CN115144590B - Arc作为肝癌诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种ARC作为肝癌诊断标志物的应用。检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂在制备用于肝癌的诊断和/或预后分析的产品中的应用，该用于诊断肝癌的新标志物含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子(ARC)，能够有效提高对早期肝癌的检出率，且能提高对肝癌的诊断特异性和预后准确性。

Description

ARC作为肝癌诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及医学诊断学领域，特别是涉及一种ARC作为肝癌诊断标志物的应用。
背景技术
肝癌发病凶猛，恶性程度高，进展快，是世界上发病率位居第五、死亡率位居第二的常见癌症。肝癌的主要类型是肝细胞型肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其占原发性肝癌的90％以上。HCC患者的预后取决于疾病的分期及早期诊断。据报道，早期HCC患者的5年生存率达75％，而晚期肝癌患者的1年生存率低于10％，这说明了早期诊断的重要性。
目前，HCC的临床筛查主要依靠超声检查，然而超声对早期HCC的诊断性能较差，敏感性低，其他成像方式如计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)对HCC筛查的价值同样有限，而且费用高昂，并有辐射暴露风险。
因此，在血清、组织或其他体液中寻找生物标志物以对肝癌进行筛查、预测预后或检测疾病进程是重要的方向。甲胎蛋白(AFP)是在HCC的诊断和预后中应用最广泛生物标志物，但大多数小肝癌(亚临床肝癌或早期肝癌)不分泌AFP。事实上，如果肿瘤直径小于3厘米，AFP敏感性会下降到25％。另外，在非HCC患者中也观察到了AFP的增加，这也提示AFP对HCC的特异性较差。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子(Apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)的试剂在制备用于肝癌的诊断和/或预后分析的产品中的应用，以改善传统肝癌的诊断方法的特异性较差的问题。
此外，还提供一种用于肝癌的诊断和/或预后分析的试剂盒。
检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂在制备用于肝癌的诊断和/或预后分析的产品中的应用。
上述用于诊断肝癌的新标志物含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子(ARC)，能够有效提高对早期肝癌的检出率，且能提高对肝癌的诊断特异性和预后准确性。
在其中一个实施例中，所述试剂能够定量检测所述细胞凋亡抑制因子。
在其中一个实施例中，所述试剂包括所述细胞凋亡抑制因子的特异性结合剂。
在其中一个实施例中，所述特异性结合剂包括特异性抗体。
在其中一个实施例中，所述特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
在其中一个实施例中，所述特异性结合剂具有用于指示信号强度的标记。
在其中一个实施例中，所述用于指示信号强度的标记包括荧光基团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金和酶中的任一种或多种。
在其中一个实施例中，所述产品包括通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法、组织芯片或质谱法进行蛋白水平检测的试剂。
在其中一个实施例中，检测的样本包括组织样本或血液样本。
一种用于肝癌的诊断和/或预后分析的试剂盒，包括上述任一实施例所述的应用中定义的试剂。
附图说明
图1为实施例1中小鼠心肌组织、人正常肝组织和人肝癌组织的ARC表达量免疫印迹示意图；
图2为实施例1中正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织的免疫组化染色示意图；
图3为实施例1中人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Huh7和人肝癌细胞株Hep3B的ARC表达量免疫印迹示意图；
图4为实施例2中阴性对照以及ARC免疫组化染色评分分别为0分、2分、4分、6分、8分、10分和12分对应的组织染色结果代表图；
