CN115137747B - 多聚水杨酸在治疗急性心肌梗死中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及多聚水杨酸在治疗急性心肌梗死中的应用。为改善阿司匹林的适应症局限，本发明将水杨酸(阿司匹林的功能成分)聚合成聚水杨酸(polysalicylic acid，PSA)。相较于阿司匹林，PSA具有显著的临床应用优势，PSA具有较高的生物安全性，经研究表明长期应用PSA对肝肾功能、血常规、体重等无明显影响。相较于阿司匹林，PSA可靶向趋化到炎症部位，能显著改善小鼠心肌梗死后的心室重构，包括提高射血分数、短轴缩短率等心功能指标，小鼠心脏纤维化程度也显著减轻，为临床上治疗急性心肌梗死后心室重构提供新的思路及新的方案。

Description

多聚水杨酸在治疗急性心肌梗死中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及多聚水杨酸在治疗急性心肌梗死中的应用。

背景技术

心血管疾病(CVD)因高发病率、高致死率，成为世界范围内最大的疾病负担。其中，急性心肌梗死是当今心血管疾病死亡的主要原因，也是导致死亡和发病的重要原因之一，心梗后心衰的住院率和死亡率居高不下。在发展中国家，情况更为严重，年增长率超过3.6％，每年约有740万人死于心梗后的心衰。因此，迫切需要寻找新的治疗策略和靶点来降低心梗后与心衰相关的死亡率和发病率。

当前，血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂、β-肾上腺素能受体阻滞剂(β-受体阻滞剂)以及血管紧张素受体脑啡肽酶的抑制剂(ANRI)等在降低慢性收缩性心力衰竭患者的发病率和死亡率方面虽然表现出一定的疗效，然而在进行上述内科优化治疗后心衰仍会进行性恶化。此外，尽管已有不少新疾病靶点被不断发现，但大多数治疗方法在患者身上并没有表现出一致的疗效。事实上，许多治疗方法在进入III期临床试验之前就被证明是无效的，甚至是有害的。

阿司匹林(Aspirin，乙酰水杨酸)是一种非甾体类抗炎药，在临床上应用广泛，其作用是抗血小板聚集(100mg)，主要适用于有冠心病或卒中病史的心血管疾病人群，用以预防冠心病或卒中的再发，即二级预防。尽管有证据表明在大规模临床试验中联用P2Y12抑制剂加乙酰水杨酸(ASA)的临床不良事件减少，但伴随药物出血的风险明显增加，尤其消化道出血风险，亦与抗血小板方案的药物剂量成正比。新近的经皮冠状动脉介入治疗指南推荐在PCI术前使用大剂量(75-325mg)阿司匹林，在冠状动脉成形术前1天，大剂量阿司匹林可显著降低干预前后的血小板活化状态。一项纳入了300个需择期行冠脉介入治疗(PCI)术病人的随机对照临床试验表明，使用大剂量阿司匹林(500mg)可能会导致消化道出血，增加围手术期死亡风险。有动物实验表明，相较于对照组，大剂量阿司匹林(120mg)药物处理组的急性心肌梗死小鼠促炎细胞因子TNF-alpha和IL-1beta的表达明显降低，然而不能改善小鼠心肌梗死后心功能；亦有研究表明使用抗炎药物(如皮质类固醇和非甾体抗炎药)可显著减少心梗面积，但其存在增加心脏修复受损、心室壁变薄和心脏破裂等不良反应。因此，如何减少阿司匹林应用的局限，降低胃肠道出血风险，有必要围绕阿司匹林开发新的药物用于治疗急性心肌梗死，避免阿司匹林的胃肠道出血风险，最大程度发挥其抗炎抗氧化的作用，从而改善急性心肌梗死后的心室重构。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明将水杨酸(阿司匹林的功能成分)聚合成聚水杨酸(poly salicylic acid，PSA)，PSA对心肌梗死后的心室重构具有显著的治疗作用，且具有较高的生物安全性。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了多聚水杨酸在制备治疗急性心肌梗死的药物中的应用。

