚培养液的pH。pH过高或过低会影响藻细胞的生长，影响碳酸根离子在营养液中的比例及微藻光合作用可利用的碳源，进而影响微藻的生长。
3)第一培养阶段
将含酚培养液与扩培后的藻液混合后进行培养，培养过程中的温度为26～28℃。含酚培养液在投加藻液前利用高压锅在120℃下灭菌30分钟，避免杂菌污染。
当藻细胞生长达到对数生长末期时，第一培养阶段结束。第一培养阶段中的初始光照强度为8.3-9.2μmol·m-2S-1。
4)第二培养阶段
当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为10.3-15.2μmol·m-2S-1，继续培养。在藻细胞生长开始下滑的时候，第二培养阶段结束。
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
即采用含酚培养液进行斜生栅藻的培养分为两个阶段，并通过培养的光强进行分阶段调节，第一培养阶段以高密度的培养为目的，将培养基的光强维持在最适合藻种生长的范围内(8.3-9.2μmol·m-2S-1)；第二培养阶段以提高藻的油脂含量为目的，即在第一阶段的基础上，当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节反应器的光强(10.3-15.2μmol·m- 2S-1)再培养。用分光光度法每天监测藻细胞密度的变化，并在藻细胞生长下滑的初期收集藻细胞，离心、干燥后进行油脂的提取。由于藻细胞对pH等参数十分敏感，通过调整pH控制细胞的生长不易实施，容易造成藻细胞的数量下降；采用光强控制藻细胞的生长更加容易实施和操控。
第一培养阶段和第二培养阶段采用如图2所示的反应器进行产油微藻的培养。具体的，反应器包括容器、设置在容器底部的曝气管、用于向曝气管内送入气体的导管以及设置在容器内的第一光板和第二光板，曝气管设置在第一光板和第二光板之间的下方位置；第一光板和第二光板用于将容器内的空间分为上升区和下降区；上升区位于第一光板和第二光板之间。
曝气管的曝气段的长度小于第一光板和第二光板之间的距离，以将第一光板和第二光板之间形成上升区。同时，两个光板的宽度均等于容器的宽度，两个光板的长度均需要小于液位的高度，两个光板的底部与容器底部之间的距离需大于或等于5cm，两个光板的顶部与液位面之间的距离大于或等于5cm以形成循环。两个光板沿竖直方向设置，且平行于容器的宽度方向。
本实施例中的采用内环流气升式中心进气的反应器，内部无搅拌装置，主要由底部的曝气管和光板组成，光板既能调节光强，又能将反应区域分为上升区和下降区。液体携带气泡在反应器内形成循环流动，从而达到良好的气液混合。优点主要是具有比其他生物反应器的流动性更为均匀，且反应器本身结构简单，设置的光板既能调节光强又具有挡板的作用，制作及操作费用也很低。与机械搅拌罐相比，成本低、能耗低，适用于对溶氧与混合要求较高的工艺；液体循环周期在正常条件下可控制在数十秒至几分钟的范围内；强化区的数量可根据液流变特性和微生物的代谢特征进行设置，以满足微生物生长和产物生成所需要的混合与传质要求。强化区的作用主要是通过二氧化碳气体带动藻液在系统循环流动，同时光合作用生成的氧气可以通过循环作用从系统中排出。
实施例1
本实施例中的产油微藻的培养方法，具体包括如下步骤：
1)扩培
本实施例中的产油微藻为斜生栅藻(Scenedesmus obliquus FACHB-12)，购于中国科学院水生生物研究所藻种库，如图1所示。将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培，以1:5的体积比扩培至500mL BG11培养液中形成藻液。
2)配制含酚培养液
将酚类物质和BG11培养液混合后形成含酚培养液，含酚培养液中的酚浓度为150mg/L，pH为7.0。酚类物质为苯酚。
采用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节含酚培养液的pH。
3)第一培养阶段
采用如图2所示的反应器将含酚培养液与扩培后的藻液(藻细胞密度为0.65*107cells/mL)混合后进行培养，培养过程中的温度为27℃。含酚培养液在投加藻液前利用高压锅在120℃下灭菌30分钟，避免杂菌污染。
当藻细胞生长达到对数生长末期时，第一培养阶段结束。第一培养阶段中的初始光照强度为9.0μmol·m-2S-1。
4)第二培养阶段
当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为12.5μmol·m-2S-1，继续培养。在藻细胞生长开始下滑的时候，第二培养阶段结束。
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
实施例2
本实施例中的产油微藻的培养方法，具体包括如下步骤：
1)扩培
本实施例中的产油微藻为斜生栅藻(Scenedesmus obliquus FACHB-12)，购于中国科学院水生生物研究所藻种库，如图1所示。将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培，以1:5的体积比扩培至500mL BG11培养液中形成藻液。
