CN115135673A

CN115135673A - 用于结合纤溶酶的抗体

Info

Publication number: CN115135673A
Application number: CN202080086682.6A
Authority: CN
Inventors: J·惠斯托克; R·劳; A·郭; P·康罗伊; 吴国杰
Original assignee: Monash University
Current assignee: Monash University
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2022-09-30
Also published as: WO2021081582A1; EP4051714A4; KR20220116435A; EP4051714A1; JP2022553784A; US20230220112A1; AU2020373297A1; CA3158174A1

Abstract

本发明提供了一种抗原结合蛋白，其包含结合纤溶酶的抗原结合结构域，其中该抗原结合蛋白降低纤溶酶的活性。本发明还提供了包含该抗原结合蛋白的组合物，以及包含这些组合物的用途和治疗方法。

Description

用于结合纤溶酶的抗体

技术领域

本发明涉及用于结合纤溶酶的抗原结合蛋白及其相关片段，涉及所述抗原结合蛋白和片段的产生，并且涉及所述抗体和片段用于检测和治疗各种病症的用途。

相关申请

本申请要求澳大利亚临时申请AU 2019904049的优先权，将其内容通过引用以其全文并入本文。

背景技术

纤溶酶原(PLG)是纤溶酶的无活性酶原形式，纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，其对靶底物(包括纤维蛋白、纤维蛋白原、补体组分3和5(C3和C5)、玻连蛋白、骨钙素、因子V、因子VIII和因子X以及一些胶原酶)具有广泛的特异性。因此，PLG和PLM一起参与各种重要的生理和病理过程，包括纤维蛋白溶解和止血、细胞外基质的降解、细胞迁移、胚胎发育、组织重塑、炎症、伤口愈合、血管生成和肿瘤侵袭。

PLG主要在肝脏中合成，但也在主要器官和组织中合成。因此，在血浆和许多血管外液体中发现了大量的PLG。在生理条件下，PLG通过激活环中的切割被转化为活性形式纤溶酶(PLM)。激活可由尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)或组织纤溶酶原激活物(tPA)或各种其他蛋白酶介导，并将单链PLG(氨基酸残基20-810)转化为由二硫键连接的重链A(残基20-580)和轻链B(残基581-810)组成的PLM。重链A含有5个克林格勒(kringle)结构域(其经由赖氨酸结合区介导与底物的结合)，并且轻链B对应于丝氨酸蛋白酶结构域。由前4个克林格勒结构域组成的片段已被命名为血管抑素，一种新的血管生成抑制剂。

纤溶酶原/纤溶酶系统与多种生理和病理过程(如纤维蛋白溶解、组织重塑、细胞迁移、炎症以及肿瘤侵袭和转移)有关。纤溶酶原的遗传性缺陷是血栓栓塞性疾病的诱发危险因素。

需要用于调节纤溶酶系统以治疗和/或预防各种病症的组合物和方法。

在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。

发明内容

本发明提供了一种抗原结合蛋白，其包含结合纤溶酶的抗原结合结构域，其中该抗原结合蛋白降低纤溶酶的活性。

优选地，该纤溶酶是人纤溶酶。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域。

优选地，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶丝氨酸蛋白酶结构域的催化位点。催化位点包含His₆₀₃、Asp₆₄₆和Ala/Ser₇₄₁(按照人纤溶酶原编号，如SEQ ID NO:33中所示)。优选地，抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:34中所示的序列或其片段的肽。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白在Arg₆₃₇、Leu₆₃₈、Leu₆₄₀、Pro₆₄₂、Arg₆₄₄、Lys₆₄₅、Gln₇₂₁、Trp₇₈₃和Asn₇₉₁的位置或等同位置处结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。优选地，本发明的抗原结合蛋白在表2所示的位置或等同位置处结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。更优选地，结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基的抗原结合蛋白的残基是如表2中所定义的氨基酸残基中的一个或多个。

本发明还提供了一种抗原结合蛋白(例如，抗体)，其在表2中为B10抗体指定的残基的位置或等同位置处具有相同的氨基酸。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白也可以结合纤溶酶原。然而，应当理解的是，由于纤溶酶原是酶原的无活性形式，因此本发明的抗原结合蛋白不抑制纤溶酶原的激活，而是抑制已经激活为纤溶酶的纤溶酶原的活性。

在本发明的某些方面，本发明的抗原结合蛋白抑制纤溶酶原激活物链激酶与纤溶酶原的结合，以及链激酶对纤溶酶原的激活。

在本发明的任何方面，本发明抗原结合蛋白的残基与纤溶酶的残基的相互作用可以由x射线晶体学和0至

(包括端值)的接触距离分析定义。

本发明还提供了一种抗原结合蛋白，其与包含含有如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的VH结构域和含有如SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的VL结构域的抗体结合纤溶酶上的相同表位，其中该抗原结合蛋白降低或抑制纤溶酶的活性。在一个实施例中，该表位由x射线晶体学定义。优选地，该表位由x射线晶体学和0至

(包括端值)的接触距离分析定义。优选地，抗原结合蛋白覆盖约

的SEQ ID NO:33的纤溶酶表面积。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白可以结合纤溶酶，并表现出大于约1×10⁴、大于约5×10⁴、大于约1×10⁵，或者大于或等于约5×10⁵或如本文所述的任何值的k_a(M^-1s^-1)。优选地，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出约8×10⁵的k_a(M^-1s^-1)。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白可以结合纤溶酶，并表现出小于约1×10^-3或小于约5×10^-4的k_d(s^-1)。优选地，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出约4.5×10^-4±0.2或如本文所述的任何值的k_d(s^-1)。

在本发明的任何方面，本发明的抗原结合蛋白可以结合纤溶酶，并表现出小于2mM、小于100μM、小于约100nM或者小于或等于约500pM的K_D。优选地，使用如本文所述的任何测定法，例如表面等离子体共振(SPR)(包括多循环SPR)来确定K_D。

本发明的抗原结合蛋白可以结合衍生自SEQ ID NO:33的肽。例如，本发明的抗原结合蛋白可以结合由SEQ ID NO:33的序列的4、5、7、8、9、10或更多个连续氨基酸残基组成的肽。更优选地，本发明的抗原结合蛋白可以结合由SEQ ID NO:34的序列的4、5、7、8、9、10或更多个连续氨基酸残基组成的肽。在一些实施例中，本发明的抗原结合蛋白结合包含SEQID NO:33的637至791残基、基本上由其组成或由其组成的肽。更优选地，根据SEQ ID NO:33中所示的纤溶酶序列，抗原结合蛋白至少结合残基His₆₀₃、Asp₆₄₆和Ala/Ser₇₄₁。

在本发明的任何方面，抗原结合蛋白不会显著降低或抑制tPA、凝血酶、胰蛋白酶、因子Xa(FXa)和血浆激肽释放酶中任何一种或多种的活性。

在任何实施例中，本发明的抗原结合蛋白不特异性结合丝氨酸-蛋白酶胰蛋白酶、凝血酶、激活的蛋白C、激肽释放酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、或其组合。

本发明提供了一种用于结合纤溶酶的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白包含：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，以及

FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区；

CDR1a、CDR2a和CDR3a各自是互补决定区；

其中这些框架区或互补决定区中任一个的序列如本文所述。

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，以及

FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区；

CDR1a、CDR2a和CDR3a各自是互补决定区；

其中这些互补决定区中任一个的序列具有如下表1中所述的氨基酸序列。优选地，框架区具有也如下表1中所述的氨基酸序列，包括特定残基处的氨基酸变化，这种变化可以通过比对衍生自每种抗体的各个框架区来确定。本发明还包括CDR1、CDR2和CDR3是来自VH的序列，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VL的序列的情况，或者CDR1、CDR2和CDR3是来自VL的序列，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VH的序列的情况。

本发明还提供了一种结合或特异性结合纤溶酶的抗原结合蛋白，并且其中该抗原结合蛋白竞争性抑制B10抗体(即，包含：包含SEQ ID NO:8中所示序列的VH和包含SEQ IDNO:7中所示序列的VL)与纤溶酶的结合。

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接头-FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区；

CDR1a、CDR2a和CDR3a各自是互补决定区；

如本文所定义，接头可以是化学物质、一个或多个氨基酸、或两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键。

本发明提供一种抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白包含(按N末端到C末端或C末端到N末端的顺序)SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白，其中该抗原结合结构域结合或特异性结合纤溶酶，其中该抗原结合结构域包含以下至少一项：

(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:4中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的互补决定区(CDR)1，含有与SEQ ID NO:5中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR2，以及含有与SEQ ID NO:6中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR3；

(ii)VH，该VH包含与SEQ ID NO:8中所示的序列至少约95％或96％或97％或98％或99％相同的序列；

(iii)VL，该VL包含含有与SEQ ID NO:1中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR1，含有与SEQ ID NO:2中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR2，以及含有与SEQ ID NO:3中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR3；

(iv)VL，该VL包含与SEQ ID NO:7中所示的序列至少约95％相同的序列；

(v)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:4中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:5中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:6中所示的序列的CDR3；

(vi)VH，该VH包含SEQ ID NO:8中所示的序列；

(vii)VL，该VL包含含有SEQ ID NO:1中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:2中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:3中所示的序列的CDR3；

(viii)VL，该VL包含SEQ ID NO:7中所示的序列；

(ix)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:4中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:5中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:6中所示的序列的CDR3；以及VL，该VL包含含有SEQID NO:1中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:2中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ IDNO:3中所示的序列的CDR3；或

(x)VH，该VH包含SEQ ID NO:8中所示的序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO:7中所示的序列。

在本发明的任何方面，该抗原结合结构域进一步包含以下至少一项：

(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:21中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的框架区(FR)1，含有与SEQ IDNO:22中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR2，含有与SEQ ID NO:23中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR3，以及含有与SEQ ID NO:24中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR4；

(ii)VL，该VL包含含有与SEQ ID NO:17中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR1，含有与SEQ ID NO:18中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR2，含有与SEQ ID NO:19中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR3，以及含有与SEQ ID NO:20中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR4；

(iii)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:21中所示的序列的FR1，含有SEQ ID NO:22中所示的序列的FR2，含有SEQ ID NO:23中所示的序列的FR3，以及含有SEQ ID NO:24中所示的序列的FR4；

(iv)VL，该VL包含含有SEQ ID NO:17中所示的序列的FR1，含有SEQ ID NO:18中所示的序列的FR2，含有SEQ ID NO:19中所示的序列的FR3，以及含有SEQ ID NO:20中所示的序列的FR4；或

(v)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:21中所示的序列的FR1，含有SEQ ID NO:22中所示的序列的FR2，含有SEQ ID NO:23中所示的序列的FR3，以及含有SEQ ID NO:24中所示的序列的FR4；以及VL，该VL包含含有SEQ ID NO:17中所示的序列的FR1，含有SEQ ID NO:18中所示的序列的FR2，含有SEQ ID NO:19中所示的序列的FR3，以及含有SEQ ID NO:20中所示的序列的FR4。

如本文所述，抗原结合蛋白可以是以下形式：

(i)单链Fv片段(scFv)；

(ii)二聚scFv(双-scFv)；

(iii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)或(ii)中之一；或

(iv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)或(ii)中之一。

进一步地，如本文所述，抗原结合蛋白可以是以下形式：

(i)双体抗体；

(ii)三体抗体；

(iii)四体抗体；

(iv)Fab；

(v)F(ab')2；

(vi)Fv；

(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；

(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一；或

(viv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)至(vii)之一。

前述抗原结合蛋白也可称为抗体的抗原结合结构域。

优选地，如本文所述的抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。典型地，抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。抗原结合蛋白可以为重组或经修饰的抗体形式(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类化抗体、去免疫抗体、同人源化抗体、半抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体)。抗体可以进一步包含化学修饰，如与活性剂或放射性标记或用于提高溶解度的试剂缀合或本文所述的其他修饰。

如本文所述，抗原结合蛋白可以是可变结构域。

本发明还提供了一种包含轻链可变区和重链可变区的抗纤溶酶抗体，

其中所述轻链可变区包含：

如SEQ ID NO:1中所示的CDR L1、如SEQ ID NO:2中所示的CDR L2以及如SEQ IDNO:3中所示的CDR L3；并且

其中所述重链可变区包含：

如SEQ ID NO:4中所示的CDR H1、如SEQ ID NO:5中所示的CDR H2以及如SEQ IDNO:6中所示的CDR H3。

在本发明的任何方面，抗纤溶酶抗体包含含有SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区。

在本发明的任何方面，抗纤溶酶抗体包含含有SEQ ID NO:8的序列的重链可变区。

在本发明的任何方面，抗纤溶酶抗体包含含有如SEQ ID NO:17中所示的FR L1、如SEQ ID NO:18中所示的FR L2、如SEQ ID NO:19中所示的FR L3以及如SEQ ID NO:20中所示的FR L4的轻链可变区。

在本发明的任何方面，抗纤溶酶抗体包含含有如SEQ ID NO:21中所示的FR H1、如SEQ ID NO:22中所示的FR H2、如SEQ ID NO:23中所示的FR H3以及如SEQ ID NO:24中所示的FR H4的重链可变区。

在本发明的任何方面，抗体为裸抗体。具体而言，抗体为非缀合形式且不适于形成缀合物。

在某些实施例中，本发明的抗原结合蛋白的互补决定区序列(CDR)可以根据IMGT编号系统来定义。

本文提到的“结合”纤溶酶的蛋白质或抗体为“特异性结合(binds specificallyto)”或“特异性结合(specifically binds to)”纤溶酶的蛋白质或抗体提供了文字支持。

本发明还提供了前述抗体的抗原结合结构域或抗原结合片段。

本发明还提供了包含如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab(单结构域抗体)、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体的融合蛋白。

本发明还提供了一种为与标记或细胞毒性剂缀合的如本文所述抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体或融合蛋白形式的缀合物。

本发明还提供了一种抗体，用于结合如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体(例如，双特异性抗体或三特异性抗体)、融合蛋白或缀合物。

本发明还提供了一种编码如本文所述的抗原结合蛋白、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物的核酸。

在一个实例中，这种核酸包含在其中该核酸与启动子可操作地连接的表达构建体中。这种表达构建体可以在载体中，例如在质粒中。

在涉及单多肽链抗原结合蛋白的本发明实例中，表达构建体可包含与编码该多肽链的核酸连接的启动子。

在涉及形成抗原结合蛋白的多条多肽链的实例中，表达构建体包含编码含有例如与启动子可操作地连接的VH的多肽的核酸和编码含有例如与启动子可操作地连接的VL的多肽的核酸。

