CN115177562A - 具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆产品的制备方法和应用，包括：将发酵菌接种至由仙桃仙人掌、苦参、麦冬、天竺葵和水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗敏舒缓的植物复合发酵原浆产品。从开菲尔菌块中筛选和培育出适合的乳酸菌对植物组合物进行复合发酵，制得一种新型植物复合发酵原浆，具有良好的抗敏舒缓功效，能够有效修复因激素脸及所导致的皮肤红肿，红斑，潮红，浮肿，干燥脱屑，毛细血管扩张，丘疹，丘脓疱疹，皮肤萎缩变薄，瘙痒，灼烧感，疼痛的症状，达到缓解皮肤神经原性感染，促进皮肤伤口愈合，重建健康皮肤屏障的效果。

Description

具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法和应用
技术领域
本公开涉及发酵技术领域，尤其涉及具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆及其制备方法和应用。
背景技术
仙人掌(学名：Opuntia stricta(Haw.)Haw.var.dillenii(Ker-Gawl.)Benson)，仙人掌科仙人掌属植物，全世界约有2000余种，主要产于墨西哥，常见的主要有仙桃仙人掌。仙桃仙人掌肉质茎肥厚，含有矿物质、多糖、黄酮、纤维素等成分。仙桃仙人掌可用于外敷，具有散瘀消肿、止痛、清热解毒、养颜护肤等作用。用仙人掌制备成水煎液，可用来治疗各种炎症，其机理是减弱毛细血管的通透性，使水肿症状减轻，显著促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，对急性与慢性炎症均有明显的抑制作用，因而，仙桃塔仙人掌在抗敏功效上，具有较高的应用价值。
苦参(学名：Sophora flavescens Alt.)，豆科槐属植物，性寒而味苦。在《神农本草经》中对其已有记载。苦参的主要成份是氧化苦参碱和苦参碱，具有抗菌、抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗过敏、抗病毒、免疫及生物反应调节作用等多方面的药理作用和功效。苦参常用作治疗皮肤瘙痒、镇静、镇痛以及抗炎等方面。
麦冬(学名：Ophiopogon japonicus(Linn.f.)Ker-Gawl.)，百合科沿阶草属草本植物，分布于东南亚地区，在其块根在我国用作为中药应用，亦可作为食品与保健品原料。研究表明，麦冬块根中含有皂苷类、异黄酮类、多糖类等生物活性成分，在抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗血栓、抗心肌炎和调节免疫等方面具有药理活性，通过将麦冬打粉后进行浸提，其麦冬粗体物在对体外抗氧化活性、酶抑制活性和抑菌活性具有较好的效果。
天竺葵(学名：Pelargonium hortorum)，牻牛儿苗科天竺葵属植物，主要产于上海、四川、云南等地，可作盆栽观赏植物，具有一定的美容价值。研究表明，天竺葵可以有效清除氧自由基以及羟自由基等对细胞的损害，可有效止痛、抗菌、增强细胞免疫能力，同时具有止血、除臭等效果。天竺葵适宜各种肌肤，尤其是油性皮肤，具有深层净化和皮肤收敛效果，可以平衡皮肤分泌。有研究表明，天竺葵的花瓣和花粉对OH-的清除率分别为88.39％和53.98％。芽、茎、叶柄对自由基的清除率分别为87.80％、89.94％、91.46％，因而天竺葵在其抗氧化和清除自由基具有重要的价值。
发酵是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动，通过现代工程技术手段，进行工业化生产人们所需产品的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分，在食品工业、生物和化妆品行业中均有广泛应用。目前对采用发酵技术提取营养物质已多有报道，但是根据发酵底物和发酵工艺条件的不同，提取效果和作用差异较大，因此需继续探索更多发酵底物组合及发酵方法制备出更多、更优功效的产品满足消费者需求。
发明内容
在下文给出关于本公开的简要概述，以提供关于本公开的某些方面的基本理解，此概述并非关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键部分，也不意图限定本公开的范围，其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为后述的详细描述的前序。
本公开的目的是提供一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆产品的制备方法、应用，该产品通过仙桃仙人掌、苦参、麦冬和天竺葵复合发酵产生协同作用，具有的抗敏舒缓的功效。
根据本公开的一个方面，提供了一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆产品的制备方法，包括：将发酵菌接种至由仙桃仙人掌、苦参、麦冬、天竺葵、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗敏舒缓的植物复合发酵原浆产品。
