CN115141267A - 一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用 - Google Patents

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CN115141267A CN202210770724.9A CN202210770724A CN115141267A CN 115141267 A CN115141267 A CN 115141267A CN 202210770724 A CN202210770724 A CN 202210770724A CN 115141267 A CN115141267 A CN 115141267A
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Abstract

本发明提供了一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用，属于生物医药技术领域。本发明所述的多肽来源于前体蛋白胸腺肽β4(TYB4)的第2‑17位，通过实验发现所述的多肽与胃癌细胞耐药密切相关，经本发明所述多肽处理的耐药胃癌细胞，顺铂作用后呈现显著诱导耐药的胃癌细胞凋亡，抑制耐药胃癌细胞的活性与迁移的功能，且对正常胃黏膜细胞没有明显的毒副作用。本发明所述的多肽具有免疫原性小，组织渗透性强，生产成本低廉，以及易于修饰增强体内稳定性和生物活性等优点。因此，将其应用于抗肿瘤领域具有广阔的临床应用前景，为胃癌治疗药物的开发提供了新的方向。

Description

一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤，肉瘤是指间叶组织，包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等，发生的恶性肿瘤，如由大肠黏膜上皮形成的恶性肿瘤称为大肠黏膜上皮癌，简称大肠癌，由皮肤上皮形成的称皮肤上皮癌，简称皮肤癌等等。肿瘤在发生进展的过程中形成了特殊的生物学功能，包括无限增殖，对生长抑制基因的逃避，细胞凋亡抑制，诱导血管生成及激活侵袭与转移等。
胃癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，其发病率位于恶性肿瘤中的第4位，在肿瘤相关死亡原因中居第2位。手术联合顺铂(Cisplatin,DDP)为代表的铂类化合物为基础的化疗方案是胃癌治疗的主要手段，但中晚期胃癌5年生存率仍低于30％，肿瘤对顺铂的原发性耐药和获得性耐药现象限制了其临床应用，且顺铂耐药的肿瘤细胞也会对其他化疗药物产生交叉耐药性。因此，研制提高顺铂化疗敏感性因子，使化疗反应率得以提升，副作用降至最低，则可使胃癌患者在化疗治疗中获益，具有重大临床价值。
虽然顺铂对机体有毒副作用，但由于其杀伤肿瘤的广泛性及有效性，目前仍应用于许多肿瘤中，特别是一些实体瘤的治疗，如肺癌、胃癌、头颈部肿瘤、卵巢癌等。顺铂是一种细胞周期非特异性药物，它的作用机理是进入细胞内，顺铂分子中的Cl-被水分子取代水合形成水化物，与细胞内的亲核物质如核酸、含巯基蛋白反应，铂原子以共价键的形式与DNA嘌呤N7结合链内交联或链间交联，诱导DNA双联损伤，触发细胞凋亡。顺铂引发胃癌耐药的分子机制复杂，包括：①腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ABC)以主动运输的形式将化疗药物进行跨膜转运，当多药耐药相关蛋白调节剂或化疗增敏剂与ABC蛋白(如P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白)结合就会减少其对化疗药物的外排，提高化疗药物的细胞内浓度，由此增强药物对肿瘤细胞的作用，此类多药耐药相关蛋白调节剂或化疗增敏剂包含：钙离子通道阻滞剂(维拉帕米及其衍生物)、环孢菌素(环孢菌素A及其衍生物)、钙调蛋白抑制剂(三氟丙嗪等吩噻嗪类化合物)、抗疟药(如奎宁)等；目前，应用此类药物逆转肿瘤细胞的多药耐药表型，增加化疗药物对肿瘤细胞的作用已开始进入临床试验，但其严重的肾脏毒性、肝脏毒性、胃肠道反应以及神经系统反应限制了临床应用；②谷胱甘肽S转移酶的解毒效应，使化疗药物失效，如酸性GST；③DNA拓扑异构酶的活性异常，如以ToPⅡ为靶点的药物，通过与DNA结合交联形成共价复合物，导致肿瘤细胞死亡，这类药物包括依托泊苷、替尼泊苷和多柔比星等；④癌基因p53突变及凋亡相关通路等。然而，以上化疗增敏药物并未在临床取得满意疗效，且存在对正常组织尤其肝肾功能的毒副作用而无法在临床大规模应用。
目前，FDA和EMA已经批准了20多个抗肿瘤肽，其中Kyprolis、SomaKitTOC、Lutathera和Gallium Dotatoc Ga 68均已上市。多肽因其毒副作用小，活性高、分子量小、易于穿膜进入肿瘤细胞，在抗肿瘤作用中发挥重要作用，如Bryostatin 1是Bryostatin家族中含量最丰富、研究最好的肽之一，其在恶性黑色素瘤、淋巴瘤和卵巢癌患者的I期试验中显示出显著的抗肿瘤活性。专利CN03158296.6公开了一种具有抗肿瘤作用的多肽ND100，由1Ala、1Glu、1Gly、1Leu、2Pro、1Thr、1Tyr组成。专利CN202110866068.8则公开了一种抗肿瘤多肽，其包括MDX1VDQSAVGFEYQGX2TEX3HASQX4GX5TX6X7VQX8EPAPGAPMGX9VTAT或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；其中，X1、X6、X9选自R或Q；X2、X3、X4、X5、X7、X8选自K或Q。