在另一个实例中，表达构建体是双顺反子表达构建体，例如，包含按5'到3'顺序的以下可操作连接的组分：

(i)启动子

(ii)编码第一多肽的核酸；

(iii)内部核糖体进入位点；以及

(iv)编码第二多肽的核酸，

其中该第一多肽包含VH，并且第二多肽包含VL，反之亦然。

本发明还设想了单独的表达构建体，其中一个编码包含VH的第一多肽，且另一个编码包含VL的第二多肽。例如，本发明还提供一种组合物，该组合物包含：

(i)第一表达构建体，其包含编码含有与启动子可操作连接的VH的多肽的核酸；以及

(ii)第二表达构建体，其包含编码含有与启动子可操作连接的VL的多肽的核酸。

本发明提供了包含本文所述载体或核酸的细胞。优选地，该细胞是分离的、基本纯化的或重组的。在一个实例中，该细胞包含本发明的表达构建体或：

(ii)第二表达构建体，其包含编码含有与启动子可操作连接的VL的多肽的核酸，

其中第一和第二多肽缔合以形成本发明的抗原结合蛋白。

本发明的细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含抗原结合蛋白或包含如本文所述的CDR和/或FR序列或如本文所述的免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab(单结构域抗体)、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明还提供了一种诊断组合物，其包含抗原结合蛋白或包含如本文所述的CDR和/或FR序列或如本文所述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物、稀释剂以及任选地标记。

本发明还提供了一种试剂盒或制品，其包含抗原结合蛋白或包含如本文所述的CDR和/或FR序列或如本文所述的免疫球蛋白可变结构域、抗体、dab、双-scFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体、融合蛋白或缀合物。

如本文所述的抗原结合蛋白可包含人恒定区，例如IgG恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其混合物。在包含VH和VL的抗体或蛋白质的情况下，VH可连接到重链恒定区，且VL可连接到轻链恒定区。

在一个实例中，如本文所述的抗原结合蛋白包含IgG4抗体的恒定区或IgG4抗体的稳定的恒定区。在一个实例中，蛋白质或抗体包含在位置241处(根据Kabat的编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列]华盛顿特区美国卫生和公共服务部(Washington DC United StatesDepartment of Health and Human Services),1987和/或1991))具有脯氨酸的IgG4恒定区。

在一个实例中，如本文所述的抗原结合蛋白或如本文所述的抗原结合蛋白的组合物包含重链恒定区(包括稳定的重链恒定区)，其包含完全或部分具有或不具有C末端赖氨酸残基的序列的混合物。

在一个实例中，抗原结合蛋白包含本文披露的连接到或融合到IgG4恒定区或稳定的IgG4恒定区(例如，如上所述)的VH以及连接到或融合到κ轻链恒定区的VL。

本发明的抗原结合蛋白的功能特征将被视为经必要的修改后应用于本发明的抗体。

如本文所述的抗原结合蛋白可以是纯化的、基本上纯化的、分离的和/或重组的。

本发明的抗原结合蛋白可以是取自表达本发明抗原结合蛋白的杂交瘤已在其中生长的培养基的上清液的一部分。

本发明提供了一种在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性的方法，该方法包括向受试者施用本发明的纤溶酶抑制性抗原结合蛋白，从而抑制受试者中的纤溶酶活性。有需要的受试者可以包括患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者。

优选地，抑制纤溶酶活性包括抑制一种或多种选自由以下组成的组的纤溶酶底物的纤溶酶切割：纤维蛋白、纤维蛋白原、因子V、因子VIII和因子X、蛋白酶激活受体I、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、血管性血友病因子、玻连蛋白、前脑源性神经营养因子、补体C3和C5、腱生蛋白、骨钙素、含CUB结构域的蛋白1和其他蛋白酶如胶原酶。

本发明提供了一种在有需要的受试者中抑制纤维蛋白溶解的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中抑制纤维蛋白溶解。

本发明还提供了一种在受试者中恢复止血或抑制纤溶酶活性的方法，该受试者已经遭受创伤或已经遭受大出血或正在大出血(例如，由于手术、创伤或分娩后)，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中恢复止血或抑制纤溶酶活性。

本发明还提供了一种在受试者中治疗或预防链球菌感染的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中治疗或预防链球菌感染。在这方面，抗原结合蛋白可用于预防感染的复发，并且这被认为是预防该感染。

本发明还提供了一种用于在受试者中治疗与链球菌感染相关或由链球菌感染引起的病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中治疗与链球菌感染相关或由链球菌感染引起的病症。与链球菌感染相关或由链球菌感染引起的病症可以是本文所述的任何病症。在本发明的任何方面，链球菌感染可以是慢性或急性的。

本发明还提供了一种在受试者中降低链球菌感染的严重程度的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中降低链球菌感染的严重程度。

仍进一步，本发明提供了一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗原结合蛋白，从而在受试者中治疗或预防癌症。如本文所用，治疗癌症的方法包括抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展，包括抑制或预防癌症的转移的方法。

本发明提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性的药物方面的用途，包括用于在患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者中抑制纤溶酶活性。

本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于在受试者中恢复止血或抑制过度的纤溶酶活性的药物方面的用途，该受试者已经遭受创伤，或在手术或分娩后需要恢复止血或抑制纤溶酶活性。

本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于在受试者中恢复或止血或抑制过度的纤溶酶活性的药物方面的用途，该受试者已经遭受创伤。

本发明提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于在有需要的受试者中抑制纤维蛋白溶解的药物方面的用途。

本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于治疗或预防链球菌感染的药物方面的用途。

本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于治疗、预防由链球菌感染引起或与其相关的任何病症或疾病或降低其严重程度的药物方面的用途。

仍进一步，本发明提供了本发明的抗原结合蛋白在制造用于在受试者中治疗或预防癌症的药物方面的用途。该药物还可以用于抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展，包括癌症的转移。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的结合抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

该药物组合物优选地用于如本文所述的用途。因此，本发明提供了一种包含本发明抗原结合蛋白的药物组合物，用于在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性，包括用于在患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者中抑制纤溶酶活性。

本发明还提供了一种药物组合物，其用于在受试者中恢复止血或抑制过度的纤溶酶活性，该受试者已经遭受创伤，或在手术或分娩后需要恢复止血或抑制纤溶酶活性。

本发明还提供了一种包含本发明的抗原结合蛋白的药物组合物，用于在受试者中恢复或止血或抑制过度的纤溶酶活性，该受试者已经遭受创伤。

本发明还提供了一种包含本发明的抗原结合蛋白的药物组合物，用于治疗或预防链球菌感染。

本发明还提供了一种包含本发明的抗原结合蛋白的药物组合物，用于治疗、预防由链球菌感染引起或与其相关的任何病症或疾病或降低其严重程度。

此外，本发明提供了一种包含本发明的抗原结合蛋白的药物组合物，用于在受试者中治疗或预防癌症。该药物组合物还可以用于抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展，包括癌症的转移。

在本发明的任何方面，链球菌感染由来自链球菌科的细菌引起。优选地，该细菌来自链球菌(Streptococcus)属。更优选地，该细菌是A组链球菌(GAS)，优选化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。在本发明的某些方面，感染可以是由选自由以下组成的组的细菌引起的感染：化脓性链球菌、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。

因此，本发明的方法、用途或药物组合物可用于治疗、预防由本文提及的细菌引起或与其相关的任何疾病或降低其严重程度。例如，本发明的方法、用途或药物组合物可以用于治疗、预防由A组链球菌(GAS)引起或与其相关的任何疾病/感染或降低其严重程度，该疾病/感染包括但不限于咽炎、扁桃体炎、猩红热、蜂窝组织炎、丹毒、风湿热、皮肤和软组织感染、心内膜炎、骨和关节感染、感染的植入物、链球菌感染后的肾小球肾炎、坏死性筋膜炎、肌坏死性骨膜下脓肿、坏死性肺炎、化脓性肌炎、纵隔炎、心肌、肾周、肝和脾脓肿、脓毒性血栓性静脉炎和严重的眼部感染，包括眼内炎和淋巴管炎。

本发明的方法和用途适用于癌症的治疗或预防。示例性癌症包括血液学癌症、上皮起源的癌症、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨肉瘤、子宫内膜癌和卵巢癌。

本发明进一步提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白或其功能片段或衍生物的核酸分子。

本发明还提供了包含本文所述载体或核酸分子的细胞。

本发明还提供了一种包含本文所述细胞的动物或从其衍生的组织。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒或制品，其包括如本文所述的本发明的抗原结合蛋白或本发明的药物组合物。

在本发明的其他方面，提供了一种用于本文所述治疗或预防应用的试剂盒，该试剂盒包括：

-容纳本发明的抗原结合蛋白或药物组合物的容器；以及

-带有使用说明的标签或包装说明书。

如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含”及该术语的变型如“包括”和“含有”并不旨在排除进一步的添加剂、组分、整体或步骤。

前述段落中所述的本发明的进一步方面和这些方面的进一步实施例将从以举例方式给出并参考附图的以下描述中变得清楚。

附图说明

图1：B10与纤溶酶原和纤溶酶的结合。B10被固定在NiHc芯片上；通过多循环表面等离子体共振(SPR)测量B10(A)纤溶酶原和(B)纤溶酶的结合动力学，虚线代表符合实验数据的1:1Langmuir模型；(C)动力学常数(k_a和k_d)和亲和常数(K_D)的汇总表。

图2：B10对tPA介导的纤溶酶原激活的剂量依赖性抑制。(A)在溶液中EACA的存在下，或(B)在纤维蛋白凝块上，B10抑制由tPA介导的纤溶酶原激活产生的纤溶酶的活性。

图3：B10抑制SK介导的纤溶酶原激活。在整个测定过程中的任何时候，当B10被添加到反应中(以20倍摩尔过量)时，它立即抑制纤溶酶活性。该结果表明B10抑制纤溶酶活性。

图4：B10对纤溶酶和其他丝氨酸蛋白酶的酶活性的影响。(A)在B10或非抑制性纤溶酶原结合抗体(A01)的存在下，纤溶酶活性的进展曲线。在B10的存在下，没有检测到纤溶酶活性。(B)在B10(0-100nM)存在下测定纤溶酶活性，IC₅₀为24.3±1.4nM；在纤溶酶与B10为1:10比率时，记录了总抑制。(C)除了纤溶酶(*)，B10不抑制丝氨酸蛋白酶(包括人激活的激肽释放酶(HPKa)、蛋白C、因子XIIa、凝血酶、因子Xa、uPA和tPA)的酶活性。还显示了在初始抗体gAb存在下酶的活性。

图5：B10抑制链激酶与纤溶酶原的结合。(A)在B10或初始鸡AB(gAb)(0-500nM)存在下，使10nM纤溶酶原通过固定在CM4芯片上的链激酶。B10在浓度为62.5-500nM时显示出抑制作用。对照的初始鸡抗体gAb未显示出对Plg与SK结合的抑制作用。(B)在500nM Ab存在下纤溶酶原与SK结合的百分比，相对于无抗体对照归一化。

图6：B10与单一重组丝氨酸蛋白酶结构域结合。与单独的SP(虚线)或单独的B10(虚线)相比，尺寸排阻色谱显示更高分子量的复合物(SP+B10，实线)。

图7：与纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域(SP)结合的B10的晶体结构。SP/B10二元复合物的晶体结构显示，B10结合纤溶酶催化三联体。显示了SP，催化三联体以条状显示并被标记，B10轻链(LC)和重链(HC)被标记。顶部是二元复合物的卡通表示，并且底部显示了被标记和编号的关键残基，其参与分子间相互作用并如上所述被标记。虚线用于说明极性相互作用。

图8：B10抑制A组链球菌(GAS)产生纤溶酶(酶测定)。(上图)与B10结合的纤溶酶原与GAS一起孵育。用荧光底物测量产生的纤溶酶的活性。这里预计GAS产生纤溶酶是由链激酶(SK)介导的。(下图)在存在或不存在重组SK的情况下纤溶酶活性的进展曲线。

图9：B10抑制合成凝块的纤维蛋白溶解。在预制纤维蛋白凝块上测量纤维蛋白溶解，这些凝块通过在37℃下将3mg/ml纤维蛋白原、1U牛凝血酶；和10nM tPA混合2小时来制备。将45nM纤溶酶原与0-90nM B10；或α2AP；或0-6.25mM TXA混合，并添加到凝块的表面。在37℃下在浊度计上监测纤维蛋白溶解长达10小时。将实现50％凝块溶解所需的时间用于IC₅₀计算。对于B10所获得的IC₅₀值与α2AP和抑肽酶的IC₅₀值相当。

图10：B10抑制红细胞和血小板存在下的全血凝块溶解。凝块溶解的百分比(与阴性和阳性对照相比)显示为在阳性对照中实现完全溶解的时间点(30-40分钟)时抑制剂浓度的函数，并使用非线性回归作图以计算IC₅₀。在抑制全血凝块溶解方面，B10比α2AP更有效大约8倍，并且比抑肽酶更有效大约9倍。

具体实施方式

应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有替代性组合。所有这些不同组合构成本发明的多个替代性方面。

现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明旨在涵盖可以包括在如权利要求所限定的本发明范围内的所有替代性方案、修改方案以及等同方案。

大出血或出血是手术、损伤或凝血因子缺乏的严重或致命并发症。抑制纤溶酶介导的纤维蛋白溶解或凝块解凝的抗纤维蛋白溶解剂可以减少失血、紧急再次手术、严重大出血的发病率和死亡率。

未受抑制的纤溶酶溶解血栓(纤维蛋白溶解)并降解凝血因子(纤维蛋白原、因子V、因子VIII)，这损害凝血，从而增加出血风险。另外，未受抑制的纤溶酶激活中性粒细胞和巨噬细胞、增加趋化性和氧化应激，以及促进促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的释放。

自从50多年前首次使用以来，小分子纤溶酶抑制剂已被证明能减少出血和相关并发症。目前可获得的纤溶酶抑制剂典型地为小分子形式，其阻断酶活性位点或干扰纤溶酶与底物的相互作用。

赖氨酸类似物ε氨基己酸(EACA)和氨甲环酸(TX)模拟赖氨酸残基，并与纤溶酶克林格勒(kringles)上的赖氨酸结合位点相互作用，以阻断其与纤维蛋白的相互作用。由于它们的分子大小和作用机制，赖氨酸类似物具有低效力和中等特异性；它们在肾脏疾病中积聚并穿透血脑屏障和胎盘。赖氨酸类似物阻止纤溶酶原和tPA与纤维蛋白结合，从而抑制纤溶酶原激活和纤维蛋白溶解。通过相同的机制，赖氨酸类似物实际上可以通过阻断与a2-抗纤溶酶的克林格勒相互作用和通过溶液中的tPA或uPA增强纤溶酶原激活来增加纤溶酶活性。赖氨酸类似物还干扰纤溶酶原-纤溶酶与细胞受体的相互作用，并阻断纤溶酶原与组织因子的相互作用。赖氨酸类似物与其他含克林格勒的蛋白质(tPA、凝血酶(凝血酶原)、肝细胞生长因子、uPA、脂蛋白(a)的脱辅基蛋白(a))的相互作用的生物学效应尚未被很好地理解。赖氨酸类似物穿过胎盘和血脑屏障，导致心脏手术患者癫痫发作，并增加蛛网膜下腔大出血患者的脑梗塞。

