CN115151592A

CN115151592A - 嵌段共聚物及其制造方法

Info

Publication number: CN115151592A
Application number: CN202180016445.7A
Authority: CN
Inventors: 松本谦一郎; 福居俊昭; 石原静流
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2022-10-04
Also published as: EP4116428A4; US20230087393A1; EP4116428A1; JPWO2021172559A1; WO2021172559A1

Abstract

一种共聚物，包含仅在2位具有羟基的羟基羧酸(A)、和在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸(B)，且具有均聚链段和共聚链段，所述均聚链段由选自羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)中的1种羟基羧酸组成，所述共聚链段包含选自羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)中的至少2种羟基羧酸。

Description

嵌段共聚物及其制造方法

技术领域

本发明涉及嵌段共聚物及其制造方法，更详细地，涉及具有均聚链段和共聚链段的嵌段共聚物、及其制造方法。

背景技术

共聚物是2种以上的单体聚合而合成的高分子化合物，与金属等其他材料相比，弹性、透明性、加工性、轻量等物性优异。因此，在医疗等各种产业领域中大量被使用。其中，由2种以上性质不同的聚合物(链段)通过共价键连接而成的链组成的嵌段共聚物，被期待成为兼具作为其构成的各链段的特长的材料。

另外，该高分子化合物通常以石油作为原料合成。然而，由于对近年来成为问题的化石资源枯竭、地球温暖化的对策，以可再生资源(生物质来源的原料)作为碳源生成的高分子化合物(所谓生物聚合物)受到关注。

例如，由微生物产生的聚羟基烷酸(PHA)作为生物基质/生物分解性材料受到关注。现在商业生产的PHA是3-羟基丁酸(3HB)与3-羟基己酸(3HHx)的共聚物，进而，2008年报告了非天然型的乳酸单元的聚合之后，报告了包含各种非天然单体的PHA(非专利文献1)。

另外，在微生物中通常2种以上的单体无规则地排列，PHA作为无规共聚物被生物合成。然而，本发明者们报告了，通过用包含2-羟基丁酸(2HB)和3HB的培养基来培养表达CoA转移酶和聚合酶的微生物，能够生物合成由2-羟基丁酸(2HB)组成的均聚链段与由3HB组成的均聚链段结合而成的嵌段共聚物(P(2HB-b-3HB))(非专利文献2)。

这样，尽管即使对于生物聚合物，也能够实现嵌段共聚物的生物合成，但为了物性等的改良，要求进一步的嵌段共聚物的开发。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Matsumoto et al.,2013,Appl.Microbiol.Biotechnol.97,8011

非专利文献2：Matsumoto K et al.,Biomacromolecules,19(2),662,2018

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而做出的，目的是提供具有均聚链段和共聚链段的嵌段共聚物。

用于解决课题的手段

本发明者们为了进一步改良非专利文献2中报告的嵌段共聚物(P(2HB-b-3HB))，利用除了以前的2HB和3HB之外还添加了3HHx的培养基，培养了所述微生物。其结果能够获得由2HB组成的均聚链段、与由3HB和3HHx组成的无规聚合链段结合而成的嵌段共聚物(P(2HB-b-(3HB-co-3HHx)))。即，与以前的仅具有均聚链段的聚合物不同，能够生物合成也具有无规共聚链段的嵌段共聚物。

进而确认了，代替3HHx，将3-羟基丙酸(3HP)、4-羟基-2-甲基丁酸(4H2MB)、2,4-二羟基丁酸(24DHB)、5-羟基戊酸(5HV)或6-羟基己酸(6HHx)加入到包含2HB和3HB的培养基中，培养所述微生物，也与使用3HHx的情况同样地，能够合成嵌段共聚物(P(2HB)-b-P(3HB-ran-3HP)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-4H2MB)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-24DHB)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-5HV)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-6HHx))。

另外，利用添加了2-羟基乙酸(乙醇酸、GL)和3HB的培养基来培养所述微生物的结果，能够得到由3HB组成的均聚链段、与由GL和3HB组成的共聚链段结合而成的嵌段共聚物(P(3HB-b-(GL-co-3HB)))。

进而另外，利用添加了GL、3HB和3HHx的培养基来培养所述微生物的结果，能够得到由3HB组成的均聚链段、与由GL、3HB和3HHx组成无规共聚链段结合而成的嵌段共聚物(P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx)))。

另外表明，将导入了ldhA(乳酸脱氢酶基因)、hadA(CoA转移酶基因)和PhaC_AR(聚合酶基因)的富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)葡萄糖同化性改变株利用包含葡萄糖和2HB的培养基进行培养的情况下，该微生物生物合成3HB和3HV(3-羟基戊酸)，进而由这些羟基羧酸也能够生物合成嵌段共聚物(P(2HB)-b-P(3HB-co-3HV))。即，即使不在培养基中添加3HB和3HV等在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸，也能够通过培养所述微生物，获得所述嵌段共聚物。

本发明基于以上的合成例，更具体地提供以下发明。

＜1＞一种共聚物，包含仅在2位具有羟基的羟基羧酸(A)、和在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸(B)，且具有均聚链段和共聚链段，

所述均聚链段由选自羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)中的1种羟基羧酸组成，

所述共聚链段包含选自羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)中的至少2种羟基羧酸。

＜2＞根据＜1＞所述的共聚物，羟基羧酸(A)是选自2-羟基丁酸、2-羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-羟基戊酸、2-羟基己酸和中链2-羟基烷酸中的至少1种羟基羧酸，

羟基羧酸(B)是选自3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基丙酸、3-羟基戊酸、中链3-羟基烷酸、4-羟基-2-甲基丁酸、4-羟基丁酸、2,4-二羟基丁酸、5-羟基戊酸和6-羟基己酸中的至少1种羟基羧酸。

＜3＞根据＜1＞所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基丁酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸和3-羟基己酸，且，

该共聚物具有由2-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚链段。

＜4＞根据＜1＞所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基乙酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸，且

该共聚物具有由3-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含2-羟基乙酸和3-羟基丁酸的共聚链段。

＜5＞根据＜1＞所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基乙酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸和3-羟基己酸，且，

该共聚物具有由3-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含2-羟基乙酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚链段。

＜6＞＜1＞～＜5＞中的任一项所述的共聚物的制造方法，该方法包括：

将表达CoA转移酶和聚合酶的微生物，利用包含羟基羧酸(A)和/或其代谢前体、和羟基羧酸(B)和/或其代谢前体的培养基进行培养的工序，和

由通过所述工序得到的培养物回收所述共聚物的工序。

发明的效果

根据本发明，能够提供具有均聚链段和共聚链段的嵌段共聚物、及其制造方法。

根据本发明，能够提供例如，由2HB组成的均聚物、与由3HB和3HHx组成的无规聚合物结合而成的嵌段共聚物(P(2HB-b-(3HB-co-3HHx)))。该嵌段共聚物如后述的实施例所示，与非专利文献2所公开的共聚物P(2HB-b-3HB)相比，具有高的拉伸性。特别是P(2HB-b-(3HB-co-3HHx))具有超过1200％的非常高的拉伸性。

另外，能够提供由3HB组成的均聚物、与由GL和3HB组成的共聚物结合而成的嵌段共聚物(P(3HB-b-(GL-co-3HB)))。进而另外，能够提供由3HB组成的均聚物、与由GL、3HB和3HHx组成的共聚物结合而成的嵌段共聚物(P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx)))。这些嵌段共聚物如后述的实施例所示，通过导入GL，从而非酶水解性提高，进而发挥在生物体内的高分解性。另外，P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的共聚链段采取梯度结构。进而，该共聚物通过导入3HHx而柔软性大幅提高。

附图说明

图1A是显示加入2HB、3HB和3HHx、使用聚合酶PhaC_AR而得的共聚物(P(2HB-b-(3HB-co-3HHx)))的、¹H NMR光谱分析的结果的图。

图1B是显示加入2HB、3HB和3HHx、使用聚合酶PhaC_AR而得的共聚物(P(2HB-b-(3HB-co-3HHx)))的、¹³C NMR光谱分析的结果的图。

图1C是对于P(2HB-b-(3HB-co-3HHx))等显示应力应变关系的图。

图2A是显示加入3HB和GL、使用聚合酶PhaC1_PsSTQK而得的共聚物的、¹H NMR光谱分析的结果的图。

图2B是显示加入3HB和GL、使用聚合酶PhaC_AR而得的共聚物(P(3HB-b-(GL-co-3HB)))的、¹H NMR光谱分析的结果的图。

图2C是显示将P(3HB-b-(GL-co-3HB))用凝胶过滤色谱分析而得的结果的分子量分布曲线。

图3A是显示P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的、¹H NMR光谱分析的结果的图。其中，图中的编号与表2的记载对应。

