CN115181102B - 含有1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶结构的cdk8抑制剂 - Google Patents

含有1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶结构的cdk8抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了含有1H‑吡唑并[3,4‑D]嘧啶结构的CDK8抑制剂，作为周期蛋白依赖性激酶8抑制剂的化合物，其化学结构新颖，具有1H‑吡唑并[3,4‑D]嘧啶结构。该化合物为通式(I)所示结构或其药学上可接受的盐；本发明同时提供了该化合物的制备方法。该抑制剂与CDK8靶标的DMG‑out构象相结合，属于II型抑制剂。它对CDK8的IC50值达到了2.3nM，与目前高活性的I型抑制剂相当，驻药时间为950分钟。该抑制剂在1μM浓度下对19种与CDK8相似的激酶没有活性，因此表现出了对CDK8的高选择性。同时作为药物具有较低的毒性。
Figure DDA0003753777630000011

Description

含有1H-吡唑并[3,4-D]嘧啶结构的CDK8抑制剂
技术领域
本发明属于医药化学领域，尤其涉及一种周期蛋白依赖性激酶8抑制剂。
背景技术
治疗肠癌的选择不多，效果不理想，造成该癌症死亡率一直居高不下。上述情况主要归咎于治疗肠癌的有效靶标比较少。周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)作为一种新型靶标，它和cyclinC的异常表达经常在各类人类肿瘤中发现，尤其在结肠和直肠癌中较为显著。对CDK8的抑制能够取得杀灭癌细胞的同时减少对正常细胞毒副作用的治疗效果，因此一被发现就备受关注，成为治疗肠癌的突破口。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可作为周期蛋白依赖性激酶8抑制剂的化合物及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
CDK8抑制剂依据其结合的CDK8靶标的构象分为两大类：I型和II型。I型抑制剂结合DMG-in构象(DMG代表活化环的N端区附近的天冬氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸)并占据ATP结合位点。II型抑制剂与DMG-out构象相结合并主要占据变构位点，并且在一定情况下同时占据ATP结合位点。变构位点与ATP结合位点相邻。目前I型抑制剂对CDK8的活性比较高，但驻药时间很短，普遍不超过100分钟；而II型抑制剂的驻药时间可以长达1000分钟以上，但其活性普遍比较低。它们都难以作为药物使用，需要对其缺点做较大的改进提升。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种作为周期蛋白依赖性激酶8抑制剂的化合物，其为具有通式(I)所示结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003753777610000021
其中，R1、R2、R3为任何一种非极性基团；
A1为电负性强的原子，包括氧原子、氮原子、硫原子；
R4为含氟原子的基团。
该化合物，其具体结构为通式(II)所示结构的化合物：
Figure BDA0003753777610000022
本发明的作为周期蛋白依赖性激酶8抑制剂的化合物的制备方法如下：
第一步：
Figure BDA0003753777610000023
冰浴条件下，将氢氧化钾(3.0当量)倒入四氢呋喃(0.6M)中并搅拌使悬浮液均匀分散，继续将4-(三氟甲基)苯胺(1.0当量)滴入四氢呋喃(0.20M)中并搅拌使悬浮液均匀分散，形成反应混合物。按照四氢呋喃/1,4二恶烷质量比为1:1配置成0.20Ml混合液，将1,1'-羰基二咪唑(1.0当量)溶解在混合液中，然后滴加到反应混合物中，形成白色沉淀后移除冰水浴，室温下将反应混合物搅拌2小时，然后滴加cis-1,4-环己二胺(1.0equiv)至四氢呋喃(1.0M)溶液中，搅拌20小时，最后加入乙酸(3.0当量)溶液终止反应，得到中间体I，粗产物通过硅胶色谱法纯化。
第二步：
Figure BDA0003753777610000031
在20mL闪烁瓶中，将4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(0.15g，0.543mmol，1.0当量)溶解在10mL四氢呋喃中，将溶液冷却至-78℃并滴加甲基锂(24mmol，44.19当量)至四氢呋喃溶液为15mL，然后将反应混合物在0-20℃搅拌16小时，将反应混合物倒入20mL乙酸乙酯中并搅拌10分钟以终止反应，获得反应混合物，浓缩，浓缩物用100mL四氢呋喃处理后过滤，滤液在室温下加入CH2Cl2(0.47g,5.4mmol,10.0当量)并搅拌4小时、过滤，然后滤渣用CHCl3/甲醇(10％)(50mL)洗涤，合并滤液并浓缩，将浓缩物通过硅胶色谱法纯化，使用CHCl3/甲醇(10％)作为洗脱剂，得到产物3-甲基-4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
第三步：
Figure BDA0003753777610000032
在3-甲基-4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(0.15g,0.49mmol)和3-溴甲苯(0.073g,0.52mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，加入K2CO3(0.21g，1.48mmol)，在氮气保护下于120℃搅拌48小时后获得混合物，在搅拌条件下将混合物缓慢倒入水(50ml)中，过滤，收集沉淀，沉淀用20mL甲醇清洗5次，真空干燥，得到灰色固体0.16g，为中间体II。
第四步：
Figure BDA0003753777610000041