本公开从开菲尔菌块中的筛选和培育出适合的乳酸菌对植物组合物进行复合发酵，制得一种新型植物复合发酵原浆，具有良好的抗敏舒缓功效，能够有效修复因激素脸及所导致的皮肤红肿，红斑，潮红，浮肿，干燥脱屑，毛细血管扩张，丘疹，丘脓疱疹，皮肤萎缩变薄，瘙痒，灼烧感，疼痛的症状，达到缓解皮肤神经原性感染，促进皮肤伤口愈合，重建健康皮肤屏障的效果。
本公开中采用的发酵菌为乳酸菌，为益生菌的一种，可以维护皮肤的微生态平衡，有益于改善皮肤的益生菌比例，强化微生物保护膜，促进肌肤再生。所述益生菌可以选自以下任一种或以上：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC 1.1797)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)。
本公开中发酵底物由仙桃仙人掌、苦参、麦冬、天竺葵、水混合灭菌制备而成。
本公开中发酵底物采用的仙桃仙人掌需清洗去皮，用组织破碎机进行破碎，然后在25℃环境中浸泡2h，20目过滤用组织破碎机破碎，仙桃仙人掌选用量为0.5％-20.0％，即仙桃仙人掌占水质量优选用量为0.5％-20.0％(如0.5％、4.0％、8.0％、12.0％、16.0％、20.0％))。若仙桃仙人掌用量大于20.0％，对发酵底物灭菌后发酵体系中沉淀析出较多，不利于后续产品的应用，若仙桃仙人掌用量小于0.5％，不会对发酵体系造成影响，但产品中活性成分偏低，均不利于后续产品的应用。
本公开中发酵底物采用的苦参、麦冬、天竺葵，具有散瘀消肿、止痛、清热解毒、养颜护肤等功效，用组织破碎机进行粉碎，过200目的筛网。本公开中苦参、麦冬和天竺葵各组分优选用量为0.5-10.0％，即发酵底物中苦参、麦冬和天竺葵各组分用量为水质量的0.5-10.0％(0.5％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％、10.0％)
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，用于接种的乳酸菌种子液浓度为108-1013CFU/mL；所述发酵菌的接种比例，即所述种子液与所述发酵底物的体积比为0.5％～10.0％。(如0.5％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％、10.0％)。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，发酵菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC1.1797)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)，用于接种的植物乳杆菌植物亚种和嗜热链球菌种子液的制备方法包括如下步骤：
种子活化：挑取植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)斜面菌株1环接种至装有25mL PDA培养基的250ml三角瓶中，30-38℃摇床活化25-60h；挑取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)斜面菌株1环接种至装有25mL MRS肉汤培养基的250ml三角瓶中，30-42℃摇床活化25-60h；
种子液：取上述3％植物乳杆菌植物亚种菌液和2％嗜热链球菌菌液，接入到LB液体培养基中，32-38℃培养10-20h得到种子液。
更进一步地，所述LB液体培养基配方为：葡萄糖18.0g，酵母浸粉5.5g，氯化钠7.5g，MgSO4·7H2O 2.0g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；所述PDA液体培养基为：马铃薯粉20.0g，葡萄糖5.0g，pH6.0，补足蒸馏水至1000mL；所述MRS肉汤液体培养基为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏4.0g，酵母浸粉2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；
所述液体培养基的灭菌条件为110-125℃、20～50min。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵培养的温度为32-38℃(如32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃)，时间为10-20h(如10h、12h、14h、16h、18h、20h)。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的温度为110-125℃(比如110℃、115℃、120℃、125℃)，时间为20-50min(比如20min、30min、40min、50min)。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，发酵培养的接种量为1-10％，温度为30-45℃，时间为8-15h