图3B是显示P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的差示扫描量热测定结果的图。

图3C是对于P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))显示应力应变关系的图。

图4A是显示对于由P(2HB)均聚物链段和包含3HB的无规共聚物链段构成的嵌段共聚物进行¹H NMR光谱分析的结果的图。

图4B是显示P(2HB)-b-P(3HB-ran-5HV)的差示扫描量热测定结果的图。

图5A是显示用于生物合成P(2HB)-b-P(3HB-co-3HV)的代谢途径的概略图。

图5B是显示在R.eutrpha H16 NSDG-GG-ΔB1株染色体上的pha操纵子中，通过同源重组将phaCNSDG(豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)来源改变型PHA合酶基因)替换成phaCAR(A.caviae和R.eutropha来源的嵌合PHA合酶基因)的概略图。

图5C是显示在phaP1(PHA颗粒结合蛋白质基因)下游插入了艰难梭菌(Clostridium difficile)来源的ldhA(乳酸脱氢酶基因)和hadA(CoA转移酶基因)的概略图。

图5D是显示对于P(2HB)-b-P(3HB-co-3HV)进行¹H NMR光谱分析的结果的图。

具体实施方式

＜嵌段共聚物＞

如后述的实施例所示，在本发明中，提供具有均聚链段和共聚链段的嵌段共聚物，更具体地提供一种共聚物，包含仅在2位具有羟基的羟基羧酸(A)、和在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸(B)，且具有均聚链段和共聚链段，

本发明的共聚物是羟基羧酸通过酯键聚合而成的，具有至少2种链段。

本发明中，所谓“链段”是指在嵌段共聚物中构成各嵌段的构成单元，是由1种单体(后述的羟基羧酸)构成的单元(均聚链段)或由多种单体构成的单元(共聚链段)。作为“共聚链段”，可列举例如，多种单体无规地聚合而成的无规聚合链段、构成的单体组成连续地变化的梯度聚合链段、多种单体交替聚合而成的交替聚合链段。另外，在本发明的共聚物中构成各链段的单体数不特别限定，但在作为材料利用的情况下，为100以上，通常为500以上，更优选为4000以上。

本发明所涉及的“羟基羧酸”分为仅在2位具有羟基的单羟基羧酸、和在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸2种。其中，后者也可以是具有多个羟基的羟基羧酸，该情况下，除了2位以外的部位之外，也可以在2位具有羟基。

作为仅在2位具有羟基的羟基羧酸(以下称为“羟基羧酸(A)”)，可列举例如，2-羟基乙酸(乙醇酸、GL)、2-羟基丁酸(2HB)、2-羟基丙酸(乳酸、2HP)、2-羟基戊酸(2-羟基戊酸)、2-羟基己酸、中链2-羟基烷酸。其中，中链2-羟基烷酸更具体可列举由氨基酸衍生的(来源于氨基酸的侧链结构的)2-羟基烷酸(参照Sudo M.et al.,J Biosci Bioeng.2019Oct 18.pii:S1389-1723(19)30785-6)。另外，本发明所涉及的羟基羧酸(A)不仅是指1种仅在2位具有羟基的单羟基羧酸，也指多种仅在2位具有羟基的单羟基羧酸。其中，从通过被导入共聚物而非酶水解性提高、进而容易发挥在生物体内的高的分解性这样的观点考虑，优选为2-羟基乙酸。另外，从得到对材料付与透明性的、具有与聚-D-乳酸(PDLA)类似的立体结构的全同立构聚合物、聚合物的玻璃化转变温度低于其他2-羟基羧酸因而生物合成容易这样的观点考虑，优选为2-羟基丁酸。

作为在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸(以下也称为“羟基羧酸(B)”)，可列举例如，3-羟基丙酸(3HP)、3-羟基丁酸(3HB)、3-羟基己酸(3HHx)、3-羟基戊酸(3-羟基正戊酸、3HV)、中链3-羟基烷酸、4-羟基-2-甲基丁酸(4H2MB)、4-羟基丁酸、2,4-二羟基丁酸(24DHB)、5-羟基戊酸(5-羟基正戊酸、5HV)、6-羟基己酸(6HHx)。其中，本发明所涉及的羟基羧酸(B)不仅是指1种在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸，也指多种在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸。其中，从能够由各种碳源最有效地合成、对材料付与强度这样的观点考虑，优选为3-羟基丁酸；从通过被导入共聚物而柔软性提高这样的观点考虑，优选为3-羟基己酸。

本发明中，作为这些羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)的组合，只要能够形成上述的2种链段，就不特别限制，可列举例如，2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸；2-羟基乙酸和3-羟基丁酸；2-羟基乙酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和3-羟基丙酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和4-羟基-2-甲基丁酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和2,4-二羟基丁酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和5-羟基戊酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和6-羟基己酸；2-羟基丁酸、3-羟基丙酸和4-羟基-2-甲基丁酸；2-羟基丁酸、3-羟基丙酸和2,4-二羟基丁酸；2-羟基丁酸、3-羟基丙酸和5-羟基戊酸；2-羟基丁酸、3-羟基丙酸和6-羟基己酸；2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸，但是2-羟基丁酸和3-羟基丁酸除外。

另外，作为由这样的组合构成的本发明的共聚物的分子量，不特别限定，但从获得充分的机械强度、进而在由溶融成型造成的分子量降低后也保持充分的分子量这样的观点考虑，数均分子量优选为1万以上，更优选为10万以上，进一步优选为100万以上。另外，作为上限不特别限定，但从制造困难这样的观点考虑，优选为通常1000万以下。

以下，对于本发明的共聚物，以具体的组合例进一步进行说明。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物，具有由2-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取无规共聚结构。

该共聚物的分子量(数均分子量)不特别限定，从得到充分的机械强度、进而在由溶融成型造成的分子量降低后也保持充分的分子量这样的观点考虑，优选为10万以上，更优选为100万以上。

另外，从发挥充分的柔软性、且也发挥由嵌段结构带来的物性这样的观点考虑，3-羟基丁酸和3-羟基己酸的无规共聚物链段优选为聚合物全体的50mol％以上，更优选为70mol％以上。本无规链段的组成从发挥充分的柔软性这样的观点考虑，3-羟基己酸优选为5mol％以上，更优选为20mol％以上。2-羟基丁酸的组成通过确定均聚链段与共聚链段的量比而唯一地确定。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基乙酸和3-羟基丁酸的共聚物，具有由3-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含2-羟基乙酸和3-羟基丁酸的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取无规共聚结构。

该共聚物的分子量(数均分子量)不特别限定，从在作为材料使用的情况下发挥机械强度、进而由溶融成型造成的分子量降低后也保持充分的分子量这样的观点考虑，优选为1万以上，更优选为100万以上。

另外，从材料的机械物性控制观点考虑，2-羟基乙酸和3-羟基丁酸的含有比率不特别限定，在作为硬质链段利用的情况下，2-羟基乙酸优选为50mol％以上，进一步优选为70mol％以上。另一方面，在作为软质链段利用的情况下，2-羟基乙酸优选为50mol％以下，进一步优选为10～30mol％。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基乙酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物，具有由3-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含2-羟基乙酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取梯度聚合结构。

作为该共聚物的分子量(数均分子量)，下限不特别限定，从作为材料使用时发挥机械强度、进而由溶融成型造成的分子量降低后也保持充分的分子量这样的观点考虑，优选为1万以上，更优选为100万以上。

另外，从材料发挥柔软性这样的观点考虑，3-羟基己酸的含有率优选为全体的10mol％以上，更优选为30mol％以上。此时的2-羟基乙酸、3-羟基丁酸的含有率优选双方为70mol％以下，进一步优选双方为50mol％以下。

另外同样地，从材料具有柔软性的观点考虑，硬质的均聚链段优选为50mol％以下，进一步优选为30mol％以下。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基丁酸、与3-羟基丁酸、与3-羟基丙酸、4-羟基-2-甲基丁酸、2,4-二羟基丁酸、5-羟基戊酸或6-羟基己酸的共聚物，具有由2-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含3-羟基丁酸和3-羟基丙酸等的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取无规共聚结构。

