CN115135310A - 用于制备包含聚乳酸盐的药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒 - Google Patents

用于制备包含聚乳酸盐的药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒，更具体地，涉及一种如下的用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒，所述试剂盒被设计成仅通过简单地混合作为试剂盒的组成成分的两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物、聚乳酸盐以及药物就可以容易地形成药物被包封在其内部的纳米颗粒。

Description

用于制备包含聚乳酸盐的药物递送用纳米颗粒组合物的试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒，更具体地，涉及一种如下的用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒，所述试剂盒被设计成仅通过简单地混合作为试剂盒的组成成分的两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物、聚乳酸盐以及药物就可以容易地形成药物被包封在其内部的纳米颗粒。
背景技术
长期以来，一直在研究利用包括核酸在内的阴离子药物的治疗中安全且有效的药物递送技术，并且开发了各种递送系统和递送技术。递送系统主要分为利用腺病毒或逆转录病毒等的病毒性递送系统和利用阳离子脂质和阳离子聚合物等的非病毒性递送系统。已知病毒性递送系统面临非特异性免疫反应等风险，并且生产工艺复杂，因此在商业化方面存在许多问题。因此，近年来，研究方向是利用非病毒性递送系统改善这些缺点。与病毒性递送系统相比，非病毒性递送系统的优点在于，在生物体内安全性方面副作用少，并且在经济性方面生产成本低。
作为用于递送核酸物质的非病毒性递送系统，具有代表性的是利用阳离子脂质的阳离子脂质和核酸的复合物(lipoplex)以及聚阳离子(polycation)聚合物和核酸的复合物(polyplex)。对这些阳离子脂质或聚阳离子聚合物进行了很多研究，这些阳离子脂质或聚阳离子聚合物通过静电相互作用与阴离子药物形成复合物，从而稳定阴离子药物，并且增加细胞内的递送(De Paula D,Bentley MV,Mahato RI,Hydrophobization andbioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting,RNA 13(2007)431-56；Gary DJ,Puri N,Won YY,Polymer-based siRNA delivery:Perspectives on thefundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNAdelivery,J Control release 121(2007)64-73)。
然而，这些复合物形成的纳米颗粒往往根据储存环境容易失去稳定性，因此不易长期储存，并且在运输过程中质量可能会受损。此外，为了确保充分的稳定性，需要复杂的制备工艺，因此具有非常难以制备的特征。
因此，需要开发一种不受储存环境的显著影响且最终消费者容易使用的用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒。
发明内容
要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种用于制备药物递送用纳米颗粒组合物的试剂盒，仅通过简单地混合试剂盒的组成成分就可以容易地形成含有药物的纳米颗粒，从而最终消费者容易使用，并且可以在使用前即刻容易地形成含有药物的纳米颗粒，因此可以将药物有效地递送到体内而不受储存或运输环境的影响。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其包括：第一腔室，包含两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物及聚乳酸盐；以及第二腔室，包含选自核酸、多肽、病毒或它们的组合中的有效成分。
一个具体实施方案中，所述试剂盒用于形成细胞内递送有效成分的纳米颗粒。
一个具体实施方案中，选自所述第一腔室和所述第二腔室中的一个以上还包含附加的溶剂。
一个具体实施方案中，所述溶剂是水性溶剂、水混溶性溶剂或它们的混合物。
一个具体实施方案中，所述第二腔室还包含pH调节剂、无机盐、糖类、表面活性剂、螯合剂或它们的组合。
一个具体实施方案中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述两亲性嵌段共聚物的量可以为0.01-50重量份。
一个具体实施方案中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述聚乳酸盐的量可以为0.1-100重量份。
一个具体实施方案中，所述第一腔室中的所述两亲性嵌段共聚物、所述阳离子化合物及所述聚乳酸盐的混合物可以在混合后通过亲水性过滤器过滤一次以上。
有益效果
根据本发明的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒中，用于形成含有药物的纳米颗粒的组成成分被分离并包含在单独的腔室中，因此与已经形成的纳米颗粒不同，不受储存或运输环境的影响，并且在使用该试剂盒时，最终使用者仅通过简单地混合腔室的成分就可以成功地形成具有有效的药物递送效果的纳米颗粒。
附图说明
图1是示出本发明的实验例2中进行的纳米颗粒的细胞内递送效率的实验结果的图。
图2是示出通过琼脂糖凝胶分析确认本发明的实验例3中进行的纳米颗粒的形成的结果的图。
图3是示出利用动态光散射(Dynamic Light Scattering)评价本发明的实验例3中进行的纳米颗粒的形成的结果的图。
图4是示出本发明的实验例4中进行的纳米颗粒的细胞内递送效率的实验结果的图。
图5是示出本发明的实验例5中进行的加速试验前后的细胞内递送效率的实验结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行更详细的说明。