主要临床试验旨在理解小分子纤溶酶原激活抑制剂在创伤中抑制纤维蛋白溶解和恢复止血方面的功效。这些研究揭示，小分子纤溶酶抑制剂受到非特异性作用机制、脱靶效应、低效力和对某些类型的大出血缺乏功效的限制。特别地，CRASH-2和MATTER试验研究了赖氨酸类似物氨甲环酸(TXA)的功效，并揭示了在损伤3小时内向重度患者施用TXA显著降低了死亡率。重要的是，这些研究还揭示了，每延迟施用15分钟，TXA的存活益处减少10％，在3小时后没有获得益处。据认为，这是由于体内凝血和纤维蛋白溶解蛋白质组的变化，导致uPA介导的纤溶酶原激活为纤溶酶的增加。因此，血浆中产生的纤溶酶导致由纤维蛋白原的降解和α2-抗纤溶酶的耗竭引起的非特异性纤维蛋白溶解潜能的增加。因此，还需要一种用于其中抑制纤溶酶原激活不再有用的临床情况的纤溶酶活性位点抑制剂。

需要具有更高特异性和效力的纤维蛋白溶解抑制剂，特别是在患有严重的、危及生命的大出血(如脑出血)的患者中，其中目前的疗法无效并且可能是有害的，部分是因为脱靶效应。创造纤溶酶的高度特异性催化抑制剂是具有挑战性的，因为它的酶活性位点与其他胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶具有显著的同源性。例如，最常用的纤溶酶活性位点抑制剂是抑肽酶。然而，这种分子是许多其他丝氨酸蛋白酶(包括胰蛋白酶、凝血酶、激活的蛋白C、激肽释放酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和其他蛋白酶)的非特异性抑制剂。由于与死亡率增加相关的安全性问题，抑肽酶在美国已经不再使用。因此，需要一种对其他丝氨酸蛋白酶具有最小抑制活性的纤溶酶特异性抑制剂。

本发明人已经开发了抗原结合蛋白，例如抗体，其结合纤溶酶并且抑制或降低其催化活性。

已经证明本发明的抗原结合蛋白特异性结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域，并经由与该蛋白质催化位点的相互作用抑制纤溶酶活性。

有利的是，本发明的抗原结合蛋白不抑制其他丝氨酸蛋白酶(包括tPA、凝血酶、胰蛋白酶、因子Xa和血浆激肽释放酶)的活性。

由于其结合并抑制或降低纤溶酶活性的能力，并且如本文进一步解释的，本发明的抗原结合蛋白可用于治疗、预防由纤溶酶和纤维蛋白溶解系统所介导的病症或疾病或延缓其进展。例如，本发明的抗原结合蛋白可用于促进创伤后的止血，或手术或分娩后大出血。

本发明的抗原结合蛋白也可用于治疗或预防细菌感染，其中细菌利用链激酶或相关酶来募集纤溶酶系统以促进宿主组织的侵袭。特别地，本发明的抗原结合蛋白可用于治疗或预防由链球菌属物种引起的感染。

纤溶酶系统还可以被侵入的肿瘤用于促进血管生成和转移。因此，本发明的抗原结合蛋白还具有抑制或减少炎症、肿瘤生长和转移活性的一个或多个方面的能力。

概况

贯穿本说明书，除非另外具体说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质成分、步骤组或物质成分组时，应视为涵盖这些步骤、物质成分、步骤组或物质成分组中的一项和多项(即一项或多项)。因此，如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该”包括复数方面，反之亦然，除非上下文另有清楚规定。例如，对“一种”的提及包括单种以及两种或更多种；对“一个”的提及包括单个以及两个或更多个；对“该”的提及包括单一以及两或更多；等等。

本领域的普通技术人员将理解，本发明易受不同于具体所述的变化和修改的那些变化和修改的影响。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独地或共同地提及的或指出的所有的步骤、特征和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何及所有组合。

本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。

本文提及的所有专利和公开物均通过引用以其全文并入。

本发明的范围不受本文所述的具体实例的限制，这些实例仅旨在用于举例说明的目的。功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。

除非另外具体说明，否则本文中的本发明的任何实例或实施例应视为经必要修改后适用于本发明的任何其他实例或实施例。

除非确切地另外定义，本文使用的所有技术和科学术语应视为具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、以及生物化学)普通技术人员通常理解的相同的含义。

除非另外指示，否则本披露中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术的来源在整个文献中被描述和解释，如J.Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning[分子克隆实用指南],约翰威利父子出版社(John Wiley and Sons)(1984)、J.Sambrook等人Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆:实验室手册],冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress)(1989)、T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:A Practical Approach[基础分子生物学：实用方法],第1和2卷,IRL出版社(1991)、D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach[DNA克隆：实用方法],第1-4卷,IRL出版社(1995和1996)，和F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],格林出版社联合公司以及威利跨学科(Greene Pub.Associates andWiley-Interscience)(1988，包括到目前为止的所有更新)、Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],冷泉港实验室,(1988)，以及J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology[免疫学现代方法],约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)(包括到目前为止的所有更新)。

本文中可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过在KabatSequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的Kabat序列],美国国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达,马里兰州,1987和1991，Bork等人,J Mol.Biol.[分子生物学杂志]242,309-320,1994，Chothia和LeskJ.Mol Biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987，Chothia等人Nature[自然]342,877-883,1989和/或Al-Lazikani等人,J Mol Biol[分子生物学杂志]273,927-948,1997中的讨论进一步澄清。

术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应理解为“X和Y”或“X或Y”，并应被视为对两种含义或任何一种含义提供明确支持。

如本文所用，术语“衍生自”应表示指定整体可从特定来源获得，尽管不一定直接从该来源获得。

本文提及的一系列例如残基应当理解为包括在内。例如，对“包含氨基酸56至65的区域”的提及将以包含的方式理解，即该区域包含在特定序列中编号为56、57、58、59、60、61、62、63、64和65的氨基酸序列。

选择的定义

纤溶酶在细胞迁移、组织重塑和细菌侵袭方面起着重要作用。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，其优先切割Lys-Xaa和Arg--Xaa键，比胰蛋白酶具有更高的选择性。纤溶酶是酶原纤溶酶原的活性形式。通过各种激活物对纤溶酶原的蛋白水解作用，纤溶酶原被激活为纤溶酶。纤溶酶原激活物如组织纤溶酶原激活物(tPA)或尿激酶(uPa)在Arg₅₆₁-Val₅₆₂键处切割人纤溶酶原分子，以产生活性纤溶酶。纤溶酶的两条所得链通过两条链间二硫键连接在一起。轻链(25kDa)携带催化中心(其包含催化三联体)并与胰蛋白酶和其他丝氨酸蛋白酶共享序列相似性。重链(60kDa)由五个称为克林格勒的高度相似的三环结构组成。一些克林格勒含有调节纤溶酶原/纤溶酶与纤维蛋白相互作用的赖氨酸结合位点。纤溶酶属于肽酶家族Si。

纤溶酶(或Plm)是一种七结构域糖蛋白，其包含1个Pap或pan-apple结构域、5个克林格勒结构域(KR 1至KR5)和1个丝氨酸蛋白酶(SP)结构域。无活性形式纤溶酶原(Plg)在血浆中以封闭和抗激活的构象循环。在定位到靶位点后，纤溶酶原结合靶(其包括纤维蛋白凝块和细胞表面受体)上的表面赖氨酸/精氨酸残基。结合经由克林格勒结构域上的赖氨酸结合位点(LBS)发生，这是一种触发纤溶酶原结构重排为开放构象的事件。当从封闭构象转变为开放构象时，KR-5和SP结构域之间的激活环暴露出来，并被纤溶酶原激活物(如组织纤溶酶原激活物或尿激酶纤溶酶原激活物)切割，以形成酶活性形式纤溶酶(Plm)。纤溶酶原激活系统受到宿主丝氨酸蛋白酶抑制剂的严格调节：纤溶酶原激活抑制剂1和2(PAI-1和PAI-2)。从靶释放的活性纤溶酶典型地被特异性抑制剂α-2-抗纤溶酶或管家酶α-2-巨球蛋白从循环中除去。

如本文所提供的术语“纤溶酶原”包括纤溶酶原的任何变体，包括Glu-纤溶酶原(Glu-Plg)、Lys-纤溶酶原(Lys-Plg)以及小型、中型和微型纤溶酶原。Lys-纤溶酶原是Glu-Plg的N-截短形式，由纤溶酶切割Glu-纤溶酶原形成。与Glu-Plg相比，Lys-纤溶酶原对纤维蛋白表现出更高的亲和力，并且被uPA和tPA更好地激活。中型纤溶酶原包含纤溶酶原的克林格勒结构域4和5以及轻链(丝氨酸蛋白酶结构域)。其通过切割来自Glu-纤溶酶原的克林格勒结构域1至3形成。小型纤溶酶原(也称为442Val-Plg或肿瘤原)由弹性蛋白酶在残基442(位于克林格勒结构域4内)处作用于Glu-纤溶酶原而产生。因此，小型纤溶酶原包含纤溶酶原的克林格勒结构域4、克林格勒结构域5和丝氨酸蛋白酶结构域的一部分。微型纤溶酶原由纤溶酶原的酶原结构域和一段连接肽以及附着在其N末端处的克林格勒5的少量残基组成。它由纤溶酶对纤溶酶原的作用产生。因此，微型纤溶酶原(或微型Plg)包含纤溶酶原的轻链(丝氨酸蛋白酶结构域)而没有克林格勒结构域。(参见例如，Shi等人(1980)JBiol.Chem.[生物化学杂志]263:17071-5)。像纤溶酶原一样，微型纤溶酶原被tPA和尿激酶激活以形成蛋白水解活性分子。人微型纤溶酶的分子量为大约29kDa，并且当与纤溶酶相比时，对纤维蛋白的亲和力较低。

仅出于命名的目的而非限制，人纤溶酶原(“glu-PLG”)的示例性氨基酸序列在SEQID NO:33中示出。包含hPlm丝氨酸蛋白酶结构域的序列在SEQ ID NO:34中示出，其中催化三联体残基带下划线并以粗体显示。

如本文所用，提及纤溶酶是指具有纤溶酶的至少一种生物化学或生物物理活性的分子。纤溶酶的生物化学或生物物理活性和结构可以与纤溶酶原的区别开来。

短语“抑制纤溶酶活性”或“降低纤溶酶活性”被理解为意指本发明的抗原结合蛋白抑制或降低纤溶酶的酶活性。此外，使用合适的体外、细胞或体内测定法测量活性，并且与在相同条件下但不含该抗原结合蛋白的相同测定法中的纤溶酶活性相比，活性被阻断或降低至少1％、5％、10％、25％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。优选地，在纤溶酶原被任何一种或多种纤溶酶原激活物激活后测量纤溶酶活性。纤溶酶原激活物是可以切割Arg₅₆₁-Val₅₆₂键(按照人纤溶酶原编号)的任何酶。示例性的切割纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，即纤溶酶原激活物，包括凝血蛋白因子IX、因子X和凝血酶原(因子II)、蛋白C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶、各种白细胞弹性蛋白酶、链激酶(SK)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和组织纤溶酶原激活物(tPA)以及纤溶酶。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是如下的蛋白质或多肽，该蛋白质或多肽由于其起源或衍生来源而未与在其天然状态下伴随它的天然缔合组分缔合；基本上不含来自相同来源的其他蛋白质。可使用本领域已知的蛋白质纯化技术使蛋白质基本上不含天然缔合组分或通过分离进行基本纯化。“基本纯化”意指蛋白质基本上不含污染物，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含污染物。

术语“重组”应理解为意指人工基因重组的产物。因此，在包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白的上下文中，该术语不涵盖在受试者体内天然发生的作为B细胞成熟期间发生的天然重组产物的抗体。然而，如果分离出此类抗体，则其应被认为是包含抗体抗原结合结构域的分离的蛋白质。类似地，如果使用重组手段分离和表达编码该蛋白质的核酸，则所得蛋白质为包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白质。重组蛋白还涵盖通过人工重组手段表达的蛋白质，在此情况下该蛋白质在细胞、组织或受试者中(例如，该蛋白在其中表达)。

术语“蛋白质”应被视为包含单个多肽链，即一系列通过肽键连接的连续氨基酸或一系列彼此共价或非共价连接的多肽链(即多肽复合物)。例如，可以使用合适的化学物质或二硫键共价连接该系列多肽链。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。蛋白质可以包括一种或多种非天然氨基酸。

术语“多肽”或“多肽链”将从前述段落理解为意指一系列通过肽键连接的连续氨基酸。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”应被视为是意指能够特异性结合抗原的抗体区域，即VH或VL或者包含VH和VL两者的Fv。抗原结合结构域不需要在整个抗体的情况下，例如，它可以是分离的(例如，结构域抗体)或另一形式(例如，如本文所述，如scFv)。

为了本披露的目的，术语“抗体”包括由于Fv内包含的抗原结合结构域而能够特异性结合一种或几种密切相关抗原(例如，纤溶酶)的蛋白质。该术语包括四链抗体(例如，两条轻链和两条重链)、重组或修饰抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类化抗体、去免疫抗体、同人源化(synhumanized)抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体可以进一步包含化学修饰，如与活性剂或放射性标记或用于提高溶解度的试剂缀合，例如本文所述抗体或其抗原结合片段的聚乙二醇化。

抗体通常包含恒定结构域，其可排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。抗体的示例性形式包括作为其基本单元的四链结构。全长抗体包括两条共价连接的重链(约50至70kD)和两条轻链(约23kDa)。轻链通常包含可变区(如果存在)和恒定结构域，并且在哺乳动物中为κ轻链或λ轻链。重链通常包含可变区和由铰链区连接到另外一个或多个恒定结构域的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链属于以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链也与其中一条重链共价连接。例如，这两条重链以及这些重链和轻链通过链间二硫键和非共价相互作用保持在一起。链间二硫键的数量在不同类型的抗体中可能有所不同。每条链都有N末端可变区(VH或VL，其中每个的长度为约110个氨基酸)和一个或多个C末端恒定结构域。轻链的恒定结构域(长度为约110个氨基酸的CL)与重链的第一恒定结构域(长度为330至440个氨基酸的CH1)对齐并二硫键合。轻链可变区与重链可变区对齐。抗体重链可包含2个或更多个另外的CH结构域(如CH2、CH3等)，并可包含CH1和CH2恒定结构域之间的铰链区。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一个实例中，抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(例如，人)抗体。在一个实例中，抗体重链缺失C末端赖氨酸残基。在一个实例中，抗体为人源化的、同人源化的、嵌合的、CDR移植的或去免疫化的。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，以指处于其基本完整形式的抗体，与抗体的抗原结合片段相反。具体而言，整个抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。

