CN115141281A - 干细胞冻干粉在制备药物或者化妆品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞冻干粉在制备药物或者化妆品中的用途。本发明提供了环氧合酶‑2(COX‑2)特异性结合的单克隆抗体和/或脐带间充质干细胞提取物冻干粉能够有效的抑制炎症因子IL‑1β和IL‑6的表达，增加皮肤表明SOD的表达提高对自由基的清除能力，抑制长期紫外线光照引起的皮肤中的炎性反应，从而治疗皮肤针对紫外线的损伤修复。具有较为广阔的应用前景。

Description

干细胞冻干粉在制备药物或者化妆品中的用途
技术领域
本申请涉及生物领域，具体的涉及干细胞提取物冻干粉在制备药物或者化妆品中的用途。
背景技术
皮肤光老化(skin photoaging)是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。表现为皮肤曝光部位粗糙、增厚、干燥，皮肤松弛、皱纹加深加粗，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张，甚至可能出现各种良性或恶性肿瘤(如日光角化病、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等)。
光老化好发于面部、颈部、前胸、后背与两上肢前臂。皮肤干燥、粗糙，有明显的皱纹，皮肤色素较重生黑色，这是由于长期紫外线照晒发生的不规则色素沉着加上光化性紫癜致使发生含铁血黄素的沉积。同时也可以发生日光性雀斑样痣。皮肤皱纹明显，皱纹面积很大，沟纹较深，形成铺路石样。面部出现毛细血管扩张也是皮肤光老化的一种常见临床表现，长期野外工作、风吹日晒刺激是其形成的主要原因之一。此外，皮肤长期受到强烈的日光照射，甚至有可能会出现各种良性或恶性肿瘤，如日光性角化病、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤等。
光老化与皮肤的炎症也有密切关系。在衰老进程中，我们的机体长期处于慢性促炎性反应进行性升高的状态，被称为“炎性衰老(inflamm-aging)。炎性衰老会因为炎性因子而促进色素生成。而氧化、紫外线、蓝光等因素又会刺激炎性因子促进黑色素合成增加，导致皮肤出现各种色素问题，直接引起皮肤不适。
目前针对光老化的治疗已有多种手段。其中针对炎症的治疗，采用间充质干细胞的治疗变得越来越重要。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)属于全能干细胞，主要来源于中胚层，在人体内主要分布于骨髓、脐带、脂肪等组织和器官间质中。在不同诱导条件下，它能够分化为脂肪、骨、软骨、等多种组织细胞。MSCs具有较强的多向分化潜能及自我更新和增殖的能力。此外，它还具有低免疫原性和免疫调节特性，在炎症环境中能抑制免疫系统，发挥抗炎作用。
MSCs对固有免疫细胞具有调节作用。固有免疫是生物在长期进化过程中逐渐形成的免疫功能，是机体抵御病原体入侵的第一道防线。机体内参与固有免疫反应的细胞主要包括树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)，以及巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞和γδT细胞等。MSCs可影响固有免疫细胞的增殖、凋亡、免疫功能和迁移能力进行免疫调节。DC是最重要的激活初始T细胞的抗原提呈细胞，MSCs与DC细胞接触后可通过影响其细胞形态、表型、刺激淋巴细胞增殖以及细胞因子分泌4个方面抑制DC的成熟。同时MSCs还可抑制多能造血干细胞向树突状细胞的分化。成熟DC与MSCs共培养后，抑制了DC表面提呈分子HLA-DR和CD1a、IL-12的分泌，共刺激分子CD83、CD80/86表达也显著下调。MSCs还能通过和DC细胞间的直接接触，上调IL-10的分泌，下调促炎性因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的产生。MSCs还可抑制NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-10等。另外，MSCs通过其表面的HLA-Ⅰ类分子下调NKG2D和NKp30相应配体PVR和ULBP的数量，以此来抑制NK细胞活化的功能。MSCs主要诱导巨噬细胞向M2型分化，上调IL-10的表达，并下调IL-12和TNF-α的表达，从而减轻炎症反应。MSCs也可分泌PGE2，下调巨噬细胞表面MHC-Ⅱ的表达，影响其抗原提呈功能。MSCs还能够抑制巨噬细胞的趋化能力，抑制巨噬细胞分泌MCP-1，从而减少巨噬细胞浸润。MSCs对中性粒细胞的保护作用，主要是削弱f-MLP诱导的呼吸爆发反应来实现。通过这种方式，使中性粒细胞的自发性凋亡延迟，过度氧化新陈代谢被抑制。目前，也有采用干细胞通过过抑制UVB辐射人皮肤角质细胞诱导炎症信号分子来防护皮肤治疗光老化。