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，将发酵培养好后的植物复合发酵物进行80℃-110℃灭菌处理，还包括离心4000r/min-12000r/min分离处理，弃沉淀取上清液，最终得到所述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆产品，即植物复合发酵原浆。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到所述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵产品，即植物复合发酵干粉。
上述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以采用真空冷冻干燥、低温喷雾等方法。
根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的的植物复合发酵原浆冻干粉。
根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述植物复合发酵原浆在制备化妆品的应用。
根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述植物复合发酵原浆冻干粉作为活性成分的护肤品或护发品。
上述根据本公开实施例的技术方案，通过挑选出适合的菌种对仙桃仙人掌、苦参、麦冬、天竺葵、水组成的底物进行组合发酵，制得了一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原液，具有良好的抗敏舒缓功效，能够有效修复因激素脸及所导致的皮肤红肿，红斑，潮红，浮肿，干燥脱屑，毛细血管扩张，丘疹，丘脓疱疹，皮肤萎缩变薄，瘙痒，灼烧感，疼痛的症状，达到缓解皮肤神经原性感染，促进皮肤伤口愈合，重建健康皮肤屏障的效果，适合制造洗发品或护肤品。
通过以下结合附图对本公开的最佳实施例的详细说明，本公开的这些以及其他优点将更加明显。
附图说明
本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
图1示出了不同浓度的植物复合发酵原浆溶血率试验结果
图2示出了植物复合发酵原浆对皮肤水分散失变化趋势；
图3示出了植物复合发酵原浆对DPPH的清除作用
图4示出了不同浓度植物复合发酵原浆对透明质酸酶活性抑制实验结果；
图5示出了植物复合发酵原浆对皮肤的修复作用的情况。
具体实施方式
在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的仙桃仙人掌来自市面销售海南海口干仙桃仙人掌。
下述实施例中的苦参来自市面销售安徽亳州野生干苦参。
下述实施例中的麦冬来自市面销售云南昆明无硫干麦冬。
下述实施例中的天竺葵来自市面销售山东济南的干花瓣天竺葵。
实施例1植物复合发酵原浆的制备
1、菌种活化：挑取植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)斜面菌株1环接种至装有25mL PDA培养基的250ml三角瓶中，37℃摇床活化48h；同时，挑取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)斜面菌株1环接种至装有25mL肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃摇床活化48h；
2、种子液制备：取上述3％植物乳杆菌植物亚种菌液和2％嗜热链球菌菌液，接入到LB液体培养基中，37℃培养12h得到种子液。
3、发酵底物配制：仙桃仙人掌需去皮，用组织破碎机进行破碎，然后在25℃环境中浸泡2h，20目过滤，加入苦参1.0g、麦冬2.0g和天竺葵5.0g，用组织破碎机进行粉碎，过200目的筛网，加水至于到1000g，搅拌均匀，灭菌，得到发酵底物。
4、植物复合发酵原浆的获得：取20.0mL步骤2得到的种子液菌液接种到1000g步骤3发酵底物中，得到发酵体系；将发酵体系在38℃摇床中，180r/min摇床培养12小时，得到发酵产物；将发酵产物在5000r/min、离心20min，弃沉淀，取上清液，于110℃灭菌20min，得到灭菌后的发酵产物即为植物复合发酵原浆。
实施例1所制得的植物复合发酵原浆的外观为粘稠状液体，颜色为浅黄色偏紫。粘度100～500cP，pH值为4.5-5.5，可溶性固含物含量0.5-10.0％。根据《化妆品安全技术规范2015版》规定，菌落总数小于1000CFU/ml，酵母和霉菌总数小于100CFU/ml，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌不得检出，植物复合发酵原浆的所有检测均达到要求。
实施例2植物复合发酵原浆在作为抗敏舒缓精华与爽肤水的应用
一、植物复合发酵原浆的安全性检测
1.红细胞溶血性(RBC)实验
RBC实验主要用于检测产品或原料中的刺激性，一些中草药提取物中，往往含有某些刺激性成分会引起溶血反应，因而对植物复合发酵原浆进行红细胞溶血性实验，旨在对其存在的刺激性进行评估。血红蛋白漏出量越多，表明损伤越大，也说明了待测物的致敏性和安全性，二者的相关性分析显示较高的一致性。
实验方法：
(1)溶液配制
1)称取NaC17.9g、KC10.2g、K2HPO41.8g、KH2PO40.24g溶解于800mL超纯水中，用稀HCl溶液调pH至7.4，即为pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)；
2)按照柠檬酸三钠：柠檬酸＝60:20mmol/L，使用超纯水配制柠檬酸缓冲溶液；
