CN115181183B - 一种il-31ra抗体以及其构建方法 - Google Patents

一种il-31ra抗体以及其构建方法 Download PDF

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

一种IL‑31RA抗体，通过筛选获得序列结构优化的抗体，提高抗体特异性，通过载体构建表达，通过引入2A连接肽和特定的载体，通过抗体纯化和活性检测可知本发明涉及的抗体以及特定的构建方法，可有效提高抗体活性。

Description

一种IL-31RA抗体以及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种IL-31RA抗体以及其构建方法
背景技术
现有的IL-31RA抗体由于序列本身设计的缺陷，以及构建方法的不足，导致最终得到的抗体活性较低，作为对照品、检测试剂，其抗原结合特异性以及抗体活性都有一定不足。而且，目前表达抗体传统的方法是把重链和轻链分别构建到两个哺乳表达载体上，然后利用含有重链和轻链的两个表达载体进行共转来实现抗体的表达。该传统方法具有一定的局限性，比如由于两个载体同时转染到细胞中，不同表达载体间有相互抑制作用，或是转染入细胞的两个质粒的量的比例不合适而导致抗体表达失败，同时构建多个载体也不经济。
发明内容
本发明涉及一种IL-31RA抗体
所述抗体重链包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3，所述抗体轻链包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所述的CDR1、CDR2、CDR3。
所述抗体重链可变区如SEQ ID NO.3所示，所述抗体重链全长如SEQ ID NO.2所示，所述抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，在抗体设计时在重链的C端增加Avi标签，重链和Avi标签之间通过GSLinker连接，提高了融合表达的效率(已经包含在SEQ ID NO.2所示的全长序列中)。
进一步的，所述抗体轻链可变区如SEQ ID NO.9所示，所述抗体轻链全长如SEQ IDNO.8所示，所述抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述Avi标签蛋白序列为SEQ ID NO.15所示，GS Linker序列并不限定，可以为本领域通用的GS linker，但优选为SEQ ID NO.16所示。
本发明自主筛选得到的IL-31RA抗体序列，可最大程度发挥抗原特异性。
本发明还涉及一种抗体构建方法，把抗体IL31RA的重链和轻链基因通过基因合成的方法同时构建到哺乳表达载体pTT5上，重链和轻链基因之间用2A肽连接。所述构建载体包括顺次连接的启动子-抗体轻链-2A Linker-抗体重链-终止子的功能元件。(结构图参见图7)
所述2A肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，所述2A肽的蛋白序列为SEQ IDNO.14所示。
所述抗体序列，配合特定的构建方法，能够起到协同增效的作用，可最大程度提高抗体活性和特异性。
附图说明
图1同源重组的方法把重链和轻链基因重组到哺乳表达载体pTT5重构建重组抗体IL31RA表达载体环状图；
图2同源重组的方法把重链和轻链基因重组到哺乳表达载体pTT5重构建重组抗体IL31RA表达载体线型图；
图3重组抗体IL31RA表达载体质粒酶切图；
图4重组质粒转染结果图；
图5重链和轻链分别构建质粒表达结果；
图6重链和轻链通过P2A同时构建在一个哺乳表达载体上的表达结果；
图7重组载体结构示意图。
有益效果
1.本发明对抗体序列进行了优化，序列结构上筛选改进；并且为了提高表达效率，再抗体重链的C端加上Avi标签，并且在重链和Avi标签直接通过GS linker连接，便于融合表达，因此提高了活性。
2.本发明通过把IL31RA抗体重链和轻链同时构建到一个哺乳表达载体上，重链和轻链之间需要加上2A肽，重链和轻链通过2A多肽链连成一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，最后这两个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白，即表达后的重链和轻链会被切开，重链和轻链的摩尔比理论上是1：1。相对于分别构建两个表达载体的传统方法，还需要摸索合适的比例，而该方法只需要构建一个表达载体进行单个转染实验即可，节约时间和试剂成本，因此该方法即高效又经济，有利于产业化放大。
具体实施方式
实施例一构建重组抗体IL31RA表达载体
1.1设计引物
使用引物设计工具GeneDesign设计重组抗体IL31RA的重链和轻链的引物，设计得到的引物委托引物合成供应商生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。
1.2引物PCR扩增得到重链和轻链DNA片段
接到生工生物工程(上海)股份有限公司合成的引物后通过两轮PCR实验得到重组抗体IL31RA重链和轻链的DNA片段：
第I轮PCR反应体系
第I轮PCR反应程序
第II轮PCR反应体系
第II轮PCR反应程序
扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定所扩增的重链和轻链DNA片段大小正确，从琼脂糖凝胶上切下大小正确的DNA片段，利用凝胶回收试剂盒纯化回收得到重链和轻链DNA片段。
1.3重组抗体IL31RA重链和轻链的DNA片段克隆至表达载体pTT5
把已经纯化好的重链和轻链的DNA片段使用同源重组的方法重组进pTT5表达载体，载体使用EcoRI和HindIII这两个限制性酶切位点进行酶切线性化，同源重组反应如下：
1.1.1同源重组反应体系：
重组反应液在50℃反应30min后得到的产物转化进DH5a感受态，转化后的感受态置于冰上冰浴15min，冰浴完成后于42℃水浴锅里热激90s，热激完之后立刻插入冰上冰育2-3min，在超净台中，加入500μL LB培养基(注意一定是无抗的LB培养基)，轻柔的上下颠倒3-5次，37℃、230rpm震荡培养45-60min。涂板，37℃恒温箱培养过夜。
1.4重组抗体IL31RA重链和轻链阳性克隆筛选
生长过夜的平板挑取单克隆进行菌落PCR，菌落PCR体系：
反应程序：
菌液PCR反应结束后电泳跑检测胶，以确认是否扩增成功，如果有相应大小的目的条带，为阳性克隆，把阳性克隆菌液送给生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证；