根据本发明的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒包括：第一腔室，包含两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物及聚乳酸盐；以及第二腔室，包含选自核酸、多肽、病毒或它们的组合中的有效成分。
本发明的试剂盒由两个以上的腔室组成，最终使用者可以通过简单地混合所述腔室来容易地形成纳米颗粒。术语“简单地混合”可以包括所有的“混合”行为，并且是指对为了形成纳米颗粒而进行混合的行为没有赋予特定条件。所述混合可以通过滴落、搅拌(涡旋(vortexing))、倒入等各种方式实现，但不限于此。根据一个具体实施方案，当使用本发明的试剂盒时，可以在例如1分钟以内、30秒以内或15秒以内快速形成理论上可形成的量的90％以上、95％以上或99％以上的纳米颗粒。
最终使用者通过简单地混合而形成的纳米颗粒中的有效成分可以通过静电相互作用与阳离子化合物形成复合物，所述复合物可以被包封在由两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的纳米颗粒结构内部。
所述纳米颗粒中，在水性环境中两亲性嵌段共聚物的亲水性部分形成纳米颗粒的外壁，两亲性嵌段共聚物的疏水性部分和作为与所述两亲性嵌段共聚物分开的成分而含有的聚乳酸盐形成纳米颗粒的内壁，有效成分和阳离子化合物的复合物可以被包封在形成的纳米颗粒的内部。这种纳米颗粒结构提高有效成分在血液中或体液中的稳定性。
所述“核酸”可以是例如DNA、RNA、siRNA、shRNA、miRNA、mRNA、适体、反义寡核苷酸或它们的组合，但不限于此。
所述“多肽”可以指抗体或其片段、细胞因子、激素或其类似物等在体内具有活性的蛋白质，或者包含抗原、其类似物或前体的多肽序列而可以在体内通过一系列过程被识别为抗原的蛋白质。
所述“病毒”可以是溶瘤病毒(oncolytic virus)，例如可以为选自腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒(HSV)及水疱性口炎病毒(VSV)中的一种以上。一个具体实施方案中，溶瘤病毒是腺病毒。本发明的具体实施方案中使用的腺病毒包含荧光素酶基因，这可以通过影像来确认。
所述病毒可以在个体的体内表达各种治疗基因，并且不限于特定的分子量、蛋白质、生物活性或治疗领域。预防用病毒可以在个体的体内诱导针对目标疾病的免疫。包含用于预防疾病的病毒的组合物的优点在于可以减少病毒本身诱导的免疫，并可以指定或扩增靶细胞，并且减少再次施用时对病毒的超免疫反应，从而可以通过多次接种获得有效的效果。
在一个实例中，所述纳米颗粒的颗粒尺寸可以由Z-平均值定义，例如可以为800nm以下、600nm以下、500nm以下、400nm以下、300nm以下、200nm以下或150nm以下，并且可以为10nm以上、50nm以上或100nm以上。一个具体实施方案中，由Z-平均值定义的所述纳米颗粒的颗粒尺寸可以是例如10-800nm、10-600nm、10-500nm、10-400nm、10-300nm、10-200nm或10-150nm。
所述“Z-平均”可以是指利用动态光散射(Dynamic light scattering，DSL)测量的颗粒分布的流体动力学直径(hydrodynamic diameter)的平均。所述纳米颗粒具有单分散颗粒分布(monodisperse particle distribution)，其多分散指数(polydispersityindex)例如可以为0.01至0.30、0.05至0.25或0.1至0.2。
此外，在一个实例中，所述纳米颗粒的表面电荷例如可以为-40mV以上、-30mV以上、-20mV以上或-10mV以上，并且可以为40mV以下、30mV以下、20mV以下或10mV以下。一个具体实施方案中，所述纳米颗粒的表面电荷例如可以为-40mV至40mV、-30mV至30mV、-20mV至20mV或-10mV至10mV。所述表面电荷可以在接近生物学环境的环境中测量，例如，可以在8-12mM的HEPES缓冲液(pH为7.0至7.5)中测量。
当纳米颗粒的颗粒尺寸和表面电荷保持上述水平时，在纳米颗粒结构的稳定性、组成成分的含量、体内的吸收性和作为药物组合物的灭菌便利性方面优选。例如，当所述有效成分为核酸时，所述核酸的一个以上的末端可以被选自胆固醇、生育酚和碳原子数为10-24个的脂肪酸中的一种以上修饰。所述胆固醇、生育酚和碳原子数为10-24个的脂肪酸包括胆固醇、生育酚和脂肪酸的各类似物、衍生物和代谢物。
以通过本发明的试剂盒形成的纳米颗粒的总重量为基准，所述有效成分例如可以为30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、15重量％以下、10重量％以下或5重量％以下，并且可以为0.001重量％以上、0.01重量％以上、0.05重量％以上、0.1重量％以上、0.25重量％以上、0.5重量％以上或1重量％以上。一个具体实施方案中，以组合物的总重量为基准，所述有效成分例如可以为0.05-30重量％、0.1-25重量％、0.25-20重量％、0.5-15重量％、1-10重量％或1-5重量％。以组合物的总重量为基准，当有效成分的含量少于上述范围时，使用的递送系统的量与药物相比过多，反而可能存在递送系统引起的副作用，当有效成分的含量超过上述范围时，纳米颗粒的尺寸变得过大，纳米颗粒的稳定性降低，并且过滤灭菌时的损失率可能会增加。当所述有效成分为病毒时，所述纳米颗粒可以包含1×106VP至1×1014VP(病毒颗粒(Virus particle))、1×107VP至1×1013VP、1×108VP至1×1012VP或1×109VP至1×1011VP的病毒。
一个具体实施方案中，所述阳离子化合物可以为阳离子脂质或阳离子聚合物，更具体可以为阳离子脂质。