此外，研究表明环氧合酶-2(COX-2)是花生四烯酸(AA)合成各种前列腺素(PGs)限速酶，参与人体炎症、肿瘤的发生，此外与许多病理过程密切相关。已发现COX-2在皮肤癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和乳腺肿瘤中过度表达。多种因素可以诱导COX-2的表达，UV辐照就是其中的因素之一。UV辐照下，COX-2表达增高，参与到炎症、细胞增殖、肿瘤的生长转移和新生血管生成等病理过程。通过干预UV导致的COX-2活性升高引起的皮肤炎症，发挥有效预防和/或治疗炎症的作用。但是目前，针对COX-2的抑制剂研究还不够多，种类也不够丰富，特别是具有较好作用的抑制剂还有待进一步的开发。
发明内容
本发明一方面提供了一种能够同时特异性结合人和鼠环氧合酶-2(COX-2)的单克隆抗体。
具体的，所述人和鼠环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体是COX-2-HM4E6。COX-2-HM4E6单克隆抗体识别的抗原表位为iedyvqhlsgyhfkl。
进一步的，COX-2-HM4E6单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示。
另一方面，本文提供了选自以下中的任何一种的抗体或抗原结合片段：
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约95％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约95％或更高同一性的序列。
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约90％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约90％或更高同一性的序列。
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约85％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约85％或更高同一性的序列。
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约80％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约80％或更高同一性的序列。
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约75％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约75％或更高同一性的序列。
包含如下VH和VL的抗体或其抗原结合片段，该VH与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的序列，并且该VL与SEQ ID NO:2具有至少约70％或更高同一性的序列。
术语“抗体”是指源自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。例如，天然存在的IgG抗体可以是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布着称为框架区(FR)的较保守的区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q))的结合。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼源化(camelised)抗体或嵌合抗体。这些抗体可以属于任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
进一步的，本发明还提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体在制备紫外线导致的皮肤炎症损伤的药物组合物中的用途。
进一步的，本发明还提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体在制备抗紫外线损伤的化妆品中的用途。
进一步的，本发明还提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体以及脐带血间充质干细胞提取物在制备紫外线导致的皮肤炎症损伤的药物组合物中的用途；脐带血间充质干细胞培养物是将培养的脐带血间充质干细胞上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，取滤液，即得脐带间充质干细胞提取物。
进一步的，所述脐带间充质干细胞提取物也可以市本领域其他的常规的脐带间充质干细胞提取物制备方法制备获得的。
进一步的，所述提取物进一步的制备为冻干粉剂型，所述冻干保护剂为海藻糖。
另一方面，本文提供了通过向受试者施用治疗有效量的以下各项来治疗对有需要的受试者的炎症的方法：本文所述的抗环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段；编码这种抗体或抗原结合片段的核酸或核酸组；包含编码这种抗体或抗原结合片段的核酸的运载体；包含这种核酸或核酸组或运载体的细胞；或包含这样的抗体或抗原结合片段、核酸或核酸组、运载体或细胞的药物组合物。在一些实施例中，将抗体或其抗原结合片段、核酸或核酸组、运载体、细胞或药物组合物通过静脉内、肿瘤内或皮下途径向受试者给予。
