CN115137716A - 紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，本发明的研究结果表明，在体内和体外，紫草素都能减弱破骨细胞的生成。通过抑制RANK和TRAF6以及下游MAPK和NF‑κB信号通路之间的相互作用来诱导抑制作用，紫草素是治疗绝经后骨质疏松症的潜在候选药物。

Description

紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨 质疏松症药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经 后骨质疏松症药物中的应用，属于中药新用途领域。

背景技术

绝经后骨质疏松症(PMOP)已成为老龄化社会的主要医疗保障负担，预防和 治疗该症主要通过增加成骨细胞和抑制破骨细胞调节骨质稳态。绝经后，雌激 素的缺乏导致促炎细胞因子分泌水平的升高，刺激巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)和核因子-κB配体受体激活剂(RANKL)，促进骨髓单核细胞(BMMs)分 化为破骨细胞[4,5]。RANKL及其受体RANK结合后，募集TNF受体相关因子 (TRAFs)形成复合物(特别是RANK-TRAF6)。激活多个下游信号通路，如核因子 -κB(NF-κB)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，引起细胞内Ca2+和活化T 细胞胞质活化核因子(NFATc1)的释放。在破骨细胞生成的信号网络中，NFATc1 是下游遗传转录的必需转录因子，包括基质金属蛋白酶9(MMP-9)，组织蛋白酶 K，降钙素受体(CTR)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和NFATc1本身。

近年来，可供选择治疗骨质疏松的西药种类不断增加，但由于存在不良反 应多、价格高昂、服药时间长而受到限制，而副作用少、价廉易提取、具有良 好抗骨质疏松效果的中医药日趋受到重视。紫草素是一种来源于紫草菌素的活 性成分，具有抗微生物和抗肿瘤等多种生物活性。但是，目前尚不清楚紫草素 在破骨细胞中是否抑制RANK活化，以及紫草素对破骨细胞分化和溶骨性疾病 的影响。

发明内容

本发明提供了一种紫草素的新用途。

本发明所述的新用途包括：

一种紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症 药物中的应用。

优选地：所述的紫草素抑制破骨细胞生成和分化，抑制NF-κB的DNA结合 活性，抑制胞内ERK，P38和JNK磷酸化，抑制NF-κB通路的活化，抑制p65入核。

优选地：所述的紫草素通过抑制RANK和TRAF6的结合，从而抑制NF-κB通 路和MAPK通路，从而最终抑制骨关键转录因子NFATc1的表达，从而发挥抑制 破骨细胞生成，减少骨质流失的作用。

优选地：所述的紫草素抑制骨量丢失，增加骨小梁数量。

优选地：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物为注射剂。

优选地：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中紫草素的给药剂量为 1.2-50mg/kg/d

优选地：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物包含治疗有效量的紫草 素或其药学上可接受的盐类和辅料，所述的辅料包括常规药用赋形剂、载体或 稀释剂。

本发明也提供了一种预防或治疗绝经后骨质疏松症药物，包括含治疗有效 量的紫草素或其药学上可接受的盐类和辅料，所述的辅料包括常规药用赋形剂、 载体或稀释剂。

本发明的有益效果：

本发明的研究结果表明，在体内和体外，紫草素都能减弱破骨细胞的生成。 通过抑制RANK和TRAF6以及下游MAPK和NF-κB信号通路之间的相互作用 来诱导抑制作用，紫草素是治疗绝经后骨质疏松症的潜在候选药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为紫草素抑制BMM和RAW264.7细胞系中RANKL诱导的破骨细胞生成 结果；

图2为紫草素对RANKL诱导的BMM中F-actin形成和骨吸收活性的抑制作用 结果；

图3为紫草素主要在早期抑制破骨细胞生成的结果；

图4为紫草素预防卵巢切除小鼠模型中破骨细胞的吸收的结果；

图5为紫草素抑制RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路的激活的结果；

图6为紫草素抑制RANKL诱导的RANK-TRAF6结合并阻断下游基因表达的 结果；

图7为紫草素通过靶向结合TRAF6改善RANKL诱导的破骨细胞生成的结果 及作用机制图；

图8为紫草素对BMSCs分化没有生物学作用的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.紫草素对C57BL/6小鼠去卵巢后骨质丢失具有抑制作用