一个具体实施方案中，所述阳离子脂质可以为选自N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N,N-二甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、N,N,N-三甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DOTMA)、1,2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(TAP)、1,2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷(DAP)、3β-[N-(N',N',N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(TC-胆固醇)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、3β-[N-(N'-单甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(MC-胆固醇)、3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(AC-胆固醇)、胆固醇氧基丙烷-1-胺(COPA)、N-(N'-氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(AC-生育酚)和N-(N'-甲氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(MC-生育酚)中的一种或两种以上的组合。
当使用这种阳离子脂质时，为了降低阳离子脂质引起的毒性，优选使用少量的分子内具有高阳离子密度的聚阳离子脂质，更具体地，优选使用每分子具有一个可在水溶液中表现出阳离子的官能团的阳离子脂质。
因此，在更优选的一个实施方案中，所述阳离子脂质可以为选自3β-[N-(N',N',N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(TC-胆固醇)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、3β-[N-(N'-单甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(MC-胆固醇)、3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(AC-胆固醇)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N,N-二甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)和N,N,N-三甲基-(2,3-二油酰氧基)丙胺(DOTMA)中的一种以上。
另外，一个具体实施方案中，所述阳离子聚合物可以选自壳聚糖(chitosan)、乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)、鱼精蛋白(protamine)、聚赖氨酸(polylysine)、聚精氨酸(polyarginine)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine)、葡聚糖(dextran)、透明质酸(hyaluronic acid)、白蛋白(albumin)、高分子量聚乙烯亚胺(PEI)、聚胺和聚乙烯胺(PVAm)，更具体地，可以为选自聚乙烯亚胺(PEI)、聚胺和聚乙烯胺(PVAm)中的一种以上。
一个具体的实施方案中，所述阳离子脂质可以是以下化学式1的阳离子脂质：
[化学式1]
Figure BDA0003801242240000071
所述式中，
n和m各自独立地为0至12，并且2≤n+m≤12，
a和b各自独立地为1至6，
R1和R2各自独立地选自碳原子数为11-25个的饱和烃基和不饱和烃基。
更具体地，所述化学式1中，n和m可以各自独立地为1至9，并且可以为2≤n+m≤10。
更具体地，所述化学式1中，a和b可以各自独立地为2至4。
更具体地，所述化学式1中，R1和R2可以各自独立地选自月桂基(lauryl)、肉豆蔻基(myristyl)、棕榈基(palmityl)、硬脂基(stearyl)、花生基(arachidyl)、山嵛基(behenyl)、二十四烷基(lignoceryl)、蜡基(cerotyl)、顺-9-十四碳烯-1-基(myristoleyl)、(9Z)-9-十六碳烯-1-基(palmitoleyl)、顺-6-十六碳烯-1-基(sapienyl)、油烯基(oleyl)、亚油基(linoleyl)、花生四烯基(arachidonyl)、二十碳五烯基(eicosapentaenyl)、瓢儿菜基(erucyl)、二十二碳六烯基(docosahexaenyl)和蜡基(cerotyl)。
一个具体实施方案中，所述阳离子脂质可以为选自1,6-二油酰基三亚乙基四酰胺(N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氮烷二基))双(乙烷-2,1-二基))二油酰胺(N,N'-((ethane-1,2-diylbis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))dioleamid e))、1,8-二亚油酰基四亚乙基五酰胺((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(氮烷二基))双(乙烷-2,1-二基))双(十八碳-9,12-二烯酰胺)((9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-(((azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(azanediyl))bis(ethane-2,1-diyl))bis(octadeca-9,12-dienamide)))、1,4-二肉豆蔻烯酰基二亚乙基三酰胺((9Z,9'Z)-N,N'-(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(十四碳-9-烯酰胺)((9Z,9'Z)-N,N'-(azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(tetradec-9-enamid e)))、1,10-二硬脂酰基五亚乙基六酰胺(N,N'-(3,6,9,12-四氮杂十四烷-1,14-二基)二硬脂酰胺(N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)distearamid e))和1,10-二油酰基五亚乙基六酰胺(N,N'-(3,6,9,12-四氮杂十四烷-1,14-二基)二油酰胺(N,N'-(3,6,9,12-tetraazatetradecane-1,14-diyl)dioleamide))中的一种以上。