关于该共聚物的分子量，为了表现与能够加工成材料相应的强度，优选为重均分子量10万以上，更优选为100万左右(例如，50万～200万、80万～150万)。

作为无规链段的单体组成，为了获得目的物性，只要是本领域技术人员就能够适宜调整，在合成以3-羟基丁酸作为主成分，包含3-羟基丙酸、4-羟基-2-甲基丁酸、5-羟基戊酸或6-羟基己酸的无规链段，以聚-3-羟基丁酸骨架的软质化为目的的情况下，3-羟基丁酸以外的成分优选为0～50mol％，为了表现适度的柔软性和强度，更优选为5～20mol％左右(例如，1～40mol％、3～30mol％)。在以聚合物的亲水化作为目的合成包含2,4-二羟基丁酸的链段的情况下，2,4-二羟基丁酸的组成优选为5～20mol％左右(例如，1～40mol％、3～30mol％)。在以除3-羟基丁酸以外的单元(3-羟基丙酸、4-羟基-2-甲基丁酸、5-羟基戊酸或6-羟基己酸)作为主成分制作软质性的链段作为目的的情况下，优选将除3-羟基丁酸以外的成分调整为50～100mol％。为了发挥柔软的物性，优选除3-羟基丁酸以外的成分比例高，为了与聚合物的合成效率同时成立，优选80～95mol％左右(例如，60～99mol％、70～97mol％)。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基丁酸、与3-羟基丙酸、与4-羟基-2-甲基丁酸、2,4-二羟基丁酸、5-羟基戊酸或6-羟基己酸的共聚物，具有由2-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含3-羟基丙酸和4-羟基-2-甲基丁酸等的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取无规共聚结构。

该共聚物中，链段中的3-羟基丙酸与其他单元的分率可以以任意组成利用，作为例子，可列举3-羟基丙酸100％或90mol％。另外，分子量优选重均分子量为10万以上。

在本发明的共聚物中，包含2-羟基丁酸、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的共聚物，具有由2-羟基丁酸组成的均聚链段、和包含3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的共聚链段。其中，该共聚物中的共聚链段采取无规共聚结构。

在该共聚物中，共聚链段优选包含3-羟基戊酸10～30mol％。分子量优选重均分子量为10万以上。

＜嵌段共聚物的制造方法＞

如后述的实施例所示，在大肠杆菌等微生物中，通过CoA转移酶而对上述羟基羧酸添加CoA，进而这些羟基羧酸通过聚合酶而聚合，从而可以得到上述的本发明的共聚物。因此，本发明提供一种方法，包括

工序1：将表达CoA转移酶和聚合酶的微生物用包含羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)的培养基进行培养的工序，和

工序2：由通过所述工序得到的培养物回收所述共聚物的工序。

(CoA转移酶)

在本发明中，所谓“CoA转移酶”是指催化对上述的羟基羧酸转移CoA(辅酶A)的反应的酶。例如，在以碳数为5以下的羟基羧酸作为对象的情况下，可列举丙酸CoA转移酶。

丙酸CoA转移酶(PCT)是指被分类为酶编号(EC)：2.8.3.1的酶。作为本发明所涉及的PCT，只要保持其催化活性，就对于其来源不特别限制，从在大肠杆菌中的异宿主表达容易这样的观点考虑，优选为来源于属于巨球菌属(Megasphera)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌的PCT，更优选来源于属于巨球菌属(Megasphera)的细菌的PCT，进一步优选来源于埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的PCT(由序列号1所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)。

另外，在自然界中也可以发生核苷酸序列突变。并且与此伴随，所编码的氨基酸也可以变化。因此，本发明所涉及的PCT只要具有所述催化活性，则也包含由在所述细菌来源的野生型氨基酸序列(例如，序列号1所记载的氨基酸序列)中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质(改变体)。

本发明所涉及的PCT中所谓“多个”，是100个氨基酸以内、优选为80个氨基酸以内、更优选为50个氨基酸以内、进一步优选为30个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内、进一步优选为10个氨基酸以内、特别优选为数个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内)。

进而，在现在的技术水准下，只要是本领域技术人员，就能够利用其基因(核苷酸序列)信息，由同种或其他细菌等确定其同源基因。作为用于鉴定同源基因的方法，可列举例如，杂交技术(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98:503,1975)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki,R.K.,et al.Science,230:1350-1354,1985、Saiki,R.K.et al.Science,239:487-491,1988)。为了鉴定同源基因，通常，在严格条件下进行杂交反应。作为严格的杂交条件，可以例示6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC的条件或与其同等的严格性的杂交条件。如果使用严格性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC的条件，则可以期待同源性更高的基因的分离。

因此，本发明所涉及的PCT只要具有所述催化活性，就也包含与由所述细菌来源的野生型核苷酸酸序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA所编码的蛋白质。

另外，由所鉴定的同源基因编码的蛋白质通常与所述细菌来源的蛋白质具有高的同源性(高的类似性)、优选具有高的同一性。这里所谓“高的”，是指至少50％以上、优选为60％以上、更优选为70％以上、进一步优选为80％以上、更优选为85％以上(例如，90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)。

因此，本发明所涉及的PCT只要具有所述催化活性，就也包含由与所述细菌来源的野生型氨基酸序列具有至少50％以上的同源性(类似性)或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

此外，序列的同源性可以利用BLAST的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)确定。该程序基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)。例如，在通过BLAST来分析氨基酸序列时，参数为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列时，可以如Altschul等(NucleicAcids Res.25:3389-3402,1997)所记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体手法是公知的。

上述的PCT的改变体或同源体是否具有所述催化活性，只要是本领域技术人员，就能够使用例如A.E.Hofmeister等(Eur.J.Biochem.、第206卷、第547-552页)所记载的方法，测定它们的催化活性来判定。

另外，除了前述的PCT之外，例如，在以3HHx等在3位具有羟基的羟基羧酸作为对象的情况下，酰基-CoA合成酶可以作为本发明所涉及的CoA转移酶的适合的例子使用。

酰基-CoA合成酶(AlkK)是指分类于酶编号(EC)：6.2.1.3的酶。作为本发明所涉及的AlkK，只要保持其催化活性，就对于其来源不特别限制，但从对中链3-羟基羧酸具有充分的活性这样的观点考虑，优选来源于属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌的AlkK，更优选来源于食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)或恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)的AlkK，进一步优选来源于恶臭假单孢菌的AlkK，更优选来源于恶臭假单孢菌KT2440的AlkK(由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)(参照Wang et al.Appl EnvironMicrobiol.2012Jan；78(2):519-527)。

另外与PCT同样地，本发明所涉及的AlkK只要具有所述催化活性，就也包含由在所述细菌来源的野生型氨基酸序列(例如，序列号2所记载的氨基酸序列)中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质(改变体)。本发明所涉及的AlkK中所谓“多个”，是指100个氨基酸以内、优选为80个氨基酸以内、更优选为50个氨基酸以内、进一步优选为30个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内、进一步优选为10个氨基酸以内、特别优选为数个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内)。

进而，本发明所涉及的AlkK只要具有所述催化活性，就也包含与由所述细菌来源的野生型核苷酸酸序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA所编码的白质、由与所述细菌来源的野生型氨基酸序列具有至少50％以上的同源性(类似性)或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

另外，关于该AlkK的改变体或同源体是否具有所述催化活性，只要是本领域技术人员，就能够使用例如如下方法来判定：将通过该酶的反应而生成的酰基CoA用酰基CoA氧化酶特异性地氧化，对于这里生成的过氧化氢，在过氧化物酶的存在下，通过4-氨基安替比林、与3-甲基-N-乙基-N-(2-羟基乙基)苯胺、N,N-二甲基苯胺、N,N-二乙基苯胺或苯酚而使其显色，从而检测。

(聚合酶)

在本发明中，作为“聚合酶”，只要是催化将前述的被转移了CoA的羟基羧酸聚合、形成上述的均聚链段和共聚链段的反应的酶即可，可列举例如，能够识别(1)仅在2位具有羟基的羟基羧酸、和(2)2位不具有羟基的羟基羧酸而控制聚合反应的聚合酶。优选列举具有所述催化活性的1型聚羟基烷酸酯合成酶(PhaC)或其改变体，进一步优选为属于气单胞菌属(Aeromonas)的细菌来源的1型PhaC或其改变体，更优选为豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)来源的1型PhaC或其改变体。进一步优选为属于气单胞菌属的细菌来源的1型PhaC的N末部分与属于罗尔斯通氏菌属的细菌来源的1型PhaC的C末部分融合而成的嵌合型聚合酶，更优选为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)来源的1型PhaC的N末部分与富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)来源的1型PhaC的C末部分融合而成的嵌合型聚合酶，进一步优选为豚鼠气单胞菌来源的1型PhaC的N末侧26％的部分与富养罗尔斯通氏菌来源的1型PhaC的C末侧74％的部分融合而成的嵌合型聚合酶(PhaC_AR、(由序列号3所记载的氨基酸序列组成蛋白质))(参照Matsumoto K.et al.,Biomacromolecules.2009Apr 13；10(4):682-685)。