利用全基因合成方法合成重组抗体IL31RA的轻链和重链基因，通过同源重组的方法把重链和轻链基因重组到哺乳表达载体pTT5重构建重组抗体IL31RA表达载体(重组图谱见图1、图2)。
实施例二重组抗体IL31RA表达载体质粒制备：
2.1接菌
把测序正确的菌液取50ul接种到装有800ml的EM培养基的三角摇瓶中，同时加入800ul的氨苄抗性，做好标记后将三角烧瓶放入37℃220r摇床中培养过夜；
2.2抽提
1.将摇床中培养过夜的菌液用离心瓶装好后离心机8000rpm 5min离心收集菌体；
2.收集得到的菌体用碱裂解法进行裂解，将裂解中和好的菌体离心机中10000rpm离心15min得到上清；
3.上清过滤后用加入100ml异丙醇进行沉淀并于离心机中10000rpm离心20min；
4.将离心好的上清倒掉，向离心瓶中加入10ml 70％乙醇，离心机中10000rpm离心5min；
5.离心瓶中的沉淀彻底烘干后，取出离心瓶，加入8ml热好的ddH2O，盖上瓶盖，将沉淀彻底振荡混匀后取出到50ml EP管中.
6.抽提完成的质粒取少量进行测序，同时用EcoRI和HindIII限制性内切酶进行酶切验证，
酶切结果图参加图3：
实施例三重组抗体IL31RA表达
1实验材料
CO2摇床、生物安全柜、6孔板、Expi293悬浮细胞、细胞培养基、Feed补料、目的质粒、移液枪、1ml枪头、200ul枪头、20ul枪头、电动移液器、移液管(10ml)、PEI(40K)、灭菌超纯水、灭菌纱布、灭菌96孔PCR板
2.准备细胞
取6孔板，标记好项目名以及各孔编号，每个孔中加入1.6mlExpi293悬浮细胞；
将重组抗体IL31RA质粒和40KDa的PEI进行瞬时转染进Expi293细胞，细胞密度为2.5～3.0+E6，转染完成后细胞放在6孔板中并置于CO2培养箱中培养6天，以下是转染条件，同时用抗体IL31RA的重链和轻链两个质粒共转作为对照。
备注：1-5样本是构建的重组抗体IL31RA质粒，6号样本是对照(重组抗体的重链和轻链两个质粒共转染)
实施例四重组抗体IL31RA纯化制备
1.试剂和耗材准备
1x PBS(20mM PB,150mM NaCl)、0.1M的甘氨酸溶液pH2.9、5M NaCl溶液、ProteinA亲和树脂填料；
96孔浅孔板、96孔深孔板、96孔板硅胶盖(方形)、96孔PCR板、快速质粒抽取试剂盒(96孔过滤板)、快速质粒抽取试剂盒(96孔过滤板)硅胶板板盖(圆形)、橡皮筋、1ml/200ul/20ul枪头、200ul排枪。
2.收集细胞上清
将培养5-7天后的细胞取出，全部转移至做好标记的深孔板内，盖上硅胶板板盖(方形)，2000rpm离心2min。离心后小心吸取细胞上清1ml至做好标记的浅孔板内；
3.孵育
取步骤3中装有细胞上清的浅孔板，用200ul的排枪加入70ul的5M NaCl溶液，再加入30-80ul protein A的树脂，盖紧硅胶板板盖(方形)，将准备好的浅孔板固定在旋转摇床上，缓慢转动，室温孵育40min-1h；
4.洗杂
将孵育完成后的树脂全部转移至快速质粒抽取试剂盒(96孔过滤板)内，用200ul的枪头从浅孔板底部吸取，确保树脂全部能转移至质粒抽取试剂盒(96孔过滤板)内，盖上硅胶板板盖(圆形)，再在下方放入96孔PCR板，用橡皮筋捆绑完成后，2000rpm离心2min。离心完成后，用200ul的排枪吸取200ul的1xPBS清洗2遍；
5.洗脱
取一新的PCR板，做好标记，固定在快速质粒抽取试剂盒(96孔过滤板)下方，每孔加入40ul 0.1M甘氨酸溶液(pH2.9)洗脱。盖上硅胶板板盖(圆形)，室温静置孵育10-20min，用橡皮筋固定好，放入离心机内，2000rpm离心5min。
6.处理样品及跑胶
从步骤5中获得所需的目的蛋白后，依次加入10-30ul/孔的5x loading buffer，放入95℃金属浴或者PCR仪中，加热10min。取出跑SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色后进行拍胶，结果如图4所示，图中，Lane1、Lane2、Lane3、Lane4和Lane5为重组抗体IL31RA质粒DNA不同浓度转染的结果，从结果上看重组抗体IL31RA得到高表达；Lane6为该重组抗体IL31RA的重链和轻链两个质粒共转表达结果。(图4中右侧两个绿色箭头，上箭头表示重链，下箭头表示轻链)
结果证明，针对重组抗体IL31RA，通过载体改造方法(轻链-2Alinker-重链融合表达)较传统方法(重链和轻链分别构建到两个表达载体上通过共转表达重组抗体)更高效。
实施例五抗体活性检测
Human IL-31 RA和Anti-IL31RA Antibody结合活性测定实验
1仪器与材料
2样品与材料
样品信息 货号 厂家
Human IL-31 RA-His ILR-HM1RA 恺佧生物
Anti-IL31RA Antibody-Fc AB437 恺佧生物
anti-Fc HRP A01854 金斯瑞
显色液 TMB-S-004 Biopanda
BSA #WXBC8988V Sigma
3主要溶液
注：除BSA外，其它均为国药试剂
4实验过程
4.1抗原包被
将抗原Human IL-31RA用包被液稀释至0.5μg/mL加入酶标板条中，100μL/孔，其中加入包被液做空白对照，2-8℃过夜。
4.2血清封闭
3％BSA 300μL/孔放于微孔板恒温振荡器中，37℃封闭1小时。
4.3一抗稀释
将一抗Anti-IL31RA Antibody从5往后3倍,后6个点5倍稀释11个点，按抗体梯度，100μL/孔上样，均做2个复孔，同时加入空白对照(稀释液)，放入微孔板振荡器内，设置37度600rpm振荡1小时。
4.4二抗稀释
anti-Fc HRP酶联抗体的稀释：稀释度为1:10000。加入酶联抗体稀释液，放入微孔板振荡器内，设置37度600rpm振荡1小时。
4.5显色
100μL/孔加入显色液，室温避光放置一定时间。
4.6终止显色
50μL/孔加入终止液终止反应。
4.7读数
用酶标仪在波长450nm处测定吸光度。
4.8数据分析
应用EXCEL、Graph Prism分析软件对读数进行数据分析。
实验结果显示：传统方法构建(重链KN386-A和轻链KN387分别构建到两个哺乳表达载体上)后在细胞中进行共转表达得到抗体，得到的抗体检测时包被浓度是1μg/ml，达到平台时EC50是27.3ng/ml；改造后(重链和轻链通过P2A同时构建在一个哺乳表达载体上)，表达纯化后得到的抗体检测时包被浓度只要0.5μg/ml时就能达到平台，EC50为6.5ng/ml，由此可见通过改造后得到的抗性活性较未改造前的抗体活性提高了近5倍。
(实验结果图见图5-6)。
序列表
<110> 恺佧生物科技（上海）有限公司