以1重量份的有效成分为基准，通过本发明的试剂盒形成的组合物中的所述阳离子化合物的含量例如可以为25重量份以下、20重量份以下、18重量份以下、15重量份以下、12重量份以下、10重量份以下或8重量份以下，并且可以为1重量份以上、1.5重量份以上、2重量份以上、2.5重量份以上、3重量份以上或3.5重量份以上。一个具体实施方案中，以1重量份的有效成分为基准，组合物中的所述阳离子化合物的含量可以为1-25重量份、1.5-10重量份、2-15重量份、2.5-10重量份或3-8重量份。另外，当有效成分为病毒时，更具体为腺病毒时，以1×1010VP的病毒为基准，所述阳离子化合物的含量可以为1μg以上、5μg以上、10μg以上、15μg以上或18μg以上，并且可以为150μg以下、100μg以下、50μg以下或30μg以下，例如可以为1-150μg、5-100μg、10-50μg、15-30μg。当组合物中的所述阳离子化合物的含量小于上述范围时，可能无法与有效成分形成稳定的复合物，当组合物中的所述阳离子化合物的含量超过上述范围时，纳米颗粒的尺寸变得过大，稳定性降低，并且过滤灭菌时的损失率可能会增加。
当所述有效成分为核酸时，所述阳离子化合物与核酸通过静电相互作用结合形成复合物。一个具体实施方案中，所述核酸(P)和阳离子化合物(N)的电荷量之比(N/P；阳离子化合物的阳离子电荷与核酸的阴离子电荷之比)可以为0.5以上、1以上、2以上或3.5以上，并且可以为100以下、50以下、20以下，例如可以为0.5至100、1至50、2至20、5至15或7至12。当上述比例(N/P)小于上述范围时，可能难以形成包含充足量的核酸的复合物，另一方面，当上述比例(N/P)超过上述范围时，可能诱发毒性。此外，N/P值可以对有效成分在脾脏中的特异性表达起到重要的作用。
一个具体的实施方案中，所述两亲性嵌段共聚物可以是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型嵌段共聚物。所述A-B型嵌段共聚物在水溶液中形成核-壳型聚合物纳米颗粒，其中，疏水性B嵌段形成核(内壁)，亲水性A嵌段形成壳(外壁)。
一个具体实施方案中，所述亲水性A嵌段可以为选自聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺及其衍生物中的一种以上。
更具体地，所述亲水性A嵌段可以为选自单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯和丙二醇的共聚物以及聚乙烯吡咯烷酮中的一种以上。
一个具体实施方案中，所述亲水性A嵌段的数均分子量可以为200-50000道尔顿，更具体可以为1000-20000道尔顿，进一步具体可以为1000-5000道尔顿。
此外，根据需要，将可到达特定组织或细胞的官能团、配体或者可促进细胞内递送的官能团化学键合到所述亲水性A嵌段的末端，从而可以调节由两亲性嵌段共聚物和聚乳酸盐形成的聚合物纳米颗粒递送系统的体内分布，或者可以提高所述纳米颗粒递送系统递送到细胞内的效率。一个具体实施方案中，所述官能团或配体可以是选自单糖类、多糖类、维生素、肽、蛋白质和针对细胞表面受体的抗体中的一种以上。更具体地，所述官能团或配体可以是选自茴香酰胺(anisamide)、维生素B9(叶酸)、维生素B12、维生素A、半乳糖、乳糖、甘露糖、透明质酸、RGD肽、NGR肽、转铁蛋白、针对转铁蛋白受体的抗体等中的一种以上。
所述疏水性B嵌段是具有生物相容性和生物降解性的聚合物，一个具体实施方案中，所述疏水性B嵌段可以是选自聚酯、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯和聚磷腈中的一种以上。
更具体地，所述疏水性B嵌段可以为选自聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二氧杂环己烷-2-酮、聚丙交酯和乙交酯的共聚物、聚丙交酯和聚二氧杂环己烷-2-酮的共聚物、聚丙交酯和聚己内酯的共聚物以及聚乙交酯和聚己内酯的共聚物中的一种以上。
一个具体实施方案中，所述疏水性B嵌段的数均分子量可以为50-50000道尔顿，更具体可以为200-20000道尔顿，进一步具体可以为1000-5000道尔顿。
此外，一个具体实施方案中，为了增加疏水性B嵌段的疏水性来提高纳米颗粒的稳定性，所述疏水性B嵌段可以通过将生育酚、胆固醇或碳原子数为10-24个的脂肪酸化学键合到疏水性B嵌段末端的羟基而被修饰。
一个具体实施方案中，在所述两亲性嵌段共聚物中，就亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的组成比而言，以共聚物的总重量为基准，亲水性嵌段(A)可以为40-70重量％的范围，更具体可以为50-60重量％的范围。以共聚物的总重量为基准，当亲水性嵌段(A)的比例小于40重量％时，聚合物在水中的溶解度低，难以形成纳米颗粒，因此，为了使共聚物在水中具有充分的溶解度以形成纳米颗粒，亲水性嵌段(A)的比例优选为40重量％以上。另外，以共聚物的总重量为基准，当亲水性嵌段(A)的比例超过70重量％时，由于亲水性过高，聚合物纳米颗粒的稳定性降低，难以用作有效成分/阳离子化合物复合物的增溶组合物，因此，考虑到纳米颗粒的稳定性，亲水性嵌段(A)的比例优选为70重量％以下。
一个具体实施方案中，通过本发明的试剂盒形成的组合物中的所述聚乳酸盐分布在纳米颗粒的核(内壁)，增强核的疏水性并稳定纳米颗粒，同时起到有效地避开体内网状内皮系统(RES)的作用。即，聚乳酸盐的羧酸阴离子比聚乳酸更有效地与阳离子复合物结合，以降低聚合物纳米颗粒的表面电位，从而该聚合物纳米颗粒与不包含聚乳酸盐的聚合物纳米颗粒相比降低表面电位的正电荷，较少被网状内皮系统捕获，因此具有向期望的部位(例如，癌细胞、炎症细胞等)的递送效率优异的优点。
一个具体实施方案中，作为与所述两亲性嵌段共聚物分开的成分且作为纳米颗粒内壁成分包含的聚乳酸盐的数均分子量可以为500-50000道尔顿，更具体可以为1000-10000道尔顿。当聚乳酸盐的数均分子量小于500道尔顿时，疏水性过低，可能难以存在于纳米颗粒的核(内壁)，当聚乳酸盐的数均分子量超过50000道尔顿时，可能存在聚合物纳米颗粒的尺寸变大的问题。