图5为实施例2中组织芯片上的肝癌组织和癌旁组织的ARC免疫组化染色结果评分统计图；
图6为实施例2中组织芯片上的男性和女性的ARC免疫组化染色结果评分统计图；
图7为实施例2中组织芯片上的60岁以上的患者组织样本和小于60岁的患者组织样本的ARC免疫组化染色结果评分统计图；
图8为实施例2中组织芯片上的体力状态(PS)评分为1分和2分的患者样本与体力状态(PS)评分为3分的患者样本的ARC染色结果评分统计图；
图9为实施例2中组织芯片上的肝性脑病分级为I-II级的患者样本与肝性脑病分级为II-III级的患者样本的ARC免疫组化染色结果评分统计图；
图10为实施例2中根据ARC免疫组化染色评分分为高表达和低表达的患者的生存曲线；
图11为实施例3中不表达ARC的肝癌细胞株JHH2和表达ARC的肝癌细胞株Huh7的ARC免疫印迹结果图；
图12为实施例3中ARC验证为阴性的肝癌细胞和ARC验证为阳性的肝癌细胞分别进行化疗药物5-FU干预后的碘化丙啶(PI)染色图；
图13为实施例3中采用siRNA沉默技术对体外培养的肝癌细胞株Huh7进行ARC表达抑制的和对照组的细胞的ARC免疫印迹结果图；
图14为实施例3中肝癌细胞株Huh7和经过ARC表达抑制的肝癌细胞株Huh7分别进行化疗药物5-FU干预前后的LDH释放统计图；
图15为实施例4中分别移植了Hepa1-6(小鼠肝癌细胞系)和移植了敲除了ARC基因的Hepa1-6的小鼠采用化疗药物5-FU按40mg/kg治疗26天的肿瘤体积统计图；
图16为实施例5中分别采用DMEM培养液和肝癌细胞条件培养液培养人肝细胞株L-02后的细胞ARC免疫印迹结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所述的“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。所述的“诊断”包括辅助诊断、癌变风险和癌变程度的评估等方面。所述的“预后分析”包括肿瘤预后判断、肿瘤进展预判、复发风险评估和用药分析等方面。
本申请一实施方式提供了一种检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂在制备用于肝癌的诊断和/或预后分析的产品中的应用。
上述用于诊断肝癌的新标志物含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子(ARC)，能够有效提高对早期肝癌的检出率，且能提高对肝癌的诊断特异性和预后准确性。
具体地，含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子(ARC)是由NOL3基因编码，NOL3基因在NCBI数据库中Gene ID为8996。
在其中一个实施例中，上述试剂能够定量检测上述细胞凋亡抑制因子。
在其中一个实施例中，上述试剂包括上述细胞凋亡抑制因子的特异性结合剂。可选地，蛋白的结合剂包括但不限于是肽、肽模拟物、核酸适配体(aptamer)、spiegelmer、DARPin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体或单价抗体片段。
进一步地，上述特异性结合剂包括特异性抗体。更进一步地，上述特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
在其中一个实施例中，上述特异性结合剂具有用于指示信号强度的标记。
在其中一个实施例中，上述用于指示信号强度的标记包括荧光基团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金和酶中的任一种或多种。
进一步地，上述用于指示信号强度的标记包括但不限于：产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物(如吖啶酯或其衍生物)和染料；具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团；可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。
在其中一个实施例中，上述产品包括通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法、组织芯片或质谱法进行蛋白水平检测的试剂。
可以理解的是，ARC也可以在RNA水平进行检测。在其他一些实施例中，上述产品可以包括通过PCR、Northern blot或RNA芯片进行RNA水平检测的试剂。
在其中一个实施例中，检测的样本包括组织样本或血液样本。
在其中一个实施例中，组织样本通过穿刺法取样。