本发明还提供了多聚水杨酸在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，所述心血管疾病为急性心肌梗死引起的各种心血管疾病。

优选地，所述多聚水杨酸(PSA)的制备方法为：先由水杨酸单体和乙酸酐制备成聚水杨酸，再由聚水杨酸和稳定剂DSPE-PEG 2000制备得到。

进一步地，聚水杨酸的制备为：先由水杨酸单体和乙酸酐在冷凝回流的条件下加热搅拌直至单体呈熔融状态，并在155-165℃下继续反应1-3h，反应后由155-165℃梯度增加至195-205℃，蒸馏5-7h。

进一步地，由聚水杨酸和稳定剂DSPE-PEG 2000制备多聚水杨酸的方法为：将聚水杨酸和稳定剂DSPE-PEG 2000分别溶解在DMSO中，合并两溶液制成油相，将所得油相滴入水中后经超滤制得。

优选地，所述治疗急性心肌梗死为改善心肌梗死后的心室重构。PSA可以显著改善小鼠心功能等各项指标及心室肥厚程度，从而改善急性心梗后心室重构。

优选地，所述多聚水杨酸的给药量为3-12mg/kg。进一步地，所述多聚水杨酸的给药量为6mg/kg。6mg/kg组相较于其他剂量组对急性心肌梗死后心室重构及心功能的改善最为明显，属于治疗急性心肌梗死后心室重构的最佳治疗剂量。

优选地，所述多聚水杨酸的给药频率为每天给药一次，给药周期为28天以内。

优选地，所述多聚水杨酸的给药方式包括口服给药、静脉给药、皮下注射。

本发明还提供了一种用于治疗急性心肌梗死的药物，所述药物以多聚水杨酸为主要活性成分。当然，其他能与多聚水杨酸起协同增效作用的心肌梗死药物也适用于本发明。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。稀释剂包括但不限于淀粉、糊精、薦糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、磷酸氢钙等；润湿剂包括水、乙醇、异丙醇等；粘合剂包括但不限于淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇等；崩解剂包括但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、聚乙二醇等。

优选地，所述药物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂和粉针剂。药物可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将水杨酸(阿司匹林的功能成分)聚合成聚水杨酸(poly salicylic acid，PSA)。相较于阿司匹林，PSA具有显著的临床应用优势，PSA具有较高的生物安全性，经研究表明长期应用PSA对肝肾功能、小鼠血常规、体重等无明显影响。相较于阿司匹林，PSA可靶向趋化到炎症部位，能显著改善小鼠心肌梗死后的心室重构，包括改善射血分数、短轴缩短率等心功能指标，小鼠心脏纤维化程度也显著减轻，为临床上治疗急性心肌梗死后心室重构提供新的思路及新的方案。

附图说明

图1为PSA用于治疗急性心肌梗死后心室重构的路线图；

图2为PSA给药的技术路线图；

图3为PSA可显著改善小鼠心肌梗死后心室重构。A为小鼠心梗后28天PBS组，aspirin组及PSA不同剂量组的M-mode心超代表性图像；B-G为各分组小鼠心梗后28天心功能指标，依次为左室射血分数，短轴缩短率，左室舒张末期内径，左室舒张末期容积，左室收缩末期内径及左室收缩末期容积；H为各分组小鼠心梗后28天心脏体重比(HW/BW ratio)；I为小鼠心梗后28天PBS组，aspirin组及PSA不同剂量组的心脏masson染色示意图；J为小鼠心梗后28天的纤维化面积(fibrosis area)；

图中的结果用mean±SEM展示，^*P≤0.05，^**P≤0.01，^***P≤0.001，每组n＝5-8。EF(Ejection Fraction)，左室射血分数；LVEDV，左室舒张末期容积；LVEDD,左室舒张末期内径；LVESV,左室收缩末期容积；LVESD，左室收缩末期内径；FS,短轴缩短率。