2)配制含酚培养液
将酚类物质和BG11培养液混合后形成含酚培养液，含酚培养液中的酚浓度为155mg/L，pH为7.1。酚类物质为苯酚。
采用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节含酚培养液的pH。
3)第一培养阶段
采用如图2所示的反应器将含酚培养液与扩培后的藻液(藻细胞密度为0.6*107cells/mL)混合后进行培养，培养过程中的温度为26℃。含酚培养液在投加藻液前利用高压锅在120℃下灭菌30分钟，避免杂菌污染。
当藻细胞生长达到对数生长末期时，第一培养阶段结束。第一培养阶段中的初始光照强度为9.2μmol·m-2S-1。
4)第二培养阶段
当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为15.2μmol·m-2S-1，继续培养。在藻细胞生长开始下滑的时候，第二培养阶段结束。
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
实施例3
本实施例中的产油微藻的培养方法，具体包括如下步骤：
1)扩培
本实施例中的产油微藻为斜生栅藻(Scenedesmus obliquus FACHB-12)，购于中国科学院水生生物研究所藻种库，如图1所示。将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培，以1:5的体积比扩培至500mL BG11培养液中形成藻液。
2)配制含酚培养液
将酚类物质和BG11培养液混合后形成含酚培养液，含酚培养液中的酚浓度为200mg/L，pH为7.0。酚类物质为苯酚。
采用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节含酚培养液的pH。
3)第一培养阶段
采用如图2所示的反应器将含酚培养液与扩培后的藻液(藻细胞密度为0.7*107cells/mL)混合后进行培养，培养过程中的温度为27℃。含酚培养液在投加藻液前利用高压锅在120℃下灭菌30分钟，避免杂菌污染。
当藻细胞生长达到对数生长末期时，第一培养阶段结束。第一培养阶段中的初始光照强度为8.3μmol·m-2S-1。
4)第二培养阶段
当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为10.3μmol·m-2S-1，继续培养。在藻细胞生长开始下滑的时候，第二培养阶段结束。
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
对比例1-9
对比例1与实施例1的区别在于本对比例中的含酚培养液中的酚浓度为50mg/L，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例2与实施例1的区别在于本对比例中的含酚培养液中的酚浓度为100mg/L，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例3与实施例1的区别在于本对比例中的培养液为不含酚的纯BG11培养液，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例4与实施例1的区别在于本对比例的培养阶段保持光照强度固定在6.82μmol·m-2S-1，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例5与实施例1的区别在于本对比例的培养阶段保持光照强度固定在16.58μmol·m-2S-1，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例6与实施例1的区别在于本对比例的含酚培养液的pH为6.5，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例7与实施例1的区别在于本对比例的含酚培养液的pH为7.5，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例8与实施例1的区别在于本对比例的添加的藻液中藻细胞密度为0.5*107cells/mL，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
对比例9与实施例1的区别在于本对比例的添加的藻液中藻细胞密度为0.9*107cells/mL，其他步骤和参数与实施例1基本一致。
实施例4
本实施例提供一种基于实施例1的产油微藻的培养方法建立的微藻的产油方法，其微藻培养方法和前述实施例相同，即先扩培，之后采用含酚培养液进行两个阶段的培养。培养结束后，将收集的藻细胞进行离心和干燥，并进行提取之后得到油脂。
经过上述培养结束后得到的藻细胞的含油率大于90％；油脂的积累量大于0.1g/L。
实施例5