在其中一个实施例中，在检测血液样本中ARC含量时检测血液样本中外泌体中ARC的含量。具体地，肿瘤会分泌外泌体至血液中，直接检测血液中的外泌体的ARC含量为无创ARC蛋白检测，是体外诊断的发展方向。
本申请一实施方式还提供了一种用于肝癌的诊断和/或预后分析的试剂盒，包括上述任一实施例所述的应用中定义的试剂。
在一个可选的具体示例中，上述试剂盒包括封闭液、显色剂以及洗涤缓冲液中的至少一种。进一步地，封闭液、显色剂以及洗涤缓冲液可以工作浓度的形式包装于试剂盒中，也可以它们的浓缩母液的形式被包装(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液)。
本申请一实施方式还提供了一种用于肝癌的诊断和/或预后分析的方法，该方法包括：使用如上述任一实施例所述的检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂或用于肝癌的诊断和/或预后分析的试剂盒检测待测样本中ARC；根据ARC的有无或含量多少对肝癌进行诊断和/或预后分析。
在其中一个实施例中，待测样本包括组织样本或血液样本。
上述检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂，以及用于肝癌的诊断和/或预后分析的试剂盒，能够检测出样本中的ARC，从而使得能根据ARC的有无或含量对肝癌进行诊断和/或预后分析，提高肝癌的早期检出率，对肝癌患者是否能使用化疗药物能够做出预测，以指导对肝癌患者的治疗方案，同时为肝癌的治疗方法提供新的方向。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
ARC在正常肝脏中不表达，而出现于肝癌细胞和肝癌组织中
(1)收集小鼠心肌组织、人正常肝组织和人肝癌组织样本，提取样本的蛋白，以小鼠心肌组织蛋白为阳性对照，利用免疫印迹法对蛋白进行分析(ARC抗体：Cat:2081，ProSciInc.)，结果如图1所示。图1为小鼠心肌组织、人正常肝组织和人肝癌组织的ARC表达量免疫印迹示意图。从图1中可以看出，作为阳性对照，小鼠心肌组织的ARC条带明显；人肝癌组织的ARC条带大小接近于小鼠心肌组织，而人正常肝组织蛋白未出现ARC条带。
(2)利用具有完整病理资料和临床分期的肝癌组织芯片(上海芯超公司，HlivH180Su18，包括90例肝癌组织以及配对的癌旁组织)进行免疫组织化学染色分析，免疫组化染色采用试剂盒(康为世纪(CWBIO)，货号：CW2035S)进行，具体步骤为：
a.组织芯片二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；
b.采用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复15min；
c.过氧化物酶阻断剂(试剂A)孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性；
d.驴血清(试剂B)封闭10min；
e.ARC抗体(1：200稀释)4℃孵育过夜；
f.生物素标记的二抗(试剂C)室温孵育30min；
g.链霉素抗生物素-过氧化物酶(试剂D)室温反应10min；
h.DAB溶液显色，成熟苏木素复染5min，1％(v/v)盐酸乙醇分色3s，流水返蓝15min；
i.梯度乙醇依次脱水，二甲苯透明5min，中性树胶封片保存，显微镜下明场拍照。
结果代表如图2所示。图2为正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织的免疫组化染色示意图。图2显示肝癌组织表达ARC，而正常肝组织和癌旁组织都不表达ARC。
(3)体外培养人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Huh7和人肝癌细胞株Hep3B，收集各细胞株样本并提取蛋白，利用免疫印迹法对蛋白进行分析，结果如图3所示。图3为人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Huh7和人肝癌细胞株Hep3B的ARC表达量免疫印迹示意图。从图3可知，体外培养的人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株Huh7和人肝癌细胞株Hep3B这三种肝癌细胞株均表达ARC。
以上结果表明肝癌细胞表达ARC，而正常细胞不表达ARC，说明ARC表达与否是区分肝癌组织和正常组织的一个标志物。
实施例2
ARC在肝癌组织中的差异表达与临床资料的相关性分析
(1)利用具有完整病理资料和临床分期的肝癌组织芯片(上海芯超公司，HlivH180Su18，包括90例肝癌组织以及配对的癌旁组织)采用双盲法对ARC进行免疫组织化学染色分析，免疫组化染色具体步骤为：