一个具体实施方案中，所述聚乳酸盐(例如，聚乳酸钠)的末端中与金属羧酸盐(例如，羧酸钠)相对的末端可以被选自羟基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、癸酰氧基、棕榈酰氧基及碳原子数为1-2个的烷氧基中的一种取代。
一个具体实施方案中，所述聚乳酸盐可以是选自以下化学式2至化学式7的化合物中的一种以上(其中，“COO”表示羧基，即“C(＝O)O”)：
[化学式2]
RO-CHZ-[A]m-[B]n-COOM
所述式2中，A为-COO-CHZ-；B为-COO-CHY-、-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或-COO-CH2CH2OCH2-；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；Z和Y各自为氢原子、甲基或苯基；M为Na、K或Li；n为1至30的整数；m为0至20的整数。
[化学式3]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
所述式3中，X为甲基；Y'为氢原子或苯基；p为0至25的整数，q为0至25的整数，并且p+q为5至25的整数；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M为Na、K或Li；Z为氢原子、甲基或苯基。
[化学式4]
RO-PAD-COO-W-M'
所述式4中，W-M'为
Figure BDA0003801242240000121
PAD选自D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸和己内酯的共聚物以及D,L-乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物；R为氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或乙基；M独立地为Na、K或Li。
[化学式5]
S-O-PAD-COO-Q
所述式5中，S为
Figure BDA0003801242240000122
L为-NR1-或-O-，其中，R1为氢原子或C1-10烷基；Q为CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3或CH2C6H5；a为0至4的整数；b为1至10的整数；M为Na、K或Li；PAD为选自D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸和己内酯的共聚物以及D,L-乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物中的一种以上。
[化学式6]
Figure BDA0003801242240000131
所述式6中，R'为-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，其中，PAD选自D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物、D,L-乳酸和己内酯的共聚物、D,L-乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物，M为Na、K或Li；a为1至4的整数。
[化学式7]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
所述式7中，X和X'独立地为氢、碳原子数为1至10的烷基或碳原子数为6至20的芳基；Y和Z独立地为Na、K或Li；m和n独立地为0至95的整数，并且5<m+n<100；a和b独立地为1至6的整数；R为-(CH2)k-、碳原子数为2至10的二价烯基(divalent alkenyl)、碳原子数为6至20的二价芳基(divalent aryl)或它们的组合，其中，k为0至10的整数。
一个具体实施方案中，所述聚乳酸盐可以是所述化学式2或化学式3的化合物。
一个具体实施方案中，为了增加mRNA的细胞内递送效率，以通过本发明的试剂盒形成的组合物的总重量为基准，本发明的试剂盒可以进一步包含0.01-50重量％的融合脂质，更具体可以包含0.1-10重量％的融合脂质。
将所述融合脂质与mRNA和阳离子脂质的复合物混合时，通过疏水性相互作用结合形成mRNA、阳离子脂质和融合脂质的复合物，并且包含所述融合脂质的复合物被包封在两亲性嵌段共聚物的纳米颗粒结构内部。
一个具体实施方案中，所述融合脂质可以是选自磷脂、胆固醇和生育酚中的一种或两种以上的组合。
更具体地，所述磷脂可以是选自磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)和磷脂酸(phosphatidic acid)中的一种以上。所述磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酸可以是与一个或两个C10-24脂肪酸结合的形式。所述胆固醇和生育酚包含胆固醇和生育酚的各类似物、衍生物和代谢物。
更具体地，所述融合脂质可以是选自二月桂酰磷脂酰乙醇胺(dilauroylphosphatidylethanolamine)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dimyristoylphosphatidylethanolamine)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine，DOPE)、二棕榈油酰磷酸乙醇胺(1,2-二棕榈油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)，DPPE)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(dilinoleoylphosphatidylethanolamine)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine)、1,2-二植烷酰-3-sn-磷脂酰乙醇胺(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine)、二棕榈油酰磷酸胆碱(1,2-二棕榈油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，DPPC)、二油酰磷酸胆碱(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，DOPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(dilauroyl