3)用PBS缓冲液配制浓度为0.1％标准表面活性剂溶液(SDS)，用于测试SDS溶血标准曲线；
4)测试样品溶液：准确称取植物复合发酵原浆冻5.00g，用PBS缓冲液定容至500mL的容量瓶中，配制成浓度为1.0％的测试原料样品，即10g/L。
(2)红细胞的制备
取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，按1:9比例加入柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为18-23℃内储存。用10mL聚乙烯无菌离心管分装采集的血液样本，室温下10000r/min离心5min，取上清液，再用3.0倍PBS缓冲液洗涤RBC 3次(10000r/min,10min)。
(3)溶血性完整性判定
用PBS缓冲溶液配制1.0mg/mLSDS溶液，向EP管中依次加入0、10、20、30、40、50、60、70、80、60、100μL的SDS溶液，分别加入PBS补齐至975μL，各管快速加入25μLRBC悬液。将各管置于摇床，室温200r/min孵育20min，终止孵育。10000r/min离心1min，取上清液200μL于530nm波长下测吸光度值。结果显示，新鲜配制的RBC悬液半溶血量约为80μg/mL，表明RBC完整性良好。
(4)实验步骤
准备测试溶液样品，在EP管中分别按照表1中的量加入测试样品，然后加入PBS补齐到950μL，快速加入50uL RBC悬液。将各管置于摇床，室温200r/min1孵育20min，终止孵育。10000r/min离心1min，移液器取200uL上清液，530nm下测其吸光度值。阴性对照：950μLPBS+50uLRBC的溶血率为0；阳性对照：950μL水+50μLRBC的溶血率为100％。
表1样品溶血实验加样表
Figure BDA0003748478650000071
2、试验结果：
经过试验验证，植物复合发酵原浆在不同的添加浓度下，红细胞溶血率均小于5％，具体结果见图1。组合提取物浓度为50mg/mL时，溶血率仅为0.5％。这表明植物复合发酵原浆基本无刺激性，安全性高，低浓度和高浓度下都可在护肤品中安全添加。
2.人体斑贴实验
人体斑贴实验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本公开根据《化妆品卫生规范》(2021)对实施例1获得的植物复合发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，
实验方法：
选取志愿者60人，年龄构成和男女比例均随机确定，根据《化妆品卫生规范》(2021)对实施例1获得的植物复合发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验：受试部位为志愿者上背部脊椎两侧皮肤，并将皮肤分为两部分区域，一部分区域为空白对照，另一部分区域涂抹含有植物复合发酵原浆；然后将加有斑试物的斑试器胶带分别粘贴在两个皮肤受试区域，并自下向上贴牢；斑贴试验时间为48h；贴敷后48h后，两侧受试区域去除斑试器，30min后再观察受试部位，记录试验结果。
2、试验结果：
参见表2。从表中可以看出：使用实施例1得到的植物复合发酵原浆后均无反应，说明本发明提供的植物复合发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。
表2、实施例1获得的植物复合发酵原浆的斑贴试验结果
Figure BDA0003748478650000081
3.植物复合发酵原浆的皮肤水分经皮散失(TEWL)测定
护肤品一般具有锁水保湿的功效，可以为皮肤提供长时间的保湿作用，使肌肤处于较好的含水量，抵抗由内外因素对皮肤所造成的蒸发干燥，提高皮肤的屏障的保护功能。
选择20-40岁健康志愿者60名，经专业人员培训后进行实验。测试环境温度控制在25±1℃，相对湿度为32±5％，测试前使用37℃左右的生理盐水擦拭受试者双臂，让受试者在测试环境下静坐15min后进行测试。
去离子水配置1.0％植物复合发酵原浆待测液，阳性对照为同浓度的1.0％透明质酸钠溶液，并设定空白对照。在每个受试者手臂内侧距手掌基部5cm处标记受试区域，区域大小一般为5x5cm2，在受试者手臂上标记多个区域，每个区域间隔1cm左右。待测样品、空白对照、阳性对照样品涂抹时均随机分布。测定每个受试区的原始值后，每个受测区域涂抹受试液约500uL，涂抹1、2、4h后用仪器测量受试区域的皮肤水分散失量，从而评价植物复合发酵原浆保湿性能。所有实验数据均在取得稳定数据后读数，测量值为5次读数的平均值，SPSS 18.0进行数据统计分析，组间比较t检验。
2、测试结果：
由图2可见，涂抹植物复合发酵原浆待样品的皮肤水分散失值有明显下降，至1h时皮肤TEWL最低，达10.5％，之后略有上升，2-4h水分散失值趋于稳定。植物复合发酵原浆防止水分散失的能力稍低于同浓度的透明质酸钠，与空白对照相比，水分散失显著减少(P＜0.05)。这表明植物复合发酵原浆能降低皮肤中水分的散失，提升皮肤屏障功能，从而在一定程度上提升皮肤的自我保护能力。
可见实施例2制备的植物复合发酵原浆具有良好的补水性能
三、植物复合发酵原浆清除DPPH自由基实验
1、实验方法