a.组织芯片二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；
b.采用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复15min；
c.过氧化物酶阻断剂(试剂A)孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性；
d.驴血清(试剂B)封闭10min；
e.ARC抗体(1：200稀释)4℃孵育过夜；
f.生物素标记的二抗(试剂C)室温孵育30min；
g.链霉素抗生物素-过氧化物酶(试剂D)室温反应10min；
h.DAB溶液显色，成熟苏木素复染5min，1％(v/v)盐酸乙醇分色3s，流水返蓝15min；
i.梯度乙醇依次脱水，二甲苯透明5min，中性树胶封片保存，显微镜下明场拍照；
j.对染色结果进行评分：以染色强度和阳性细胞数比例综合计分，即积分法计算结果。每张切片随机选取某类细胞至少10个视野，至少1000个细胞进行评分。染色强度根据染色深浅与背景着色对比，以多数细胞呈现的染色特性计分：无着色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。阳性细胞比例：无着色为0分；<25％计为1分；25％～50％计为2分；50％～75％计为3分，超过75％计为4分。染色强度和阳性细胞比例两者相乘得到最终评分，0分～6分为低表达，大于6分为高表达。阴性对照、0分、2分、4分、6分、8分、10分和12分对应的组织染色结果代表图如图4所示。
(2)根据以上组织芯片的病理信息和评分进行统计，结果如图5～图10所示。图5为组织芯片上的肝癌组织和癌旁组织的ARC免疫组化染色结果评分统计图；图5显示肝癌组织的免疫组化染色评分显著高于癌旁组织，说明肝癌组织的ARC表达水平高于癌旁组织。图6为组织芯片上的男性和女性的ARC免疫组化染色结果评分统计图；从图6中可看出男性和女性的组织样本ARC免疫组化染色结果评分无差异，说明ARC表达水平可能与性别无关。图7为组织芯片上的60岁以上的患者组织样本和小于60岁的患者组织样本的ARC免疫组化染色结果评分统计图；图7显示60岁以上的患者组织样本和小于60岁的患者组织样本的ARC免疫组化染色评分无差异，说明ARC表达水平可能与年龄无关。图8为组织芯片上的体力状态(PS)评分为1分和2分的患者样本与体力状态(PS)评分为3分的患者样本的ARC染色结果评分统计图；图8显示PS评分较高的患者样本的ARC染色结果评分显著高于PS评分较低的患者样本，说明患者的体力状态与ARC表达水平可能存在正相关关系；图9为组织芯片上的肝性脑病分级为I-II级的患者样本与肝性脑病分级为II-III级的患者样本的ARC免疫组化染色结果评分统计图；从图9可以看出，肝性脑病分级较高的患者的样本的ARC免疫组化染色结果评分显著高于肝性脑病分级较低的患者的样本，说明患者的肝性脑病分级与ARC表达水平可能存在正相关关系；图10为根据ARC免疫组化染色评分分为高表达和低表达的患者的生存曲线，图10显示，ARC高表达的患者与ARC低表达的患者的生存曲线存在显著差异，ARC低表达的患者的生存率较高。
以上结果说明肝癌组织的ARC表达水平可显著区分肝癌患者和非肝癌患者，且症状越严重的患者的ARC表达水平更高，ARC高表达的患者的生存率更低，也就是ARC高表达的患者的预后更差。
实施例3
表达ARC的肝癌细胞显著耐药，降低其表达有利于化疗药物发挥作用
体外培养构建的不表达ARC的肝癌细胞株JHH2和表达ARC的肝癌细胞株Huh7，提取细胞蛋白，利用免疫印迹法对蛋白进行分析验证，结果如图11所示。图11的结果证明，肝癌细胞株JHH2为ARC阴性，肝癌细胞株Huh7为ARC阳性。
体外构建步骤如下：细胞在含10％FBS的DMEM培养基(含有100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中，置于37℃含5％CO2孵育箱中培养，每2天～3天换液或传代一次。转染前24小时，以3×105细胞接种6孔板，转染步骤参照LipofectamineTM 2000说明书进行，每孔DNA用量为4μg，10μL LipofectamineTM2000，以不转染载体细胞组为对照，分别转染pEGFP空载体和pARC-EGFP融合载体，转染后培养24小时。
对体外培养的均带有EGFP的ARC验证为阴性的肝癌细胞和ARC验证为阳性的肝癌细胞分别进行化疗药物5-FU干预，后进行碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，观察细胞状态，结果如图12所示。图12显示，ARC阴性肝癌细胞对化疗药物5-FU高度敏感，5-FU引起大量细胞坏死样凋亡，而表达ARC的癌细胞对化疗药物5-FU抵抗，5-FU没有引起表达ARC的癌细胞的大量坏死。