进一步的，本发明还提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体在制备抗紫外线损伤的化妆品中的用途。
进一步的，本发明还提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体以及脐带间充质干细胞提取物在制备抗紫外线的化妆品中的用途。
有益效果
本发明提供了环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体和/或脐带间充质干细胞提取物冻干粉能够有效的抑制炎症因子IL-1β和IL-6的表达，增加皮肤表明SOD的表达提高对自由基的清除能力，抑制长期紫外线光照引起的皮肤中的炎性反应，从而治疗皮肤针对紫外线的损伤修复。具有较为广阔的应用前景。
附图说明
图1单抗Weastern-blot检测结果图
图2单抗的抗原表位鉴定结果图
图3单抗对炎性因子IL-1β和IL-6表达影响结果图
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1COX-2单克隆抗体的制备
根据人和小鼠的COX-2蛋白的三维模型找寻关键活性结构域，筛选得到了在人和小鼠中具有99％一致性的保守且活性位点多肽片段，其分别为：
人COX-2多肽：favgqevfgl vpglmmyati wlrehnrvcd vlkqehpewg deqlfqtsrliligetikiv iedyvqhlsg yhfklkfdpe llfn。
小鼠COX-2多肽：favgqevfgl vpglmmyati wlrehnrvcd ilkqehpewg deqlfqtsrliligetikiv iedyvqhlsg yhfklkfdpe llfn。
将二者通过人工合成(委托国肽生物科技)，将人COX-2多肽与BSA偶联，作为免疫原备用。
采用皮下多点注射法免疫BALB/c小鼠(注射剂量150ug/只，初次免疫加完全佐剂，其后每两周加弗式不完全佐剂进行加强免疫，共3次，剂量为200ug/只)，选出小鼠血清效价最高的小鼠，于融合前3天用150ug/只冲击免疫一次。处死小鼠，取其脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按照6:1的比例在50％的PEG4000作用下融合，通过人COX-2多肽和小鼠COX-2多肽进行双向正筛，以重组人COX1(abcam，ab198643)作为反筛，筛选获得能够同时结合人COX-2多肽和小鼠COX-2多肽但是不能与人COX1结合的特异性的杂交瘤细胞株共5株，通过3次亚克隆，选择阳性最强的2株单克隆抗体COX-2-HM3C3和COX-2-HM4E6进行小鼠腹水的制备。
将BALB/c小鼠用石蜡油进行预处理，1周后腹腔注射杂交瘤细胞(1x1O6个细胞/只)，约1O天后抽取腹水，用饱和硫酸铵沉淀抗体并采用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中抗体，SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体的显示2个抗体均在约55和约25KDa处有2条条带，无其他杂带，表明抗体纯化效果较好。
SDS-PAGE及Weastern-blot检测抗体的特异性：将人皮肤成纤维细胞和小鼠皮肤成纤维细胞分别进行裂解，提取全蛋白并与重组人COX2、重组人COX1一起进行SDS-PAGE电泳，用湿转印法将蛋白质转印至硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭1h，分别加入1：2000稀释的2种抗COX-2单克隆抗体，4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min，兔抗鼠二抗1：3000稀释，37℃孵育1h，洗膜后ECL显色。结果如图1所示。
从图1的结果可以看出，泳道1-2、6-7分别是人和小鼠的皮肤成纤维细胞裂解液全蛋白，泳道3和8是重组人COX2，这6个泳道分别都能够与2株单克隆抗体COX-2-HM3C3(泳道1-3)和COX-2-HM4E6(泳道6-8)形成特异性的条带，而泳道4和5是重组人COX1均不与2株单克隆抗体COX-2-HM3C3和COX-2-HM4E6形成特异性的条带，这说明，2株单克隆抗体COX-2-HM3C3和COX-2-HM4E6具有特异性针对人COX-2和小鼠COX-2结合的能力，而不与同源性较高的COX-1结合。
实施例2单克隆抗体COX-2-HM4E6的特性分析
(1)生物膜干涉技术(BLI)测定抗原抗体亲和力
使用生物膜干涉技术来测量单克隆抗体COX-2-HM4E6与人COX-2的亲和力，将纯化得到的单克隆抗体COX-2-HM4E6 25nM固化到AHC传感器上，人COX-2两倍连续稀释物以按照样品板排列加样，按照“基线检测-加载检测-淬火-淬火-洗板-基线检测-结合检测-解离检测”的程序设定进行操作。计算平衡解离常数(KD)，结果显示，单克隆抗体COX-2-HM4E6与人COX-2的KD为(6.96±0.08)×10-10M，表现出了较好的结合特性。
(2)轻重链可变区鉴定