如本文所用，“可变区”指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链中能够特异性结合抗原的部分，并包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)以及框架区(FR)的氨基酸序列。例如，可变区包含三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选地FR4)以及三个CDR。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。

如本文所用，术语“互补决定区”(同义词CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在是特异性抗原结合的主要促成因素。每个可变区结构域(VH或VL)典型地有三个CDR，分别鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。VH的CDR在本文中也分别称为CDR H1、CDRH2和CDR H3，其中CDR H1对应于VH的CDR1，CDR H2对应于VH的CDR 2，并且CDR H3对应于VH的CDR 3。同样，VL的CDR在本文中分别称为CDR L1、CDR L2和CDR L3，其中CDR L1对应于VL的CDR 1，CDR L2对应于VL的CDR 2，并且CDR L3对应于VL的CDR 3。在一个实例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置根据以下定义：Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[具有免疫学意义的蛋白质的Kabat序列],美国国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州,1987和1991(本文中也称为“Kabat编号系统”)。在另一个实例中，根据增强的Chothia编号方案(Enhanced Chothia Numbering Scheme)(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)定义分配给CDR和FR的氨基酸位置。本发明不限于由Kabat编号系统定义的FR和CDR，而是包括所有编号系统，包括规范编号系统或Chothia和Lesk J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987；Chothia等人,Nature[自然]342:877-883,1989；和/或Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948,1997的编号系统；Honnegher和Plükthun J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309:657-670,2001的编号系统；或Giudicelli等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:206-211 1997中讨论的IMGT系统。在一个实例中，根据Kabat编号系统定义CDR。任选地，根据Kabat编号系统的重链CDR2不包含本文所列的五种C末端氨基酸，或者那些氨基酸中的任一种或多种被另一种天然发生的氨基酸取代。在这方面，Padlan等人,FASEB J.[FASEB杂志],9:133-139,1995确定重链CDR2的五个C末端氨基酸通常不参与抗原结合。

“框架区”(FR)是指除CDR残基以外的可变区残基。VH的FR在本文中也分别称为FRH1、FR H2、FR H3和FR H4，其中FR H1对应于VH的FR 1，FR H2对应于VH的FR 2，FR H3对应于VH的FR 3，并且FR H4对应于VH的FR 4。同样，VL的FR在本文中分别称为FR L1、FR L2、FR L3和FR L4，其中FR L1对应于VL的FR 1，FR L2对应于VL的FR 2，FR L3对应于VL的FR 3，并且FR L4对应于VL的FR 4。

如本文所用，术语“Fv”应被视为意指任何蛋白质，无论其由多个多肽还是单个多肽构成，其中VL和VH缔合并形成具有抗原结合结构域的复合物，即能够特异性结合抗原。形成抗原结合结构域的VH和VL可以位于单个多肽链中或位于不同的多肽链中。进一步地，本发明的Fv(以及本发明的任何蛋白质)可具有可结合或可不结合相同抗原的多个抗原结合结构域。该术语应理解为涵盖直接衍生自抗体的片段以及对应于使用重组手段产生的此类片段的蛋白质。在一些实例中，VH未连接到重链恒定结构域(CH)1和/或VL未连接到轻链恒定结构域(CL)。示例性含有Fv的多肽或蛋白质包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、scFv、双体抗体、三体抗体、四体抗体或更高阶复合物、或者连接到其恒定区或结构域的前述任一项(例如，CH2或CH3结构域，例如微型抗体)。“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可通过木瓜蛋白酶消化整个抗体以生成由完整轻链和部分重链组成的片段来产生，或可使用重组方式产生。抗体的“Fab”片段可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，以产生由完整轻链以及包含VH和单个恒定结构域的部分重链组成的分子来获得。以这种方式处理的每个抗体获得两个Fab'片段。Fab'片段也可以通过重组手段产生。抗体的“F(ab')2片段”由通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子(无需随后还原)来获得。“Fab2”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段的重组片段。“单链Fv”或“scFv”是包含抗体可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链可变区和重链可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。

如本文所用，术语“结合”在提及抗原结合位点或其抗原结合结构域与抗原的相互作用时意指该相互作用取决于抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般情况的蛋白质。如果抗体与表位“A”结合，则含有表位“A”的分子(或游离的、未标记的“A”)在含有经标记的“A”和该蛋白质的反应中的存在将减少与抗体结合的经标记的“A”的量。

如本文所用，术语“特异性结合(specifically binds或binds specifically)”应被视为意指本发明的抗原结合蛋白与特定抗原或表达相同抗原的细胞以与替代性抗原或细胞相比更频繁、更快速地、更大的持续时间和/或更大的亲和力反应或缔合。例如，抗原结合蛋白与纤溶酶(例如，人纤溶酶)结合的亲和力比与其他相关分子(如其他丝氨酸蛋白酶)结合的亲和力实质上更大(例如，1.5倍或2倍或5倍或10倍或20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)。在本发明的一个实例中，抗原结合蛋白“特异性结合”纤溶酶(优选人)，其亲和力是与相关的丝氨酸蛋白酶结合的至少1.5倍或2倍或更高(例如，5倍或10倍或20倍或50倍或100倍或200倍)。通常，但不是必须的，提及结合意味着特异性结合，并且每个术语应理解为对另一个术语提供明确的支持。

如本文所用，术语“不可检测地结合”应理解为意指抗原结合蛋白，例如抗体，以高于背景小于10％或8％或6％或5％的水平结合候选抗原。背景可以是在不存在蛋白质和/或存在阴性对照蛋白(例如，同种型对照抗体)的情况下检测到的结合信号水平和/或在存在阴性对照抗原的情况下检测到的结合水平。使用生物传感器分析(例如Biacore)检测结合水平，其中抗原结合蛋白被固定并与抗原接触。

如本文所用，术语“不显著地结合”应理解为意指本发明的抗原结合蛋白与多肽的结合水平在统计学上不显著高于背景，例如在不存在抗原结合蛋白和/或存在阴性对照蛋白(例如，同种型对照抗体)的情况下检测到的结合信号水平和/或在存在阴性对照多肽的情况下检测到的结合水平。使用生物传感器分析(例如Biacore)检测结合水平，其中抗原结合蛋白被固定并与抗原接触。

如本文所用，术语“表位”(同义词“抗原决定簇”)应理解为意指包含抗体的抗原结合结构域的抗原结合蛋白结合的纤溶酶区域。除非另有定义，否则该术语不必限于抗原结合蛋白进行接触的特定残基或结构。例如，该术语包括跨越抗原结合蛋白所接触氨基酸的区域和该区域外的5-10个(或更多个)或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实例中，表位包含一系列不连续的氨基酸，当抗原结合蛋白折叠时，这些氨基酸彼此靠近，即“构象表位”。熟练的技术人员还将意识到术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包括分子的化学活性表面分组，如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链，并且在某些实例中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。

如本文所用，术语“病症”指正常功能的中断或干扰，并且不限于任何特定病症，并将包括疾病或障碍。

如本文所用，术语“预防(preventing、prevent或prevention)”包括施用本发明的抗原结合蛋白以从而停止或阻碍病症的至少一种症状的发展。该术语还涵盖对缓解期受试者进行的用以预防或阻碍复发的治疗。

如本文所用，术语“治疗(treating、treat或treatment)”包括施用本文所述的抗原结合蛋白以从而减少或消除特定疾病或病症的至少一种症状。

如本文所用，术语“受试者”应指包括人在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人和非人灵长类动物。例如，受试者是人。

抗体

在一个实例中，根据任何实例如本文所述的抗原结合蛋白或纤溶酶结合蛋白是抗体。

用于产生抗体的方法是本领域已知的和/或描述于Harlow和Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],冷泉港实验室,(1988)中。通常，在此类方法中，将任选地与任何合适或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的纤溶酶(例如，人纤溶酶)或其区域(例如，细胞外区域)或其免疫原性片段或表位或表达和展示其的细胞(即，免疫原)施用至非人动物，例如，小鼠、鸡、大鼠、兔子、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。免疫原可以通过鼻内、肌内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或其他已知途径施用。

多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的不同时间点对免疫动物的血液取样来监测。如果需要实现期望的抗体滴度，可以进行一次或多次进一步的免疫接种。重复加强和滴定的过程，直到实现合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，将免疫的动物放血，并且分离和储存血清，和/或用动物来产生单克隆抗体(mAb)。

单克隆抗体是本发明考虑的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mAb”是指能够结合一种或多种相同抗原，例如抗原内相同表位的同质抗体群。该术语并不旨在就抗体来源或其制备方式进行限制。

对于mAb的生产，可以使用许多已知技术中的任一种，例如像，在US 4196265或Harlow和Lane(1988),同上中举例说明的程序。

例如，在足以刺激抗体产生细胞的条件下，用免疫原免疫合适的动物。啮齿动物如兔子、小鼠和大鼠是示例性动物。经基因工程化以表达人抗体的小鼠，例如不表达鼠抗体的小鼠，也可以用于产生本发明的抗体(例如，如WO 2002/066630中所述)。

在免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，用于mAb产生方案。这些细胞可以从脾脏、扁桃体或淋巴结的活组织检查中获得，或者从外周血样中获得。然后将来自免疫动物的B细胞与永生骨髓瘤细胞(通常来源于与用免疫原免疫的动物相同的物种)融合。

通过在选择性培养基中培养来扩增杂交体，该选择性培养基包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。示例性试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。

使扩增的杂交瘤经受抗体特异性和/或滴度的功能选择，例如像通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、斑点免疫测定等)。

可替代地，将ABL-MYC技术(美国麦迪逊WI 53713的NeoClone公司(NeoClone,Madison WI 53713,USA))用于产生分泌MAb的细胞系(例如，如Largaespada等人,J.Immunol.Methods.[免疫学方法杂志]197:85-95,1996中所述)。

还可以通过筛选展示文库，例如噬菌体展示文库来产生或分离抗体，例如，如US6300064和/或US 5885793中所述。例如，本发明人已经从噬菌体展示文库中分离了全人抗体。

本发明的抗体可以是合成抗体。例如，该抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体同人源化抗体、灵长类化抗体或去免疫抗体。

含抗体结合结构域的蛋白质

单结构域抗体

在一些实例中，本发明的蛋白质是或包含单结构域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dAb”互换使用)。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变区的单一多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(多曼提斯公司(Domantis,Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州；参见例如US 6248516)。

双体抗体、三体抗体、四体抗体

在一些实例中，本发明的蛋白质是或包含如WO 98/044001和/或WO 94/007921中所述的那些的双体抗体、三体抗体、四体抗体或更高阶蛋白质复合物。

例如，双体抗体是包含两条缔合的多肽链的蛋白质，每条多肽链包含结构V_L-X-V_H或V_H-X-V_L，其中V_L是抗体轻链可变区，V_H是抗体重链可变区，X是包含不足以使单个多肽链中的V_H和V_L缔合(或形成Fv)的残基的接头或者不存在，其中一条多肽链的V_H与另一条多肽链的V_L结合以形成抗原结合结构域，即，形成能够特异性结合一种或多种抗原的Fv分子。V_L和V_H在每条多肽链中可以相同，或者V_L和V_H在每条多肽链中可以不同，以形成双特异性双体抗体(即，包含两种具有不同特异性的Fv)。

单链Fv(scFv)

本领域技术人员将知道，scFv包含单个多肽链中的V_H和V_L区以及V_H和V_L之间的多肽接头，该接头使scFv能够形成抗原结合所期望的结构(即，使单个多肽链的V_H和V_L彼此缔合以形成Fv)。例如，该接头包含超过12个氨基酸残基，其中(Gly₄Ser)₃是scFv的更有利接头之一。

本发明还设想了二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中将单个半胱氨酸残基引入V_H的FR和V_L的FR中，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的Fv。

可替代地或另外，本发明涵盖二聚scFv，即包含两个通过非共价或共价键连接的scFv分子的蛋白质，例如，通过亮氨酸拉链结构域(例如，衍生自Fos或Jun)连接。可替代地，两个scFv通过具有足够长度的肽接头连接，以使两个scFv形成并结合抗原，例如，如US20060263367所述。

重链抗体

重链抗体在结构上不同于许多其他形式的抗体，只要它们包含重链但不包含轻链。因此，这些抗体也被称为“仅重链抗体”。例如，在骆驼和软骨鱼中发现了重链抗体(也称为IgNAR)。

为了将其与常规4链抗体中存在的重链可变区(称为“V_H结构域”)和常规4链抗体中存在的轻链可变区(称为“V_L结构域”)区分开，天然发生的重链抗体中存在的可变区在骆驼抗体中通常称为“V_HH结构域”，并且在IgNAR中称为V-NAR。

对骆驼重链抗体及其可变区以及生产和/或分离和/或使用它们的方法的一般描述可在以下参考文献WO 94/04678、WO 97/49805和WO 97/49805中找到。

关于软骨鱼重链抗体及其可变区以及生产和/或分离和/或使用它们的方法的一般描述尤其可在WO 2005/118629中找到。

包含其抗原结合结构域的其他抗体和蛋白质

本发明还设想了其他抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质，如：

(i)如US 5731168所述的“匙孔”双特异性蛋白质；

(ii)异源缀合物蛋白质，例如，如US 4676980所述；

(iii)使用化学交联剂产生的异源缀合物蛋白质，例如，如US 4676980所述；以及

(iv)Fab₃(例如，如EP 19930302894所述)。

蛋白质突变

本发明还提供了一种抗原结合蛋白或编码该蛋白的核酸，该核酸与本文披露的序列具有至少80％的同一性。在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白或核酸包含与本文披露的序列至少约85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列。

可替代地或另外，抗原结合蛋白包含与本文根据任何实例所述的V_H或V_L的一个或多个CDR至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的CDR(例如，三个CDR)。

在另一个实例中，本发明的核酸包含与编码具有本文根据任何实例所述的功能的抗原结合蛋白的序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列。本发明还涵盖编码本发明的抗原结合蛋白的核酸，由于遗传密码的简并性，其不同于本文举例说明的序列。