因此，亟需提供一种具有更好的抗肿瘤作用的多肽，为肿瘤的治疗或预防提供新的思路。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用。本发明所述的多肽来源于前体蛋白胸腺肽β4(TYB4)的第2-17位，通过实验发现所述的多肽与胃癌细胞耐药密切相关，可提高耐药的胃癌细胞对顺铂的敏感性。经本发明所述多肽处理的耐药胃癌细胞，顺铂作用后呈现显著诱导耐药的胃癌细胞凋亡，抑制耐药胃癌细胞的活性与迁移的功能，且对正常胃黏膜细胞没有明显的毒副作用。本发明所述的多肽具有免疫原性小，组织渗透性强，生产成本低廉，以及易于修饰增强体内稳定性和生物活性等优点。因此，将其应用于抗肿瘤领域具有广阔的临床应用前景，且目前还未发现将该多肽用于胃癌顺铂化疗敏感性提升的报道。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种抗肿瘤多肽，所述的多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，本发明所述的多肽来源于其前体蛋白胸腺肽β4(Thymosin Beta 4，TYB4，前体蛋白ID为：P62328)的第2-17位的氨基酸序列。
在某些实施例中，通过ProtParam分析发现，本发明所述的多肽在真核细胞中的半衰期是1.9h；亲脂指数(Aliphatic index)30.63，亲水性指数(Grand averageofhydropathicity，GRAVY)-1.581，表明本发明所述的多肽亲水性差，脂溶性强，容易通过扩散或胞吞作用进入肿瘤细胞内。
又一方面，本发明提供了上述多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
又一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的药物包括上述多肽。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
又一方面，本发明提供了上述多肽在制备提高胃癌顺铂化疗敏感性药物中的应用。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
又一方面，本发明提供了一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的药物，所述的药物包括上述多肽。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
又一方面，本发明提供了上述多肽与顺铂联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
又一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的药物包括上述多肽和顺铂。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种抗肿瘤多肽，所述的多肽来源于前体蛋白胸腺肽β4(TYB4)的第2-17位，其亲水性差，脂溶性强，容易通过扩散或胞吞作用进入肿瘤细胞内。
(2)本发明首次发现所述的多肽与胃癌细胞耐药密切相关，可提高耐药的胃癌细胞对顺铂的敏感性。经本发明所述多肽处理的耐药胃癌细胞，顺铂作用后呈现显著诱导耐药的胃癌细胞凋亡，抑制耐药胃癌细胞的活性与迁移的功能，且对正常胃黏膜细胞没有明显的毒副作用。
(3)本发明所述的多肽具有免疫原性小，组织渗透性强，生产成本低廉，以及易于修饰增强体内稳定性和生物活性等优点。因此，将其应用于抗肿瘤领域具有广阔的临床应用前景，为胃癌治疗药物的开发提供了新的思路与方向。
附图说明
图1为标准曲线图。
图2为内源性差异多肽前体蛋白的生物信息学分析结果图。
图3为内源性差异多肽的确定结果图(*，P<0.05；**，P<0.01；#，P>0.05vs 1μM)。
图4为正常胃黏膜细胞GES-1的活性检测结果图(#，P>0.05vs Scramble)。
图5为PD-TYB42-17在人、小鼠中的保守性分析结果图。
图6为SGC7901/DDP细胞的迁移情况检测结果图(×200)。
图7为SGC7901/DDP细胞的凋亡情况检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
如本文中所使用的，单词“一个”、“一种”和“该/所述”，如无另外特别说明是指“至少一个”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)相关联使用时，指该物质基本上不含至少一种在天然来源中可包括的物质。例如，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞材料(例如来自所述蛋白质的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质)或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的抗体。术语“基本上不含细胞材料”包括多肽的制备物，其中所述多肽与细胞(该多肽是从该细胞分离或自该细胞重组制备的)的细胞组分是分离的。
术语“蛋白”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语不但适用于天然存在的氨基酸聚合物，还适用于其中一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或非天然存在的残基(例如，相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些在细胞中翻译后经修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸))。短语“氨基酸类似物”指这样的化合物，其与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基)，但具有经修饰的R基或经修饰的主链(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基硫)。短语“氨基酸模拟物”指与通用氨基酸具有不同结构但相似功能的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。除非另有明确指明，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且与它们普遍接受的单字母密码所提及的氨基酸类似。与氨基酸类似，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物两者。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、或核酸分子可以由DNA、RNA或其组合构成。