提取COX-2-HM4E6杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用抗体轻重链可变区的扩增引物PCR克隆该杂交瘤细胞重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；mVH和mVL分别与克隆载体(pJET cloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定得到COX-2-HM4E6单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示。
轻链可变区
DIVITQRPALMAASPGEKVTITCQDSGNVYRNEKPWYQQKSGISPKPWIYYATHFTKGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCTFGCKHFDHFGAGTKLELK
重链可变区
EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSVLMILWIKQRPGQGLEWIGLCKMLIPNFNMRHALFGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGFIDNIWYWGLGTTLAVSS
(3)抗原表位的确定
将人COX-2多肽：favgqevfgl vpglmmyati wlrehnrvcd vlkqehpewg deqlfqtsrliligetikiv iedyvqhlsg yhfklkfdpe llfn氨基酸序列截断，合成长度为15位氨基酸的多肽，相邻的两个多肽之间的5个氨基酸重叠，据此合成8条多肽。
favgqevfgl vpglmmyati wlrehnrvcd vlkqehpewg deqlfqtsrl iligetikiviedyvqhlsg yhfklkfdpe llfn
COX-2-1多肽：favgqevfglvpglm
COX-2-2多肽：vpglmmyatiwlreh
COX-2-3多肽：wlrehnrvcdvlkqe
COX-2-4多肽：vlkqehpewgdeqlf
COX-2-5多肽：deqlfqtsrlilige
COX-2-6多肽：iligetikiviedyv
COX-2-7多肽：iedyvqhlsgyhfkl
COX-2-8多肽：yhfklkfdpellfn
合成的COX-2分段多肽用DMSO溶解，将8段多肽用碳酸盐包被液稀释，使其浓度为40μg/mL，每孔100μL，3个复孔包被ELISA板，37℃孵育2个小时，取出用PBST缓冲液洗板3次，而后用封闭液封闭过夜。阳性对照为重组人COX-2蛋白2μg/ml，阴性对照碳酸盐包被液，每孔100μL 3个复孔，37度孵育1小时。用PBST缓冲液洗板3次，将COX-2-HM4E6单抗用PBST稀释成2μg/ml，每孔100μl，37度孵育1小时，用PBST缓冲液洗板3次，每孔加100μL用PBST缓冲液按1:5000进行稀释Goat-Anti-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育过夜。PBST缓冲液洗板五次，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5min，立即用50μL的2M H2SO4终止。双波长450/630nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的2.1倍)，大于阈值为阳性抗体。结果如图2所示。
从图2结果可以看出显示，COX-2-7多肽：iedyvqhlsgyhfkl能够和COX-2-HM4E6单克隆抗体结合，由此COX-2-HM4E6单克隆抗体识别的抗原位点落在iedyvqhlsgyhfkl整段氨基酸序列的范围内。
实施例3单克隆抗体COX-2-HM4E6抗炎作用
HaCaT细胞的培养于37℃，5％CO2培养箱，10％FBS、双抗的DMEM高糖培养基培养。0.25％胰蛋白酶消化传代。将处于对数生长期的HaCaT细胞消化成细胞悬液，并以(1×104)个/mL接种于另一细胞培养瓶，共25瓶。正常培养24h后，于UVB灯下照射，灯管距培养瓶15cm。根据公式:UV剂量＝UV辐照强度×时间，照射剂量为35mJ/cm2。将处于对数生长期的HaCaT细胞消化成细胞悬液，并以(1×104)个/mL接种于另一细胞培养瓶，5mL/瓶，共计接种5瓶，设为空白对照组，正常培养24h后，用于指标检测。将25瓶经UVB照射的HaCaT细胞随机分成4组。分别设定为UVB模型组；10μg/mL COX-2-HM4E6单抗处理组；100μg/mL COX-2-HM4E6单抗处理组；阳性对照组(甘草酸二钾100μg/mL)。UVB模型组HaCaT细胞于UVB照射后，弃去PBS，加入新培养液；单抗和阳性对照组HaCaT细胞于UVB照射后，弃去PBS，分别加入含相应浓度药物的新培养液；以上5组细胞于正常饲养12h后，用于指标检测。以上各组细胞培养上清进行IL-1β，IL-6含量检测，采用酶联免疫吸附(ELISA法)。操作过程严格按照说明书步骤进行。结果如图3所示。