另外与上述的CoA转移酶同样地，本发明所涉及的聚合酶只要具有所述催化活性，就也包含由在所述酶的氨基酸序列(例如，序列号3所记载的氨基酸序列)中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质(改变体)。本发明所涉及的CoA转移酶中所谓“多个”，是指100个氨基酸以内、优选为80个氨基酸以内、更优选为50个氨基酸以内、进一步优选为30个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内、进一步优选为10个氨基酸以内、特别优选为数个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内)。

作为该改变，例如，在PhaC_AR中，可列举选自F314X、I320X、G423X、V448X和I505X中的至少1种氨基酸替换(“X”是指与替换前不同的氨基酸)。通过该氨基酸替换，3HHx聚合能力被强化，因此例如，在作为羟基羧酸(B)使用3HHx的情况下，能够提高本发明所涉及的共聚物中的3HHx分率。

进而，本发明所涉及的聚合酶只要具有所述催化活性，就也包含由与由编码所述酶的核苷酸酸序列组成的DNA在严格条件杂交的DNA所编码的蛋白质、由与所述酶的氨基酸序列具有至少50％以上的同源性(类似性)或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

另外，关于该聚合酶的改变体或同源体是否具有所述催化活性，只要是本领域技术人员，就能够使用例如非专利文献2所记载的方法来判定。

(微生物)

在本发明中，通过培养表达上述的2种酶的微生物，可以制造本发明的共聚物。作为该微生物，可以使用生来表达这些酶的，但通常使用将编码该酶的DNA导入微生物而制备的转化体。

作为本发明所涉及的“微生物”，只要是能够功能性地表达聚羟基烷酸(PHA)合成酶群的微生物就不特别限定，但可列举例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、氢细菌(钩虫贪铜菌、Cupriavidus necator)、棒形细菌、酵母、罗尔斯通氏菌属细菌、假单胞菌属细菌。这些微生物之中，从聚合物生产性及其生产稳定性的观点考虑，优选为大肠杆菌、氢细菌，更优选为大肠杆菌。大肠杆菌的菌株不特别限定，从能够实现更稳定的共聚物生产这样的观点考虑，作为优选的一例，可列举E.coli JM109株。另外，如后述的实施例所示，从能够生物合成本发明所涉及的羟基羧酸(B)(3HB、3HV、3HHx等)这样的观点考虑，优选罗尔斯通氏菌属细菌，更优选为富养罗尔斯通氏菌，进一步优选为富养罗尔斯通氏菌的葡萄糖同化性改变株(H16 NSDG-GG-ΔB1株)，更优选为后述的实施例所示的H16CAR-GG-ΔB1、H16 CAR-GG-ΔB1-ldhAhadA。

该微生物中，为了表达本发明所涉及的2种酶，上述DNA通常以被整合到载体中形态被导入。另外，也可以利用同源重组向染色体导入。此外，为了被导入到本发明所涉及的微生物的染色体中的DNA(基因)被适当转录、进而被翻译成具有所期望的活性的蛋白质，该DNA在染色体上需要以在适当的引物的控制下的方式整合。

在本发明中，“载体”基本可以构建自我复制载体、即作为染色体外的独立体而存在、其复制不依赖于染色体的复制的例如质粒。另外，载体在被导入宿主细胞时，也可以整合到该宿主细胞的基因组中，与整合了该载体的染色体一起被复制。

作为这样的载体，可列举例如，质粒DNA、噬菌体DNA。作为用于导入大肠杆菌中的载体的例子，可列举pBLuescript(pBLuescript KS+、pBLuescript SK+、pBLuescriptII KS+、pBLuescriptII KS-等)、pBR322、pUC18等质粒DNA、EMBL3、M13、λgtII等噬菌体DNA。作为用于导入氢细菌的载体的例子，可列举pCUP2(参照国际公开2007/049716号)、具有在一定范围的宿主中复制/保持的RK2复制起点的pLA2917(ATCC37355)、具有RS F1010复制起点的pJRD215(ATCC37533)等。作为用于导入棒形细菌中的载体的例子，可列举pAM330、pHM1519、pAJ655、pAJ611、pAJ1844、pCG1、pCG2、pCG4、pCG11、pHK、pPSPTG1、pVC7、pUC19I等。作为用于导入酵母中的载体的例子，可列举YEp13、YCp50等。另外，作为用于导入罗尔斯通氏菌属细菌、假单胞菌属细菌等中的载体的例子，可列举前述的pLA2917(ATCC37355)、pJRD215(ATCC37533)。另外，作为同源重组用的载体，可列举例如，pK18mobsacB(Schafer等，Gene145，69-73(1994))、pJQ200(Quandt,J.and Hynes,M.P.，Gene(1993)17：15-21)。

编码上述的各酶的DNA向载体的插入可以使用基因工程学领域惯用的公知的基因重组技术。例如，为了将该DNA插入载体，可采用：首先，将经纯化的DNA用适当的限制性酶切断，插入到适当载体的限制性酶部位或多克隆位点而连接到载体的方法等。

重组时，优选在能够调节由被插入载体的DNA的各蛋白质的转录翻译的启动子的下游连接所述DNA。作为启动子，只要能够在宿主中调节基因的转录就不特别限制，可以作为控制编码与宿主细胞同种或异种的任一蛋白质的基因的表达的DNA序列获得。例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可列举lac启动子、trp启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子。另外，也可以利用钩虫贪铜菌的phb操纵子的启动子区域。在使用氢细菌作为宿主的情况下，可列举该细菌来源的phaC1基因启动子、该细菌来源的phaP1基因启动子。在使用棒形细菌作为宿主的情况下，可列举例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的细胞表层蛋白质基因启动子。在使用酵母作为宿主的情况下，可列举例如，gal1启动子、gal10启动子。在使用假单胞菌属细菌作为本发明的微生物的情况下，可以使用包含phaC1Ps基因上游、phbCABRe操纵子上游的启动子的区域。

载体中也可以根据需要包含能够在要导入所述DNA的微生物中能够利用的终止子序列、增强子序列、剪接信号序列、多聚A添加信号序列、核糖体结合序列(SD序列)等除启动子以外的控制表达的序列。另外除了该序列以外也可以包含诱导表达的序列。作为该序列，可列举能够通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导配置在下游的基因的表达的乳糖操纵子。

载体可以根据需要包含选择标志物基因。选择标志物基因可以根据所转化的微生物细胞的选择方法来适宜选择，可列举例如，氨苄青霉素耐性基因、四环素耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、氯霉素耐性基因等药剂耐性基因；参与氨基酸、核酸等营养素的细胞内生物合成的基因(辅助营养要求性的基因)；萤光素酶等参与化学发光的基因；编码GFP等荧光蛋白质的基因。

载体中可以将编码本发明所涉及的酶(CoA转移酶、聚合酶)的DNA 1种1种地插入，另外也可以将多种DNA插入1个载体。在载体中插入多种DNA的情况下，如果在一个载体插入多种DNA，则优选这些DNA形成操纵子。这里所谓“操纵子”是在同一启动子的控制下转录出的由1个或多个基因构成的核酸序列单元。

上述DNA、或插入有该DNA的载体可以使用公知的手法导入微生物中。作为对微生物的DNA导入方法，可列举例如，氯化钙法、热休克法、磷酸钙法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、接合转染法、使用钙离子的方法。

(培养基等的培养条件)

在本发明中，通过将前述的微生物用包含羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)的培养基进行培养，从而能够制造本发明的共聚物。

培养基只要能够供应充分浓度的碳源就不特别限定，但可以包含作为除了碳源以外的营养源的氮源、无机盐类、其他有机营养源。

作为碳源，只要上述的微生物能够同化就任何碳源都可以使用，优选列举葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类；棕榈油、棕榈仁油、玉米油、椰子油、橄榄油、大豆油、菜籽油、麻风树油等油脂、其分级油类；月桂酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等脂肪酸或它们的衍生物等。

作为氮源，可列举例如，氨；氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐；胨、肉膏、酵母提取物等。作为无机盐类，可列举例如，磷酸2氢钾、磷酸氢2钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。作为其他有机营养源，可列举例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸；维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素等。