称取40mgDPPH，用无水乙醇溶解并定容于1000mL容量瓶中，获得试验所需的DPPH溶液，浓度为10mmol/L。将植物复合发酵原浆分别用去离子水稀释成不同浓度的测试液(分别为2、4、8、10、20、50mg/mL)。取不同浓度的测试液3.0mL及10mmol/L DPPH溶液3.0mL于烧杯中，混合均匀后反应30min，于518nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，同浓度的维生素C溶液为阳性对照。根据吸光度值计算DPPH抑制率。
抑制率(％)＝[1-(S1-S2)/S3]x100％
式中，S1为3.0mL DPPH溶液与3.0mL测试液的吸光度；S2为2.0mL测试液与2.0mL无水乙醇的吸光度；S3为2.0mLDPPH溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度。
2、实验结果
从图3可以看出，当植物复合发酵原浆浓度越高的时候，DPPH清除率越高，当植物复合发酵原浆浓度接近50mg/ml时候，清除率达80％，表明植物复合发酵原浆的DPPH清楚能力较强，但随后提高植物复合发酵原浆的浓度后，其清楚效果增缓减弱。
实施例3
测试实施例1制备的植物复合发酵原浆的抗敏舒缓功效作用，通过透明质酸酶活性抑制实验、抑制皮肤瘙痒评价方法对磷酸组胺致豚鼠皮肤瘙痒的影响实验、皮肤刺激修复实验的方法来测试该植物复合发酵原浆的功效
一、透明质酸酶活性抑制试验
透明质酸酶是I型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，研究报道各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏物质有强抑制透明质酸酶活性，因此抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标
(1)溶液配制
透明质酸酶：浓度500U/ml，现配现用，以醋酸缓冲液做溶剂；
透明质酸钠：0.5mg/ml，一次配制，多次使用，用醋酸缓冲液做溶剂；
Buffer：溶液A(0.2mol/L的醋酸和11.55ml冰醋酸溶于1L蒸馏水中)4.8ml溶液B(0.2mol/L醋酸钠和16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1L蒸馏水中)45.2ml，混合稀释至100ml，配制成PH＝5.6的醋酸缓冲液；
乙酰丙酮溶液：50ml 1.0mol/L碳酸钠溶液和3.5ml乙酰丙酮溶液混合均匀(临用现配)
P-DAB显色剂：0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇混合均匀。
CaCl2溶液：2.5mol/L
NaOH溶液：5mol/L
(2)实验过程
在试管中加入0.1mL 2.5mol/L CaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶液，37℃保温培养20min；加入0.5mL样品液，37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液，37℃保温30min；然后室温静置10min，加入5mol/L NaOH溶液0.1mL和乙酰丙酮溶液0.5mL，沸水浴15min，冰浴10min，放置室温10min，再加入1.0mL P-DAB显色剂并用1.0mL无水乙醇进行稀释，放置室温20min后进行显色，530nm测定其吸光度值，代入下式计算抑制率：
透明质酸酶抑制率(％)＝[(C-D)-(A-B)]/(C-D)x100％
式中：A为(透明质酸酶+样品+透明质酸钠)试样溶液的OD值
B为(醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液)试样空白的OD值
C为(透明质酸酶+去离子水+透明质酸钠)对照溶液OD值
D为(醋酸缓冲液+去离子水+醋酸缓冲液)对照空白的OD值
实验结果：
结果见图4，随着植物复合发酵原浆浓度的增大，透明质酸酶活性抑制率也在增大。当植物复合发酵原浆为6.0mg/mL时，透明质酸酶活性抑制率为92％，当大于6.0mg/mL时，透明质酸酶活性抑制率不再呈剂量关系，趋于稳定。当植物复合发酵原浆为1.0mg/mL时，透明质酸酶活性抑制率为也有41％，这表明植物复合发酵原浆在低浓度下，也具有良好的透明质酸酶活性抑制率，抗敏效果显著。
二、对小鼠腹腔毛细血管通透性增强的影响
(1)将小鼠随机分为5组，5组小鼠数量相同，分别为植物复合发酵原浆低剂量组、植物复合发酵原浆中剂量组、植物复合发酵原浆高剂量组、阳性对照组、正常组(模型组)。
(2)实验前1天，先对小鼠背部实验区域进行脱毛处理，一般背部脱毛区面积约为2.0x2，0c㎡。
(3)实验时每组小鼠背部脱毛区分别涂抹相应的受试样品(1mL/kg)、蒸馏水，正常对照组不做任何处理。
(4)处理3小时后，每只小鼠尾部静脉注射0.2％伊文思蓝生理盐水0.1mL/10g，接着每只小鼠腹腔注射0.6％冰醋酸液0.2mL。
(5)20min后采用脱颈椎方法处死小鼠，剪开小鼠腹腔，用4mL生理盐水冲洗腹腔2次，合并冲洗液，5000r/min离心l0min。取上清液在590nm波长下，测定吸光度值。
2、实验结果
Figure BDA0003748478650000111
从表3可以看出，与正常组相比较，阳性对照组、植物复合发酵原浆高剂量组对降低毛细血管的通透性有显著作用(*P<0.05)，能大大降低皮肤红肿症状的表现程度，具有一定的抗敏功效。