一、实验材料：

采用生理盐水将紫草素稀释成不同浓度的药物溶液。

6周龄雌性C57BL/6小鼠，购自上海史莱克公司，饲养于长海医院SPF级动物 房。

RAW264.7和BMMs细胞由海军医科大学提供，其它材料为市场上购买，无 特殊要求。

二、实验方法：

1.通过MTT测定的细胞活力

将BMMs在96孔板中以1.25×10⁴个细胞/孔的密度在不同浓度(0，0.2，0.6， 1.8，5.4，16.2和48.6μM)的紫草素中培养48小时。然后加入MTT溶液2小时。 最后，通过酶联免疫吸附测定板读数器在490nm处测量吸光度。然后，在每个 孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，并将细胞在CO2培养箱中温育3小时。温 育后，吸出培养基，加入100μL增溶溶液使细胞溶解。然后，用 FlexStation3(Molecular Devices，Japan)测量570nm处的吸光度(参考：650nm)。

2.体外破骨细胞形成试验

根据参考文献[1]，对于原代细胞培养，从C57BL/6小鼠的股骨中新鲜分离 BMM，使用α-MEM和30ng/mL M-CSF诱导3天。后将细胞(1×10⁴个细胞/孔) 接种到96孔板中，并用20ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL诱导。然后将不 同浓度的紫草素(0，0.2，0.6和1.8μM)加入板中。7天后，进行酒石酸抗性酸性 磷酸酶(TRAP)染色(Sigma，MO，USA)，将具有超过3个细胞核的细胞计为破 骨细胞。

3.F-actin测定和陷窝形成测定

根据参考文献前[2]进行F-actin测定，用M-CSF和RANKL诱导细胞7天， 用PBS固定和洗涤3次。用异硫氰酸荧光素标记的单抗预处理1小时，然后对 细胞进行染色。

根据参考文献[3]，进行陷窝形成分析。用胶原酶处理诱导的成熟破骨细胞， 接种于96孔板上，用M-CSF和RANKL处理，加入不同浓度的紫草素。48小 时后，切片经0.5％甲苯胺蓝染色1分钟。

4.免疫荧光染色

根据参考文献[4]的免疫荧光法检测了1.8μM的紫草素对RAW264.7细胞中 p65核易位的影响。固定并清洗细胞。向靶向因子抗体中依次加入抗鼠IgG抗体 和荧光素缀合的紫草素，进一步观察和成像。

5.蛋白质印迹法

将RAW264.7细胞分为3组，所有组均用M-CSF处理，两组仅用RANKL 或RANKL+紫草素(1.8μM)处理。根据参考文献[5]研究RANK诱导的NF-κB和 MAPKS通路的相关因素。

6.卵巢切除(OVX)小鼠模型

雌性C57BL/6小鼠，6周龄，体重20±1g，取自Slack(中国上海)，使其在获 得食物和水的自由条件下饲养。将30只小鼠随机分为3组(每组10只)：对照组、 去卵巢组和紫草素组。小鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉。在小鼠腹部做了 小切口后不久，切除包括部分输卵管在内的卵巢。切口用5-0合成可吸收缝线缝 合。根据参考文献[6]的涉及动物的实验指南，整个过程在特定的无病原体动物 实验室进行。每天腹腔注射2mg/kg的紫草素。治疗6周后，处死小鼠，取股骨。 动脉血样也留作进一步研究。

7.组织学和显微计算机断层扫描(CT)分析

股骨标本制备后，采用苏木精伊红(H-E)染色和TRAP染色进行组织学分析， 做成4μM切片。用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，贝塞斯达)计算小梁骨面 积和破骨细胞数量。对于每根股骨，扫描生长板上的100个截面平面 (Skyscan1172，安特卫普，比利时)。我们在选定的干骺端区域内使用内置软件 分析指标，包括骨小梁、骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)、骨表面积/总 体积(BS/TV)和骨小梁数量(TB.n)。此外，根据制造商的说明生成并分析二维和 三维版本的骨骼结构图像。

8.RT-PCR

根据参考文献[7]使用InvitrogenTRIzol试剂提取细胞RNA，用三唑从分离 的股骨骨髓培养物中提取细胞RNA。PCR引物表1。

表1 Real-timePCR引物序列

9.统计分析

所有统计分析均使用SAS 9.1软件进行。结果重复三次。结果与单因素方差 分析及SNK检验进行了多次比较。P<0.05具有统计学意义。

参考文献：

1.Thummuri D,Naidu VGM,Chaudhari P.Carnosic acid attenuates RANKL-induced oxidative stress and osteoclastogenesis via induction of Nrf2 andsuppression of NF-kappaB and MAPK signalling.Journal of molecular medicine(Berlin,Germany).2017.