如本文中所使用的，术语“生物学样品”指整个生物体或其组织、细胞或构成部分(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、脐带血、尿、阴道液和精液)的亚组。“生物学样品”还指从整个生物体或其细胞、组织或构成部分的亚组制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物学样品”指这样的培养基，例如培养过生物体的营养肉汤或凝胶，其含有细胞组分，例如蛋白质或多核苷酸。
用于本方法的多肽或片段可以作为天然存在的蛋白通过常规纯化方法从自然界获得，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可以用于合成的常规肽合成方法，包括：
(1)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；
(2)The Proteins，第2卷，Academic Press，New York，1976；
(3)Peptide Synthesis(in Japanese)，Maruzen Co.，1975；
(4)Basics and Experiment ofPeptide Synthesis(in Japanese)，MaruzenCo.，1985；
(5)Development ofPharmaceuticals(第二卷)(in Japanese)，第14卷(peptidesynthesis)，Hirokawa，1991；
(6)WO99/67288；及
(7)Barany G.和MerrifieldR.B.，Peptides第2卷，“SolidPhasePeptideSynthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118.
或者，可以采用生成多肽的任何已知基因工程方法来获得蛋白质(例如，MorrisonDA.等，J Bacteriol.1977年10月；132(1)：349-51；Clark-Curtiss JE和CurtissR 3rd.Methods Enzymol.1983；101：347-62)。例如，制备适合的载体，其包含可表达形式的(例如在调节序列包括启动子的下游)编码目的蛋白质的多核苷酸，转化入合适的宿主细胞中，然后培养宿主细胞以生成蛋白质。更具体地，通过将基因插入表达外来基因的载体。
本发明药物可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲液和pH调节剂。适合的添加剂包括生理学生物相容性缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合剂配合物(例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)、或者，任选地，添加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明药物组合物可以进行包装以作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以采用常规的无毒性固体载体；例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
除了上述内容外，本药物还可以包含其它药物活性成分，只要它们不抑制本多肽的体内功能。例如，所述组合物可以包含通常用于治疗癌症的化疗剂。
实施例1：抗肿瘤多肽的筛选及制备
一、顺铂耐药和顺铂敏感胃癌组织中内源性差异多肽的筛选
采用Label Free定量蛋白质组学方法，筛选顺铂耐药和敏感胃癌组织中的差异内源性多肽。
基本流程为：
(1)顺铂耐药和顺铂敏感胃癌组织中多肽提取和样品处理：取适量顺铂耐药和顺铂敏感胃癌组织液氮中研磨之后加入蛋白裂解液，吹打混匀，再加入终浓度1mM PMSF，2mMEDTA，10mM DTT，混匀之后冰上超声10min。4℃，12000r/min离心30min，取上清至新的离心管。取等量蛋白用10kD超滤管(4℃12000r/min离心30min)超滤，收集穿透液，即为多肽样品。
(2)用二喹啉甲酸(BCA)法进行多肽浓度测定：①BCA工作液配制：按BCA试剂A：BCA试剂B：BCA试剂C为50：48：2体积比配制适量BCA工作液，充分混匀；②配制标准溶液：使用Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay试剂盒提供的标准多肽溶液，按其说明书配制不同浓度，分别为0、0.016、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1mg/mL；③各样品均取4μL与16μL水混合，之后加入180μL BCA工作液。震荡混匀，37℃反应15min；④采用SPECTRAMAX酶标仪，读取480nm吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度，标准曲线如图1所示，样品浓度如下表1所示。
表1.样品浓度列表
序号 样品名称 样品类型 多肽浓度(μg/μL) 多肽总量(μg)
1 MG1 0.196 18.6
2 MG2 0.468 44.5
3 MG3 多肽血清 0.349 33.2
4 NY1 0.228 21.7
5 NY2 0.315 29.9
6 NY3 0.518 49.2
(3)取等量样本进行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析：根据肽段定量结果用质谱上样缓冲液(2％乙腈0.1％甲酸)溶解等浓度为0.25μg/μL的肽段进行质谱分析。
数据采集软件：Thermo Xcalibur 4.0(Thermo,USA)
反相柱信息：C18 column(75μm×25cm,Thermo,USA)
色谱仪器：EASY-nLC 1200(Thermo,USA)
质谱仪器：Q_Exactive HF-X(Thermo,USA)
色谱分离时间：120min
A：2％乙腈0.1％甲酸
B：80％乙腈0.1％甲酸
流速：300nL/min
梯度：
表2.EASY-nLC液相梯度
Time(min) B(％)
0 5
64 23
80 29
90 38
92 48