核酸或多肽的同一性％通过GAP(Needleman和Wunsch.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48,443-453,1970)分析(GCG程序)测定，其中间隙产生罚分＝5，且间隙延伸罚分＝0.3。查询序列的长度为至少50个残基，GAP分析将两个序列在至少50个残基的区域上对齐。例如，查询序列的长度为至少100个残基，GAP分析将两个序列在至少为100个残基的区域上对齐。例如，将两个序列在其整个长度上对齐。

本发明还设想了在严格杂交条件下与编码本文所述抗原结合蛋白的核酸杂交的核酸。“中等严格”在本文中定义为在2x SSC缓冲液、0.1％(w/v)SDS中在45℃至65℃范围内的温度或等同条件下进行的杂交和/或洗涤。“高严格”在本文中定义为在0.1x SSC缓冲液、0.1％(w/v)SDS或较低盐浓度中，在至少65℃的温度或等同条件下进行的杂交和/或洗涤。本文提及的特定严格水平涵盖使用本领域技术人员已知的SSC以外的洗涤/杂交溶液的等同条件。例如，本领域已知用于计算双链核酸的链将解离的温度(也称为解链温度或Tm)的方法。类似于(例如，在5℃或10℃内)或等于核酸Tm的温度被认为是高严格。中等严格应被认为在计算的核酸Tm的10℃至20℃或10℃至15℃内。

本发明还设想了本发明的抗原结合蛋白的突变形式，该抗原结合蛋白的突变形式与本文所示序列相比包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实例中，抗原结合蛋白包含10个或更少，例如9或8或7或6或5或4或3或2或1个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有类似侧链和/或亲水性和/或亲合性的氨基酸残基替换的取代。

具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在现有技术中定义，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。亲合性指数描述于例如Kyte和Doolittle J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],157:105-132,1982中，并且亲水性指数描述于例如US 4554101中。

本发明还设想了非保守氨基酸变化。例如，特别感兴趣的是用另一种带电荷的氨基酸和用中性或带正电的氨基酸取代带电荷的氨基酸。在一些实例中，抗原结合蛋白包含10个或更少，例如，9或8或7或6或5或4或3或2或1个非保守氨基酸取代。

在一个实例中，一个或多个突变发生在本发明的抗原结合蛋白的抗原结合结构域的FR内。在另一个实例中，一个或多个突变发生在本发明的抗原结合蛋白的CDR内。

用于产生抗原结合蛋白突变形式的示例性方法包括：

·DNA突变(Thie等人,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]525:309-322,2009)或RNA(Kopsidas等人,Immunol.Lett.[免疫学快报]107:163-168,2006；Kopsidas等人BMCBiotechnology[BMC生物技术],7:18,2007；和WO 1999/058661)；

·将编码该多肽的核酸引入突变细胞(例如XL-1Red、XL mutS和XL mutS Kanr细菌细胞(斯特拉塔根公司(Stratagene)))中；

·DNA改组，例如在Stemmer,Nature[自然]370:389-91,1994中所披露的；以及

·定点突变，例如，如Dieffenbach(编辑)和Dveksler(编辑)(于：PCR Primer:ALaboratory Manual[PCR引物:实验室手册],纽约冷泉港实验室,1995中)所述。

用于确定本发明的突变型抗原结合蛋白的生物活性的示例性方法对于本领域技术人员将而言是显而易见的和/或在本文中进行了描述，例如抗原结合。例如，本文描述了用于确定抗原结合、结合的竞争抑制、亲和力、缔合、解离和治疗功效的方法。

恒定区

本发明涵盖本文所述的抗原结合蛋白和/或包含抗体恒定区的抗体。这包括融合到Fc的抗体的抗原结合片段。

可用于产生本发明的蛋白质的恒定区序列可从许多不同来源获得。在一些实例中，蛋白质的恒定区或其部分衍生自人抗体。其恒定区或部分可衍生自任何抗体类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE；以及任何抗体同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实例中，恒定区为人同种型IgG4或稳定的IgG4恒定区。

在一个实例中，恒定区的Fc区具有减少的诱导效应子功能的能力，例如，与天然或野生型人IgG1或IgG3 Fc区相比。在一个实例中，效应子功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。用于评估含有Fc区的蛋白质的效应子功能水平的方法在本领域中是已知的和/或在本文中进行了描述。

在一个实例中，Fc区是IgG4 Fc区(即，来自IgG4恒定区)，例如人IgG4 Fc区。合适的IgG4 Fc区的序列对于技术人员来说是显而易见的，和/或可以在公开可用的数据库中获得(例如，可以从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)获得)。

在一个实例中，恒定区是稳定的IgG4恒定区。术语“稳定的IgG4恒定区”将被理解为意指如下的IgG4恒定区，该IgG4恒定区已被修饰以减少Fab臂交换或者经历Fab臂交换的倾向或者半抗体的形成或者形成半抗体的倾向。“Fab臂交换”是指对人IgG4进行的一种类型的蛋白质修饰，其中IgG4重链和附接的轻链(半分子)被转换为来自另一个IgG4分子的重-轻链对。因此，IgG4分子可能获得两个不同的Fab臂，识别两种不同的抗原(产生双特异性分子)。Fab臂交换在体内天然发生，并可通过纯化的血细胞或还原剂(如还原型谷胱甘肽)在体外诱导。当IgG4抗体解离形成两个分子，每个分子包含单一重链和单一轻链时，就会形成“半抗体”。

在一个实例中，稳定的IgG4恒定区包含根据Kabat系统的铰链区位置241处的脯氨酸(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列]华盛顿特区美国卫生和公共服务部(Washington DC United StatesDepartment of Health and Human Services),1987和/或1991)。根据EU编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列]华盛顿特区美国卫生和公共服务部(Washington DC United States Department ofHealth and Human Services),2001和Edelman等人,Proc.Natl.Acad.USA[美国国家科学院院刊],63,78-85,1969)，该位置对应于铰链区的位置228。在人IgG4中，这种残基通常是丝氨酸。在丝氨酸取代脯氨酸之后，IgG4铰链区包含序列CPPC。在这方面，本领域技术人员将知道，“铰链区”是抗体重链恒定区中富含脯氨酸的部分，其连接向抗体的两个Fab臂赋予移动性的Fc和Fab区。铰链区包含参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。根据Kabat的编号系统，它通常被定义为从人IgG1的Glu226延伸至Pro243。通过将形成重链间二硫键(S-S)的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置，其他IgG同种型的铰链区可与IgG1序列对齐(例如，参见WO 2010/080538)。

稳定的IgG4抗体的其他实例是其中人IgG4重链恒定区中位置409(根据EU编号系统)处的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代的抗体(例如，如WO2006/033386所述)。恒定区的Fc区可另外或可替代地包含选自由以下组成的组的残基：对应于405的位置处的丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(根据EU编号系统)。任选地，铰链区包含位置241处的脯氨酸(即，CPPC序列)(如上所述)。

在另一实例中，Fc区是经修饰以具有减少的效应子功能的区域，即“非免疫刺激Fc区”。例如，Fc区是包含在选自由268、309、330和331组成的组的一个或多个位置处的取代的IgG1 Fc区。在另一个实例中，Fc区是包含一个或多个以下变化E233P、L234V、L235A以及G236的缺失和/或一个或多个以下变化A327G、A330S和P331S的IgG1 Fc区(Armour等人,EurJ Immunol.[欧洲免疫学杂志]29:2613-2624,1999；Shields等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]276(9):6591-604,2001)。非免疫刺激性Fc区的另外的实例描述于例如Dall'Acqua等人,J Immunol.[免疫学杂志]177:1129-1138 2006；和/或Hezareh J Virol[病毒学杂志]；75:12161-12168,2001中。

在另一个实例中，Fc区是嵌合Fc区，例如，包含来自IgG4抗体的至少一个C_H2结构域和来自IgG1抗体的至少一个C_H3结构域，其中该Fc区包含在选自由240、262、264、266、297、299、307、309、323、399、409和427(EU编号)组成的组的一个或多个氨基酸位置处的取代(如WO 2010/085682中所述)。示例性取代包括240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F。

另外的修饰

本发明还设想了对包含Fc区或恒定区的抗体或抗原结合蛋白的另外的修饰。

例如，抗体包含增加蛋白质半衰期的一个或多个氨基酸取代。例如，抗体包含含有增加Fc区对新生儿Fc区(FcRn)的亲和力的一个或多个氨基酸取代的Fc区。例如，Fc区在较低pH，例如约pH 6.0下对FcRn的亲和力增加，以促进Fc/FcRn在核内体中的结合。在一个实例中，与在约pH 7.4下的亲和力相比，Fc区在约pH 6下对FcRn的亲和力增加，这有利于Fc在细胞再循环后重新释放到血液中。这些氨基酸取代而可用于通过减少从血液中的清除来延长蛋白质的半衰期。

根据EU编号系统，示例性氨基酸取代包括T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。另外或替代的氨基酸取代描述于例如US20070135620或US 7083784中。

蛋白质产生

在一个实例中，通过在足以产生蛋白质的条件下(例如，如本文所述和/或本领域已知的)培养杂交瘤来产生本文根据任何实例所述的抗原结合蛋白质

重组表达

在另一个实例中，本文根据任何实例所述的抗原结合蛋白都是重组的。

在重组蛋白的情况下，编码该重组蛋白的核酸可被克隆到表达构建体或载体中，然后将这些表达构建体或载体转染到不以其他方式产生该蛋白质的宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、或骨髓瘤细胞。用于表达蛋白质的示例性细胞为CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的，并且描述于例如Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],格林出版社联合公司以及威利跨学科(1988，包括到目前为止的所有更新)或Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],冷泉港实验室出版社(1989)中。很多克隆和体外扩增方法适合于构建重组核酸。生产重组抗体的方法在本领域中也是已知的，参见例如US 4816567或US 5530101。

分离后，将核酸可操作地连接到表达构建体或表达载体中的启动子，以进一步在无细胞系统或细胞中克隆(扩增DNA)或表达。

如本文所用，术语“启动子”要在其最广泛的背景下看待并包含基因组基因的转录调控序列，包括准确转录起始所需的TATA盒或起始元件，具有或不具有改变核酸的表达(例如，响应于发育和/或外部刺激，或以组织特异性方式)的另外的调控元件(例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本上下文中，术语“启动子”还用于描述重组、合成或融合核酸，或者赋予、激活或增强与其可操作连接的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可包含一个或多个特定调控元件的另外的拷贝，以进一步增强所述核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。

如本文所用，术语“可操作地连接到”意指相对于核酸定位启动子，使得核酸的表达由启动子控制。

许多用于在细胞中表达的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一项或多项：信号序列、编码蛋白质的序列(例如，衍生自本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。本领域技术人员将知道用于表达蛋白质的合适序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导物、α因子前导物或酸性磷酸酶前导物)或哺乳动物分泌信号(例如单纯疱疹病毒gD信号)。

哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、罗斯肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子的混合调节元件或其活性片段。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(293或293细胞亚克隆，用于悬浮培养生长；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

适于在酵母细胞(例如像选自包括毕赤酵母、酿酒酵母和波姆酵母的组的酵母细胞)中表达的典型启动子包括但不限于ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。

本领域技术人员已知用于将分离的核酸或包含其的表达构建体引入细胞中以进行表达的方法。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA引入细胞中的方法包括微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染如通过使用脂质转染胺(吉博科公司(Gibco)，马里兰州，美国)和/或cellfectin(吉博科公司，马里兰州，美国)、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击如通过使用DNA涂覆的钨或金颗粒(Agracetus公司，威斯康星州，美国)等。

用于产生该蛋白质的宿主细胞可在多种培养基中培养，取决于所用的细胞类型。可商购的培养基如Ham的Fl0(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基((MEM)(西格玛公司)、RPMl-1640(西格玛公司)和杜尔贝科氏改良伊格培养基((DMEM)，西格玛公司)适合于培养哺乳动物细胞。用于培养本文讨论的其他细胞类型的培养基在本领域中是已知的。

蛋白质的分离

用于分离蛋白质的方法在本领域中是已知的和/或在本文中进行了描述。

当抗原结合蛋白被分泌到培养基中时，可首先使用可商购蛋白质浓缩过滤器(例如，艾美康恩公司(Amicon)或密理博皮里康恩公司(Millipore Pellicon)超滤装置)浓缩来自此类表达系统的上清液。可在前述任何步骤中包含如PMSF等的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白质水解，且可包含抗生素以防止外来污染物的生长。可替代地或另外，可以从表达该蛋白质的细胞中过滤和/或分离上清液，例如，使用连续离心。

从细胞制备的抗原结合蛋白可使用例如离子交换、羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱(例如，蛋白质A亲和色谱或蛋白质G色谱)或前述的任何组合来纯化。这些方法是本领域已知的，并描述于例如WO 99/57134或Ed Harlow和DavidLane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],冷泉港实验室,(1988)中。

本领域技术人员还将知道，该蛋白质可被修饰以包含便于纯化或检测的标签，例如聚组氨酸标签(例如六组氨酸标签)、或流感病毒血凝素(HA)标签、或猿猴病毒5(V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。然后使用本领域中已知的方法纯化(如亲和纯化)所得蛋白质。例如，通过使包含该蛋白质的样品与特异性结合固定在固体或半固体支持物上的六组氨酸标签的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)接触，洗涤样品以去除未结合的蛋白质，随后洗脱结合的蛋白质，来纯化包含六组氨酸标签的蛋白质。可替代地或另外，在亲和纯化方法中使用结合标签的配体或抗体。

抗原结合蛋白的活性测定

与纤溶酶及其突变体结合

本领域技术人员从本文的披露内容中将清楚地看到，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶。用于评估与蛋白质的结合的方法是本领域已知的，例如描述于Scopes(于:Proteinpurification:principles and practice[蛋白质纯化：原理与实践],第三版,施普林格维拉格(Springer Verlag),1994)中。这种方法通常涉及固定抗原结合位点并使其与标记抗原(纤溶酶)接触。在洗涤以去除非特异性结合蛋白后，检测标记的量以及因此结合的抗原的量。当然，可以标记抗原结合蛋白并固定抗原。也可以使用平移式测定。可替代地或另外，可以使用表面等离子体共振测定。

任选地，测定针对纤溶酶或其表位的固定化抗原结合蛋白的解离常数(Kd)、缔合常数(Ka)和/或亲和常数(K_D)。在一个实例中，纤溶酶结合蛋白的“Kd”或“Ka”或“K_D”通过放射性标记或荧光标记的纤溶酶配体结合测定法来测量。在“Kd”的情况下，在一系列滴定的未标记的纤溶酶存在下，该测定用最小浓度的标记的纤溶酶或其表位平衡抗原结合蛋白。在洗涤除去未结合的纤溶酶或其表位后，测定标记的量，其指示蛋白质的Kd。