phosphatidylcholine)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoyl phosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoyl phosphatidylcholine)、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoyl phosphatidylcholine)、二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine)、1,2-二植烷酰-3-sn-磷脂酰胆碱(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine)、二月桂酰磷脂酸(dilauroyl phosphatidic acid)、二肉豆蔻酰磷脂酸(dimyristoyl phosphatidic acid)、二棕榈酰磷脂酸(dipalmitoyl phosphatidicacid)、二硬脂酰磷脂酸(distearoyl phosphatidicacid)、二油酰磷脂酸(dioleoylphosphatidic acid)、二亚油酰磷脂酸(dilinoleoyl phosphatidic acid)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酸(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid)、1,2-二植烷酰-3-sn-磷脂酸(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosp hatidic acid)、胆固醇及生育酚中的一种或两种以上的组合。
更具体地，所述融合脂质可以是选自二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈油酰磷酸胆碱(1,2-二棕榈油酰-s n-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，DPPC)、二油酰磷酸胆碱(1,2-二油酰-s n-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，DOPC)及二棕榈油酰磷酸乙醇胺(1,2-二棕榈油酰-s n-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)，DPPE)中的一种以上。
一个具体实施方案中，通过本发明的试剂盒形成的组合物中的组成成分中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物的含量可以为0.01-50重量份、0.01-30重量份、0.01-15重量份、0.01-12重量份、0.1-50重量份、0.1-30重量份、0.1-15重量份、0.1-12重量份、0.5-50重量份、0.5-30重量份、0.5-15重量份、0.5-12重量份、1-50重量份、1-30重量份、1-15重量份或1-12重量份。
更具体地，所述两亲性嵌段共聚物的含量可以根据有效成分在上述范围内进行调节。例如，一个具体实施方案中，当有效成分为病毒时，以1重量份的阳离子化合物为基准，所述两亲性嵌段共聚物的含量可以为3-7重量份，在另一个具体实施方案中，当有效成分为核酸时，以1重量份的阳离子化合物为基准，所述两亲性嵌段共聚物的含量可以为0.7-7重量份、1-5重量份或1-3重量份。
一个具体实施方案中，通过本发明的试剂盒形成的组合物中的组成成分中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述聚乳酸盐的含量可以为0.1-100重量份、0.1-80重量份、0.1-50重量份、0.1-30重量份、0.1-10重量份、0.1-5重量份、0.5-100重量份、0.5-80重量份、0.5-50重量份、0.5-30重量份、1-100重量份、1-80重量份、1-50重量份、1-30重量份、2-100重量份、2-80重量份、2-50重量份或2-30重量份。
更具体地，所述聚乳酸盐的含量可以根据有效成分在上述范围内进行调节。例如，一个具体实施方案中，当有效成分为病毒时，以1重量份的阳离子化合物为基准，所述聚乳酸盐的含量可以为3-15重量份，在另一个具体实施方案中，当有效成分为核酸时，以1重量份的阳离子化合物为基准，所述聚乳酸盐的含量可以为0.2-4重量份、1-4重量份或0.2-0.8重量份。
一个具体实施方案中，所述第一腔室和/或第二腔室可以进一步包含水性溶液、水混溶性有机溶剂或它们的组合。所述“水性溶液”可以用作与水溶液相同的含义，例如可以指水、无菌纯净水、缓冲液、注射液等，并且还可以是进一步包含有机酸的缓冲液。所述水性溶液例如可以为柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液等，但不限于此。所述“水混溶性有机溶剂”可以为C1-C4的低级醇、丙酮、乙腈、其水混合物或它们的混合物，但不限于此。
一个具体实施方案中，所述第一腔室中包含的两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物及聚乳酸盐的混合物可以在混合后通过亲水性过滤器过滤一次以上并用作第一腔室的内容物。亲水性过滤器的材料例如包括尼龙、混合纤维素酯(Mixed Cellulose Ester，MCE)、聚乙基砜(PES)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)、醋酸纤维素(cellulose acetate，CA)、聚四氟乙烯(PTFE)及它们的混合物，但不限于此。在亲水性过滤器的情况下，有效成分可以更加成功地包含在纳米颗粒中，并且可以增加纳米颗粒的稳定性。
