CN115161249A - 一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，包括如下分离筛选步骤：初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20‑30min，即成10倍悬液。本发明通过生防菌，可制成生防菌剂和微生物菌肥，对能产生水稻细菌性条斑病的农作物进行防治，以及应用于水稻的种植，解决了现有的水稻细菌性条斑病在防治时，一般采用喷洒化学药剂的方式进行，采用此种方式，容易对人畜产生毒害，污染农作物周边环境的土壤，且化学药剂容易残留，给人们的后续食用带来安全隐患，以及不利于生态环境可持续发展的问题。

Description

一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用
技术领域
本发明涉及水稻种植技术领域，具体为一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用。
背景技术
水稻是世界上栽培面积和总产量仅次于小麦的重要作物，我国的稻谷总产量居于世界产稻国家之首，这充分说明了稻不仅是我国乃至世界上重要的粮食作物，也是我国主要的粮食作物，但每年因为各种病害造成的水稻大量减产带来了不少经济损失，其中条斑病是影响水稻产量的主要病害之一，南方大部分水稻种植区都有发生，严重危害水稻产量。
水稻细菌性条斑病是由稻黄单孢菌引起的一种水稻病害，该病主要危害叶片，病株叶面初期表现为细小水渍状短条斑，逐渐发展成纵条斑，对光观察呈半透明；严重时全叶枯黄，甚至呈红褐色；湿润叶面病斑上有许多菌脓胶粒，干燥后成黄色小珠，不易脱落；水稻发病后，一般秕粒增多，危害严重则影响抽穗灌浆，造成重大损失，一般减产15-25%，严重时可达40-60%；由于病原菌的易传播，易生存繁殖，条斑病的流行也更为容易，因此水稻条斑病带来的损失十分严重，近年来已超过白叶枯病的危害，是国内外都极为重视的植物检疫性病害。
农业生产上，水稻细菌性条斑病传统防治策略主要包括：抗病品种选择、化学防治、生物防治等；其中化学防治是最主要措施，在水稻不同的生长周期中使用的化学农药种类与目的也不尽相同；在水稻播种前期，使用稀释5000倍的浸种灵浸种36h，然后催芽播种，以及在秧苗的三叶期或移栽前的一两天施用稀释50倍的40%的强氯精都可以有效地清除残留在种子及秧苗上的水稻细菌性条斑病菌，减少初侵染源，起到预防水稻细菌性条斑病发生的作用；在水稻感染细菌性条斑病初期，使用10%的叶枯净可湿性粉剂可有效地防止病情的扩增，叶枯净为保护性杀菌剂，具有强烈的抑制水稻细菌性条斑病菌生长的作用；此外，20%的叶枯灵可湿性粉剂、20%的叶青双可湿性粉剂都可对稻细菌性条斑病进行有效的防控，防治效果都在75%以上；但长期施用化学农药容易使病原物产生耐药性，造成环境污染，引发食品安全等一系列问题；由于以上种种问题的存在，使得兼具防病、促生功效，且对环境友好的微生物农药逐渐受到农业工作者的重视。
生物防治与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题；生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展；可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造；多种因素和成分发挥作用，病原菌难以产生抗药性。
因此，本领域希望能够筛选出防治水稻细菌性条斑病的生防菌，尤其是能够在水稻生长所处环境中进行很好地生长繁殖的生防菌，在应用中更具有实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，具备无毒、无污染和无残留的对稻细菌性条斑病进行防治的优点，解决了现有的水稻细菌性条斑病在防治时，一般采用喷洒化学药剂的方式进行，采用此种方式，容易对人畜产生毒害，污染农作物周边环境的土壤，且化学药剂容易残留，给人们的后续食用带来安全隐患，以及不利于生态环境可持续发展的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种生防菌，包括如下分离筛选步骤：
初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20-30min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；
复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；
分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌。
优选的，所述分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，所述初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌。
优选的，所述LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。
一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，包括如下步骤：
培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。
防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100~200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。
温室防病试验：
一：用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻植株，每处理接种6穴水稻，24片叶，接种后立即用培养36h、含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌菌液进行喷雾，每处理喷雾100mL菌液，空白培养液为对照；14d后测量条斑病病斑大小，计算防治效果；
二：用蜡质芽孢杆菌的菌液对生长14d的水稻进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组；
三：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；
四：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液接种对上述三个实验中的水稻植株，20-25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况。
优选的，所述温室防病试验中，所提的步骤二为水稻细菌性条斑病试验的实验组，所提的步骤三为水稻细菌性条斑病试验的对照组。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过生防菌，可制成生防菌剂和微生物菌肥，对能产生水稻细菌性条斑病的农作物进行防治，以及应用于水稻的种植，解决了现有的水稻细菌性条斑病在防治时，一般采用喷洒化学药剂的方式进行，采用此种方式，容易对人畜产生毒害，污染农作物周边环境的土壤，且化学药剂容易残留，给人们的后续食用带来安全隐患，以及不利于生态环境可持续发展的问题，值得推广。
附图说明
图1为本发明实验对比图。
具体实施方式
请参阅图1，一种生防菌，包括如下分离筛选步骤：
初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20-30min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；
复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；
分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌；
分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌；
LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2；
一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，包括如下步骤：
培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。
防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100~200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。
温室防病试验：