将中间体I(147mg,0.4mmol，1.0当量)、中间体II(0.44mmol，1.1当量)和二异丙基乙胺(0.44mmol，1.1当量)溶解在四氢呋喃(3mL)中，然后在室温下搅拌过夜，旋蒸除去四氢呋喃，水和乙腈的体积比为30：70混合得到混合液，将固体残余物重新溶解在混合液中，过滤得到黄色固体。固体用水洗涤并真空干燥，得到乳绿色固体，为最终产物(179mg，82％)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种作为周期蛋白依赖性激酶8抑制剂的化合物及其制备方法，该化合物化学结构新颖，具有1H-吡唑并[3,4-D]嘧啶结构。该抑制剂与CDK8靶标的DMG-out构象相结合，属于II型抑制剂。它对CDK8的IC50值达到了2.3nM，与目前高活性的I型抑制剂相当，驻药时间为950分钟。该抑制剂在1μM浓度下对19种与CDK8相似的激酶没有活性，因此表现出了对CDK8的高选择性。同时作为药物具有较低的毒性。该抑制剂因此是治疗肠癌的优良候选药物。
附图说明
图1为reporter置换检测的原理示意图；
图2为探针分子随时间关系被置换的情况；
图3为Kd的测定；
图4为测定亲和动力学参数。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。
实施例1：药物对靶蛋白的亲和力和动力学参数的测定：
该测试使用了reporter置换检测的方法，其原理如图1所示。reporter置换检测技术基于reporter探针分子。该探针分子设计成用于结合靶蛋白的目标位点。探针分子和蛋白质之间的接近导致光信号的发射。当被检测的化合物与靶蛋白结合时将作用于与探针分子相同的位点，从而置换探针分子导致光信号减弱。在添加不同浓度的化合物后，探针分子随时间关系被置换的情况通过光信号检测出来，如图2所示。
为了确保探针分子被置换速率反映的是化合物与靶蛋白结合的速率而不是探针分子解离速率，探针分子被设计为具有快速解离速率。因此，化合物结合而非探针解离是探针被置换的限速步骤。
对于Kd的测定，计算系统达到平衡的最后时间点的探针分子被置换的百分比值。在化合物的每一个浓度上计算探针分子被置换的百分比值。然后相对于化合物浓度作图(如图3所示)。使用标准拟合算法计算类似IC50的值(对应于50％探针分子被置换率)。
Figure BDA0003753777610000051
由于探针分子在反映其自身Kd(probe)值的浓度使用，因此根据Cheng Prusoff方程，可以用Kd＝1/2×IC50计算Kd值。
为了测定亲和动力学参数(即kon，koff和驻药时间)，我们将探针分子被置换率对时间作图，并拟合为每种化合物浓度的单指数衰减方程(探针分子结合率＝B+A x exp(-kobsx t))。得到的指数系数等于表观关联率kobs。
在二级图中，将kobs值相对于相应的化合物浓度作图(如图4所示)。基于等式kobs＝koff+kon x([化合物浓度]/(1+[探针分子浓度]/Kdprobe)),在线性拟合之后从斜率提取kon值。koff值由Kdcompound x kon计算得到。驻药时间定义为化合物在靶蛋白上的停留时间，通过1/koff计算。对于二次图，只有在化合物浓度下可以清楚地确定kobs值的时候，该浓度有关的数据才被采纳。以下情况下的数据不在二级图分析中采用：(1)探针分子被置换太快而无法计算准确的kob s值；(2)化合物浓度太低而无法显著替换探针分子；或者(3)化合物结合比探针分子解离快。
该化合物与周期蛋白依赖性激酶8作用，可以对其产生很强的抑制效果。其与靶蛋白的亲和力以及动力学参数测试结果如下表所示。
Figure BDA0003753777610000061
以上测定IC50值的实验除了针对CDK8，也对一组共19种与CDK8相似的激酶进行。这19种激酶如下：CDK2,CDK9,GSK3β,PLK1,ASK1,CK1δ,PKA,ROCK1,PKCθ,CDC7,AKT1,AuroraB,MEK1,MAPKAPK2,CHK1,EGFR,JAK1,RK1,p38α，在1μM浓度下该抑制剂与以上激酶均没有活性。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备周期蛋白依赖性激酶8抑制剂中的应用，其特征在于，所述式(I)的结构为：
Figure FDA0004124547050000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式(I)的具体制备过程包括以下步骤：
S1、冰浴条件下，将氢氧化钾倒入四氢呋喃中并搅拌使悬浮液均匀分散，继续将4-(三氟甲基)苯胺滴入四氢呋喃中并搅拌使悬浮液均匀分散，形成反应混合物；按照四氢呋喃/1,4二恶烷质量比为1:1配置成混合液，将1,1'-羰基二咪唑溶解在混合液中，然后滴加到反应混合物中，形成白色沉淀后移除冰水浴，室温下将反应混合物搅拌；然后滴加cis-1,4-环己二胺至四氢呋喃溶液中，并搅拌；最后加入乙酸溶液终止反应；得到中间体I，粗产物通过硅胶色谱法纯化；
S2、在闪烁瓶中，将4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶溶解在四氢呋喃中；将溶液冷却并滴加甲基锂，然后将反应混合物搅拌；将反应混合物倒入乙酸乙酯中并搅拌以终止反应；获得反应混合物，浓缩，浓缩物用四氢呋喃处理后过滤，滤液在室温下加入CH2Cl2并搅拌、过滤，然后滤渣用CHCl3/甲醇洗涤，合并滤液并浓缩，将浓缩物通过硅胶色谱法纯化，使用CHCl3/甲醇作为洗脱剂，得到产物3-甲基-4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶；
S3、在3-甲基-4-氯-6-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶和3-溴甲苯溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入K 2CO3，在氮气保护下搅拌获得混合物，在搅拌条件下将混合物缓慢倒入水中，过滤，收集沉淀，沉淀用甲醇清洗，真空干燥，得到灰色固体，为中间体II；
S4、将中间体I,中间体II和二异丙基乙胺溶解在四氢呋喃中，然后在室温下搅拌过夜；旋蒸除去四氢呋喃，水和乙腈的体积比为30：70混合得到混合液，将固体残余物重新溶解在混合液中，过滤得到黄色固体；固体用水洗涤并真空干燥，得到乳绿色固体，为最终产物。
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