作为本发明所涉及的培养基的例子，在培养大肠杆菌等的情况下，可列举LB培养基(含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠)，但不限于这些。另外，在使用天然的PHA生产菌(例如，氢细菌、恶臭假单孢菌)作为宿主的情况下，可列举氮源限制无机盐培养基(例如，含有9g/L Na₂HPO₄，1.5g/L KH₂PO₄，0.5g/L NH₄Cl，0.2mg/L MgSO₄，微量元素(trace element))、磷源限制无机盐培养基(例如，葡萄糖1g/L，KNO₃ 0.5g/L，MgSO₄(7H₂0)0.2g/L，CaC1₂ 0.1g/L，NaC1 0.1g/L，在其中加入8.0mg K₂HPO₄和2.0mg KH₂P0₄，将pH调整为7)，但不限于这些。

添加于培养基的羟基羧酸如上所述，但既可以是R型异构体，也可以是外消旋的，但优选为R型异构体。另外可以根据培养基的最适pH而调整(中和等)pH之后添加，也可以以盐的形态添加。作为该盐，可列举钠盐、钾盐、铵盐等。作为对培养基的添加量，只要是适合共聚合成的浓度即可，另外也可以为了控制依赖于浓度而合成的共聚中的单体组成而适宜调整，例如为1～10g/L。

另外，如后述的实施例所示，即使培养基中不包含羟基羧酸(A)和羟基羧酸(B)本身，只要是能够生物合成该羟基羧酸的微生物，也可以通过使用它们的代谢前体(代谢的起始物质等)来制造本发明的共聚物。

因此，本发明也可以说成是一种方法，包括：

将表达CoA转移酶和聚合酶的微生物用包含羟基羧酸(A)和/或其代谢前体、和羟基羧酸(B)和/或其代谢前体的培养基进行培养的工序、工序2：由通过所述工序得到的培养物回收所述共聚物的工序。

作为本发明所涉及的代谢前体，只要是通过微生物中的代谢途径能最终转换成本发明所涉及的羟基羧酸的物质，就不特别限制，可列举例如，在羟基羧酸(A)是2HB的情况下，可列举葡萄糖、苏氨酸、2-酮丁酸等。例如，在羟基羧酸(B)是3HB的情况下，可列举葡萄糖、丙酮酸、乙酰CoA、乙酰乙酰CoA等。例如，在羟基羧酸(B)是3HV的情况下，可列举2HB、2-氧代丁酸、苏氨酸、丙酸、丙酸-IP、丙酸-CoA、3-酮戊酰-CoA等(请参照图5A等)。

作为培养上述的微生物时的条件，除了前述的培养基之外，培养温度只要在所使用的微生物能够生长繁殖的范围、各酶活性能够发挥的范围就不特别限制，通常为25～37℃、优选为28～32℃、特别优选为30℃。另外根据所使用的微生物的种类，可以适宜选择需氧的条件、厌氧的条件，但从更容易促进共聚物合成这样的观点考虑，优选为需氧的条件。作为培养时间，可以根据共聚物的生产量等适宜调整，但通常为12小时～1周、优选为1～3天。

(共聚物的回收等)

在本发明中，从培养上述的微生物而得的培养物回收本发明的共聚物。其中所谓“培养物”，不仅包含将微生物用培养基进行培养而得的、增殖了的该微生物，还包含含有该微生物的分泌产物和代谢产物等的培养基、它们的稀释物、浓缩物。

作为从这样的培养物回收共聚物的回收方法，不特别限定，但例如，可以通过如下方法进行。培养结束后，从培养基通过离心分离处理等分离微生物，将该微生物用蒸馏水和甲醇等洗涤，使其干燥(例如，冷冻干燥)。将该干燥菌体使用氯仿等有机溶剂进行加热处理，从而提取共聚物。由包含该共聚物的有机溶剂溶液通过过滤等除去菌体成分，在其滤液中加入甲醇、己烷等贫溶剂而使共聚物沉淀。进而，通过过滤、离心分离除去上清液，使其干燥而回收共聚物。

另外，这样得到的共聚物如后述的实施例所示，可以使用核磁共振法(NMR)、凝胶渗透色谱、气相色谱法等公知的分析方法确认其平均分子量、单体组成、结构等。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。另外实施例使用下述方法进行。

(实施例1)

＜P(2HB-b-(3HB-ran-3HHx))的制备方法＞

制备在pBluescript KS+质粒中依次插入了C.nector的phb操纵子的启动子区域、PhaC_AR基因、埃氏巨型球菌来源的pct基因、恶臭假单孢菌KT2440来源的AlkK基因的质粒(pBSPreCARpctAlkK)。此外，在pBSP_RephaC(AR)pct(参照非专利文献2)中，在所述pct基因的下游通过常规方法插入所述AlkK基因而制成。然后，将该质粒用氯化钙法导入大肠杆菌(JM109株)中，获得转化体。

将该转化体用含有(R,S)-2HB-Na 1～10g/mL、(R,S)-3HB-Na 1～10g/mL和(R,S)-3HHx-Na 1～10g/mL的LB培养基在30℃振荡培养48小时。

将由所得的培养液回收的大肠杆菌冷冻干燥，进行氯仿加热处理，从而回收聚合物(请参照Taguchi,S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.2008，105(45)，17323-17327所记载的回收方法)。

＜P(2HB-b-(3HB-ran-3HHx))的结构分析＞

将(R,S)-2HB-Na、(R,S)-3HB-Na、和(R,S)-3HHx-Na分别以2.5g/mL添加到LB培养基中，使所得的聚合物溶解在氘代氯仿中，然后通过进行¹H NMR测定，计算出组成和mol分率。其结果如图1A所示，由于仅能观察到一个来源于2HB的5ppm信号，因而表明P(2HB)链段存在。

另外，将同一样品进一步供于¹³C NMR测定。其结果如图1B所示，可知由于3HHx彼此的连锁强度弱，因而不存在P(3HHx)均聚链段、即包含3HHx单元的结构是无规排列。

由以上表明，上述所得的聚合物是由P(2HB)均聚物链段、与P(3HB-ran-3HHx)无规链段构成的嵌段共聚物。

＜P(2HB-b-(3HB-ran-3HHx))的物性分析＞

将聚合物100mg左右溶解于氯仿中，在玻璃培养皿中使溶剂挥发，从而制成溶剂浇铸膜。由所得的圆形的膜切下试验片，通过供于拉伸试验，计算出断裂伸长率(拉伸性)、拉伸强度等参数。

由图1C所示的结果表明那样，与非专利文献2所公开的二元共聚物P(2HB-b-3HB)相比，这次获得的三元共聚物P(2HB-b-(3HB-ran-3HHx))显示高的拉伸性。特别三元共聚物显示超过1200％的非常高的拉伸性。由这些结果也提示，根据本发明，通过这样控制单体的排列、进而控制高级结构，能获得显示变形与应力成比例的弹性体物性的共聚物。

(实施例2)

＜P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的制备方法＞

与实施例1同样地，将pBSPreCARpctAlkK通过氯化钙法导入大肠杆菌(JM109株)，获得转化体。

另外，制备代替编码PhaC_AR的质粒DNA，导入了编码PhaC1_PsSTQK的质粒DNA的转化体。此外，该质粒在pBSPreCARpctAlkK中，通过常规方法，代替PhaC_AR基因而替换成PhaC1_PsSTQK基因，从而制成。

然后，将这些转化体用含有(R,S)-GL-Na 0～12g/L和(R,S)-3HB-Na 5g/L的LB培养基在30℃振荡培养48小时，由所得的培养液与实施例1所记载的方法同样地回收聚合物。

＜P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的分析＞

通过将培养后的菌体冷冻干燥，进行氯仿提取，从而提取细胞内的聚合物。将滤出菌体后的氯仿溶液浓缩后，加入过量的甲醇使聚合物。使回收的聚合物溶解于氘代氯仿，进行¹H NMR测定。将所得的结果示于图2A和2B。此外，这些图显示对使用含有(R,S)-GL-Na12g/L和(R,S)-3HB-Na 5g/L的LB培养基而得的聚合物进行分析而得的结果。另外，基于峰强度计算出单体组成。将所得的结果示于表1。

表1

＜对于P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的凝胶过滤色谱(GPC)分析＞

通过将培养后的菌体冷冻干燥，进行氯仿提取，从而提取细胞内的聚合物。然后，在分析时，使用PTFE膜进行过滤，供于以氯仿作为移动相的GPC分析。将所得的结果示于图2C。此外，该图显示使用含有(R,S)-GL-Na 12g/L和(R,S)-3HB-Na 5g/L的LB培养基分析所得的聚合物而得的结果。