图4为心梗后小鼠体内PSA的药物分布情况。A为PSA@DiR在心脏内药物浓度的荧光图；B-F分别为PSA@DiR在心、肺、肝脏、脾脏、肾的荧光强度统计图；G-I为PSA@DiR给药后小鼠血清ALT、AST、肌酐的检测结果。

图5为PSA@DiR给药后肾脏、肝脏、肺脏的HE染色结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1多聚水杨酸(poly salicylic acid，PSA)对小鼠心肌梗死的治疗作用

(1)多聚水杨酸(PSA)的制备

1)聚水杨酸PSA的制备

A.将0.1mol水杨酸单体和0.1mol乙酸酐加入50mL圆底烧瓶，在搅拌和冷凝回流的条件下加热至160℃，待单体完全熔融后，在160℃下继续反应2h。

B.拆下冷凝回流装置，同时安装上低压蒸馏装置，按照每15min提高10℃的速度将反应体系的温度由160℃梯度增加至200℃，继续蒸馏6h；

C.停止蒸馏，待反应产物冷却成块状透明固体后，加入10mL DMSO溶解产物，然后利用甲醇析出沉淀，抽滤后得到白色粉末状固体；

D.利用超纯水反复洗涤粉末多次，然后进行冻干，最终得到聚水杨酸产物。

2)多聚水杨酸纳米粒的制备

A.将聚水杨酸和稳定剂DSPE-PEG 2000分别溶解在DMSO中，均配置成20mg/mL的溶液；

B.将400μL聚水杨酸溶液和200μL DSPE-PEG 2000的溶液混合均匀得到油相，在1600rpm的搅拌条件下将600μL油相逐滴加入6mL超纯水中，继续搅拌1min后停止搅拌；

C.将溶液转移至截留分子量为100KDa的超滤管中，在2000rpm的条件下离心8-10min以除去有机溶剂，并加入超纯水洗涤，重复两次，最终得到多聚水杨酸纳米粒，其结构式如下所示：

(2)多聚水杨酸治疗急性心梗小鼠

1)小鼠心肌梗死模型的制备

用1％戊巴比妥钠按75mg/kg的量麻醉小鼠后将小鼠四肢用胶布固定于手术板上，光源对准小鼠胸部，用撑开器暴露会咽部后进行气管插管，观察小鼠胸部起伏与呼吸机频率一致后表明插管成功，将呼吸机参数设置为吸呼比1：1，呼吸频率为120次/分，小鼠体重设置为30g，插管成功后于第4肋间斜行剪开皮肤，依次剪开胸大肌和胸小肌，沿肋间隙用显微剪剪开肋间肌，后用扩胸器撑开可见被脂肪垫包裹着的左心耳及部分左心室，注意不要剪伤肺组织，用显微镊小心分离脂肪垫，可在左心耳下2mm处见粉红色随心脏跳动而充盈的左冠脉，用9-0缝线结扎后可见心尖变白，后用4-0缝线关胸，逐层缝合肌肉层及皮肤。放置在保温垫上至小鼠可自主翻身爬动后放回笼内饲养。

2)给药方法

称取小鼠体重并记录后，提起小鼠尾巴将其塞入固定器内并用头部固定器塞入固定，小鼠头部不可转动即可，注意不要塞入过多避免小鼠窒息，将小鼠尾巴放置在成像仪光源上方，调节光源亮度及位置，可见小鼠尾巴两侧各有一深红色走行于浅层皮肤下的静脉血管，按压尾巴使血管充盈，取30G针头套在1mL注射器上，吸取药物后排空注射器内空气，平行进针后缓慢推注液体，如进入血管此时推注过程无阻力，如推注阻力较大则未进血管，需重新注射，注射完毕后松开按压器并用棉签按压止血后放回笼内，治疗剂量为6mg/kg，自术后每天给药，持续给药28天。

