CN115165821A - 一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法，该方法包括以下步骤：向含有大肠杆菌的待测样品中加入氧化铜至终浓度不低于20μg/mL，孵育至少0.5h，加入氧化酶底物邻苯二胺，振荡反应至少0.5h，反应后离心取上清液，通过423nm的光激发，对荧光信号做采集和分析处理，得出大肠杆菌浓度。本发明基于大肠杆菌的铜稳态系统能显著降低氧化铜的类氧化酶活性，从而降低荧光信号，实现对大肠杆菌的快速定量检测。该发明无需引入大肠杆菌的选择性识别探针，因此成本低廉，操作简单，且利用荧光信号作为测定指标，有利于实现对大肠杆菌的现场快速检测。
Description
技术领域
本发明属于光学生物传感检测领域，具体涉及一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法。
背景技术
食源性致病菌对食品安全有相当程度的威胁，大多数食源性疾病与食源性致病菌有关，而大肠杆菌是三种最主要的细菌之一，能引起出血性腹泻、溶血性尿毒症综合征及其他疾病，后果严重甚至致命，因此大肠杆菌的早期检测对预防食源性疾病的爆发和病原体的传播具有积极意义。
食源性致病菌的检测方法主要包括基于培养的平板计数法、基于核酸的分子生物学方法和基于抗原抗体免疫反应的免疫学方法。尽管这些方法具有高准确性和高灵敏度的优点，但它们耗时长、或需要昂贵的设备、或对操作人员的专业要求高等缺点限制了它们的推广应用，尤其不利于现场的快速监测。因此迫切需要发展灵敏、快速、简单的大肠杆菌检测方法。而光学生物传感器具有操作简单、快捷的特点，同时可实现现场对目标物的分析，因此备受关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法。氧化铜具有良好的类氧化酶活性，能快速催化邻苯二胺的氧化产生荧光信号，而大肠杆菌的铜稳态系统能显著降低氧化铜的类氧化酶活性，从而降低荧光信号，实现对大肠杆菌的快速定量检测。该发明无需引入大肠杆菌的选择性识别探针，因此成本低廉，操作简单，且利用荧光信号作为测定指标，有利于实现对大肠杆菌的现场快速检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法，包括以下步骤：
向含有大肠杆菌的待测样品中加入氧化铜(CuO)至终浓度不低于20μg/mL，孵育至少0.5h，利用大肠杆菌的铜稳态代谢过程，将CuO的Cu(II)组分还原为Cu(I)，从而降低了CuO的类氧化酶活性；接着，加入氧化酶底物邻苯二胺(OPD)，振荡反应至少0.5h，OPD被CuO催化氧化产生荧光物质氧化型邻苯二胺(oxOPD)，在423nm的光激发下，oxOPD在573nm处发出橙黄色荧光，大肠杆菌浓度越高，CuO类氧化酶活性越低，产生的荧光越弱；反应后离心取上清液，通过423nm的光激发，对荧光信号做采集和分析处理，得出大肠杆菌的浓度；
所述待测样品中，大肠杆菌的浓度为10-107cfu/mL，优选102-107cfu/mL；
所述邻苯二胺的浓度为8-12mM，优选10mM；
所述孵育和振荡反应的温度优选25-40℃；
所述离心优选5000-12000rpm离心1min；
所述对荧光信号的采集和分析处理，可以采用荧光分光光度计进行，也可以采用辅助装置和图像处理软件进行。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明方法无需引入大肠杆菌的选择性识别探针，基于大肠杆菌的铜稳态系统，实现对大肠杆菌的优异选择性。
2、本发明中，CuO具有类氧化酶活性，可将无荧光性质的OPD氧化形成具有荧光性质的氧化型OPD(oxOPD)，在催化OPD氧化中表现出优异的稳定性。
3、本发明提出的定量荧光分析装置采用了ImageJ进行数字图像分析，在图像处理时操作简单，无需深奥繁复的学科知识背景，对编程能力无要求，并可对感兴趣的目标区域(region of interest，ROI)进行测量和量化得来的原始数据进行统计分析，使得使用者能够更方便地操作。
附图说明
图1为CuO与大肠杆菌孵育前后的TEM图；其中，A为CuO的TEM图，B为大肠杆菌吸附CuO的TEM图。
图2为检测体系中各物质的Zeta电势图；其中CuO@E.coli为大肠杆菌与CuO孵育后的Zeta电势图。
图3为Tris-HCl缓冲体系中不同浓度大肠杆菌存在下传感系统的荧光光谱(A)及相应校准曲线(B)；在激发波长423nm，狭缝为10.0下测定573nm处的荧光强度(n＝3)。
图4为珠江水样品中不同浓度大肠杆菌存在下传感系统的荧光光谱(A)及相应校准曲线(B)；在激发波长423nm，狭缝为10.0下测定573nm处的荧光强度(n＝3)。
图5为实施例中对ROI区域数值测量的示意图，其中A为原图ROI，B图为分离颜色通道后，只保留Red通道的ROI图像。
图6为图像处理软件分析缓冲体系中样品荧光图像Red颜色通道数值与大肠杆菌浓度函数关系。
