CN115125212A - 一种外周血循环肿瘤细胞类器官培养方法 - Google Patents

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Chengdu Nuoyeide Medical Laboratory Co ltd
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Chengdu Nuoyeide Medical Laboratory Co ltd
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Abstract

本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种从外周血中分离循环肿瘤细胞并进行类器官培养的方法。本发明采用梯度离心结合磁珠分选的方法，只需要少量外周血，就可以分离出循环肿瘤细胞并培养成特定类型的类器官。再采用培养的类器官进行药物筛选，形成循环肿瘤细胞分离‑不同类器官培养‑药物筛选的完整应用链条。

Description

一种外周血循环肿瘤细胞类器官培养方法
本申请要求2022年06月17日提交的中国发明专利申请【CN2022106904818】、名称为“一种外周血循环肿瘤细胞类器官培养方法”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种从外周血中分离循环肿瘤细胞并进行类器官培养的方法。
背景技术
长期以来，学术界都利用动物模型来进行疾病研究和动物开发，随着干细胞技术的发展，利用新的培养方法，将多能干细胞、成体干细胞或肿瘤细胞诱导产生一些类似于体内组织或者器官的三维结构，即类器官。利用类器官进行临床前用药测试或者临床同步用药检测试验已成为一大主流，相比于2D培养的肿瘤细胞系或PDX小鼠模型等，类器官优势在于更加贴近患者本身的肿瘤组织特征，获取结果时间缩短，结果判读更加直观。然而目前类器官培养之前的组织获取存在着一定的局限性，首先，虽然手术切除获取离体新鲜组织进行类器官的构建是首选，但是根据临床治疗指南，晚期肿瘤患者一般不建议手术切除，因此很难获取晚期肿瘤患者的肿瘤组织进行体外培养研究。其次，想要获取患者组织，需要通过穿刺和手术等手段，其前提是均需获得患者同意。而由于会产生创伤，部分患者并不愿意进行穿刺。因此，如何以更少的患者受创面获得相对较多的肿瘤细胞，以及，如何扩大不同种类细胞样本来源途径，是目前需要突破的技术难题。基于此，本发明提出提取外周血中的循环肿瘤细胞培养为类器官进行体外实验为一种理想选择。
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。由于CTC在进入外周血后大部分会发生凋亡或被吞噬，因此目前获取外周血中的CTC主要用于肿瘤的检测，还未见将CTC和类器官培养技术相结合的应用。现有的分离CTC的方法主要有1)肿瘤标志物的磁珠分选(包括EPCAM，CK8，CK18，CK19等)；2)免疫细胞CD45标志物磁珠分选，负筛，分离免疫细胞；3)密度梯度离心方法：需要的血液量大，杂质多；4)过滤：可能损失较小的肿瘤细胞，还需根据肿瘤的不同制定不同的滤膜，生产要求高；5)特殊的仪器装置：门槛高，价格昂贵。
综上所述，优化提取循环肿瘤细胞的方法以获得数量更多杂质更少的循环肿瘤细胞，再结合类器官培养技术将其培养为特定类型的类器官进行下一步的研究，可以缓解现有技术中存在的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从外周血中分离循环肿瘤细胞并进行类器官培养的方法，具体技术方案如下。
一种外周血循环肿瘤细胞类器官培养方法，其从新鲜外周血中分离提取循环肿瘤细胞和培养为特定类型的类器官，包括以下步骤：
1)采集少量甚至微量的肿瘤患者新鲜外周血然后加入等体积DPBS磷酸盐缓冲液；所述新鲜外周血包括1ml、2ml、3ml、4ml和5ml；
2)加入Ficoll溶液配置成Ficoll-血液-DPBS混合液，然后将所述Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机进行低速梯度离心，经过梯度离心后的所述Ficoll-血液-DPBS混合液分为四层，吸取从上往下数第二层的乳白色细胞悬液；
3)低速离心所述乳白色细胞悬液，使用CD45磁珠吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液继续低速离心；