(3)PSA对小鼠急性心肌梗死的治疗效果

1)PSA可显著改善小鼠急性心肌梗死后心室重构

如图1、图2所示，为了探究PSA是否可以改善小鼠急性心肌梗死后心室重构，本研究对小鼠行左冠状动脉前降支永久性结扎术，术后将小鼠随机分为5个小组：分别是空白对照PBS组、阿司匹林组、PSA 3mg/kg组、6mg/kg组及12mg/kg组各10只，自术后每天给PBS或不同剂量的PSA药物，连续鼠尾静脉注射共28天后，检测其心功能发现：相对PBS组，阿司匹林组、不同剂量(3mg/kg组、6mg/kg组及12mg/kg)的PSA药物组，心功能均有不同程度的改善(图3A-G)，其中左室射血分数(27.23±4.08％VS 21.37±2.11％VS 32.61±5.87％VS42.24±3.71％VS 39.33±3.73％，P<0.01)，短轴缩短率(12.67±0.27％VS 9.85±1.01％VS 15.49％±3.053VS 20.57±2.02％VS 19.13±1.99％，P<0.01)明显改善，左室舒张末期内径(4.45±0.32％VS 5.27±0.19％VS 4.16±0.32％VS 3.82±0.20％VS 4.41±0.23％，P<0.01)及收缩末期内径(3.91±0.36％VS 4.76±0.22％VS 3.57±0.39％VS3.05±0.21％VS 3.57±0.23％，P<0.01)均显著降低。PSA(12mg/kg)组小鼠心脏/体重比较阿司匹林处理组下降35％(图3H)，表明其心脏肥厚的程度显著降低。Masson染色可反映PSA治疗组心梗后纤维化程度显著低于药物对照组(图3I-J)，这些结果表明PSA可以显著改善小鼠心功能等各项指标及心室肥厚程度，从而改善急性心梗后心室重构。

2)PSA改善急性心肌梗死后心室重构的最佳治疗剂量

为了寻找对小鼠急性心肌梗死后心室重构的最佳治疗剂量，分别设置3组PSA不同浓度，3mg/kg，6mg/kg组及12mg/kg组，6mg/kg组相较于其他剂量组对急性心肌梗死后心室重构及心功能的改善最为明显，左室射血分数及短轴缩短率较阿司匹林组(21.37±2.11％VS 42.24±3.71％，P<0.01)明显上升(9.85±1.01％VS 20.57±2.02％，P<0.01，图3B-C)，左室舒张末期内径(5.27±0.19％VS 3.82±0.20％，P<0.01)及左室收缩末期内径(4.76±0.22％VS 3.05±0.21％，P<0.001)较阿司匹林组均明显下降(图3D-F)。Masson染色显示PSA(6mg/kg)组心梗后纤维化程度显著低于对照组(26.64±5.69％VS 10.02±1.39％，P<0.01，图3I-J)。由此可见，PSA对急性心肌梗死后心室重构的最佳治疗剂量为6mg/kg。

(4)急性心梗小鼠体内PSA的生物学分布特征

1)PSA@DiR的制备

A.将PSA、稳定剂DSPE-PEG 2000和DiR染料分别溶解在DMSO中，均配置成20mg/mL的溶液；

B.将400μL PSA、200μL DSPE-PEG 2000和5μL DiR染料的DMSO溶液混合均匀得到油相，在1600rpm的搅拌条件下将油相逐滴加入6mL超纯水中，继续搅拌1min后停止搅拌；

C.将溶液转移至截留分子量为100KDa的超滤管中，在2000rpm的条件下离心8-10min以除去有机溶剂，并加入超纯水洗涤，重复两次，最终得到PSA@DiR。