由于UVB辐射人皮肤角质细胞通过分泌IL-1β和IL-6可以间接导致皮肤光老化。从图3的结果可以看出，本发明的单克隆抗体能够具有较好的降低细胞上清中IL-1β，IL-6的含量，相比较与模型组差异及其显著，P<0.01,有统计学意义。特别是在100μg/mL COX-2-HM4E6单抗处理组条件下，其IL-1β，IL-6的含量分别是(7.96±0.31)ng/L和(9.89±0.49)ng/L，比阳性对照组的要效果还要显著。
实施例4脐带血间充质干细胞提取物冻干粉的制备
取脐血50mL，并对其进行肝素抗凝；同时和0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)按照1：1的比例混合均匀，并与5g/L的甲基纤维素按照4：1的比例混合均匀后静置。30min后吸取上清液进行离心，并采用PBS制成单细胞悬液，并将其叠加入相对密度1.077淋巴细胞分离液上进行离心，离心后取界面层，并加入PBS制成单细胞悬液，洗涤后以1.0×106/cm2的密度接种到MesencultTM培养液中，将其置入37℃且体积积分为5％的CO2饱和湿度的孵箱中。一周以后更换培养基，并丢掉末贴壁细胞，此次更换后，每隔三日更换一次；直至细胞达到80％的融合后用0.2g/L EDTA混合液和1：1的2.5g/L胰蛋白酶消化，并以8.0×103/cm2的密度接种传代到培养瓶中行扩增培养。收集第3～18代的细胞培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，取滤液，即得脐带间充质干细胞提取物；将脐带间充质干细胞提取物与冻干保护剂海藻糖5％wt脐带间充质干细胞提取物混匀后，用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后使用注射用水调节蛋白浓度至50μg/ml，冷冻干燥，所述冷冻干燥具体为：-80℃超低温冰箱中预冻12h，然后置于真空冷冻干燥机中，-30℃保持2h，在真空度为1.5×10-2mbar，-5℃条件下冻干12h，保持真空度，在20℃继续冻干4h，即得人脐带间充质干细胞提取物冻干粉。
实施例5脐带血间充质干细胞和单克隆抗体COX-2-HM4E6对皮肤光老化模型小鼠的保护作用
ICR小鼠，雌雄各半，清洁级，体重18～22g。将小鼠正常喂养1周后，随机分为6组，即空白组、模型组、阳性对照组、单克隆抗体COX-2-HM4E6组、干细胞提取物组、单抗联合干细胞提取物组。
剃毛刀剃去背部鼠毛，空白组不照射紫外，其余每组紫外照射前重复剃毛。造模方法为本领域常规的采用紫外制备光老化小鼠模型造模方法，每天照射2h，累积照射14d，UVB光照剂量累计250mJ/cm2。在开始照射的第一天即按照各组进行给药，具体如下：
空白组：腹腔注射0.5ml生理盐水；
模型组：紫外照射后，腹腔注射0.5ml生理盐水；
干细胞提取物组：腹腔注射0.3mg/只实施例4制备的冻干粉，每周一次，连续给药3周。
单抗组：取COX-2-HM4E6单抗腹腔注射方式注入小鼠体内，注射量为150.0μg/只，每周一次，连续给药3周。
单抗联合干细胞提取物组：腹腔注射0.3mg/只实施例4制备的冻干粉，每周一次，连续给药3周；间隔1h后，取COX-2-HM4E6单抗腹腔注射方式注入小鼠体内，注射量为150.0μg/只，每周一次，连续给药3周。
阳性对照组：甘草酸二钾150μg只，每周一次，连续给药3周。
在给药结束后1周，处死小鼠，取小鼠治疗处皮肤，匀浆后测定皮肤SOD、IL-6以及TNF-α含量，检测按照试剂盒说明书操作。结果如表1所示。
表1各组中SOD以及IL-6和TNF-α的表达量结果
Figure BDA0003719266900000111
*VS模型组P<0.05。
从表1的实验结果可以看出，本发明的COX-2-HM4E6单抗与干细胞提取物一起使用后，能够通过提高SOD活性，提高对自由基的清除能力，抑制长期紫外线光照引起的皮肤中的炎性反应，从而治疗皮肤针对紫外线的损伤修复。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
序列表
<110> 北京绎源生物科技有限公司
<120> 干细胞冻干粉在制备药物或者化妆品中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Asp Ser Gly Asn Val Tyr Arg Asn
20 25 30
Glu Lys Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Thr His Phe Thr Lys Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Phe Gly Cys Lys His Phe
85 90 95
Asp His Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Val Leu
20 25 30
Met Ile Leu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Cys Lys Met Leu Ile Pro Asn Phe Asn Met Arg His Ala Leu
50 55 60