根据另一个实例，Kd、Ka或K_D通过使用表面等离子体共振测定法来测量，例如，使用具有固定化纤溶酶或其区域或固定化抗原结合蛋白的BIAcore表面等离子体共振(新泽西州皮斯卡塔韦的BIAcore公司(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ))。

测定抑制活性

本发明的抗原结合蛋白优选地能够抑制纤溶酶活性。有利的是，本发明的抗原结合蛋白以与纤溶酶活性的生理抑制剂或纤溶酶活性的药理学抑制剂相当或显著更高的水平抑制纤溶酶介导的凝块溶解。

本领域已知各种测定法用于评估蛋白质抑制或降低纤溶酶活性的能力。

在一个实例中，抗原结合蛋白抑制纤溶酶对任何底物的蛋白水解。优选地，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶，并防止丝氨酸蛋白酶结构域结合和/或切割纤溶酶底物。优选地，本发明的抗原结合蛋白结合或空间屏蔽纤溶酶的催化三联体，使得催化三联体不能切割纤溶酶底物，其中催化三联体包含SEQ ID NO:33的残基His603、Asp646和Ala/Ser741(其等同于使用胰凝乳蛋白酶编号的His57、Asp102和Ser195)。因此，在优选的实施例中，本发明的抗原结合蛋白是抗催化抗原结合蛋白。

优选地，本发明的抗原结合蛋白抑制或防止切割纤溶酶的任何已知底物，包括但不限于：纤维蛋白、纤维蛋白原、因子V、因子VIII和因子X、蛋白酶激活受体I、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、血管性血友病因子、玻连蛋白、前脑源性神经营养因子、补体C3和C5、腱生蛋白、骨钙素、含CUB结构域的蛋白1和其他蛋白酶如胶原酶。

本发明的抗原结合蛋白还可以抑制链激酶与纤溶酶的结合，或者抑制病原体衍生的蛋白的结合，该蛋白以与链激酶相似的机制结合纤溶酶。更具体地，已知由化脓性链球菌分泌的链激酶围绕纤溶酶原/纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域，并且一旦结合，则激活纤溶酶原形成纤溶酶。本发明的抗原结合蛋白有利地抑制链激酶与纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的结合，从而抑制通过由链激酶激活纤溶酶原所介导的纤溶酶活性。

例如在实例2、5和6中，本文描述了用于测定纤溶酶活性抑制的示例性方法。

本发明的抗原结合蛋白还可用于需要检测生物样品中纤溶酶和/或纤溶酶原的应用中。例如，本发明的抗原结合蛋白可用于诊断应用，包括蛋白质用于组织学和ELISA以及类似应用，由此抗原结合蛋白与靶蛋白的结合可以提供有用的诊断信息。

待治疗的病症

本发明的抗原结合蛋白可用于最小化或减少手术、损伤后或凝血因子缺乏个体的大出血或出血。在这种情况下使用抗原结合蛋白抑制纤溶酶介导的纤维蛋白溶解或凝块解凝，从而减少失血并降低或最小化输血需求。输血伴随着高风险的不匹配、过敏反应、多器官功能障碍和感染，从而导致发病率和死亡率增加。

本发明的抗原结合蛋白还可以用于预防其他病症(如血友病、月经过多、血管性血友病综合征)中的出血和血栓溶解诱导的出血。

本发明的抗原结合蛋白可用于在许多临床情况下抑制纤维蛋白溶解，包括减少已经经历心脏手术、整形外科手术、神经外科手术、肝移植、血管手术、胸外科手术、妇科手术的患者，或患有终末期肾病、围产期出血、胃肠出血、创伤、创伤性脑损伤、颅内出血和蛛网膜下腔大出血的患者的出血。换句话说，本发明的抗原结合蛋白可用于抑制处于纤维蛋白溶解亢进状态的个体中的纤溶酶。

因此，本发明的抗原结合蛋白可用于在需要抑制纤溶酶活性的广泛情况下抑制纤维蛋白溶解。

本发明的抗原结合位点还可用于治疗或预防与细菌的存在或水平增加相关或由其引起的任何病症，该细菌通过链激酶和相关酶介导其发病机理。

化脓性链球菌或A组链球菌(GAS)是一种兼性的革兰氏阳性球菌，其以链状生长，并在人类中引起多种感染，包括咽炎、扁桃体炎、猩红热、蜂窝组织炎、丹毒、风湿热、链球菌感染后的肾小球肾炎、坏死性筋膜炎、肌坏死和淋巴管炎。

因此，本发明的抗原结合蛋白可用于抑制或预防由化脓性链球菌、停乳链球菌或肺炎链球菌引起的皮肤色素沉着或炎症、脓疱病、咽炎、扁桃体炎、猩红热、蜂窝织炎、丹毒、风湿热、链球菌感染后的肾小球肾炎、坏死性筋膜炎、肌坏死和淋巴管炎。

本发明的抗原结合蛋白还可用于抑制肿瘤转移，已知肿瘤转移也能募集纤溶酶系统。可用本发明的抗原结合蛋白治疗的示例性癌症包括囊性和实体肿瘤、骨和软组织肿瘤，包括肛门组织、胆管、膀胱、血细胞、肠、脑、乳腺、类癌、宫颈、眼、食管、头颈、肾、喉、白血病、肝、肺、淋巴结、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤(例如鳞状细胞癌)、肉瘤、胃、睾丸、甲状腺、阴道、外阴肿瘤。软组织肿瘤包括良性单体性施旺氏细胞瘤、硬纤维瘤、脂母细胞瘤、脂肪瘤、子宫平滑肌瘤、透明细胞肉瘤、皮肤纤维肉瘤、尤因肉瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、腺泡横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。特定骨肿瘤包括非骨化性纤维瘤、单房性骨囊肿、内生软骨瘤、动脉瘤性骨囊肿、成骨细胞瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨化性纤维瘤和釉质瘤、骨巨细胞瘤、纤维发育不良、尤文肉瘤嗜酸性肉芽肿、成骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和转移癌。白血病包括急性淋巴母细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病。

其他实例包括乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞肿瘤、肝细胞瘤/胆管细胞癌、神经内分泌肿瘤、垂体肿瘤、小20圆细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、间质莱迪希细胞瘤、塞尔托立细胞瘤(Sertoli cell tumor)、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口腔肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食管肿瘤、喉肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和威尔姆氏肿瘤。

组合物

在一些实例中，如本文所述的抗原结合蛋白可经口、肠胃外施用，通过吸入喷雾、吸附、吸收施用，局部(包括作为喷雾剂或洗剂)、直肠、鼻、颊、阴道、脑室内施用，以含有常规无毒的药学上可接受的载体的剂量配制品经由植入贮存器施用，或通过任何其他方便的剂型施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、鞘内、脑室内、胸骨内和颅内注射或输注技术。

用于将抗原结合蛋白制备成适合于向受试者施用的形式(例如药物组合物)的方法是本领域已知的，并且包括例如以下中所述的方法：Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学](第18版,马克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿,宾夕法尼亚州,1990)以及U.S.Pharmacopeia:National Formulary[美国药典：国家处方集](麦克出版公司(Mack Publishing Company),伊斯顿,宾夕法尼亚州,1984)。

本发明的药物组合物特别可用于肠胃外施用，如静脉内施用或向器官或关节的体腔或内腔施用。用于施用的组合物通常将包含抗原结合蛋白溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。组合物可以含有如接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本发明的抗原结合蛋白在这些配制品中的浓度可以广泛变化，并且将主要根据所选择的特定施用方式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等来选择。示例性载体包括水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用非水性媒介物，如混合油和油酸乙酯。脂质体也可用作载体。这些媒介物可含有少量的增强等渗性和化学稳定性的添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。

本发明的抗原结合蛋白可以被配制用于局部化或局部施用，如用于局部应用于需要治疗的皮肤或组织。用于局部施用的配制品典型地包含与一种或多种活性剂组合的局部媒介物，有或没有另外的任选组分。本发明的药物组合物可以为用于局部施用的喷雾剂、乳膏、凝胶、洗液等形式。

合适的局部媒介物和另外的组分是本领域熟知的，并且显然媒介物的选择将取决于特定的物理形式和递送方式。局部媒介物包括有机溶剂，如醇(例如，乙醇、异丙醇或甘油)、二醇(如丁烯、异戊二烯或丙二醇)、脂肪醇(如羊毛脂)、水和有机溶剂的混合物以及有机溶剂的混合物(如醇和甘油)、基于脂质的物质(如脂肪酸)、酰基甘油，包括油(如矿物油)，以及天然或合成来源的脂肪、磷酸甘油酯、鞘脂和蜡、基于蛋白质的物质(如胶原和明胶)、基于硅酮的物质(非挥发性和挥发性的)，以及基于碳氢化合物的物质(如微海绵和聚合物基质)。

组合物可以进一步包括一种或多种适于提高所应用配制品的稳定性或有效性的组分，如稳定剂、悬浮剂、乳化剂、粘度调节剂、胶凝剂、防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透促进剂、保湿剂和持续释放材料。此类组分的实例描述于Martindale-The Extra Pharmacopoeia[马丁代尔大药典](伦敦英国医药出版社(Pharmaceutical Press,London)1993)和Martin(编辑)，Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿氏药物科学]中。配制品可以包含微胶囊，如羟甲基纤维素或明胶微胶囊、脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒或纳米胶囊。

局部配制品可以制备成多种物理形式，包括例如固体、糊剂、霜剂、泡沫、洗剂、凝胶、粉末、含水液体、乳剂、喷雾剂和皮肤贴剂。此类剂型的物理外观和粘度可以由存在于配制品中一种或多种乳化剂和一种或多种粘度调节剂的存在和数量来控制。固体通常是坚硬的和不可倾倒的，并且通常被配制成条或棒，或颗粒形式。固体可以是不透明的或透明的，并且任选地可以含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂以及增加或增强最终产品功效的其他活性成分。霜剂和洗剂通常彼此相似，主要区别在于它们的粘度。洗剂和霜剂二者可以是不透明的、半透明的或透明的，并且通常含有乳化剂、溶剂和粘度调节剂，以及保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂以及增加或增强最终产品功效的其他活性成分。可以制备具有一定粘度范围(从粘稠或高粘度至稀薄或低粘度)的凝胶。这些配制品，像洗剂和霜剂一样，也可以含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂以及增加或增强最终产品功效的其他活性成分。液体比霜剂、洗剂或凝胶更稀薄，并且通常不含乳化剂。液体局部用产品通常含有溶剂、乳化剂、保湿剂、润肤剂、芳香剂、染料/着色剂、防腐剂以及增加或增强最终产品功效的其他活性成分。

用于局部配制品的乳化剂包括但不限于离子乳化剂鲸蜡硬脂醇、非离子乳化剂如聚氧乙烯油基醚、PEG-40硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-12、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇聚醚-30、鲸蜡硬脂醇聚醚醇、PEG-100硬脂酸酯和硬脂酸甘油酯。合适的粘度调节剂包括但不限于保护胶体或非离子胶，如羟乙基纤维素、黄原胶、硅酸镁铝、二氧化硅、微晶蜡、蜂蜡、石蜡和棕榈酸鲸蜡酯。凝胶组合物可以通过添加胶凝剂来形成，如脱乙酰壳多糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚季铵盐、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆或氨化甘草酸盐。合适的表面活性剂包括但不限于非离子、两性、离子和阴离子表面活性剂。例如，聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂酰胺DEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺MEA、油基甜菜碱、椰油酰胺丙基磷脂酰PG-氯化二铵和月桂醚硫酸铵中的一种或多种可以用于局部配制品中。

防腐剂包括但不限于抗菌剂，如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、苯甲酸和甲醛，以及物理稳定剂和抗氧化剂，如维生素E、抗坏血酸钠/抗坏血酸和没食子酸丙酯。合适的保湿剂包括但不限于乳酸和其他羟基酸及其盐、甘油、丙二醇和丁二醇。合适的润肤剂包括羊毛脂醇、羊毛脂、羊毛脂衍生物、胆固醇、矿脂、异硬脂醇新戊酸酯和矿物油。合适的芳香剂和颜色包括但不限于FD&C红40号和FD&C黄5号。可以包含在局部配制品中的其他合适的另外的成分包括但不限于研磨剂、吸收剂、抗结块剂、消泡剂、抗静电剂、收敛剂(如金缕梅)、酒精和草药提取物如甘菊提取物、粘合剂/赋形剂、缓冲剂、螯合剂、成膜剂、调理剂、推进剂、遮光剂、pH调节剂和保护剂。

局部用组合物的典型递送方式包括使用手指施加、使用物理施加器(如布、纸巾、棉签、棒或刷子)施加、喷射(包括喷雾、气溶胶或泡沫喷射)、滴管施加、喷洒、浸泡和冲洗。还可以使用控释媒介物，并且组合物可以被配制用于透皮施用(例如，作为透皮贴剂)。

在配制后，本发明的抗原结合蛋白将以与剂量配制品相容的方式和治疗/预防有效的量施用。配制品易于以各种剂型施用，如上述类型的可注射溶液，但还考虑了其他药学上可接受的形式，例如用于口服施用的片剂、丸剂、胶囊或其他固体、栓剂、阴道栓剂、鼻腔溶液或喷雾剂、气雾剂、吸入剂、脂质体形式、凝胶、霜剂、喷雾剂等。还可以使用药物“缓释”胶囊或组合物。缓释配制品通常被设计成在较长时间内提供恒定的药物水平，并可以用于递送本发明的抗原结合蛋白。

WO 2002/080967描述了用于施用包含用于治疗例如哮喘的抗体的雾化组合物的组合物和方法，其也适合于施用本发明的抗原结合蛋白。

施用剂量和施用时间

本发明的抗原结合蛋白的合适剂量将根据抗原结合蛋白的特异性、待治疗的病症和/或正在治疗的受试者而变化。熟练的医师有能力确定合适的剂量，例如，从次优剂量开始，逐步修改剂量以确定最佳或可用剂量。可替代地，为了确定治疗/预防的适当剂量，使用来自细胞培养测定或动物研究的数据，其中合适的剂量在循环浓度的范围内，包括毒性很小或没有毒性的活性化合物的ED₅₀。该剂量可以取决于所采用的剂型以及使用的施用途径而在该范围内变化。治疗/预防有效剂量可从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可配制剂量以达到循环血浆浓度范围，包括在细胞培养中测定的IC₅₀(即达到症状的半最大抑制的化合物浓度或量)。这类信息可以用来更精确地确定用于人中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。

在一些实例中，本发明的方法包括施用预防或治疗有效量的本文所述蛋白质。

可以基于接受本发明抗原结合蛋白的受试者的临床状态来确定施用时机。例如，在受试者已经遭受创伤的情况下，应当理解的是，本发明的抗原结合蛋白可用于在创伤后尽可能快地施用，以便抑制受试者的纤溶亢进状态。