图7为图像处理软件分析珠江水样品荧光图像Red颜色通道数值与大肠杆菌浓度的函数关系。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的CuO根据参考文献(Cheng,Z.,Chu,X.,Xu,J.,Zhong,H.,Zhang,L.,2016.Ceram.Int.42,3876–3881.)方法制备，所制得的CuO为纳米级尺寸，宽30-50nm，长100-150nm。
实施例
CuO与大肠杆菌孵育前后的TEM图的获取，包括以下步骤：
将400μL的Tris-HCl缓冲液和大肠杆菌悬浮液(106cfu/mL)分别与CuO(50μg/mL，400μL)混合后，在37℃下以200rpm的转速振荡孵育0.5h。用Tris-HCl缓冲液稀释混合液，使CuO的终浓度为0.01mg/mL。将稀释液分别滴加在TEM专用100目铜网上，自然风干后，进行TEM观察。TEM图(图1)清晰表明了大肠杆菌对CuO的吸附。
检测体系中各物质的Zeta电势，包括以下步骤：
首先配制以下体系：①大肠杆菌悬浮液(106cfu/mL)；②CuO悬浮液(100μg/mL)；③大肠杆菌悬浮液(400μL)与CuO(100μg/mL，400μL)的混合液；接着在37℃下以200rpm的转速振荡孵育0.5h。最后在粒径分析仪上分别测定上述体系的Zeta电势。
从图2可以看出CuO与大肠杆菌混合液的Zeta电势绝对值介于大肠杆菌悬浮液和CuO悬浮液之间，而非两者的总和，进一步表明了大肠杆菌与CuO的吸附，且CuO在与大肠杆菌孵育过程中发生了变化，组分中出现了Cu(I)，因此可以辅助证明CuO的类氧化酶活性降低，这个结果与大肠杆菌的铜稳态系统有关。
在Tris-HCl缓冲体系中基于CuO类氧化酶活性和大肠杆菌铜稳态系统的检测方法，包括以下步骤：
将不同浓度的大肠杆菌悬浮液(400μL)，分别与CuO(50μg/mL，400μL)混合，将该混合物在37℃下以200rpm的转速振荡孵育0.5h。然后，向混合物中加入OPD溶液(200μL，10mM)，缓冲体系为Tris-HCl(10mM，pH 8.0)，振荡0.5h，离心1min(10000rpm)，取上清液进行荧光光谱和强度测定。
从图3(A)图可以看出，在Tris-HCl缓冲体系中，检测体系上清液的荧光强度随着大肠杆菌浓度的升高而降低，由此证明CuO具有类氧化物酶的性质，可以将无荧光性质的OPD氧化形成具有荧光性质的氧化型OPD(oxOPD)，而大肠杆菌的铜稳态系统可以将CuO中的部分Cu(II)还原成Cu(I)，因此导致检测体系上清液的荧光强度随着大肠杆菌浓度的升高而降低。
将大肠杆菌各浓度的对数值与其对应的荧光强度变化程度进行线性拟合，如图3(B)图所示，说明本发明的检测方法可对大肠杆菌进行定量检测，检测范围为10-107cfu/mL。
珠江水样品中大肠杆菌的检测方法，包括以下步骤：
将珠江水样品稀释10倍，加入不同浓度的大肠杆菌，涡旋1.5～2min，使大肠杆菌和珠江水样品充分混合，得到混有不同浓度大肠杆菌的珠江水样品溶液。将含有不同浓度大肠杆菌的珠江水样品(400μL)，分别与CuO(50μg/mL，400μL，珠江水样品配制)混合。然后将混合物在37℃下以200rpm的转速振荡孵育0.5h。然后，向混合物加入OPD溶液(200μL，10mM，珠江水样品配制)，振荡0.5h，离心1min(10000rpm)，取上清液进行荧光光谱和强度测定。
从图4(A)图可以看出，在珠江水样品中，检测体系上清液的荧光强度随着大肠杆菌浓度的升高而降低。
将大肠杆菌各浓度的对数值与其对应的荧光强度变化程度进行线性拟合，如图4(B)图所示，说明本发明的检测方法可对珠江水样中的大肠杆菌进行定量检测，检测范围为102-107cfu/mL。
上述方法中，上清液的荧光光谱及强度由港东F-380A荧光分光光度计获得，测定参数设置为：狭缝为10.0，激发波长423nm，发射波长为573nm。
其中，基于港东F-380A荧光分光光度计的荧光光谱及强度的获取包括以下步骤：
(1)样品加载：将空白样品与待测样品分批加入港东F-380A荧光分光光度计配套的比色皿中，并将装有样品的比色皿置于仪器暗腔中的样品池中，用于荧光采集。
(2)软件参数设置：打开港东F-380A荧光分光光度计配套检测软件“ZWin荧光分光光度计软件”，点击界面右侧的“测量方法”按钮打开配置页面，选择“仪器”打开参数设置页面，将采集参数中的狭缝均设置为10.0，激发波长设置为423nm，发射波长范围设置为500-700nm，增益设置为2。
(3)荧光光谱及强度采集：在设置好的参数下，点击扫描，港东F-380A荧光分光光度计开始工作，会自行对暗腔中的样品进行荧光激发，并同时利用光电倍增管对荧光信号进行采集，最后在配套检测软件“ZWin荧光分光光度计软件”端输出为荧光数值及对应光谱图。
另外，基于辅助装置和图像处理软件对上清液的荧光激发、图像处理和分析包括以下步骤：
首先，待测样品的荧光激发：将辅助装置(CN 113433120A中定量比色分析装置中的观测装置)中的白光LED光源替换成波长为425nm的LED光源作为荧光激发光源，打开LED光源开关即可激发待测样品发射荧光。将不含大肠杆菌的空白样品与待测样品分别取不同浓度下的150μL标准组溶液置于可拆式96孔板中，通过顶盖的适配夹持装置固定好智能手机。