2.Koide M,Kinugawa S,Ninomiya T,et al.Diphenylhydantoin inhibitsosteoclast differentiation and function through suppression of NFATc1signaling. Journal ofbone and mineral research:the officialjournal oftheAmerican Society for Bone and Mineral Research.2009；24(8):1469-1480.

3.Chen X,Zhi X,Cao L,et al.Matrine derivate MASM uncovers a novelfunction for ribosomal protein S5 in osteoclastogenesis and postmenopausalosteoporosis.Cell Death&Disease.2017；8.

4.Lee J-W,Kobayashi Y,Nakamichi Y,et al.Alisol-B,a novel phyto-steroid, suppresses the RANKL-induced osteoclast formation and prevents boneloss in mice. Biochemical Pharmacology.2010；80(3):352-361.

5.Chen X,Li X,Zhai X,et al.Shikimic Acid Inhibits Osteoclastogenesisin Vivo and in Vitro by Blocking RANK/TRAF6 Association and Suppressing NF-kappaB and MAPK Signaling Pathways.Cellular physiology and biochemistry:international journal of experimental cellular physiology,biochemistry,andpharmacology.2018；51(6):2858-2871.

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7.Li C,Yang Z,Li Z,et al.Maslinic acid suppresses osteoclastogenesisand prevents ovariectomy-induced bone loss by regulating RANKL-mediated NF-kappaB and MAPK signaling pathways.Journal of bone and mineral research:theofficial journal oftheAmerican Society forBone andMineral Research.2011；26(3):644-656.

三、结果

1.紫草素抑制RANKL诱导的破骨细胞生成

MTT法检测的细胞活力结果如图1所示，图中(A)紫草素的化学结构。(B) 通过MTT法测量与不同浓度紫草素孵育48小时后的BMM的增殖率。(C，D) 用不同浓度紫草素处理的BMM和RAW264.7细胞培养物中TRAP阳性多核细 胞(在放大倍数×100下测量)的代表性图像和测量。*相对于对照组，P<0.05， 相对于RANKL诱导组，#P<0.05。

在1.8μM以下，紫草素没有明显的细胞毒性作用(图1B)。为了研究紫草素 对破骨细胞生成的影响，我们使用BMMS和RAW264.7细胞，并分别用浓度为 0.2、0.6和1.8μM的紫草素进行处理。如图1C和1D所示，RANKL和M-CSF 诱导的BMMS和RAW264.7细胞分别在5-7天和3-5天内分化为成熟破骨细胞。 相比之下，紫草素以剂量依赖性的方式显著减少TRAP阳性细胞的数量。

2.紫草素抑制F-actin的形成和骨吸收活性

为了探讨紫草素在破骨细胞功能和细胞骨架形成中的作用，用荧光素异硫 氰酸盐染色(图2A)观察F-actin形成，结果如图2所示，图中(A)通过异硫氰酸荧 光素-鬼笔环肽染色观察和鉴定肌动蛋白环的形成。(B)陷窝形成测定结果的典 型图像，通过图像定量分析再吸收区域。如上所述，紫草素对F-actin的形成具 有抑制作用，并且以剂量依赖性的方式缩小了吸收范围。*相对于对照组，P <0.05，相对于RANKL诱导组，#P<0.05。(原始比例尺，50μM)

RANKL诱导骨髓单核巨噬细胞分化为成熟破骨细胞，形成F-actin细胞骨 架。然而，紫草素以剂量依赖性的方式降低了F-actin的大小和数量，表明紫草 素对成熟破骨细胞形成F-actin具有抑制作用。此外，在RANKL/M-CSF诱导的 骨吸收实验中，RAW264.7细胞在骨仿生合成表面形成明显的陷窝，表明细胞分 化为成熟的破骨细胞，并发生了骨吸收。而紫草素明显缩小了骨吸收范围，这 表明，紫草素不仅能抑制破骨细胞的形成，还能抑制破骨细胞的吸收功能(图 2B)。

3.紫草素对BMSCs分化的影响有限

骨重建可以通过破骨细胞和成骨细胞间的平衡来调节，为了进一步确定紫 草素在骨质疏松症中的作用以及其是否在骨形成中发挥作用，我们通过碱性磷 酸酶(ALP)染色和茜素红染色评估了紫草素对成骨作用的影响，结果如图8所示， 碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色显示不同浓度紫草素对诱导组的钙结节物 质化具有相似的影响，而油红O染色的结果表明，紫草素与体外脂肪颗粒的形 成关系不大。紫草素对BMSC分化和成骨作用的影响有限，因此认为紫草素主 要通过影响破骨细胞生成来预防骨质流失。