术语“治疗有效量”是指当向需要治疗的受试者施用时，改善受试者的预后和/或状态和/或将本文所述临床病症的一个或多个症状减少或抑制至低于作为该病症的临床诊断或临床特征观察到并接受的水平的量。给受试者的施用量取决于待治疗病症的特定特征、正治疗的病症的类型和阶段、施用方式、以及受试者的特征(如一般健康状况、其他疾病、年龄、性别、基因型和体重)。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。因此，该术语不应解释为将本发明限于特定量(例如一种或多种蛋白质的重量或量)，而是本发明涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何量的一个或多个抗原结合蛋白。

如本文所用，术语“预防有效量”应被视为意指足以预防或抑制或延迟临床病症的一种或多种可检测的症状的出现的量的蛋白质。本领域技术人员将知道，这个量将根据例如施用的一种或多种特定抗原结合蛋白和/或特定受试者和/或病症的类型或严重程度或水平和/或病症的易感性(遗传或其他)而变化。因此，该术语不应解释为将本发明限于特定量(例如一个或多个抗原结合蛋白的重量或量)，而是本发明涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何量的一个或多个抗原结合蛋白。

试剂盒

本发明另外包括包含以下一项或多项的试剂盒：

(i)本发明的抗原结合蛋白或一种或多种编码该抗原结合蛋白的表达构建体；

(ii)本发明的细胞；

(iii)本发明的复合物；或

(iii)本发明的药物组合物。

在用于检测纤溶酶的试剂盒的情况下，该试剂盒还可以包括检测装置，例如，连接到本发明的抗原结合蛋白。

在用于治疗/预防用途的试剂盒的情况下，该试剂盒可另外包含药学上可接受的载体。

任选地，本发明的试剂盒与关于在本文根据任何实例所述的方法中使用的说明书一起包装。

表1：氨基酸和核苷酸序列概述

表2：B10抗体和纤溶酶的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域之间的关键相互作用。

实施例

实例1：B10抗体的生产

通过在鸡中引起对全长纤溶酶原的抗体反应来获得结合纤溶酶的抗体。通过PCR从鸡cDNA扩增抗体可变重链和轻链(VH和VL)，并经由柔性接头连接在一起以创建scFv文库。

通过经由ELISA和Biacore SK介导的纤溶酶原激活筛选纤溶酶原结合抗体进行选择，并进行纤维蛋白溶解测定以鉴定防止或抑制纤溶酶原激活为纤溶酶或抑制纤溶酶活性的抗体。

实例2：结合纤溶酶活性位点的抗体B10的表征

SPR测定

通过胺偶联将鸡抗体固定在系列S CM4(通用电气医疗集团(GE healthcare))芯片上。在蛋白酶抑制剂混合物的存在下，使用Biacore T200(通用电气医疗集团)在由10mMHEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％Tween20组成的缓冲液中，分析浓度范围为0.39nM至高达50nM的纤溶酶原或纤溶酶与本发明抗体的结合。以30μl/min注射纤溶酶原/纤溶酶进行180s缔合，随后解离600s。在每个循环结束时，在下一次注射之前，用pH 1.8的10mM甘氨酸再生传感器芯片，进行最少6个循环。为了获得动力学参数，使用Biacore T200评估软件(通用电气医疗集团)用Langmuir 1:1结合模型拟合传感图。

结合实验的结果(图1)表明，本发明的抗原结合蛋白结合纤溶酶原和纤溶酶二者，但与纤溶酶相比对纤溶酶原具有略微更高的亲和力。

B10抑制由tPA介导的纤溶酶原激活形成的纤溶酶的活性

在溶液中：

在室温下，在20mM EACA存在下，将20nM的纤溶酶原与各种B10浓度(0-200nM)混合30分钟。在孵育后，使用荧光底物(H-Ala-Phe-Lys-AMC，巴亨公司(Bachem))在FluostarOmega平板读数器(BMG Labtech公司)中测量4nM tPA的纤溶酶原激活，激发和发射波长分别为355nm和460nm。在GraphPad Prism 6中，将进程曲线拟合到非线性指数方程：

Y＝Y₀*exp(激活率*X)

其中Y₀是X＝0时的Y值。相对于相应的B10浓度绘制激活率，以产生抑制曲线，该曲线可以在GraphPad Prism 6用抑制剂相比于响应模型拟合：

Y＝底部+(顶部-底部)/(1+((X^坡)/(IC₅₀ ^坡)))

其中顶部和底部是荧光读数中的平台，并且坡是曲线陡度的量度。IC₅₀值，即抑制溶液中50％tPA介导的纤溶酶原激活的B10浓度，为21.51±2.28nM。

关于纤维蛋白：

在预制纤维蛋白凝块的表面上测量纤溶酶原激活，该凝块通过在37℃下将3mg/ml纤维蛋白原(班克西亚科技公司(Banksia Scientific))；1U牛凝血酶(Jomar生命研究公司)；和10nM tPA(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))混合2小时来制备。将与浓度(0-2μM)的B10混合的100nM纤溶酶原添加到凝块的表面。如上所述，使用200μM荧光底物(H-Ala-Phe-Lys-AMC，巴亨公司)监测纤溶酶活性。如上所述计算纤溶酶原激活率和IC₅₀。对于抑制纤维蛋白上tPA介导的纤溶酶原激活所获得的IC₅₀值为86±11.6nM。结果在图2中示出。

B10抑制由SK介导的纤溶酶原激活形成的纤溶酶的活性

将链激酶对纤溶酶原的激活用于评估本发明抗体的能力。在37℃下，用5nM的重组链激酶激活50nM的纤溶酶原。使用200μM纤溶酶荧光底物H-Ala-Phe-Lys-AMC(巴亨公司)，在Fluostar Omega平板读数器(BMG Labtech公司)中，经由分别为355nm和460nm的激发和发射波长，监测纤溶酶原激活的进程。在该过程中，在特定时间点(t＝0、t＝60分钟和t＝160分钟)分别添加0.5μM抗体。添加HEPES缓冲盐水代替抗体作为阴性对照。

图3中的结果表明，在整个测定过程中的任何时候，当B10抗体被添加到反应中时，它立即抑制纤溶酶活性。

B10对纤溶酶和其他血浆蛋白酶活性的影响

在200μM荧光底物(H-Ala-Phe-Lys-AMC，巴亨公司)存在下，在Fluostar Omega平板读数器(BMG Labtech公司)中，经由分别为355nm和460nm的激发和发射波长，测量纤溶酶(血液技术公司(Haematologic Technologies))活性。B10和A01(一种非抑制性纤溶酶原抗体)在10:1抗体:纤溶酶比率下的进展曲线。与A01相比，B10显示出对Plm活性的完全抑制。使用Fluostar Omega平板读数器(BMG Labtech公司)，经由分别为355nm和460nm的激发和发射波长，在37℃下测量抗体B10(0-200nM)存在下的纤溶酶(20nM)活性。测定IC₅₀为24.3±1.4nM。

为了测试与其他血浆丝氨酸蛋白酶的交叉反应性，将250nM的B10与10nM的人血浆蛋白酶(即血浆激肽释放酶(Molecular Innovations公司)、因子Xa(MolecularInnovations公司)、因子XIIa(酶研究实验室(Enzyme research laboratories))、蛋白C(Molecular Innovations公司)、凝血酶(Molecular Innovations公司)、uPA(尿激酶(Abbokinase))、tPA(Actilyse)和纤溶酶)混合。在37℃下，使用Fluostar Omega平板读数器(BMG Labtech公司)在405nm下，使用生色底物T2943(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))测量凝血酶、因子Xa、tPA和纤溶酶活性，而血浆激肽释放酶、因子XIIa和蛋白C活性使用生色底物S2032(Chromogenix公司)测量。使用Fluostar Omega平板读数器(BMGLabtech公司)，经由分别为355nm和460nm的激发和发射波长，在37℃下使用荧光底物(Spectrofluor)测量uPA活性。还显示了在初始抗体gAb存在下酶的活性。这里，酶活性相对于HEPES缓冲盐水对照(其中抗体被缓冲液替代)进行归一化。如图4C所示，除Plm外，B10对测试的血浆蛋白酶活性没有影响。

B10抑制SK与纤溶酶原的结合

使用Biacore T200(通用电气医疗集团)研究B10对链激酶与纤溶酶原结合的影响。在0、62.5、125、250和500nM的B10或初始鸡抗体(gAb)存在下，使10nM纤溶酶原通过固定在CM4(通用电气医疗集团)芯片上的链激酶。B10在测试的所有浓度62.5-500nM下显示出抑制作用。对照的初始鸡抗体gAb未显示出抑制作用。在图5B中，示出了在500nM G05和gAb存在下SK与纤溶酶原结合的百分比(相对于无抗体对照归一化)。

图5中显示的结果表明，与对照抗体相比，B10将纤溶酶原与链激酶的结合抑制了约33％。

实例3：B10与丝氨酸蛋白酶结构域的结合

B10与克林格勒5-丝氨酸蛋白酶结构域(KR5-SP)结合并形成稳定的二元复合物，该复合物可以通过尺寸排阻色谱进行共纯化。使用Superdex 200 16/60柱(通用电气医疗集团)，并且缓冲液是HEPES缓冲盐水。如图6所示，共复合物以58.5ml作为单峰被洗脱。作为参考，KR5-SP和B10抗体分别以67.2ml和73.3ml被洗脱，也作为单峰。

实例4：B10与单一重组克林格勒5-丝氨酸蛋白酶结构域结合的晶体结构

在含有25mM HEPES、150mM NaCl的缓冲液中，将10mg/ml的纯化复合物在0.1M MESpH 6.5和0.2M(NH₄)₂SO₄、20％(w/v)PEG 8K存在下于20℃下结晶。在20％(v/v)甘油存在下，将晶体在液体N2中闪蒸冷却。使用EIGER X 16M像素检测器(瑞士Dectris有限公司，也称为ACRF检测器)，在澳大利亚同步加速器MX2光束线上收集

数据集。使用来自纤溶酶原结构(PDB ID 4DUR)和鸡单链片段可变区(PDB ID4P48)的SP结构域作为搜索模型，使用程序PHASER(CCP4)通过分子置换解析晶体结构。使用COOT进行多轮建模，并且使用PHENIX进行细化。图7中显示的最终模型是使用PyMOL(www.pymol.org/)制备的。

B10-SP复合物结构揭示了B10与催化结构域的结合干扰了功能性催化位点的形成，从而阻止了纤溶酶与底物的结合/底物的切割。

实例5：GAS存在下B10对纤溶酶活性的影响

如上所述生长GAS培养物，但OD₆₀₀为1.0。每个样品使用1ml培养物。将细胞洗涤两次，并将每个样品重悬于250μl补充有2％纤溶酶原耗尽的FCS的PBS中。80nM纤溶酶原和8μMB10/gAb或13.5mM TXA在室温下混合15分钟，随后与经洗涤的GAS细胞在室温下孵育1小时。在孵育1小时后，将细胞洗涤两次，并最终重悬于50μl补充有2％纤溶酶原耗尽的FCS的PBS中。将10μl重悬的细胞添加到100μl反应混合物中，该反应混合物用25mM Tris、150mMNaCl、0.05％Tween20 pH 7.4和200μM荧光底物H-Ala-Phe-Lys-AMC(巴亨公司)缓冲。在Fluostar Omega平板读数器(BMG Labtech公司)中，经由分别为355nm和460nm的激发和发射波长，在37℃下测量纤溶酶活性。

图8中显示的结果表明，与对照抗体和HEPES缓冲盐水对照相比，B10将GAS产生的纤溶酶活性降低了约60％。下图说明了在不存在GAS细胞的情况下，重组SK(2nM)激活溶液中的Plg。

实例6：B10抑制合成凝块和全血凝块的溶解

通过在37℃下混合3mg/ml纤维蛋白原(班克西亚科技公司)；1U牛凝血酶(Jomar生命研究公司)；和10nM tPA(勃林格殷格翰公司)2小时来形成合成纤维蛋白凝块。通过将与0-90nM B10；或0-90nMα2AP；或0-6.25mM TXA混合的45nM纤溶酶原添加到凝块的表面来启动纤维蛋白溶解。

在37℃下在浊度计(BMG)上监测纤维蛋白溶解长达10小时。将实现50％凝块溶解所需的时间用于IC₅₀计算。对于B10所获得的IC₅₀值与α2AP和抑肽酶的IC₅₀值相当(图9)，并且显著低于(大约50倍)TXA的IC₅₀值。

全血凝块是由从健康供体收集的人血形成的。通过在HBS中将全血与15％含有补充有合成磷脂(Dade Innovin，德国西门子公司(Siemens Germany))和67mM CaCl₂的重组组织因子的混合物以1:4的比率混合来产生晕状凝块。使用前将平板密封并在37℃下孵育60分钟。

通过添加7nM的tPA和以下浓度的抗体或Plm抑制剂来诱导凝块溶解：0-312.5nMB10；0-1000nMα2AP；0-1000nM抑肽酶；0-7.5mM TXA。凝块溶解导致浊度增加，并且使用平板读数器在OD6₁₀ nm处监测。

在高浓度(例如高达1,000nM)下，α2AP和抑肽酶仅部分地抑制凝块溶解；浓度高达100μM的TXA延迟了凝块溶解，并且在300μM及以上观察到凝块溶解的完全抑制(数据未示出)。抗体B10在250nM及以上的浓度下完全抑制凝块溶解。

将实现50％凝块溶解所需的时间用于IC₅₀计算。对于B10所获得的IC₅₀值比α2AP高大约8倍，并且比抑肽酶高大约9.5倍(图10)，表明B10在抑制全血凝块溶解方面明显更有效。B10比TXA更有效超过180倍(未示出)。

因此，在非常类似生理系统的凝块溶解测定的情况下，抗体B10在抑制纤溶酶诱导的溶解方面明显比纤溶酶的生理抑制剂α2AP更有效。此外，抗体B10在抑制纤溶酶诱导的溶解方面，明显比现有的药理学试剂TXA和抑肽酶更有效。

序列表

<110> 莫纳什大学

<120> 用于结合纤溶酶的抗体

<130> P22112268WP

<150> AU2019904049

<151> 2019-10-28

<160> 34

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR1（蛋白质）

<400> 1

Asp Ser Gly Ser

1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR2（蛋白质）

<400> 2

Gly Ser Asp

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR3（蛋白质）

<400> 3

Gly Thr Ala Asp Ser Ser Thr Thr Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR1（蛋白质）