然后，荧光图像获取：打开智能手机的专业拍照模式，通过调整感光度、快门时间、焦距等参数捕捉到高质量的样品图片(本案例中ISO为50、曝光时间为1/15s、焦距为27mm、定时时间为5s、放大倍数为×1)。分别拍摄不含有大肠杆菌的空白样本图片与待测样本图片，得到多组标准溶液图像与空白样本溶液图像。
其次，图像分析：将图像导入ImageJ软件中，分别对图像中感兴趣的目标区域(region of interest，ROI)进行选择性细化和裁剪得到ROI区域；再对ROI区域进行颜色通道分离，只保留Red通道。结合图5所示，再对只保留了Red通道的ROI区域，从左到右大肠杆菌浓度依次为0、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL，进行数值测量，得到样品的Red通道数值，测量结果依次为135.437、133.166、128.727、114.262、107.132、77.903；
其中，细化ROI区域步骤为：Edit—Selection—Specify。Width与Height均设置为200，勾选Oval与Constrain square/circle设置选项；
其中，剪裁ROI区域步骤为：Edit—Clear Outside。
其中，颜色通道分离步骤为：Image—Color—Merge Channels…。C1(red)下拉选项中选择剪裁ROI区域后的图片。
其中，Red通道的ROI区域数值测量步骤为：Analyze—Measure，选择Mean列数值作为测量数值。
最后，将样品浓度与ROI区域的Red数值进行函数曲线拟合，x轴为大肠杆菌浓度的对数值，y轴为Red通道数值的差值与空白样品Red通道数值的比值，其中Red通道数值的差值为待测样品和空白样品两者的差值。
如图6与图7所示，缓冲体系中，拟合函数为y＝0.09x-0.23，R2＝0.98；珠江水真实样品中，拟合函数为y＝0.05x-0.12，R2＝0.98。因此可根据待测样品的荧光图像中Red数值预测大肠杆菌的浓度，实现对大肠杆菌的定量检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于氧化铜纳米材料的大肠杆菌检测方法，其特征在于包括以下步骤：
向含有大肠杆菌的待测样品中加入氧化铜至终浓度不低于20μg/mL，孵育至少0.5h，加入氧化酶底物邻苯二胺，振荡反应至少0.5h，反应后离心取上清液，通过423nm的光激发，对荧光信号做采集和分析处理，得出大肠杆菌浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待测样品中，大肠杆菌的浓度为10-107cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待测样品中，大肠杆菌的浓度为102-107cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述邻苯二胺的浓度为8-12mM。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述邻苯二胺的浓度为10mM。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述孵育和振荡反应的温度为25-40℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述离心为5000-12000rpm离心1min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对荧光信号做采集和分析处理，采用荧光分光光度计进行。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对荧光信号做采集和分析处理，采用辅助装置和图像处理软件进行。
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| CN101671718A (zh) * | 2009-10-27 | 2010-03-17 | 北京师范大学 | 一种纳米材料毒性检测方法 |
| CN105482808A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-04-13 | 中南林业科技大学 | 检测食源性水中s2-的荧光探针的制备方法和应用 |
| CN110411993A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-11-05 | 天津科技大学 | 一种双通道可视化快速检测食源性致病菌的新方法 |
| CN113433120A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-24 | 华南师范大学 | 一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统 |
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2022
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