三抑制皮肤瘙痒评价方法对磷酸组胺致豚鼠皮肤瘙痒的影响
30只豚鼠随机分为3组，即：(1)正常组，(2)阳性对照组，(3)植物复合发酵原浆组。实验前1天，先将各组豚鼠右后足背部剃毛处理，剃毛后涂抹相应植物复合发酵原浆溶液1次，每足涂抹量为0.2mL。正常组涂等量生理盐水，阳性对照组每只涂抹0.2mL。第二天进行实验时，先用砂纸擦伤豚鼠右后足背部剃毛处，擦伤程度以损伤表皮、不伤真皮、皮肤轻度渗血为度，面积约2cm2，局部再涂各植物复合发酵原浆1次，最后一次涂药后10min，开始在豚鼠右后足创面处滴0.01％磷酸组胺每只0.2mL，此后每间隔3min，按照0.01％，0.02％，0.03％，0.04％递增浓度，每次均为0.2mL。当看到豚鼠出现回头舔右后足时，即试验终止。计算豚鼠出现回头舔右后足时的磷酸组胺使用总量为致痒阈。
2、实验结果
Figure BDA0003748478650000121
植物复合发酵原浆对豚鼠磷酸组胺致痒反应的影响结果见表4，从数据中可以看出，与正常组相比，植物复合发酵原浆对磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒均有抑制作用，其作用机理可能与提高皮肤的耐受性和屏障功能有关。
四、皮肤刺激修复试验
按《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》，随机选取符合要求的志愿者10人，以受试者左、右手臂内测作为受试部位，以规格为2cmx2cm的方形区域进行循环标记；用清水清洗受试区(同一区域)，受试者静坐20min，进行皮肤红值空白值的测量，随后进入涂抹实验阶段；用质量分数为60％的辣椒素水溶液对受试区域进行刺激；持续刺激20min及40min后，进行数值采集；在受试区域涂抹测试样品(浓度均为10mg/mL的植物复合发酵原浆，约0.5mL，15min、30min、45min后进行数据采集；空白对照涂抹0.05mL纯水；统计受试者实验部位每次测得的数值，分析红值的变化。皮肤红值变化反映在测试周期内，实验区域皮肤泛红随时间变化规律。其值越大，皮肤泛红的程度越大。皮肤红值变化率(％)＝(T-T空白值)/T空白值×100％。
2、实验结果
从图5中可以看出，植物复合发酵原浆涂抹45min后，红值变化率由23％下降到7％，皮肤基本恢复正常，空白对照红值变化率由26％下降到17％.，这表明植物复合发酵原浆对辣椒素水溶液刺激后的皮肤显著的修复功效，能快速修复受损肌肤。
实施例4采用实施例1制备的植物复合发酵原浆作为活性成分的爽肤水制备以及性能测试
1、组分：爽肤水配方如下表5。
表5爽肤水配料表
Figure BDA0003748478650000122
Figure BDA0003748478650000131
2、制备方法：
将丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、丙二醇、海藻糖、EDTA-2Na、植物复合发酵原浆、去离子水混合，不断搅拌下加热至85℃，降温至45°加入1.2戊二醇，对羟基苯乙酮搅拌均匀，过滤出料，然后过机分装既可得植物复合发酵原浆爽肤水。
3、性能测试：
对本实施例1制备得到的植物复合发酵原浆的爽肤水效果进行抗敏舒缓的研究分析。采用仅仅使用未添加植物复合发酵原浆的爽肤水和只使用生理盐水作为对照。
1)测试实验一
测试方法为：测试跟踪人数为30人，其中女性15人，男士15人，年龄20～60岁之间，脸部有严重过敏反应者有15人，有明显过敏反应者有9人，有轻微过敏反应者有6人。将所有人员随机分成三组，每组分别使用植物复合发酵原浆爽肤水、未添加植物复合发酵原浆的爽肤水和生理盐水，每一天涂抹一次爽肤水，连续使用14天，每日对脸部过敏反应况进行评分，将每组评分取平均值，得到抗敏舒缓的平均分值，如表6所示。
评分标准如下：全脸消肿退红：5分，局部消肿退红：4分，消肿没有退红：3分，不消肿但退红：2分，不消肿不退红：1分；不瘙痒：5分，局部有时瘙痒：4分，局部经常瘙痒：3分，；全脸瘙痒：2分，全脸严重瘙痒：1分。
Figure BDA0003748478650000132
Figure BDA0003748478650000141
表6三种测试样品消肿退红平均分值
由表6中的数据结果可以看出，采用实施例1的植物复合发酵原浆制得的爽肤水，在使用1天后，即可看到明显的消肿退红效果，随着使用天数的增加，消肿退红效果越来越明显，使用10天之后，脸部红肿的症状基本消失；且从数据可以看出，本实施例所得爽肤水护肤品的消肿退红效果较好。
实施例5采用实施例1制备的植物复合发酵原浆作为活性成分的乳液制备以及性能测试
表7乳液配料表
Figure BDA0003748478650000142
Figure BDA0003748478650000151
2、制备方法：
称取A相中所有原料，在油相锅中升温搅拌至均匀，加热到85℃后，搅拌使A相原料完全溶解；称取B相中所有原料，投入水相锅加热到85℃，搅拌溶解完全；开启真空，先抽A相进乳化锅，再抽B相进乳化锅,搅拌1000r/min，均质5min，均质完成后，对乳液进行搅拌降温45°加入C相，冷却后灌装至无菌包装瓶中。
3、性能测试：
对本实施例1制备得到的植物复合发酵原浆的乳液效果进行抗敏舒缓的研究分析。采用添加植物复合发酵原浆的乳液和只使用市面上售卖的乳液作为对照。