93 100
120 Stop
MS扫描范围(m/z)：300-1500，采集模式：DDA，Top 20；
Top 20(选择母离子中信号最强的20个进行二级碎裂)；
一级质谱分辨率：60000，AGC target：3e6，最大注入时间：20ms，碎裂方式：HCD；
二级分辨率：15000，AGC target：5e4，最大注入时间：45ms，fixed first mass：100m/z；
minimum AGC target：8e3，Intensity threshold：1.8e5，动态排除时间：30s。
(4)采用ProteomeDiscoerer中Sequest或Mascot模块搜库。①数据库的选择，目前使用到的数据库主要可以分为两类，一类是NCBI来维护的，另外一类是由EBI负责维护。数据库建立的方法主要有以下几种：a)NCBInr全库；b)NCBInr分类库，包括动物全库、植物全库、微生物全库、细菌全库等；c)SwissProt/UniProt分类库，包括动物全库、植物全库、微生物全库、细菌库等；d)NCBInr对应物种库，包括人、小麦、酵母、大肠杆菌等；e)其他物种库，如自测基因组、转录组数据库。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。②数据库的搜索。查库使用软件版本为PEAKS Studio 8.5。查库时将raw文件提交至PEAKSStudio 8.5服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。相关参数如下表3：
表3.PEAKS Studio 8.5搜索参数
Item Value
PEAKSStudioversion 8.5
ProteinDatabase uniprot-taxonomy_9606_unique.fasta
Cysalkylation Iodoacetamide
DynamicModification Oxidation(M),Acetyl(ProteinN-Terminus)
StaticModification Carbamidomethyl(C)
EnzymeName Trypsin(Full)
Max.MissedCleavageSites 2
PrecursorMassTolorance 10ppm
FragmentMassTolorance 0.05Da
注：结果过滤参数为Peptide FDR≤0.01。
(5)将得到的搜库结果进行数据统计和生物信息学分析。
表4.搜库结果列表
TotalSpectrum IdentifiedSpectrum Peptidenumber Proteinnumber Proteingroupnumber
79273 3416 495 197 80
二、顺铂耐药和顺铂敏感胃癌组织中内源性差异多肽的确定
采用Label Free定量蛋白质组学方法，共获得内源性多肽3416条，其中差异性显著多肽有495条(t-test，P<0.05)。分析发现，这些多肽主要由8-20个氨基酸组成，与蛋白酶体降解途径产生的内源性多肽性质相符；前体蛋白分子量大小集中在1-30kDa范围，所含肽段数量在1-2之间(见图2A-C)。鉴于内源性多肽主要源自蛋白前体的降解，因此对差异多肽的蛋白前体进行功能分析。结果发现，这些蛋白前体的功能主要涉及PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、凋亡通路(见图2D-E)，而这些信号通路则与细胞的凋亡信号密切相关。进一步，依据①质谱信号水平高、②组内差异小、③组间差异大等差异多肽筛选原则，进一步缩小选择范围，并从符合条件的45条(上调29条，下调16条)差异多肽中选择4条进行初步的功能研究。其中，2条内源性多肽分别来自Zyxin、TYB4protein(Thymosin Beta 4)前体蛋白，均差异低表达于顺铂耐药胃癌组织，差异倍数0.21，0.23倍；2条内源性多肽分别来自Fibrinogen alpha chain、Hemoglobin subunitbeta(Fragment)前体蛋白，均差异高表达于顺铂耐药胃癌组织，差异倍数5.02，5.04倍。化学合成多肽后，以不同浓度(1μm、50μm、100μm、200μm、300μm)干预顺铂耐药的胃癌细胞株，结果显示，TYB4来源的多肽(PD-TYB42-17)与顺铂联合作用下，具有显著降低顺铂耐药胃癌细胞的活性(见图3A-C)。进一步，以300μm的PD-TYB42-17与300μm的scramble对照肽作用胃黏膜上皮细胞，结果显示PD-TYB42-17对正常胃黏膜细胞没有明显的细胞毒性(见图4)，提示PD-TYB42-17与顺铂联合抑制胃癌细胞的活性功能与胃癌顺铂耐药病理生理密切相关。
三、合成直线多肽SDKPDMAEIEKFDKSK，多肽从C端到N端方向合成。具体步骤如下：
①称取wang树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150mL的反应器中，用50mL的二氯甲烷(DCM)浸泡。②2h后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。③称取C端第一个氨基酸赖氨酸K适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50mL的离心管中，加入20mL的DMF将其溶解，然后加入3mL的N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，再向反应器中加入3倍摩尔量的DMAP，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。④4h后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：DIEA：DCM＝1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。⑤向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1：4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。