上述NMR分析的结果在图2A和2B中，在4.5～4.9ppm观察到的4个峰是归属于GL单元的信号，最低磁场侧(左侧)的峰对应于3HB所夹的GL单元(3HB-GL-3HB)。在GL分率为20mol％左右的无规共聚物的情况下，预测3HB-GL-3HB的信号被强烈地观测到。

由以上判定，使用PhaC1_PsSTQK而得的聚合物是无规共聚物(P(GL-ran-3HB))(参照图2A)。另一方面，使用PhaC_AR而得的聚合物强烈地观测到GL-GL-GL的信号，可知包含GL密度高的结构。由4个峰的相对强度比推定GL分率为约70mol％，由于这与聚合物全体的GL分率约20mol％大不相同，因而可知本聚合物具有无规-嵌段结构(P(3HB-b-(GL-ran-3HB)))。

另外，在上述凝胶过滤色谱分析中，在聚合物是二种以上的混合物(例如，与P(3HB)的共聚物)的情况下，观测到多个分子量分布。然而，关于使用PhaC_AR而得的聚合物，如图2C所示，观察到单峰性的峰，支持了该聚合物在同一分子内具有序列结构。

这样，使用PhaC_AR而得的聚合物包含P(3HB)均聚物链段和P(GL-ran-3HB)无规共聚物链段，具有在到目前为止的生物合成PHA中完全没有合成例的、在同一分子链内组成大不相同的序列结构。

这样的聚合物具有具有2个优点。第一个是由于制成在同一分子内物性不同的多个聚合物连接而成的结构，因而有时能够实现起因于其结构的新材料的创制。第二个是由于包含大量的GL单元的连锁，因而非酶水解性提高(参照Matsumoto K.et al.，ACSBiomaterials Science&Engineering，3(12)3058，2017)。

(实施例3)

＜P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的制备方法＞

将pBSPreCARpctAlkK通过氯化钙法导入大肠杆菌(JM109株)，得到转化体。将该转化体用含有(R,S)-GL-Na 2.5～5g/L、(R,S)-3HB-Na 0～2.5g/L和(R,S)-3HHx-Na 1g/L的LB培养基在30℃振荡培养48小时，从所得的培养液通过与实施例1所记载的同样的方法回收聚合物。

＜P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的分析＞

与上述＜P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的分析＞所记载的方法同样地，进行¹H NMR测定。将所得的结果示于图3A。此外，该图是使用含有(R,S)-GL-Na 5g/L、(R,S)-3HB-Na2.5g/L和(R,S)-3HHx-Na 1g/L的LB培养基分析所得的聚合物而得的结果，是将GL单元的信号扩大而得的。另外，由峰面积值计算出单体组成。所得的结果示于表2。

表2

＜对于P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的差示扫描量热测定(DSC)＞

通过将聚合物溶解于氯仿，在玻璃培养皿中使溶剂挥发，从而制作溶剂浇铸膜。由所得的膜切下数毫克的试验片，封入铝盘，从而制成样品。将本样品供于DSC分析。DSC分析进行从-50℃到220℃的升温，判断伴随结晶熔解的吸热峰的有无。所得的结果示于图3B。

如表2所示，根据本发明，表明能够合成包含GL、3HB和3HHx的3元共聚物。另外，在这样得到的3元共聚物中，3HHx能够上升到60mol％。这是为了给聚合物物性付与柔软性而充分的比例。另外，GL分率能够上升到30mo％左右，为了改变材料物性的目的而能够实现充分的GL单元分率。

另外，如图3A所示，在上述NMR分析结果中放大GL单元的信号，结果基于观测到的4个信号的相对强度，表明所得的本聚合物具有梯度结构。因为在梯度结构中，分子的两端与中央部分分别具有不同的结构，因而采取接近三嵌段的结构。

进而，如图3B所示，在DSC分析中，完全没有观察到结晶熔解峰。由此显示，本聚合物采取结晶化度非常低的结构。

由以上的结果表明，本聚合物与实施例2所示的P(3HB-b-(GL-ran-3HB))同样地，包含GL分率高的内部结构。另一方面能够判断，3HB与3HHx单元彼此无规地聚合。因此，本聚合物具有在现有型的3HB、3HHx无规共聚物上补加了富GL区域的特殊结构(P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx)))。

＜P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的物性分析＞

将聚合物溶解于氯仿，在玻璃培养皿中使溶剂挥发，从而制成溶剂浇铸膜。由所得的膜切下试验片供于拉伸试验。所得的结果示于图3C。

图3C所示的P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的拉伸试验结果由于斜率缓和，因而可知是柔软的物性。另外，可以稍微拉伸。这样，表明本聚合物可以通过导入软质性的3HHx单元，从而柔软性大幅提高。

另外，本聚合物通过导入GL单元，从而非酶水解性增加，例如，由于期待在生物体内的高的分解性，因而在医疗机器(例如，缝合线)等中是有用的。

(实施例4)

＜由P(2HB)均聚物链段与以3-羟基酸为主体的无规共聚物链段构成的嵌段共聚物的制备方法、和该嵌段共聚物的分析＞

如实施例1记载的那样，如果用添加了2HB、3HB和3HHx的培养基培养导入了质粒pBSPreCARpctAlkK的大肠杆菌JM109株，则得到由P(2HB)均聚物链段与P(3HB-ran-3HHx)无规链段构成的嵌段共聚物。

于是，在本实施例中，实施例1所记载的培养体系中，代替3HHx，使用分别添加了3-羟基丙酸(3HP)、4-羟基-2-甲基丁酸(4H2MB)、2,4-二羟基丁酸(24DHB)、5-羟基戊酸(5HV)或6-羟基己酸(6HHx)的钠盐各1.0g/L的LB培养基进行培养(30℃振荡培养48小时)，对于能否与实施例1同样地合成包含各个单体单元的共聚物进行了确认。将所得的结果示于图4A和4B。此外，图4A中显示与上述＜P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的分析＞所记载的方法同样地进行¹H NMR测定的结果。图4B中显示与上述＜对于P(3HB-b-(GL-co-3HB-co-3HHx))的差示扫描量热测定(DSC)＞同样地分析而得的结果。

如图4A所示，P(2HB)均聚物链段的存在通过¹H NMR测定被确认了。如果更具体地说明，则因为由任意聚合物都在5.1ppm附近观测到归属于2HB的次甲基的共振，所以显示P(2HB)链段存在。

另外，以3HB为主体的链段是无规共聚物，可以由熔点测定来确认。在图4B所例示的P(3HB-co-5HV)的示差热量测定的热分析图中，表示熔点的峰位置比P(3HB)的熔点(178℃)附近低。由此能够确认，5HV无规地共聚。此外，虽未图示，对于其他共聚物也得到同样的热分析图。

由以上的结果确认了，所得的聚合物中，新添加的单体前体成为与3HB单元的无规共聚物而被掺入，2HB成分作为P(2HB)均聚物链段而聚合。更具体地，确认了通过上述的培养条件，得到新的3元嵌段共聚物、P(2HB)-b-P(3HB-ran-3HP)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-4H2MB)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-24DHB)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-5HV)、P(2HB)-b-P(3HB-ran-6HHx)。

进而，本发明中，即使将加入培养基中的前体3HB替换成3HP，也与所述同样地，得到由P(2HB)均聚物链段、与以3-羟基酸为主体的链段的无规共聚物构成的嵌段共聚物。即，根据本发明，也能够得到P(2HB)-b-P(3HP-ran-4H2MB)、P(2HB)-b-P(3HP-ran-24DHB)、P(2HB)-b-P(3HP-ran-5HV)、P(2HB)-b-P(3HP-ran-6HHx)等。

另外，本发明中，这些聚合物的合成取决于聚合酶的性质，只要能够合成对应的单体的CoA体，就不挑选单体供应酶。

(实施例5)

＜由葡萄糖和2HB制备嵌段共聚物(P(2HB)-b-P(3HB-co-3HV))的制备方法＞

本发明者们考虑，如图5A所示，如果是具备以下所示的生物合成途径的微生物，则通过在葡萄糖和2HB的存在下进行培养，可能获得由P(2HB)均聚物链段与由3HB和3HV构成的链段的无规共聚物构成的嵌段共聚物(P(2HB)-b-P(3HB-co-3HV))。

＜生物合成途径＞

·2HB在HadA(CoA转移酶)的存在下被转换成2HB-CoA。

·在糖酵解系统中，由葡萄糖生成丙酮酸。由丙酮酸进而生成乙酰CoA，在PhaA存在下转换成乙酰乙酰CoA，进而在PhaB的存在下生物合成3HB-CoA(Journal ofBiotechnology，152(2011)，144-146)。