本实施例提供了一种基于实施例1的产油微藻的培养方法建立的含酚废水的处理方法，其与产油微藻的培养方法基本一致，不同点在于将实施例1中的含酚培养液替换为含酚废水，即采用实施例1中的培养方法将产油微藻在含酚废水中进行培养，以达到对含酚废水进行处理的作用。
斜生栅藻在不同浓度含酚废水中的苯酚浓度变化如图4所示。从图中可以看出，各试验组的苯酚浓度变化趋势大致相同。在培养的前2天，斜生栅藻充分吸收水中的苯酚，将苯酚作为直接碳源，用于自身生长，苯酚浓度大幅度下降，第2天，斜生栅藻在各个浓度含酚废水(浓度由低到高)中对苯酚的降解率分别为87.7％、70.8％、60.1％和49.2％，说明斜生栅藻的去除能力随苯酚的增加而减弱。第3天，酚浓度为50mg/L的试验组对苯酚的去除率达到100％；第4天，酚浓度为100mg/L的试验组对苯酚的降解率达到100％；第5天，酚浓度为150mg/L的试验组对苯酚的降解达到100％。前5天，酚浓度为200mg/L的试验组的苯酚降解呈下降趋势，而第5天至第6天，苯酚降解速度突然加快，斜生栅藻可能在培养初期被驯化，在苯酚作用下形成诱导酶，使栅藻降解苯酚的能力有所提高，推测在第7、8天，苯酚的浓度可降为0mg/L。通过上述结果可以说明斜生栅藻对苯酚有很好地降解作用。
单独的将产油微藻的斜生栅藻应用于处理含酚废水中，控制含酚废水中的酚浓度为低于或等于200mg/L即可，因为斜生栅藻能够较好的生长且能够有效降解酚类物质。但是在结合含酚废水的处理的同时进行斜生栅藻的培养和产油，以达到效果的最优化，那么向含酚废水中加入产油微藻时，控制含酚废水中的酚浓度为150～200mg/L，pH为7.0-7.1，生物需氧量(COD)浓度为153.0-467.0mg/L，控制加入的藻液的藻细胞密度为0.65*107cells/mL。结合前述的实施例和对应的结果，此时能够实现酚类物质的有效降解以及斜生栅藻的有效培养和产油。
结果与讨论
基于实施例1、3和对比例1-9，统计斜生栅藻在不同酚浓度培养液中生物量、干重和油脂积累量的变化。
斜生栅藻在不同浓度含酚培养液中(实施例1、3和对比例1-3)的油脂产率如图3所示。从图中可以看出，斜生栅藻在苯酚胁迫下有促进油脂相对含量积累的作用；且斜生栅藻在200mg/L的酚废水中的油脂产率小于在150mg/L的酚废水油脂产率，可能因为苯酚浓度过高，斜生栅藻的生长受到损伤，造成油脂合成途径受阻。实验表明，斜生栅藻在150mg/L的酚浓度废水中油脂的相对含量最高，为0.1013g/L。
更具体的，从图3(a)可以直观看出，酚浓度的增加可以促进生物量增大，但并非呈正比，如斜生栅藻在200mg/L的含酚培养液中生物量(藻细胞密度为0.097cells/mL)反而小于150mg/L的含酚培养液中的生物量(藻细胞密度为0.117cells/mL)。与空白组比较，酚浓度在150-200mg/L范围内对斜生栅藻的生长有促进作用，但是在150mg/L的含酚废水中生物量最大，说明培养斜生栅藻的最佳酚浓度为150mg/L，同时也验证了在含酚废水中培养斜生栅藻的可行性。由图3(b)可知，在150mg/L的含酚培养液培养的斜生栅藻的干重(干重指的是取一升藻液，微藻烘干后的质量)为0.112g/L，在200mg/L的含酚培养液培养的斜生栅藻的干重为0.136g/L。斜生栅藻在不同浓度含酚培养液中的油脂产率如图3(c)所示。从图中可以看出，斜生栅藻在苯酚胁迫下有促进油脂相对含量积累的作用。其原因主要是：斜生栅藻在含酚废水中的培养前期，藻细胞的生长虽然受到一定程度的抑制，但是斜生栅藻可能在该环境中被驯化，在一定酚浓度下增加了乙酰辅酶A羧化酶的活性，从而提高了脂肪酸的合成速率，使藻细胞体内油脂含量增加。该酶是脂肪酸合成过程中的关键限速酶，对脂肪酸合成以及氧化过程有限制作用。
对比例4对应得到的斜生栅藻的干重为0.0328g/L、油脂相对含量为0.0358g/L；对比例5对应得到的斜生栅藻的干重为0.0368g/L、油脂相对含量为0.0329g/L。说明光强是影响微藻生长，繁殖重要的影响因素，适当的光照才能够有助于产油微藻光合作用的发生，光照太强会对微藻的光合系统造成不可逆的损伤。光强还能影响微藻细胞成分，色素及光合活性的变化。此外，光强还影响油脂的合成，光强饱和时微藻产生的过量NADPH流向油脂，促进油脂的生成。且采用实施例中的两个阶段的不同光照强度比单一不变化的光照强度更加能够促进斜生栅藻的生长以及最终产油量的提升。
对比例6对应得到的斜生栅藻的干重为0.081g/L、油脂相对含量为0.079g/L；对比例7对应得到的斜生栅藻的干重为0.082g/L、油脂相对含量为0.087g/L。说明pH过高或过低会影响培养基碳酸根离子的比例，从而影响微藻光合作用中可利用的碳源进而影响微藻的生长。
对比例8对应得到的斜生栅藻的干重为0.072g/L、油脂相对含量为0.069g/L；对比例9对应得到的斜生栅藻的干重为0.085g/L、油脂相对含量为0.073g/L。说明藻细胞的密度过低，单位藻细胞对应的酚类物质过多，会抑制藻细胞的生长，无法起到有效的作用。若藻细胞的密度过高，一定浓度的酚对单位藻细胞刺激作用有限。因此，无法刺激藻细胞快速生长。