⑥取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。⑦称取后面第二个氨基苏氨酸T适量和HOBT适量于50mL的离心管中，加入25mL的DMF将其溶解，然后加入2.5mL的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。⑧1h后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。⑨待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1：4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。⑩按照步骤7-9依次接上后面的氨基酸SDKPDMAEIEKFDKSK。脱除Lys的Fmoc后，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸：1，2乙二硫醇：3，异丙基硅烷：水＝95：2：2：1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10mL切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1：9)离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化，再冻干，得到98％纯度的多肽。
实施例2：多肽PD-TYB42-17对顺铂耐药胃癌细胞的生物学功能影响的验证
1.细胞培养：胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP购自上海博谷生物科技有限公司，SGC7901/DDP细胞株接种于含10％胎牛血清(FBS)的PRMI-1640完全培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞密度为70-80％融合度时，进行实验。SGC7901/DDP细胞施加300μM PD-TYB42-17或300μM Scramble肽(对照组)孵育6h后，施加终浓度20μM DDP继续培养48h。实验分组：DDP+Scramble组和DDP+PD-TYB42-17组。
2.SGC7901/DDP细胞活性的检测：采用CCK-8实验检测SGC7901/DDP细胞活性。以完全培养液调整SGC7901/DDP细胞浓度为1×109/L，接种于96孔板。细胞施加不同作用因素后培养48h，弃去培养液，每孔加入90μL PRMI-1640完全培养液和10μL CCK-8试剂，继续孵育4h，于酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度值。
3.SGC7901/DDP细胞凋亡的检测：细胞施加不同作用因素后培养48h，以预冷PBS调整细胞密度为1×108/mL，分别加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的碘化丙啶，低温避光孵育15min，流式细胞仪检测SGC7901/DDP细胞凋亡率。
4.SGC7901/DDP细胞迁移的检测：采用Transwell侵袭实验检测SGC7901/DDP细胞的迁移。实验前将SGC7901/DDP细胞饥饿24h，收集细胞，以无血清培养基调整细胞密度为3×106个/mL，取500μL细胞悬液置于Transwell小室(6.5mm，8.0μm孔径；Corning)上室，下室加入750μL含20％FBS的PRMI-1640完全培养液，培养24h。甲醛固定侵袭的细胞，10％结晶紫对“贴壁”细胞进行染色，显微镜下计数，评估SGC7901/DDP细胞的迁移能力。
借助UniProt在线分析发现，PD-TYB42-17来源于人TYB4蛋白的第2-17位氨基酸(SDKPDMAEIEKFDKSK)，在人、小鼠中高度保守(图5)。
进一步实验数据表明：与DDP+Sramble组比较，DDP+PD-TYB42-17组细胞的增殖活性及迁移数量减少，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6、7，表5。
表5.各组SGC7901/DDP细胞的增殖活性、迁移及凋亡率比较
Figure BDA0003723892420000131
Figure BDA0003723892420000132
注：(*，P<0.05；**，P<0.01vs DDP+Scramble组)
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 江苏省肿瘤医院
<120> 一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的多肽及其应用
<130> 20220628
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于：所述的多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的多肽来源于其前体蛋白胸腺肽β4的第2-17位的氨基酸序列。
3.权利要求1-2任一项所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述的药物包括权利要求1-2任一项所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的药物还包括药学上可接受的载体。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的肿瘤包括膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
7.权利要求1-2任一项所述的多肽在制备提高胃癌顺铂化疗敏感性药物中的应用。
8.一种提高胃癌顺铂化疗敏感性的药物，其特征在于：所述的药物包括权利要求1-2任一项所述的多肽。
9.权利要求1-2任一项所述的多肽与顺铂联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述的药物包括权利要求1-2任一项所述的多肽和顺铂。
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