·2HB在LdhA(乳酸脱氢酶)的存在下被转换成2-氧代丁酸。由苏氨酸和2-氧代丁酸生成丙酸和2-羟基丁酸(Letters in Applied Microbiology，1997，25，371-374)。由丙酸，经过丙酸-IP，被转换成丙酸-CoA。丙酸-CoA和乙酰-CoA在PhaA的存在下被转换成3-酮戊酰-CoA，进而，在PhaB的存在下被转换成3HV-CoA(Journal of Biotechnology，152(2011)，144-146)。

＜富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)改变株的构建＞

如图5B所示，在作为富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)葡萄糖同化性改变株的R.eutrpha H16 NSDG-GG-ΔB1株(参照Zhang等，Microbial Cell Factories、volume18、Article number：147(2019))染色体上的pha操纵子中，将phaCNSDG(Aeromonas caviae来源改变型PHA合酶基因)通过同源重组替换成phaC_AR基因，构建PhaC_AR表达株H16CAR-GG-ΔB1。具体地，将包含目的片段的质粒pK18mobsacB衍生物介由具有接合转染能力的大肠杆菌S17-1株导入R.eutrpha中，以卡那霉素耐性为指标筛选在染色体DNA上的目的位置插入了phaCAR基因的株，接着利用pK18mobsacB所包含的sacB在蔗糖存在下的致死性，分离载体部分被除去的重组株。

进而，如图5C所示，在该改变株染色体上的phaP1(PHA颗粒结合蛋白质基因)下游插入艰难梭菌(Clostridium difficile)来源的ldhA(乳酸脱氢酶基因)和hadA(CoA转移酶基因)，构建能够在phaP启动子(PphaP，在PHA合成期转录活性增大)的控制下表达这些酶的H16CAR-GG-ΔB1-ldhAhadA。

＜R.eutropha改变株的培养和生物合成PHA的分析＞

将上述改变株(R.eutrpha H16 CAR-GG-ΔB1-ldhAhadA)在以葡萄糖为单一碳源的氮源限制无机盐培养基添加2HB-Na外消旋体(2HB)尝试培养，结果确认了通过2HB的添加而造成强的生长繁殖阻碍。对于该生长繁殖阻碍的回避进行了研究，发现缬氨酸或丙酮酸的添加是有效的。于是，在将2HB添加到培养基中的情况下，添加缬氨酸或丙酮酸、或这两方来进行培养。此外，氮源限制无机盐培养基的组成为水100ml中，Na₂HPO₄·12H₂O 0.9g、KH₂PO₄ 0.15g、NH₄Cl 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.02g、和微量元素溶液0.1ml。另外，添加到该培养基中的其他成分的最终浓度是葡萄糖2％(w/v)、2HB-Na 0.25％(w/v)、丙酮酸0.8％(w/v)、缬氨酸0.05％。

培养以使用了振荡烧瓶的100mL规模进行，在30℃以118strokes/min进行振荡培养。由120小时后的培养液通过离心分离回收菌体，冷冻干燥而获得干燥菌体。

关于菌体内蓄积的PHA的量和组成，将干燥菌体所包含的PHA进行了甲醇分解处理后，通过气相色谱(GC)进行分析。本方法是在PHA的分析中使用的最一般的方法(参照PNASNovember 11，2008 vol.105 no.45 17323～17327)，通过在酸性条件甲醇存在下将PHA溶液加热，从而能够将聚合物完全分解成有挥发性的单体衍生物，通过GC进行定量/定性分析。另外，与上述＜P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的分析＞和＜对于P(3HB-b-(GL-ran-3HB))的凝胶过滤色谱(GPC)分析＞中记载的方法同样地，通过由干燥菌体的氯仿提取和甲醇再沉淀获得纯化PHA，进行利用¹H-NMR的结构分析和利用GPC的分子量测定。

用包含葡萄糖2％(w/v)、2HB-Na 0.25％(w/v)、丙酮酸0.8％(w/v)、缬氨酸0.05％的氮源限制无机盐培养基培养H16 CAR-GG-ΔB1-ldhAhadA株，结果得到了2.24±0.00g/L的干燥菌体，PHA量为0.42±0.00g/L(PHA蓄积率18.92±0.20wt％)。在干燥菌体的PHA分析中，推测为由3HB与2HB(10.60±0.24mol％)组成的共聚物。

另外，所述¹H-NMR分析的结果如图5D所示，表明该聚合物除了3HB、2HB之外，还含有少量的3HV单元。进而，如图5D的“4.8～5.4ppm”所示，强烈提示是具有2HB的均聚链段的嵌段共聚物。

进而，综合利用GPC的分析结果，确定了其详细组成为P[(3HB-co-0.5mol％3HV)-block-8.3mol％2HB]。另外，数均分子量(Mn)＝3.71×10⁵、重均分子量(Mw)＝9.58×10⁵、多分散性指数(PDI)＝2.58。进而，能够估算平均聚合度为4,311，其中2HB链段的聚合度为358。

产业可利用性

如以上所说明的那样，根据本发明，能够提供具有均聚链段和共聚链段的嵌段共聚物。该嵌段共聚物兼有作为其构成的各聚合链段的特长，能够发挥各种物性。因此，在医疗等各种产业领域是有用的。另外，根据本发明，能够通过生物合成提供嵌段共聚物，因而也能够对环境问题解决做出贡献。

序列表

<110> 嵌段共聚物及其制造方法

<120> 国立大学法人北海道大学

<130> IBPF21-507WO

<150> JP2020-034109

<151> 2020-02-28

<160> 3

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 517

<212> PRT

<213> 埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)

<400> 1

Met Arg Lys Val Glu Ile Ile Thr Ala Glu Gln Ala Ala Gln Leu Val

1 5 10 15

Lys Asp Asn Asp Thr Ile Thr Ser Ile Gly Phe Val Ser Ser Ala His

20 25 30

Pro Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Glu Lys Arg Phe Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Thr Pro Gln Asn Leu Thr Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gln Gly Lys Arg

50 55 60

Asp Gly Arg Ala Ala Glu His Leu Ala His Thr Gly Leu Leu Lys Arg

65 70 75 80

Ala Ile Ile Gly His Trp Gln Thr Val Pro Ala Ile Gly Lys Leu Ala

85 90 95

Val Glu Asn Lys Ile Glu Ala Tyr Asn Phe Ser Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

His Trp Phe Arg Ala Leu Ala Gly His Lys Leu Gly Val Phe Thr Asp

115 120 125

Ile Gly Leu Glu Thr Phe Leu Asp Pro Arg Gln Leu Gly Gly Lys Leu

130 135 140

Asn Asp Val Thr Lys Glu Asp Leu Val Lys Leu Ile Glu Val Asp Gly

145 150 155 160

His Glu Gln Leu Phe Tyr Pro Thr Phe Pro Val Asn Val Ala Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Met Asp Glu Glu

180 185 190

Ile Gly Pro Phe Glu Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Val His Asn Cys

195 200 205

Gly Gly Lys Val Val Val Gln Val Lys Asp Val Val Ala His Gly Ser

210 215 220

Leu Asp Pro Arg Met Val Lys Ile Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val

225 230 235 240

Val Val Ala Ala Pro Glu Asp His Gln Gln Thr Tyr Asp Cys Glu Tyr

245 250 255

Asp Pro Ser Leu Ser Gly Glu His Arg Ala Pro Glu Gly Ala Ala Asp

260 265 270

Ala Ala Leu Pro Met Ser Ala Lys Lys Ile Ile Gly Arg Arg Gly Ala

275 280 285

Leu Glu Leu Thr Glu Asn Ala Val Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro

290 295 300

Glu Tyr Val Ala Ser Val Ala Gly Glu Glu Gly Ile Ala Asp Thr Ile

305 310 315 320

Thr Leu Thr Val Glu Gly Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Gln Gly Gly

325 330 335

Ala Arg Phe Gly Ser Ser Arg Asn Ala Asp Ala Ile Ile Asp His Thr

340 345 350

Tyr Gln Phe Asp Phe Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Ile Ala Tyr Leu

355 360 365

Gly Leu Ala Gln Cys Asp Gly Ser Gly Asn Ile Asn Val Ser Lys Phe

370 375 380

Gly Thr Asn Val Ala Gly Cys Gly Gly Phe Pro Asn Ile Ser Gln Gln

385 390 395 400

Thr Pro Asn Val Tyr Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys

405 410 415

Ile Ala Val Glu Asp Gly Lys Val Lys Ile Leu Gln Glu Gly Lys Ala

420 425 430

Lys Lys Phe Ile Lys Ala Val Asp Gln Ile Thr Phe Asn Gly Ser Tyr

435 440 445

Ala Ala Arg Asn Gly Lys His Val Leu Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val