采用siRNA沉默技术对体外培养的肝癌细胞株Huh7进行ARC表达抑制，提取细胞蛋白，利用免疫印迹法对蛋白进行分析验证ARC表达量，结果如图13所示。图13显示，与野生型肝癌细胞株相比，经过ARC表达抑制的癌细胞的ARC表达水平明显下降，说明siRNA沉默成功，该细胞可用于后续研究。
对上述体外培养的肝癌细胞株Huh7和经过ARC表达抑制的肝癌细胞株Huh7分别进行化疗药物5-FU干预，后进行LDH释放检测，统计LDH释放检测结果，如图14所示，ARC表达抑制的癌细胞经过化疗药物5-FU干预后的LDH释放显著上升，而表达ARC的癌细胞的LDH释放上升不明显，进一步说明了表达ARC的癌细胞对化疗药物5-FU抵抗。
实施例4
ARC基因敲除大大提高了肝癌组织对化疗药物的敏感性
选取Hepa1-6(小鼠肝癌细胞系)和敲除了ARC基因(ARC-KO)的Hepa1-6分别进行小鼠荷瘤实验，具体步骤为：Hepa1-6或者Hepa1-6 ARC-KO细胞胰酶消化后PBS重悬，计数后将细胞悬液调整至2*107个/ml备用。取20只C57BL/6小鼠随机分成两组，每组10只小鼠。以75％乙醇对小鼠腹部皮肤进行常规消毒,使用胰岛素针将100μl含有2×106个Hepa1-6或者Hepa1-6 ARC-KO细胞缓慢注射到腹部皮下，拔出针头，无菌棉签按压针孔30秒。每2天测量肿瘤大小并统计。在第14天、16天、18天和20天分别给予两组小鼠腹腔注射5-FU(40mg/kg)共4次。
小鼠肿瘤体积统计如图15所示，从图15中可以看出，从治疗第18天开始，移植了敲除ARC基因的Hepa1-6的小鼠的肿瘤体积显著小于移植了表达ARC基因的Hepa1-6的小鼠的肿瘤体积，说明在体内表达ARC的癌细胞同样对化疗药物5-FU抵抗。
以上结果说明表达ARC的肝癌患者可能对化疗药物5-FU不敏感。
实施例5
肿瘤微环境诱发正常人肝细胞株L-02ARC的表达
体外分别采用DMEM培养液和肝癌细胞条件培养液培养人肝细胞株L-02两至三天，后收集细胞，提取细胞中的蛋白，利用免疫印迹法对蛋白进行分析，结果如图16所示。其中，获得肝癌细胞条件培养液的具体步骤为：将肝癌细胞株Huh7培养于含10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃含5％CO2孵育箱中培养，待细胞长满瓶底后，收集培养瓶中的培养液。用0.22μm滤器过滤条件培养液去除细胞成分，-20℃储存备用。图16的结果显示，正常人肝细胞株L-02不表达ARC，但经过肝癌细胞条件培养液培养的人肝细胞株L-02表达ARC。
以上结果表明肝癌细胞条件培养液可以诱导正常肝脏细胞表达ARC，说明肿瘤微环境可能会进一步诱发其他正常肝脏细胞表达ARC，可能引起肝癌的进一步发展，导致患者预后不佳。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (9)

1.检测含有半胱天冬酶招募结构域的细胞凋亡抑制因子的试剂在制备用于评估肝癌患者对5-FU敏感性的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂能够定量检测所述细胞凋亡抑制因子。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括所述细胞凋亡抑制因子的特异性结合剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性结合剂包括特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求4～5任一项所述的应用，其特征在于，所述特异性结合剂具有用于指示信号强度的标记。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于指示信号强度的标记包括荧光基团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金和酶中的任一种或多种。
8.根据权利要求1～2、4～5和7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法、组织芯片或质谱法进行蛋白水平检测的试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，检测的样本包括组织样本或血液样本。
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