<120> 一种IL-31RA抗体以及其构建方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcaactgg tgcaatctgg cgctgaggta aagaaaccag gcgcttctgt taaggttagc 120
tgcaaagcta gcggatatac ttttactggg tatattatga actgggttcg gcaggcacca 180
ggtcaagggc tggaatggat gggcctcatc aacccttaca atggcggaac cgattacaac 240
ccacagtttc aagacagggt gacaattaca gccgataagt ccacttccac agcctacatg 300
gagttgtcta gcctgcgatc tgaggacacg gccgtgtatt attgcgcaag agatggctat 360
gatgacggcc cgtatactct ggagacatgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagctcc 420
gccagcacca agggcccatc cgtgttccct ctggctccta gcagcaagtc cacctccggc 480
ggcaccgccg ctctgggatg tctggtgaag gattacttcc ctgagcctgt gacagtgtcc 540
tggaacagcg gcgccctgac ctccggcgtg cacacattcc ctgccgtgct gcagagctcc 600
ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgaca gtgcctagct ccagcctggg cacacagaca 660
tacatctgca atgtgaatca caagcccagc aataccaagg tggataagag agtggagccc 720
aagagctgcg acaagacaca cacatgtcct ccctgcccag ctcctgagct gctgggcgga 780
cccagcgtgt tcctgtttcc tcctaagcct aaggataccc tgatgatctc cagaacacct 840
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaggtgaa gtttaattgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ctagggagga gcagtacaat 960
tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctcc 1080
aaggccaagg gccagcctag agagcctcag gtgtacaccc tgcctccctc cagagaggag 1140
atgaccaaga accaggtgag cctgacatgc ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaataatt acaagaccac acctcccgtg 1260
ctggattccg atggcagctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtgttctc ctgtagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca 1380
cagaagtccc tgtccctgag ccctggcaag ggcggcggca gcggcctgaa tgatatcttc 1440
gaggcccaga agatcgagtg gcacgag 1467
<210> 2
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu His Leu Thr Pro Pro Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Ala Thr
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro
35 40 45
Thr Gly Thr Ile Met Ala Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu
50 55 60
Gly Thr Met Gly Leu Ile Ala Pro Thr Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala
65 70 75 80
Pro Gly Pro Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Ala Ala Leu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Val
100 105 110
Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gly Pro Thr Thr Leu Gly
115 120 125
Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Leu
130 135 140
Gly Pro Ser Val Pro Pro Leu Ala Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Leu Ala Thr Pro Pro Gly Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Pro Pro Ala Val Leu Gly Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr Ile Cys Ala
210 215 220
Val Ala His Leu Pro Ser Ala Thr Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Pro
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala
275 280 285
Val Ser His Gly Ala Pro Gly Val Leu Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly
290 295 300
Val Gly Val His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ala
305 310 315 320
Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly Ala Thr
325 330 335
Leu Ala Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Gly Leu Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly
355 360 365
Pro Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Ala Gly Gly Met Thr Leu Ala
370 375 380
Gly Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile
385 390 395 400
Ala Val Gly Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Leu
420 425 430
Leu Thr Val Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Leu Gly Gly Gly Ser Gly Leu Ala Ala Ile Pro
465 470 475 480
Gly Ala Gly Leu Ile Gly Thr His Gly
485
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr Gly Thr
20 25 30
Ile Met Ala Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gly Thr Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ala Pro Thr Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Pro Gly Pro
50 55 60
Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Ala Ala Leu Ser Thr Ser Thr Ala Thr
65 70 75 80
Met Gly Leu Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gly Pro Thr Thr Leu Gly Thr Thr Gly
100 105 110
Gly Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Thr Thr Pro Thr Gly Thr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Pro Thr Ala Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Gly Thr Ala Ala Gly Pro Thr Thr Leu Gly Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gatatccaga tgacccagag cccaagtagc ctgtcagctt ctgtcggaga tagagtaaca 120
attacatgtc aggcttctga ggatatctac tctttcgtgg cttggtacca acagaagccc 180
ggaaaggccc ccaagcttct catctacaat gcccagaccg aagcacaggg tgtgccaagc 240
cggttttctg gaagcgggtc tgggactgac tttaccctta caatcagcag cttgcaaccc 300
gaagattttg ctacctacta ttgtcaacac cattatgaca gcccccttac tttcggcggc 360
ggcacaaagg tggagattaa aagaacagtg gccgctccta gcgtgttcat cttccctcct 420
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctat 480
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caatagccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggat tccacctaca gcctgtcctc caccctgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 660
ctgtccagcc ctgtgacaaa gtccttcaac agaggcgagt gt 702
<210> 8
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gly Thr Pro Ala Gly Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Thr Leu Pro
1 5 10 15
Ala Thr Thr Gly Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gly Ala
35 40 45
Ile Thr Ser Pro Val Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro
50 55 60
Leu Leu Leu Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly His His Thr
100 105 110
Ala Ser Pro Leu Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Pro Ile Pro Pro Pro Ser Ala Gly Gly
130 135 140
Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ala Ala Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Gly Ala Leu Val Gly Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Gly Ser
165 170 175
Gly Ala Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly Gly Ala Ser Leu Ala Ser Thr