一：用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻植株，每处理接种6穴水稻，24片叶，接种后立即用培养36h、含菌量为109cfu⋅mL−1（稀释10倍）的拮抗菌菌液进行喷雾，每处理喷雾100mL菌液，空白培养液为对照；14d后测量条斑病病斑大小，计算防治效果；
二：用蜡质芽孢杆菌的菌液（活菌浓度为1×107CFU/ml）对生长14d的水稻进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组；
三：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；
四：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液（活菌浓度为1×107CFU/ml）接种对上述三个实验中的水稻植株，20-25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况；
温室防病试验中，所提的步骤二为水稻细菌性条斑病试验的实验组，所提的步骤三为水稻细菌性条斑病试验的对照组。
实施例一：
一种生防菌，包括如下分离筛选步骤：
初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；
复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；
分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌；
分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌；
LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2；
一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，包括如下步骤：
培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。
防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。
温室防病试验：
一：用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻植株，每处理接种6穴水稻，24片叶，接种后立即用培养36h、含菌量为109cfu⋅mL−1（稀释10倍）的拮抗菌菌液进行喷雾，每处理喷雾100mL菌液，空白培养液为对照；14d后测量条斑病病斑大小，计算防治效果；
二：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；
三：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液（活菌浓度为1×107CFU/ml）接种对上述二个实验中的水稻植株，20℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况；
实施例二：
一种生防菌，包括如下分离筛选步骤：
初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；
复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；
分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌；
分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌；
LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。
一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，包括如下步骤：
培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。
防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。
温室防病试验：
一：用蜡质芽孢杆菌的菌液（活菌浓度为1×107CFU/ml）对生长14d的水稻进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组；
二：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；
三：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液（活菌浓度为1×107CFU/ml）接种对上述二个实验中的水稻植株，25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况。
表格1. 菌剂促进水稻抗病性分析（水稻叶片侵染面积百分比）
未处理组 低浓度菌剂 中浓度菌剂 高浓度菌剂
稻瘟病 45.26% 38.35% 20.08% 8.13%
细菌性条斑病 62.12% 35.05% 22.06% 17.97%
低浓度菌剂： 1x104
中浓度菌剂： 1x105
高浓度菌剂： 1x106
综上所述：该生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，通过生防菌，可制成生防菌剂和微生物菌肥，对能产生水稻细菌性条斑病的农作物进行防治，以及应用于水稻的种植，解决了现有的水稻细菌性条斑病在防治时，一般采用喷洒化学药剂的方式进行，采用此种方式，容易对人畜产生毒害，污染农作物周边环境的土壤，且化学药剂容易残留，给人们的后续食用带来安全隐患，以及不利于生态环境可持续发展的问题。

Claims (7)

1.一种生防菌，其特征在于包括如下分离筛选步骤：
初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20-30min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；
复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；
分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌。
2.根据权利要求1所述的一种生防菌，其特征在于：所述分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，所述初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种生防菌，其特征在于：所述LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，其特征在于包括如下步骤：
培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。
5.防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100~200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。
6.温室防病试验：
一：用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻植株，每处理接种6穴水稻，24片叶，接种后立即用培养36h、含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌菌液进行喷雾，每处理喷雾100mL菌液，空白培养液为对照；14d后测量条斑病病斑大小，计算防治效果；
二：用蜡质芽孢杆菌的菌液对生长14d的水稻进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组；
三：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；
四：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液接种对上述三个实验中的水稻植株，20-25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况。
7.根据权利要求4所述的一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，其特征在于：所述温室防病试验中，所提的步骤二为水稻细菌性条斑病试验的实验组，所提的步骤三为水稻细菌性条斑病试验的对照组。
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