450 455 460

Phe Glu Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Ile Glu Val Ala Pro Gly

465 470 475 480

Ile Asp Ile Glu Lys Asp Ile Leu Ala His Met Asp Phe Lys Pro Ile

485 490 495

Ile Asp Asn Pro Lys Leu Met Asp Ala Arg Leu Phe Gln Asp Gly Pro

500 505 510

Met Gly Leu Lys Lys

515

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)

<400> 2

Met Leu Gln Thr Arg Ile Ile Lys Pro Ala Glu Gly Ala Tyr Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Leu Leu Ile Lys Arg Leu Leu Met Ser Gly Ser Arg Tyr Glu Lys

20 25 30

Thr Arg Glu Ile Val Tyr Arg Asp Gln Met Arg Leu Thr Tyr Pro Gln

35 40 45

Leu Asn Glu Arg Ile Ala Arg Leu Ala Asn Val Leu Thr Glu Ala Gly

50 55 60

Val Lys Ala Gly Asp Thr Val Ala Val Met Asp Trp Asp Ser His Arg

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Cys Met Phe Ala Ile Pro Met Ile Gly Ala Val Val His

85 90 95

Thr Ile Asn Val Arg Leu Ser Pro Glu Gln Ile Leu Tyr Thr Met Asn

100 105 110

His Ala Glu Asp Arg Val Val Leu Val Asn Ser Asp Phe Val Gly Leu

115 120 125

Tyr Gln Ala Ile Ala Gly Gln Leu Thr Thr Val Asp Lys Thr Leu Leu

130 135 140

Leu Thr Asp Gly Pro Asp Lys Thr Ala Glu Leu Pro Gly Leu Val Gly

145 150 155 160

Glu Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Ala Ser Pro Arg Tyr Asp Phe Pro

165 170 175

Asp Phe Asp Glu Asn Ser Val Ala Thr Thr Phe Tyr Thr Thr Gly Thr

180 185 190

Thr Gly Asn Pro Lys Gly Val Tyr Phe Ser His Arg Gln Leu Val Leu

195 200 205

His Thr Leu Ala Glu Ala Ser Val Thr Gly Ser Ile Asp Ser Val Arg

210 215 220

Leu Leu Gly Ser Asn Asp Val Tyr Met Pro Ile Thr Pro Met Phe His

225 230 235 240

Val His Ala Trp Gly Ile Pro Tyr Ala Ala Thr Met Leu Gly Met Lys

245 250 255

Gln Val Tyr Pro Gly Arg Tyr Glu Pro Asp Met Leu Val Lys Leu Trp

260 265 270

Arg Glu Glu Lys Val Thr Phe Ser His Cys Val Pro Thr Ile Leu Gln

275 280 285

Met Leu Leu Asn Cys Pro Asn Ala Gln Gly Gln Asp Phe Gly Gly Trp

290 295 300

Lys Ile Ile Ile Gly Gly Ser Ser Leu Asn Arg Ser Leu Tyr Gln Ala

305 310 315 320

Ala Leu Ala Arg Gly Ile Gln Leu Thr Ala Ala Tyr Gly Met Ser Glu

325 330 335

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340 345 350

Gly Ser Glu Asp Glu Arg Val Thr Tyr Arg Ile Lys Ala Gly Val Pro

355 360 365

Val Pro Leu Val Glu Ala Ala Ile Val Asp Gly Glu Gly Asn Phe Leu

370 375 380

Pro Ala Asp Gly Glu Thr Gln Gly Glu Leu Val Leu Arg Ala Pro Trp

385 390 395 400

Leu Thr Met Gly Tyr Phe Lys Glu Pro Glu Lys Ser Glu Glu Leu Trp

405 410 415

Gln Gly Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Val Ala Thr Leu Asp Gly Met

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Gly Tyr Ile Asp Ile Arg Asp Arg Ile Lys Asp Val Ile Lys Thr Gly

435 440 445

Gly Glu Trp Val Ser Ser Leu Asp Leu Glu Asp Leu Ile Ser Arg His

450 455 460

Pro Ala Val Arg Glu Val Ala Val Val Gly Val Ala Asp Pro Gln Trp

465 470 475 480

Gly Glu Arg Pro Phe Ala Leu Leu Val Ala Arg Asp Gly His Asp Ile

485 490 495

Asp Ala Lys Ala Leu Lys Glu His Leu Lys Pro Phe Val Glu Gln Gly

500 505 510

His Ile Asn Lys Trp Ala Ile Pro Ser Gln Ile Ala Leu Val Thr Glu

515 520 525

Ile Pro Lys Thr Ser Val Gly Lys Leu Asp Lys Lys Arg Ile Arg Gln

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Asp Ile Val Gln Trp Gln Ala Ser Asn Ser Ala Phe Leu Ser Thr Leu

545 550 555 560

<210> 3

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PhaCAR

<400> 3

Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr

1 5 10 15

Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala

20 25 30

Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu

35 40 45

Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp

50 55 60

Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg

85 90 95

Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys

100 105 110

Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala

115 120 125

Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr

130 135 140

Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ala Asn Phe Leu Ala Thr Asn

145 150 155 160

Pro Glu Ala Gln Arg Leu Leu Ile Glu Ser Gly Gly Glu Ser Leu Arg

165 170 175

Ala Gly Val Arg Asn Met Met Glu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Ile Ser

180 185 190

Gln Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val Gly Arg Asn Val Ala Val Thr

195 200 205

Glu Gly Ala Val Val Phe Glu Asn Glu Tyr Phe Gln Leu Leu Gln Tyr

210 215 220

Lys Pro Leu Thr Asp Lys Val His Ala Arg Pro Leu Leu Met Val Pro

225 230 235 240

Pro Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Gln Pro Glu Ser Ser

245 250 255

Leu Val Arg His Val Val Glu Gln Gly His Thr Val Phe Leu Val Ser

260 265 270

Trp Arg Asn Pro Asp Ala Ser Met Ala Gly Ser Thr Trp Asp Asp Tyr

275 280 285

Ile Glu His Ala Ala Ile Arg Ala Ile Glu Val Ala Arg Asp Ile Ser

290 295 300

Gly Gln Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Phe Cys Val Gly Gly Thr Ile

305 310 315 320

Val Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly Glu His Pro Ala

325 330 335

Ala Ser Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asp Phe Ala Asp Thr Gly

340 345 350

Ile Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Gly His Val Gln Leu Arg Glu Ala

355 360 365

Thr Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro Cys Ala Leu Leu Arg Gly Leu

370 375 380

Glu Leu Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg Pro Asn Asp Leu Val Trp

385 390 395 400

Asn Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Thr Pro Val Pro Phe

405 410 415

Asp Leu Leu Phe Trp Asn Gly Asp Ala Thr Asn Leu Pro Gly Pro Trp

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435 440 445

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465 470 475 480

Trp Thr Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ala Asn Lys Leu Arg

485 490 495

Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala Gly Val Ile Asn Pro Pro

500 505 510

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515 520 525

Pro Gln Gln Trp Leu Ala Gly Ala Ile Glu His His Gly Ser Trp Trp

530 535 540

Pro Asp Trp Thr Ala Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly Ala Lys Arg Ala

545 550 555 560

Ala Pro Ala Asn Tyr Gly Asn Ala Arg Tyr Arg Ala Ile Glu Pro Ala

565 570 575

Pro Gly Arg Tyr Val Lys Ala Lys Ala

580 585

Claims

1.一种共聚物，包含仅在2位具有羟基的羟基羧酸(A)、和在2位以外的部位具有羟基的羟基羧酸(B)，且具有均聚链段和共聚链段，

2.根据权利要求1所述的共聚物，羟基羧酸(A)是选自2-羟基丁酸、2-羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-羟基戊酸、2-羟基己酸和中链2-羟基烷酸中的至少1种羟基羧酸，

3.根据权利要求1所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基丁酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸和3-羟基己酸，且，

4.根据权利要求1所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基乙酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸，且

5.根据权利要求1所述的共聚物，羟基羧酸(A)是2-羟基乙酸，羟基羧酸(B)是3-羟基丁酸和3-羟基己酸，且，

6.权利要求1～5中的任一项所述的共聚物的制造方法，该方法包括：

将表达CoA转移酶和聚合酶的微生物，利用包含羟基羧酸(A)和/或其代谢前体、和羟基羧酸(B)和/或其代谢前体的培养基进行培养的工序，和由通过所述工序得到的培养物回收所述共聚物的工序。