测试实验一
选30个志愿者参加本测试，男性15人，女性15人，年龄在18至60岁之间，脸部有严重红肿者有14人，有局部红肿者10人，有轻微红肿者有6人。测试方法为：将所有人员一半脸部使用本实施例所得添加植物复合发酵原浆的乳液，另一半头发使用市场上消肿退红的乳液，其主要成分为洋甘菊与积雪草提取物的乳液，每天涂抹一次，连续使用14天，分别由18位专业老师进行脸部红肿的评价，结果发现，使用本实施例所得乳液护肤品的一半脸部红肿瘙痒症状明显减轻，有90％的受试者的脸部红肿头痒症状消失，而使用市场上其主要成分为洋甘菊与积雪草提取物的的乳液的一半受试者中，53.3％的人仍会感觉到明显的头屑头痒。
综上，在根据本公开的实施例中，本公开提供了如下技术方案，但不限于此：
方案1、一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法，其特征在于，包括：麦冬、仙桃仙人掌、苦参、天竺葵、水组成的底物，进行发酵培养灭菌，制得一种新型植物复合发酵原浆，具有良好的抗敏舒缓功效的发酵产品。
方案2、根据方案1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为乳酸菌，从开菲尔块中进行筛选。
方案3、根据方案2所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌属于以下任一种或多种：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC 1.1797)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)。。
方案4、根据方案1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述仙桃仙人掌需去皮，用组织破碎机进行破碎，然后在25℃环境中浸泡2h，20目过滤。
方案5、根据方案1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述仙桃仙人掌占水质量为0.5％-20.0％。
方案6、根据方案6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述麦冬和天竺葵用量占水质量的0.5-10.0％。
方案7、根据方案2-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，用于接种的乳酸菌种子液浓度为108-1013CFU/mL；所述种子液与所述发酵底物的体积比为0.5％～10.0％。
方案8、根据方案2-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC 1.1797)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)，用于接种的植物乳杆菌植物亚种和嗜热链球菌种子液的制备方法包括如下步骤：
种子活化：挑取植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)斜面菌株1环接种至装有25mL PDA培养基的250ml三角瓶中，30-38℃摇床活化25-60h；挑取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)斜面菌株1环接种至装有25mL肉汤培养基的250ml三角瓶中，30-42℃摇床活化25-60h；
种子液：取上述3％植物乳杆菌植物亚种菌液和2％嗜热链球菌菌液，接入到LB液体培养基中，32-38℃培养10-20h得到种子液。
方案9、根据方案8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基配方为：葡萄糖18.0g，酵母浸粉5.5g，氯化钠7.5g，MgSO4·7H2O 2.0g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；所述PDA液体培养基为：马铃薯粉20.0g，葡萄糖5.0g，pH6.0，补足蒸馏水至1000mL；所述肉汤液体培养基为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏4.0g，酵母浸粉2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；所述液体培养基的灭菌条件为110-125℃、20～50min。
方案10、根据方案1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量为1-10％，温度为30-45℃，时间为8-15h。
方案11、根据方案1-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28-34℃，时间为10-24h。
方案12、根据方案1-11中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还需对发酵后的植物复合发酵体系分离处理，取上清液，然后进行所述的灭菌处理，最终得到植物复合发酵原浆。
方案13、根据方案12所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理；所述离心处理的速度是4000-12000r/min，时间是20-40min。