一个具体实施方案中，所述第二腔室可以进一步包含适于提高有效成分的稳定性的稳定剂。所述稳定剂还可以包含pH调节剂、无机盐、糖类、表面活性剂、螯合剂等，但不限于此。所述“糖类”可以指单糖类、二糖类、作为它们的还原糖的糖醇、单一或混合的多糖的聚合物等，所述多糖类可以指三糖类以上的糖类。所述单糖类例如包括甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖等；所述二糖类包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、蜜二糖等；所述糖醇包括甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇等；所述多糖类包括棉子糖、葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、纤维素、羟乙基纤维素、低聚糖，但不限于此。所述“pH调节剂”可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、乙酸盐、天冬氨酸盐或它们的组合，所述“表面活性剂”可以是十二烷基硫酸钠、二丁酸二辛酯磺酸钠、二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、苯扎氯铵、曲拉通(Triton)X-100、曲拉通X-114、聚桂醇(lauromacrogol)400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80或它们的组合，但不限于此。所述“螯合剂”可以是柠檬酸、多酚羧酸、EDTA、DTPA、EDDHA或它们的组合，但不限于此。所述“无机盐”是指一价或二价金属的盐，可以是NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MgSO4、CaSO4、CaCO3、MgCO3等，但不限于此。
例如，当有效成分为病毒时，所述第二腔室还可以包含5-15mM的Tris、5-15mM的组氨酸、50-90mM的NaCl、2-8％(w/v)的蔗糖、0.5-1.5mM的MgCl2、0.005-0.05％(w/v)的PS-80、0.05-0.15mM的EDTA及0.1-1.0％(v/v)的乙醇，pH可以为7.0至8.0。在另一个具体实施方案中，当有效成分为核酸时，所述第二腔室还可以包含PBS缓冲液，例如，pH为7.0至8.0且包含2.0-3.5mM的KCl、1.0-2.5mM的KH2PO4、125-145mM的NaCl及7.5-9.5mM的Na2HPO4的溶液。
所述“腔室”适合容纳纳米颗粒的材料或含有纳米颗粒的溶剂，包括玻璃、塑料、纸、膜等，但不限于此。
以下，通过下述实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例仅仅是用于说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
[实施例]
制备例1：含有dioTETA/mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)/PLANa(1.7k)的第一腔室组合物的制备以及纳米颗粒的形成
(1)第一腔室组合物的制备
将20mg的1,6-二油酰基三亚乙基四酰胺(dioTETA)溶解在1ml的乙醇中，将50mg的单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯-生育酚共聚物(mPEG-PLA-生育酚)(2k-1.7k)溶解在1ml的90％乙醇中，并且将50mg的聚乳酸钠(PLANa)(1.7k)溶解在50％乙醇中。按照下表1的比例混合dioTETA、mPEG-PLA-生育酚(2k-1.7k)、PLANa(1.7k)，然后混合30倍的PBS，从而制备复合乳液。将制备的组合物用0.22μm的亲水性过滤器进行过滤(参照表1)。
[表1]
第一腔室组合物 组成比 dioTETA mPEG-PLA-生育酚 PLANa
实施例1 20/25/50 20μg 25μg 50μg
实施例2 20/50/100 20μg 50μg 100μg
实施例3 20/100/100 20μg 100μg 100μg
实施例4 20/100/200 20μg 100μg 200μg
(2)含有溶瘤病毒的第二腔室组合物的制备
将分注在A195缓冲液(10mM的Tris、10mM的组氨酸、75mM的NaCl、5％(w/v)的蔗糖、1mM的MgCl2、0.02％(w/v)的PS-80、0.1mM的EDTA、0.5％(v/v)的乙醇，pH为7.4)中的形式的VQAd CMV Luc病毒(ViraQuest，批号(Lot#)：33088)计数为1×1010VP来准备。
(3)纳米颗粒的制备
在使用前即刻搅拌(涡旋)所述第一腔室组合物和第二腔室组合物10-15秒来进行混合，从而形成纳米颗粒。
实验例1：确认含有溶瘤病毒的纳米颗粒的形成
在使用前即刻混合第一腔室组合物和第二腔室组合物，从而确认实施例1至实施例4的纳米颗粒是否正常形成。
其结果，在所有的实施例1至实施例4中，即使进行简单的混合，也未观察到沉淀物，因此确认了纳米颗粒正常形成。
实验例2：确认含有溶瘤病毒的纳米颗粒的细胞内递送效率
为了评价纳米颗粒的细胞内递送效率，准备了适合评价病毒的递送效率的低CAR表达的MDA-MB435细胞。在细胞内注入前即刻混合第一腔室组合物和第二腔室组合物，从而形成实施例1至实施例4的纳米颗粒，并以相当于基于病毒的500moi的量分注到细胞中。进一步培养15-24小时，然后将荧光素(luciferin)添加到细胞中以测量荧光素酶的表达量。作为对照组，使用病毒(裸露病毒(naked Ad)；Ad)，而不是纳米颗粒。将其结果示于图1中。
其结果，观察到进行实验的实施例的纳米颗粒与对照组相比均表现出更高的细胞内递送效率。
制备例2：含有(dioTETA)/mPEG-PLA(2k-1.7k)/PLANa(1.7k)的第一腔室组合物的制备以及纳米颗粒的形成
(1)第一腔室组合物的制备
将20mg的dioTETA溶解在1ml的20mM乙酸钠缓冲液(pH为4.6)中，将10mg的单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯共聚物(mPEG-PLA)(2k-1.7k)溶解在1ml的水中，并且将10mg的PLANa(1.7k)溶解在1ml的水中。按照下表2的比例混合dioTETA、mPEG-PLA(2k-1.7k)、PLANa(1.7k)，然后用0.22μm的亲水性过滤器进行过滤(参照表2)。
[表2]
Figure BDA0003801242240000191