4.紫草素主要在早期抑制破骨细胞生成

为了研究紫草素在哪个阶段抑制破骨细胞生成，将1.8μM紫草素分别加入 到含BMMs或RAW264.7的培养基中并观察，结果如图3所示，TRAP阳性多 核细胞的代表性图像和定量结果(在放大倍数下测量×100)。(A)不同时间点用 1.8μM紫草素处理的RANKL诱导的BMM培养物；(B)不同时间点用1.8μM的 紫草素处理RANKL诱导的RAW264.7细胞培养物。(C，D)分别为BMMs 和RAW264.7对应TRAP染色的计数结果。(E)为BMMs细胞经不同时间点加 入紫草素后下游mRNA的表达情况。

结果表明，早期加入紫草素可完全抑制破骨细胞分化，但在后期加入紫草 素后效果较差，特别是当RAW264.7细胞培养时间超过3天后，BMM培养时间 超过5天后。我们认为，紫草素可能对RANKL诱导的破骨细胞前体分化的早 期有影响，但对成熟破骨细胞的形成没有影响。

5.紫草素预防卵巢切除小鼠模型中的破骨细胞骨吸收

在绝经后骨质疏松症中，随着雌激素水平的降低，破骨细胞的产生和活 性增强，导致炎症反应失衡。因此，我们建立OVX小鼠模型用于探查紫草素的 作用，结果如图4所示，图中股骨干骺端的HE染色显示OVX组具有显著的小 梁骨丢失，而用2mg/kg的紫草素处理的OVX组的骨小梁丢失得到显著改善。 (A)用2mg/kg紫草素处理的对照组和OVX组股骨骨小梁的代表性2D和3D重 建图像。显示了紫草素对OVX组骨小梁的保护作用。(B)在选定的干骺端区域 内显示骨矿物质密度(BMD；g/cc)，骨量/总体积(BV/TV；mm-1)，小梁数(Tb.N； mm-1)和骨表面积/总体积(BS)/TV；％)。(C，E)关于所述组股骨干骺端TRAP 染色的代表性图像及骨小梁计数情况。(D，F)关于所述组股骨干骺端TRAP染 色的代表性图像及单位骨表面积上破骨细胞表面积计数情况。(G)用2mg/kg紫 草素处理的OVX组中抑制促炎细胞因子和破骨细胞生成的血清标志物，含 TNF-α，IL-6，TRAcp5B和CTX-1。*相对于对照组，P<0.05，相对于RANKL 诱导组，#P<0.05。

在手术后6周处死三组小鼠，并且将样品(包括收集的动脉血和股骨)保存 良好并处理。收集的股骨的H-E染色和显微计算机断层扫描(CT)显示OVX组具 有显著的骨小梁丢失，而紫草素处理后骨小梁保持区域面积更大(图4A和4B)。 微型计算机断层扫描技术分析的详细结果如图4A所示，表明用紫草素处理后骨 量维持有所改善。此外，OVX组中TRAP染色阳性破骨细胞的数量显著增加， 并且紫草素显著减少破骨细胞的数量(图4D)。至于促炎细胞因子，我们检测了 TNF-α和IL-6的血清水平。对于破骨细胞生成的血清标志物，检测Ⅰ型胶原C- 端肽(CTX-1)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcp5B)。与对照组相比，OVX组血清因 子水平显著升高。然而，在紫草素组中，血清水平显著降低，由此我们得出结 论，紫草素可以抑制OVX小鼠中的促炎细胞因子分泌和破骨细胞的活性(图 4G)。

6.紫草素抑制RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路的激活

为了深入探讨由紫草素诱导的破骨细胞形成受损的潜在机制，我们对经典 破骨细胞信号通路进行了Westernblot分析，结果如图5所示，图中(A)免疫荧 光染色显示，紫草素抑制RANKL诱导的P65核转位，三组的计算机辅助核百 分比分析，(B)用或不用紫草素预处理的RAW264.7细胞被RANKL和集落刺激 因子进行0，15，30，60分钟的刺激。使用如图所示的抗体提取蛋白质用于蛋 白质印迹分析。*相对于对照组，P<0.05，相对于RANKL诱导组，#P<0.05。