180 185 190
Thr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Leu Ala Ala Thr Gly Leu
195 200 205
His Leu Val Thr Ala Cys Gly Val Thr His Gly Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Leu Ser Pro Ala Ala Gly Gly Cys
225 230
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gly Ala Ile Thr Ser Pro
20 25 30
Val Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Leu Leu Leu Ile
35 40 45
Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly His His Thr Ala Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala
100 105
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Ala Ile Thr Ser Pro Val Ala
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly His His Thr Ala Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaagcggag cgacgaattt tagtctactg aaacaagcgg gagacgtgga ggaaaaccct 60
ggacct 66
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Ser Gly Ala Thr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Ala Pro Gly Pro
20
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Gly Gly Ser
1

Claims (10)

1.一种抗IL-31RA抗体，其特征在于，所述抗体的重链包括SEQ ID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2、SEQ ID NO.6所示的CDR3，所述抗体的轻链包括SEQ ID NO.10所示的CDR1、SEQ ID NO.11所示的CDR2、SEQ ID NO.12所示的CDR3。
2.权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO.3所示，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.9所示。
3.权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的C端通过GS linker与Avi标签序列连接。
4.权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链全长蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体轻链全长蛋白序列如SEQ ID NO.8所示。
5.权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.一种权利要求1-5任一项所述抗体的构建方法，其特征在于，把抗IL31RA抗体的重链和轻链基因通过基因合成的方法同时构建到哺乳动物表达载体上。
7.权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pTT5。
8.权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重链和所述轻链基因之间用2A肽连接。
9.权利要求6-8之一所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体包括顺次连接的启动子-抗体轻链-2A Linker-抗体重链-终止子的功能元件。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述2A肽的核苷酸序列为SEQ IDNO.13所示；所述2A肽的蛋白序列为SEQ ID NO.14所示。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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AU2016248786A1 (en) * 2015-04-14 2017-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing lL-31 antagonist as active ingredient
CN107614016A (zh) * 2015-04-14 2018-01-19 中外制药株式会社 包含il‑31拮抗剂作为活性成分的用于预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016248786A1 (en) * 2015-04-14 2017-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing lL-31 antagonist as active ingredient
CN107614016A (zh) * 2015-04-14 2018-01-19 中外制药株式会社 包含il‑31拮抗剂作为活性成分的用于预防和/或治疗特应性皮炎的药物组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Monoclonal antibodies against interleukin 13 and interleukin 31RA in development for atopic dermatitis;Carsten R. Hamann等;Journal of the American Academy of Dermatology;第78卷(第3期);第S37-S42页 *

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