上述的干重通过如下步骤进行测量：
取25mL斜生栅藻藻液于50mL比色管中，稀释至50mL。用0.45μm的滤膜在循环水式多用真空泵的作用下抽滤，抽滤前将滤膜放在烘箱中，在100℃下烘干60min，结束进行称重，记作W1。抽滤之后的滤膜同上述方法进行烘干，同样测其重量，记为W2。
Figure BDA0003699273070000121
式中：W1为抽滤前滤膜的重量，W2为抽滤后滤膜的重量，V为所取藻液的体积(mL)。
上述的油脂相对含量通过如下步骤进行测量：
油脂测量采用溶剂提取法。样品经真空冷冻干燥机制成藻粉，取大约0.1g藻粉，加入3mL氯仿-甲醇混合液(氯仿与甲醇体积比为2:1)，在恒温震荡器中震荡30min，再超声破碎20min，最终在离心机中以运转条件8000r/min离心10min，将上清液放于已称量试管中。重复以上步骤2次。最后将试管放在通风橱中进行氮吹，直至吹干萃取溶剂。再对试管进行称量。
藻细胞含油率＝油脂重量/藻粉重量×100％
油脂相对含量＝藻细胞干重(g/L)×藻细胞含油率
本发明采用对微生物的生长有促进作用的低浓度的酚培养产油微藻，且设置两阶段培养方式，培养产油微藻，实现“废水-微藻培养”的大规模应用。具体的，产油微藻采用斜生栅藻，采用气升式光生物反应器培养，取适量的苯酚溶解于BG11培养液中，配置成酚浓度为150mg/L的微藻培养液。该培养液的pH为7.0-7.1，生物需氧量(COD)浓度为153.0-467.0mg/L，培养温度保持27℃左右。通过培养的光强进行分阶段调节，第一阶段是将培养基的光强维持在最适合藻种生长的范围内(8.3-9.2μmol·m-2S-1)，以高密度的培养为目的；第二阶段是在第一阶段的基础上，当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节反应器的光强(10.3-15.2μmol·m-2S-1)再培养，以提高藻的油脂含量，并用分光光度法每天监测藻细胞密度的变化，并在藻细胞生长下滑的初期收集藻细胞，离心、干燥后进行油脂的提取。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种产油微藻的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制含酚培养液，所述含酚培养液中的酚浓度为150-200mg/L，pH为7.0-7.1；
将所述含酚培养液与藻液混合后进行培养，培养过程中的温度为26-28℃；所述藻液中的藻细胞密度为0.6-0.7*107cells/mL；
所述培养阶段的初始光照强度为8.3-9.2μmol·m-2S-1；当藻细胞生长达到对数生长末期时，调节光照强度为10.3-15.2μmol·m-2S-1，继续培养；
监测藻细胞的密度变化，并在藻细胞生长开始下滑的时候收集藻细胞；培养结束。
2.根据权利要求1所述的产油微藻的培养方法，其特征在于，所述含酚培养液中的酚浓度为150～180mg/L。
3.根据权利要求2所述的产油微藻的培养方法，其特征在于，所述产油微藻为斜生栅藻。
4.根据权利要求1所述的产油微藻的培养方法，其特征在于，所述含酚培养液为酚类物质和BG11培养液混合后形成；所述酚类物质为苯酚、邻苯二酚，对苯二酚、间苯二酚中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的产油微藻的培养方法，其特征在于，采用反应器进行产油微藻的培养；所述反应器包括容器、设置在所述容器底部的曝气管、用于向所述曝气管内送入气体的导管以及设置在所述容器内的第一光板和第二光板，所述曝气管设置在所述第一光板和第二光板之间的下方位置；所述第一光板和第二光板用于将所述容器内的空间分为上升区和下降区；所述上升区位于所述第一光板和第二光板之间。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述藻液为将藻种采用BG11培养液以不断传代的培养方法进行扩培后形成。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用HCl溶液和NaOH溶液调节含酚培养液的pH。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，培养结束后得到的藻细胞的含油率大于90％；油脂的积累量大于0.1g/L。
9.一种微藻的产油方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任意一项所述的产油微藻的培养方法对产油微藻进行培养；培养结束后，将收集的藻细胞进行离心和干燥，并进行提取之后得到油脂。
10.一种含酚废水的处理方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任意一项所述的产油微藻的培养方法，将产油微藻在含酚废水中进行培养以处理含酚废水。
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