发现在RANKL诱导后，p65易位到细胞核中。免疫荧光染色显示RANKL 增加了RAW264.7细胞中的p65位点，但紫草素可以阻断p65的核转位(图5A)。 NF-κB信号传导途径是RANKL刺激后最早激活的信号级联反应之一。蛋白印 迹结果表明，IκB，p50和p65磷酸化分别在30分钟，60分钟和60分钟时达到 峰值，证实在M-CSF和RANKL的诱导作用后NF-κB通路被激活。然而，在紫 草素处理组中，RAW264.7细胞中的磷酸化水平被显著抑制(图5B)。

MAPK是破骨细胞生成的另一个重要途径。对于MAPK途径，通过蛋白质 印迹检查主要亚家族，例如ERK，p38和JNK。通过蛋白印迹分析这些因子的 磷酸化水平，结果如图5B所示，紫草素通过抑制P65，P50和IkB蛋白下调RANKL诱导的NF-kB通路表达，同时阻断破骨细胞生成的MAPKs途径中因子 的磷酸化，包括ERK，JNK和P38。(B)对破骨细胞生成相关标记物(包括TRAF6， NFATc1，MMP-9，组织蛋白酶K，TRAP和RAW264.7细胞中的CTR)的表达水 平的Westernblot结果和计数分析(n＝2)。*相比于对照组，P<0.05。

用M-CSF和RANKL诱导后下游通路表达水平显著增加，并且在30分钟 时均达到其峰值，而紫草素给药能够抑制其在RAW264.7细胞中的磷酸化 (图.6A)。总之，紫草素主要通过减弱RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路 的激活从而造成破骨细胞的生成受损。

7.紫草素抑制RANK-TRAF6结合并阻断其下游的基因表达。

由于RANKL诱导的RANK募集TRAF6，我们通过RT-PCR和蛋白质印迹 检测TRAF6，发现在RANKL作用后后紫草素显著抑制其表达(图6A和6B)。 NFATc1是由早期RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路诱导的主要转录因 子，也在下游基因的破骨细胞生成中起中枢调节剂的作用。为了进一步探索紫 草素的确切相互作用位点，结果如图7所示，图中(A)通过RT-PCR测量不同时 间加入载体或紫草素(1.8μM)后BMMs细胞的RANK的mRNA表达水平。(B) 免疫荧光染色显示，紫草素显著下调TRAF6蛋白的表达。(C)三组中标准化 RANK和TRAF6水平的阳性细胞百分比的定量。(D)TRAF6与RANKL采用免 疫共沉淀结果示意图。(E)紫草素改善RANKL诱导的破骨细胞生成的机制示 意图。

发现紫草素显著抑制TRAF6与RANK的结合，并且阻碍了TRAF6的表达。 在我们的研究中，RANKL诱导后，RAW264.7细胞中RT-PCR和蛋白质印迹显 示NFATc1水平过度表达，但是，紫草素的处理减轻了NFATc1的水平。与减毒 的NFATc1蛋白表达一致，当用紫草素处理时，检测到破骨相关基因(例如MMP-9，组织蛋白酶K，TRAP和CTR)的表达显著下调(图6A和6B)。因此， 体外实验表明，通过减轻RANK诱导的NF-κB和NFAT信号传导途径，紫草素 表现出抗破骨细胞作用，并通过与TRAF6的结合发挥作用。