2)PSA在注射后24小时达到顶峰

为了探究急性心梗后小鼠体内PSA的药物分布情况，本研究选用DiR红外探针染料制备了PSA@DiR。在小鼠急性心梗造模1天后通过尾静脉给药，剂量为0.5mg/kg，而对照组则给等量DiR，在给药后12，24，48小时分别处死小鼠并取出肺脏(Lung)、心脏(Heart)、肾脏(Kidney)、脾脏(Spleen)及肝脏(Liver)等实质器官，用活体成像仪检测PSA@DiR在各个器官的荧光强度，并通过计算药物荧光强度【average radiant efficiency(平均辐射效率)p/s/cm²/sr×10⁷】分析药物随时间在各器官的分布情况。结果显示，相比于DiR组，PSA@DiR药物组在给药后12h内开始出现在各器官，其中肝脏的药物浓度相比其他器官要高，12-24小时药物浓度持续升高，除肝脏外其他器官的药物浓度在48小时后开始下降，而给DiR对照组在各器官内的浓度并无随时间变化的趋势，说明PSA药物的体内代谢在24小时达到顶峰，而给药24小时后药物在体内出现衰减(图4C-F)。说明药物浓度在体内给药后24小时最高。

3)PSA可在心脏富集

为了探究急性心梗后小鼠体内PSA是否可在心脏内富集，计算了PSA@DiR在心脏内的药物荧光强度，以分析药物在心脏内随时间的分布情况。结果显示，相比于DiR组，PSA@DiR药物组在给药后12h内开始出现在心脏内(11.70±2.07×10⁷VS 55.44±26.31×10⁷p/s/cm²/sr，p＝0.17)，在给药后24小时药物浓度达到顶峰(10.35±1.35×10⁷VS131.31±36.09×10⁷p/s/cm²/sr，p＜0.05)，48小时检测时药物浓度下降(9.57±0.94×10⁷VS 58.74±5.44×10⁷p/s/cm²/sr，p＜0.0001，图4A-B)，而DiR对照组在各器官内则无随时间变化的趋势，说明PSA可在心脏内富集。

4)PSA具有较高的生物安全性

为探究小鼠在给PSA后的生物安全性，取心梗后28天的小鼠血清进行肝肾功能检测，取肝脏、肺脏及肾脏做石蜡切片并进行HE染色观察器官形态结构是否发生变化，结果显示，PSA 3mg/kg组、6mg/kg组的血清ALT、AST、肌酐(CREA)较正常组及阿司匹林药物对照组无显著差异(图4G-I)，12mg/kg组的血清ALT、AST则较正常组及阿司匹林组有轻微上调(图4G-I)。而HE染色则反映各分组肾脏、肝脏、肺脏与正常组及阿司匹林组在形态结构方面无明显差别(图5)。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.多聚水杨酸在制备改善急性心肌梗死后心室重构药物中的应用，其特征在于，所述多聚水杨酸的制备方法包括以下步骤：

S1、聚水杨酸的制备：

S11、将0.1mol水杨酸单体和0.1mol乙酸酐在搅拌和冷凝回流的条件下加热至160℃，待单体完全熔融后，在160℃下继续反应2h；

S12、按照每15min提高10℃的速度将反应体系的温度由160℃梯度增加至200℃，继续蒸馏6h；

S13、停止蒸馏，待反应产物冷却成块状透明固体后，加入10mLDMSO溶解产物，然后利用甲醇析出沉淀，抽滤后得到白色粉末状固体；

S14、利用水反复洗涤粉末多次，然后进行冻干，最终得到聚水杨酸产物；

S2、多聚水杨酸的制备：

S21、将聚水杨酸和稳定剂DSPE-PEG2000分别溶解在DMSO中，均配置成20mg/mL的溶液；

S22、将400μL聚水杨酸溶液和200μLDSPE-PEG2000的溶液混合均匀得到油相，在1600rpm的搅拌条件下将600μL油相逐滴加入6mL水中，继续搅拌1min后停止搅拌；

S23、将溶液转移至截留分子量为100KDa的超滤管中，在2000rpm的条件下离心8-10min以除去有机溶剂，并加入超纯水洗涤，重复两次，最终得到多聚水杨酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多聚水杨酸的给药量为3-12mg/kg。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多聚水杨酸的给药频率为每天给药一次，给药周期为28天以内。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多聚水杨酸的给药方式包括口服给药、静脉给药、皮下注射。