(2)含有mRNA的第二腔室组合物的制备
将10μg的
Figure BDA0003801242240000201
萤火虫荧光素酶(FireFly Luciferase)mRNA(5-甲氧基尿苷(5-methoxyuridine))(TriLink，货号(Catalog)L-7202)溶解在PBS(pH为7.4，2.67mM的KCl、1.47mM的KH2PO4、136.9mM的NaCl、8.1mM的Na2HPO4)中，从而准备第二腔室组合物。
(3)纳米颗粒的制备
在使用前即刻搅拌(涡旋)所述第一腔室组合物和第二腔室组合物10-15秒来进行混合，从而形成纳米颗粒。
实验例3：确认mRNA纳米颗粒的形成
在使用前即刻混合第一腔室组合物和第二腔室组合物，从而确认是否与mRNA结合并形成实施例5至实施例8的纳米颗粒。利用琼脂糖凝胶阻滞试验(agarose gelretardation assay)(1.5％的琼脂糖(agarose)；DyneGelSafe试剂盒(Kit))测量mRNA复合(complexation)，并将结果示于图2中。并且，为了确认纳米颗粒的形成，将使用DLS的颗粒尺寸的测量结果示于图3中。基于与游离(free)mRNA比较的凝胶阻滞试验结果和DLS结果，确认了实施例5至实施例8中均形成了mRNA复合(complex)纳米颗粒。
实验例4：确认含有mRNA的纳米颗粒的细胞内递送效率
为了评价形成的纳米颗粒的细胞内递送效率，准备了A549人肺癌细胞(humanlung cancer)。在细胞内注入前即刻混合第一腔室组合物和第二腔室组合物，从而形成对应于实施例6或实施例8的纳米颗粒，并且以相当于基于96孔(well)的250ng mRNA的量分注到细胞中。进一步培养6小时，然后将荧光素添加到细胞中以测量荧光素酶的表达量。作为对照组，使用商业试剂(commercial reagent)
Figure BDA0003801242240000202
-mRNA试剂盒(Mirus Bio)。将其结果示于图4中。其结果，观察到进行实验的实施例的纳米颗粒表现出与对照组相似水平的细胞内递送效率。
实验例5：根据含有mRNA的纳米颗粒的稳定性的细胞内递送效率的比较
为了确认在施用前即刻通过试剂盒制备的纳米颗粒由于纳米颗粒的稳定性而具有更高的细胞内递送效率，准备了HepG2细胞并通过加速试验比较了细胞内递送效率。在细胞内注入前即刻混合第一腔室组合物和第二腔室组合物，从而形成对应于实施例6的纳米颗粒，并以相当于基于96孔的250ng mRNA的量分注到细胞中。作为对照组，将以相同方式制备的纳米颗粒以及利用通常用作转染剂(transfection agent)的L3K制备的纳米颗粒在42℃下储存1小时并使用，并以相同的方式分注到细胞中。进一步培养15小时，然后将荧光素添加到细胞中以测量荧光素酶的表达量。将其结果示于图5中。其结果，确认了制备后通过加速试验降低了稳定性，因此细胞内递送效率迅速降低。

Claims (8)

1.一种用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其包括：
第一腔室，包含两亲性嵌段共聚物、阳离子化合物及聚乳酸盐；以及
第二腔室，包含选自核酸、多肽、病毒或它们的组合中的有效成分。
2.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，所述试剂盒用于形成细胞内递送有效成分的纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，选自所述第一腔室和所述第二腔室中的一个以上还包含附加的溶剂。
4.根据权利要求3所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，所述溶剂是水性溶剂、水混溶性溶剂或它们的混合物。
5.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，所述第二腔室还包含pH调节剂、无机盐、糖类、表面活性剂、螯合剂或它们的组合。
6.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述两亲性嵌段共聚物的量为0.01-50重量份。
7.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，以1重量份的所述阳离子化合物为基准，所述聚乳酸盐的量为0.1-100重量份。
8.根据权利要求1所述的用于制备纳米颗粒组合物的试剂盒，其中，所述第一腔室中的所述两亲性嵌段共聚物、所述阳离子化合物及所述聚乳酸盐的混合物在混合后通过亲水性过滤器过滤一次以上。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05111524A (ja) * 1991-10-23 1993-05-07 Maeda Sangyo Kk 医療用キツト製品
EP1173600A2 (en) * 1999-04-20 2002-01-23 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
KR100502840B1 (ko) * 2002-09-04 2005-07-21 학교법인 포항공과대학교 약물 담지능력이 우수한 블록 공중합체 미셀 조성물
MX2018003096A (es) * 2015-09-15 2018-05-11 Samyang Biopharmaceuticals Composicion farmaceutica que contiene farmaco anionico, y metodo de preparacion para la misma.
EP3630076A1 (en) * 2017-05-30 2020-04-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods for manufacturing a liposome encapsulated rna
KR20190127277A (ko) * 2018-05-04 2019-11-13 주식회사 삼양바이오팜 mRNA 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법

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