4、结论

绝经后骨质疏松症是原发性骨质疏松症的最常见形式，并且发病率迅速上 升。骨是一种动态组织，不断经历成骨和破骨细胞之间的相互作用。破骨细胞 过度激活在失衡中起着至关重要的作用，RANKL是影响破骨细胞分化和功能的 重要因素。当RANKL结合到破骨细胞前体细胞表面，激活MAPKs和NF-κB 通路时，TRAFs被招募。因此，通过RANKL介导的信号从而抑制破骨细胞的 再生是预防和治疗绝经后骨质疏松症的重要策略。许多治疗骨质疏松症的药物 对预防脆弱性骨折有效，包括双磷酸盐。然而，双膦酸盐会导致一些不良反应，例如不典型的股骨骨折和颌骨坏死。因此，需要寻找新的药物来预防和治疗骨 质疏松症。天然化合物是治疗许多疾病的潜在来源。从中草药中提取的各种单 体通过抑制破骨细胞生成表现出抗骨质疏松的作用。紫草素是从紫草科紫草菌 素的提取物中分离出的一种活性成分。具有多种生物作用，包括抗炎、抗肿瘤。 在这项研究中，我们首先证明了紫草素能有效地阻止RANKL诱导的破骨细胞 生成。目前，这是第一个表明在体外紫草素能够抑制破骨细胞生成和卵巢切除 诱导骨丢失作用的研究。在这项研究中，我们证明，通过抑制破骨细胞的生成， 紫草素可以预防骨质流失，其模型是由OVX诱导的雌激素缺乏引起的骨质疏松。 组织化学分析和TRAP染色表明，紫草素能显著降低OVX小鼠TRAP阳性破骨 细胞的数量，并能显著抑制BV的下降。与OVX组相比，Micro-CT扫描显示紫 草素治疗的OVX小鼠胫骨继发性海绵状骨结构有所改善。RANKL介导的信号 通路对成熟破骨细胞的形成至关重要。在骨质疏松症中，下游MAPK和NF-κB 通路是研究最充分的信号通路。RANKL及其受体序列的结合导致TRAF6、TGF- β活化激酶1(Tak1)和TRAF结合接头蛋白Tak1结合蛋白的募集。Tak1在招募 后被激活，随后p65、p50和IκB蛋白通过NF-κB途径的磷酸化被激活。目前 研究发现，通过抑制p65、p50和IκB蛋白的磷酸化，紫草素下调了RANKL 诱导的NF-κB通路的表达。此外，RANKL和RANK的结合通过ERK、JNK 和p38的磷酸化促进MAPK通路的激活，后者在破骨细胞生成过程中形成AP-1 复合体。同时，在破骨细胞生成的MAPKs途径中，包括ERK、JNK和p38，紫 草素能够抑制上述因子的磷酸化。

RANK与TRAF6的相互作用导致了破骨细胞生成过程中NFATc1的激活。 TRAF6是破骨细胞生成的必要结合位点，由于其对破骨细胞生成的抑制是剂量 依赖性的，所以紫草素抑制TRAF6和RANKL之间的结合。此外，研究结果表 明，TRAF6与RANK的相互作用可能是抑制破骨细胞生成相关疾病的潜在靶点。 NFATc1在破骨细胞生成的许多研究中已得到证实。NFATc1对功能性破骨细胞 的形成是必不可少的，它可以调节标记基因的表达，如MMP-9、组织蛋白酶K、 CTR、TRAF6和TRAP，从而将破骨细胞前体分化为功能性破骨细胞。MMP-9 是一种属于基质金属蛋白酶家族的胞外内肽酶。先前的研究表明MMP-9是一个 重要的下游效应器。分子诱导病理性骨丢失和许多研究使用MMP-9作为破骨细 胞生成相关的标记物。组织蛋白酶K也是一种分泌蛋白酶，在破骨细胞骨吸收 和骨质疏松性骨丢失中起着重要作用。降钙素受体(CTR)是降钙素受体家族中的 一员，能与肽激素降钙素结合。CTR参与骨形成和代谢。TRAF蛋白与TNF受 体超家族相关。受体RANKL的信号被证实是由TRAF6介导的。TRAF6在NF- κB通路中作为信号转导因子发挥作用，激活IκB激酶，以响应炎症因子。 NFATc1是RANKL诱导信号通路的下游主要转录因子。当NF-κB和AP-1与NFATc1启动子结合时，NFATc1的表达被激活。这项研究表明，紫草素抑制 NFATc1的表达及其下游基因。综上所述，我们的研究结果表明，在体内和体外， 紫草素都能减弱破骨细胞的生成。通过抑制RANK和TRAF6以及下游MAPK 和NF-κB信号通路之间的相互作用来诱导抑制作用。这些结果表明，紫草素是治疗绝经后骨质疏松症的潜在候选药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种紫草素及其药学上可接受的盐类在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的紫草素抑制破骨细胞生成和分化，抑制NF-κB的DNA结合活性，抑制胞内ERK，P38和JNK磷酸化，抑制NF-κB通路的活化，抑制p65入核。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的紫草素通过抑制RANK和TRAF6的结合，从而抑制NF-κB通路和MAPK通路，从而最终抑制骨关键转录因子NFATc1的表达，从而发挥抑制破骨细胞生成，减少骨质流失的作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的紫草素抑制骨量丢失，增加骨小梁数量。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物为注射剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中紫草素的给药剂量为1.2-50mg/kg/d。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物包含治疗有效量的紫草素或其药学上可接受的盐类和辅料，所述的辅料包括常规药用赋形剂、载体或稀释剂。

8.一种预防或治疗绝经后骨质疏松症药物，其特征在于：包括含治疗有效量的紫草素或其药学上可接受的盐类和辅料，所述的辅料包括常规药用赋形剂、载体或稀释剂。

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