<400> 4

Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Gly

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR2（蛋白质）

<400> 5

Ile Asp Asp Asp Gly Gly Gly Thr

1 5

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR3（蛋白质）

<400> 6

Ala Lys Ala Val Gly Tyr Gly Cys Thr Tyr Leu Gly Tyr Ser Cys Ala

1 5 10 15

Gly Ser Ile Asp Ala

20

<210> 7

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，VL（蛋白质）

<400> 7

Gln Ala Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Asp Ser Gly Ser Tyr Gly Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Gly

35 40 45

Ser Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gly Thr Ala Asp Ser Ser Thr Thr Ala Ala

85 90 95

Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

100

<210> 8

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，VH（蛋白质）

<400> 8

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asp Asp Asp Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Pro Ala

50 55 60

Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val

65 70 75 80

Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Lys Ala Val Gly Tyr Gly Cys Thr Tyr Leu Gly Tyr Ser Cys

100 105 110

Ala Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR1（DNA）

<400> 9

gatagcggct cc 12

<210> 10

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR2（DNA）

<400> 10

ggctctgat 9

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LCDR3（DNA）

<400> 11

ggcaccgccg actctagcac cacagccg 28

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR1（DNA）

<400> 12

ggcttcatct tttctgacta cgga 24

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR2（DNA）

<400> 13

atcgacgatg acggaggagg cacctcc 27

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HCDR3（DNA）

<400> 14

gccaaggccg tgggctatgg ctgcacatac ctgggctatt cttgtgcagg cagcatcgac 60

gca 63

<210> 15

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，VL（DNA）

<400> 15

caggccgcac tgacccagcc tagctccgtg agcgccaacc caggcgagac agtgaagatc 60

acatgctccg gaggcgatag cggctcctac ggctggtatc agcagaaggc ccccggctcc 120

gcccctgtga ccgtgatcta cggctctgat aagcggccaa gcgacatccc ctcccgcttc 180

tctggcagca catccggctc taccaataca ctgaccatca caggcgtgca ggtggaggat 240

gaggccatct actattgcgg caccgccgac tctagcacca cagccgccgg caccacactg 300

acagtgctg 309

<210> 16

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，VH（DNA）

<400> 16

gccgtgaccc tggatgagag cggaggaggc ctccagacac ccggcggcgc cctgagcctg 60

gtgtgcaagg gctccggctt catcttttct gactacggaa tgttttgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcagga atcgacgatg acggaggagg cacctcctac 180

tatgcacctg ccgtgaaggg aagggcaacc atcagcagag ataacggcca gagcaccgtg 240

aggctccagc tgaacaatct gagagccgag gacaccggca catactattg tgccaaggcc 300

gtgggctatg gctgcacata cctgggctat tcttgtgcag gcagcatcga cgcatggggc 360

cacggcaccg aagtgatcgt gagcagc 387

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR1（蛋白质）

<400> 17

Gln Ala Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly

20 25

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR2（蛋白质）

<400> 18

Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val

1 5 10 15

Ile Tyr

<210> 19

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR3（蛋白质）

<400> 19

Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly

1 5 10 15

Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR4（蛋白质）

<400> 20

Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

1 5

<210> 21

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR1（蛋白质）

<400> 21

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser

20 25

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR2（蛋白质）

<400> 22

Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR3（蛋白质）

<400> 23

Ser Tyr Tyr Ala Pro Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu

20 25 30

Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR4（蛋白质）

<400> 24

Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR1（DNA）

<400> 25

caggccgcac tgacccagcc tagctccgtg agcgccaacc caggcgagac agtgaagatc 60

acatgctccg gaggc 75

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR2（DNA）

<400> 26

tacggctggt atcagcagaa ggcccccggc tccgcccctg tgaccgtgat ctac 54

<210> 27

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR3（DNA）

<400> 27

aagcggccaa gcgacatccc ctcccgcttc tctggcagca catccggctc taccaataca 60

ctgaccatca caggcgtgca ggtggaggat gaggccatct actattgc 108

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，LFR4（DNA）

<400> 28

gccggcacca cactgacagt gctg 24

<210> 29

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR1（DNA）

<400> 29

gccgtgaccc tggatgagag cggaggaggc ctccagacac ccggcggcgc cctgagcctg 60

gtgtgcaagg gctcc 75

<210> 30

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR2（DNA）

<400> 30

atgttttggg tgcgccaggc ccccggcaag ggcctggagt gggtggcagg a 51

<210> 31

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR3（DNA）

<400> 31

tcctactatg cacctgccgt gaagggaagg gcaaccatca gcagagataa cggccagagc 60

accgtgaggc tccagctgaa caatctgaga gccgaggaca ccggcacata ctattgt 117

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体B10，HFR4（DNA）

<400> 32

tggggccacg gcaccgaagt gatcgtgagc agc 33

<210> 33

<211> 791

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

275 280 285

Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

325 330 335

Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

355 360 365

Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser

370 375 380

Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro

405 410 415

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu

420 425 430

Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

435 440 445

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

450 455 460

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

485 490 495

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

500 505 510

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

515 520 525

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

530 535 540

Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly

545 550 555 560

Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

565 570 575

Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

580 585 590

Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser

595 600 605

Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val

610 615 620

Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu

625 630 635 640

Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

645 650 655

Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr

660 665 670

Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr

675 680 685

Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val

690 695 700

Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val

705 710 715 720

Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser

725 730 735

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys

740 745 750

Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro

755 760 765

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile

770 775 780

Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

785 790

<210> 34

<211> 250

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

1 5 10 15

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

20 25 30

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

35 40 45

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

50 55 60

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

65 70 75 80

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

85 90 95

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

100 105 110

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

115 120 125

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

130 135 140

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

145 150 155 160

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

165 170 175

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

180 185 190

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

195 200 205

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

225 230 235 240

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245 250

Claims

1.一种抗原结合蛋白，其包含结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的抗原结合结构域，其中该抗原结合蛋白特异性抑制纤溶酶的活性。

2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合结构域结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的催化位点。

3.如权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合结构域结合包含以下序列的肽：SEQ ID NO:34或其片段。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在如SEQ IDNO:33中所示的Arg₆₃₇、Leu₆₃₈、Leu₆₄₀、Pro₆₄₂、Arg₆₄₄、Lys₆₄₅、Gln₇₂₁、Trp₇₈₃和Asn₇₉₁的位置或等同位置处结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基，或者在表2所示的位置或等同位置处结合纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。

5.如权利要求1至4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该蛋白质结合人纤溶酶。

6.如权利要求1至5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该蛋白质抑制链激酶与纤溶酶的结合。

7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该蛋白质不显著结合选自由以下组成的列表的丝氨酸蛋白酶或者不显著降低或抑制其活性：组织-纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、凝血酶、胰蛋白酶、因子Xa、血浆激肽释放酶、人激活的激肽释放酶(HPKa)、蛋白C和因子XIIa。

8.如权利要求1至7中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白抑制或减少选自以下的一种或多种纤溶酶底物的纤溶酶介导的切割：纤维蛋白、纤维蛋白原、因子V、因子VIII和因子X、蛋白酶激活受体I、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、血管性血友病因子、玻连蛋白、前脑源性神经营养因子、补体C3和C5、腱生蛋白、骨钙素、含CUB结构域的蛋白1和胶原酶。

9.如权利要求1至8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白的残基与纤溶酶的残基的相互作用由x射线晶体学和0至

(包括端值)的接触距离分析定义。

10.如权利要求1至9中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白与包含含有如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的VH结构域和含有如SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的VL结构域的抗体结合纤溶酶上的相同表位，其中该抗原结合蛋白降低或抑制纤溶酶的活性。

11.如权利要求10所述的抗原结合蛋白，其中该表位由x射线晶体学定义，任选地，其中该表位由0至

(包括端值)的接触距离分析定义。

12.如权利要求1至11中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出大于约1×10⁴、大于约5×10⁴、大于约1×10⁵，或者大于或等于约8×10⁵的k_a(M^-1s^-1)，优选地，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出约8×10⁵的k_a(M^-1s^-1)。

13.如权利要求1至12中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出小于约1×10^-3或小于约5×10^-4的k_d(s^-1)，优选地，其中本发明的抗原结合结合纤溶酶，并表现出约4.5×10^-4的k_d(s^-1)。

14.如权利要求1至13中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶，并表现出小于2mM、小于100μM、小于约100nM，或者小于或等于约500pM的K_D，其中该K_D使用表面等离子体共振(SPR)来测定。

15.如权利要求1至14中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合衍生自SEQ ID NO:33的肽，任选地，其中该抗原结合蛋白结合由SEQ ID NO:33的序列的4、5、7、8、9、10或更多个连续氨基酸残基组成的肽。

16.如权利要求15所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合由SEQ ID NO:34的序列的4、5、7、8、9、10或更多个连续氨基酸残基组成的肽。

17.如权利要求1至16中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:33的637至791残基、基本上由其组成或由其组成的肽。

18.如权利要求17所述的抗原结合蛋白，其中根据SEQ ID NO:33中所示的纤溶酶序列，该抗原结合蛋白至少结合残基His603、Asp646和Ala/Ser741。

19.如权利要求1至18中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白包含：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，以及

FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区；

CDR1a、CDR2a和CDR3a各自是互补决定区；

其中这些框架区或互补决定区中任一个的序列如本文所述，

任选地，其中这些互补决定区中任一个的序列具有如表1中所述的氨基酸序列。

20.如权利要求1至18中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白包含(按N末端到C末端或C末端到N末端的顺序)SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

21.如权利要求1至20中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合结构域包含：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接头-FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a

并且其中该抗原结合结构域包含以下至少一项：

(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:4中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的互补决定区(CDR)1，含有与SEQ IDNO:5中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR2，以及含有与SEQ ID NO:6中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR3；

(vi)VH，该VH包含SEQ ID NO:8中所示的序列；

(viii)VL，该VL包含SEQ ID NO:7中所示的序列；

(ix)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:4中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:5中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:6中所示的序列的CDR3；以及VL，该VL包含含有SEQ IDNO:1中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:2中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:3中所示的序列的CDR3；或

22.如权利要求21所述的抗原结合蛋白，其中该蛋白质进一步包含以下至少一项：

(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:21中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的框架区(FR)1，含有与SEQ ID NO:22中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR2，含有与SEQ ID NO:23中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR3，以及含有与SEQ ID NO:24中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR4；

23.如权利要求1至22中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白是以下形式：

(i)单链Fv片段(scFv)；

(ii)二聚scFv(双-scFv)；

(iv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)或(ii)中之一。

24.如权利要求1至22中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白是以下形式：

(i)双体抗体；

(ii)三体抗体；

(iii)四体抗体；

(iv)Fab；

(v)F(ab')2；

(vi)Fv；

(vii)双特异性抗体；

(viv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)至(vii)之一。

25.如权利要求1至24中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，优选地，其中该结合蛋白是单克隆抗体或可变结构域。

26.如权利要求21至25中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该接头是化学物质、一个或多个氨基酸、或两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键。

27.一种包含轻链可变区和重链可变区的抗纤溶酶抗体，

其中所述轻链可变区包含：

如SEQ ID NO:1中所示的CDR L1、如SEQ ID NO:2中所示的CDR L2以及如SEQ ID NO:3中所示的CDR L3；并且

其中所述重链可变区包含：

如SEQ ID NO:4中所示的CDR H1、如SEQ ID NO:5中所示的CDR H2以及如SEQ ID NO:6中所示的CDR H3。

28.如权利要求27所述的抗纤溶酶抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区。

29.如权利要求27或28所述的抗纤溶酶抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:8的序列的重链可变区。

30.如权利要求27至29中任一项所述的抗纤溶酶抗体，其中该抗体包含含有如SEQ IDNO:17中所示的FR L1、如SEQ ID NO:18中所示的FR L2、如SEQ ID NO:19中所示的FR L3以及如SEQ ID NO:20中所示的FR L4的轻链可变区。

31.如权利要求27至30中任一项所述的抗纤溶酶抗体，其中该抗体包含含有如SEQ IDNO:21中所示的FR H1、如SEQ ID NO:22中所示的FR H2、如SEQ ID NO:23中所示的FR H3以及如SEQ ID NO:24中所示的FR H4的重链可变区。

32.如权利要求1至31中任一项所述的抗原结合蛋白或抗纤溶酶抗体，其中该蛋白质或抗体是裸抗体。

33.一种融合蛋白，其包含如权利要求1至32中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体。

34.一种为如权利要求1至32中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体形式的缀合物，其与标记或细胞毒性剂缀合。

35.一种核酸，其编码如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物。

36.一种载体，其包含权利要求35所述的核酸。

37.一种在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体融合蛋白或缀合物，从而在该受试者中抑制纤溶酶活性。

38.一种在有需要的受试者中抑制纤维蛋白溶解的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物，从而在该受试者中抑制纤维蛋白溶解。

39.如权利要求37或38所述的方法，其中该方法用于在患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者中抑制纤溶酶活性，或者用于在已经遭受创伤或由于手术或分娩而大出血的受试者中恢复止血。

40.一种在受试者中治疗或预防链球菌感染的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物，从而在该受试者中治疗或预防链球菌感染。

41.如权利要求40所述的方法，其中该方法包括在该受试者中降低感染的严重程度或治疗与链球菌感染相关或由其引起的病症。

42.一种治疗、抑制、预防或最小化癌症扩散或进展的方法，其包括在受试者中抑制或预防癌症的转移，该方法包括向有需要的受试者施用如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物，从而治疗、抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展，包括在该受试者中抑制或预防癌症的转移。

43.如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物在制造用于在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性的药物方面的用途。

44.如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物在制造用于在有需要的受试者中抑制纤维蛋白溶解的药物方面的用途。

45.如权利要求43或44所述的用途，其中该药物用于在患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者中抑制纤溶酶活性，或者用于在已经遭受创伤或由于手术或分娩而大出血的受试者中恢复止血。

46.如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物在制造用于治疗或预防链球菌感染的药物方面的用途。

47.如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物在制造用于治疗、抑制、预防或最小化癌症扩散或进展的药物方面的用途，包括抑制或预防癌症的转移。

48.一种药物组合物，其包含如权利要求1至34中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体、融合蛋白或缀合物以及药学上可接受的赋形剂。

49.如权利要求48所述的药物组合物，其用于在有需要的受试者中抑制纤溶酶活性。

50.如权利要求48所述的药物组合物，其用于在有需要的受试者中抑制纤维蛋白溶解。

51.如权利要求49或48所述的药物组合物，其中该组合物用于在患有血友病、月经过多、血管性血友病综合征或血栓溶解诱导的出血的受试者中抑制纤溶酶活性，或者用于在已经遭受创伤或由于手术或分娩而大出血的受试者中恢复止血。

52.如权利要求48所述的药物组合物，其用于治疗或预防链球菌感染。

53.如权利要求48所述的药物组合物，其用于治疗、抑制、预防或最小化癌症的扩散或进展，包括抑制或预防癌症的转移。