Phe Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Phe Ile Asp Asn Ile Trp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种COX-2单克隆抗体，其特征在于是COX-2-HM4E6单克隆抗体，其轻链可变区如SEQID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示；该单克隆抗体识别的抗原表位为iedyvqhlsgyhfkl。
2.环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体在制备紫外线导致的皮肤炎症损伤的药物组合物中的用途；其中，单克隆抗体是COX-2-HM4E6单克隆抗体，其轻链可变区如SEQID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示；该单克隆抗体识别的抗原表位为iedyvqhlsgyhfkl。
3.环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体和脐带血干细胞冻干粉在制备紫外线导致的皮肤炎症损伤的药盒中的用途；其中，单克隆抗体是COX-2-HM4E6单克隆抗体，其轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示；该单克隆抗体识别的抗原表位为iedyvqhlsgyhfkl；脐带血干细胞冻干粉是将培养的脐带血干细胞上清通过0.22μm的无菌过滤器后与冻干保护剂5％wt的海藻糖混匀后，过滤除菌，冷冻干燥即得冻干粉。
4.如权利要求2或3所述的用途，进一步的，其还添加有药学上可接受的载体。
5.环氧合酶-2(COX-2)特异性结合的单克隆抗体和脐带血干细胞冻干粉在制备抗紫外线的化妆品中的用途；其中，单克隆抗体是COX-2-HM4E6单克隆抗体，其轻链可变区如SEQID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示；该单克隆抗体识别的抗原表位为vpglmmyatiwlreh；脐带血干细胞冻干粉是将培养的脐带血干细胞上清通过0.22μm的无菌过滤器后与冻干保护剂5％wt的海藻糖混匀后，过滤除菌，冷冻干燥即得冻干粉。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013199468A (ja) * 2012-02-21 2013-10-03 National Agriculture & Food Research Organization 皮膚の炎症または傷害の予防または抑制剤
CN103554262A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 吉林大学 一种抗环氧合酶人源单链抗体
WO2021250323A1 (en) * 2020-06-09 2021-12-16 Helsingin Yliopisto Anti-cox-2 autoantibody as a diagnostic marker, and methods, kits and uses related thereto
CN114042030A (zh) * 2021-11-29 2022-02-15 北京戴域生物技术有限公司 一种含有脂肪间充质干细胞冻干粉的化妆品及抗炎药物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013199468A (ja) * 2012-02-21 2013-10-03 National Agriculture & Food Research Organization 皮膚の炎症または傷害の予防または抑制剤
CN103554262A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 吉林大学 一种抗环氧合酶人源单链抗体
WO2021250323A1 (en) * 2020-06-09 2021-12-16 Helsingin Yliopisto Anti-cox-2 autoantibody as a diagnostic marker, and methods, kits and uses related thereto
CN114042030A (zh) * 2021-11-29 2022-02-15 北京戴域生物技术有限公司 一种含有脂肪间充质干细胞冻干粉的化妆品及抗炎药物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NESARI 等: "Effects of zinc on expression of apoptosis-related genes in freezing thawing damage of adipose tissue derived mesenchymal stromal cells" *
徐海环等: "脐带间充质干细胞上清提取物对糖尿病皮肤溃疡大鼠肿瘤坏 死因子-α 及血管内皮生长因子的影响" *
石星星等: "人脐带间充质 干细胞来源的外泌体在 皮肤老化方面的作用" *

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