方案14、根据方案1-13中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到植物复合发酵干粉。
方案15、根据方案14所述的制备方法，其特征在于，所述干燥处理包括低温喷雾干燥或真空冷冻干燥。
方案16、一种采用如方案14或15所述的制备方法制备的植物复合发酵原浆粉末。
方案17、一种采用如方案1-12所述的制备方法制备的植物复合发酵原浆。
方案18、如方案16所述的植物复合发酵原浆粉末或方案17所述的植物复合发酵原浆在制备化妆品的应用。
方案19、一种如方案16所述的植物复合发酵原浆粉末或方案17所述的植物复合发酵原浆作为活性成分的护肤品或洗发品。
最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (12)

1.一种具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆的制备方法，其特征在于，包括：仙桃仙人掌、苦参、麦冬、天竺葵、水组成的底物，进行80℃-110℃灭菌，然后进行发酵培养，所得产品4000r/min-12000r/min离心，制得一种新型植物复合发酵原浆，具有良好的抗敏舒缓功效的发酵产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为乳酸菌，从开菲尔块中进行筛选。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌属于以下任一种或多种：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC1.1797)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述仙桃仙人掌需去皮，用组织破碎机进行破碎，然后在25℃环境中浸泡2h，20目过滤。
5.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述仙桃仙人掌占水质量为0.5％-20.0％。
6.根据权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述麦冬、苦参和天竺葵为烘干后的材料，用组织破碎机进行粉碎，过200目的筛网。
7.根据权利要求6中所述的制备方法，其特征在于，所述麦冬、苦参和天竺葵各组分用量占水质量的0.5-10.0％。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，用于接种的乳酸菌种子液浓度为108-1013CFU/mL；所述种子液与所述发酵底物的体积比为0.5％～10.0％。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,GDMCC 1.1797)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，GDMCC 1.1808)，用于接种的植物乳杆菌植物亚种和嗜热链球菌种子液的制备方法包括如下步骤：
种子活化：挑取植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)斜面菌株1环接种至装有25mL PDA培养基的250ml三角瓶中，30-38℃摇床活化25-60h；挑取嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)斜面菌株1环接种至装有25mL MRS肉汤培养基的250ml三角瓶中，30-42℃摇床活化25-60h；
种子液：取上述3％植物乳杆菌植物亚种菌液和2％嗜热链球菌菌液，接入到LB液体培养基中，32-38℃培养10-20h得到种子液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基配方为：葡萄糖18.0g，酵母浸粉5.5g，氯化钠7.5g，MgSO4·7H2O 2.0g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；所述PDA液体培养基为：马铃薯粉20.0g，葡萄糖5.0g，pH6.0，补足蒸馏水至1000mL；所述MRS肉汤液体培养基为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏4.0g，酵母浸粉2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH5.0，补足蒸馏水至1000mL；所述培养基的灭菌条件为110-125℃、20～50min。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量为1-10％，温度为30-45℃，时间为8-15h。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，将发酵培养好后的植物复合发酵物进行80℃-110℃灭菌处理，还包括离心4000r/min-12000r/min分离处理，弃沉淀取上清液，最终得到所述具有抗敏舒缓功效的植物复合发酵原浆产品。
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