4)离心后的细胞悬液去除上清后与基质胶混合重悬，种植于孔板内，待基质胶凝固后加入适合所述特定类型的类器官生长的培养基培养到形成可传代的类器官体积。
进一步，所述DPBS磷酸盐缓冲液为无菌且预冷到10℃以下。
进一步，用接近室温的Ficoll溶液加入到血液-DPBS混合液中，加入的所述Ficoll溶液与血液-DPBS等体积。
进一步，所述步骤2)中的低速梯度离心速度为400-800g，离心10-30min。
进一步，所述步骤3)中低速离心所述乳白色细胞悬液的离心速度为400-800g，离心5-10min。
进一步，所述步骤3)中低速离心所述未吸附的细胞悬液的离心速度为400-800g离心1-5min。
进一步，所述步骤3)中还使用裂红液裂解去除离心沉淀中的明显红细胞沉淀。
进一步，所述步骤3)中所述CD45磁珠的用量比例为每2×107个细胞加入250uL体积的磁珠。
进一步，所述步骤4)中的基质胶为Matrigel基质胶；还可以加入适合所述特定类型的类器官生长的生长因子，包括B27、重组R-Spondin-1、Noggin、Nicotinamide、SB202190、gastrin、N-acetylcysteine、A83-01、WNT3A、Y-27632和/或EGF中的一种或多种。
本发明的一个实施例中使用的基质胶为康宁公司的matrigel，多用于培养类器官使用。但也可以是其他公司的培养类器官的基质胶，比如R&D公司的matrigel。
培养时间根据细胞来源不同生长时间也有所不同，生长状态良好的情况下一般为一周左右即可形成可以传代类器官体积。
进一步，所述可传代的类器官体积为30-100um。
本发明所述的“特定类型的类器官”是指由外周血中分离出的特定循环肿瘤细胞培养成相对应的类器官。例如，分离出结直肠癌循环肿瘤细胞，培养为结直肠癌类器官。
由于肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EMT，Epithelial Mesenchymal Transition)，故CTC存在不同类型，因此分离得到的CTC再用不同的肿瘤类器官培养基进行培养，可以得到不同类型的类器官。本发明方法培养方法培养得到的类器官包括但不限于结直肠癌类器官、膀胱癌类器官、乳腺癌类器官。
有益技术效果
1)本发明的方法只需要获取少量甚至微量的患者新鲜外周血(1-5ml)，就可以分离出其中的循环肿瘤细胞并将其进行特定类型的肿瘤细胞三维培养。根据分离得到的CTC不同，可以培养得到不同类型的类器官。因此本发明的方法获取样品的方式便捷，患者创伤小，获得的肿瘤细胞类型多样化。
2)本发明的分离提取方法由梯度离心和磁珠分选结合。先用密度梯度离心去除大量无关外周血内其他类型细胞后，接着即可使用少量CD45磁珠去除多余免疫细胞从而富集外周血内肿瘤细胞。因此本发明方法适用于各种肿瘤患者外周血的循环肿瘤细胞的分离提取。
3)进一步的，使用本发明培养得到的类器官再快速进行体外药敏测试和药物筛选，可以使患者的受益面达到最大化。
综上所述，本发明实际上提供一种循环肿瘤细胞分离-不同类器官培养-药物筛选的完整应用链条，从外周血中分离提取循环肿瘤细胞进行类器官培养，解决了“以更少的受创面获得相对较多的细胞”和“扩大样品来源途径”两个技术问题。同时基于CTC的特点，培养出的类器官种类多样化，可以实现不同组织筛选不同药物，具有深远的临床意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为循环肿瘤细胞富集及培养流程图；
图2为本发明培养的结直肠癌类器官白光图；
图3为膀胱癌循环肿瘤细胞类器官培养图；
图4为乳腺癌循环肿瘤细胞类器官培养图；
图5为其他实施例培养的结直肠癌肿瘤类器官白光图(培养时间为3天)；
图6为肿瘤类器官Ki67免疫荧光染色图；
图7为循环肿瘤类器官的临床前化疗药物筛选结果；
图8为不同分离方法培养的类器官(A为本发明培养的类器官；B为普通方法培养的类器官)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围
Figure BDA0003714472000000071
的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例一
方法概述1
先使用Ficoll分离除去大量红细胞，血小板，血清等，再利用CD45磁珠分选除去大量免疫细胞，减少了CD45磁珠的用量。
优选地，所述DPBS磷酸盐缓冲液需要无菌且预冷到10℃以下，优选的是预冷到4℃，可最大程度的维持细胞在体外的活性时间。
首先加入Ficoll溶液离心分离外周血中各种密度梯度的细胞。所述Ficoll溶液需要加入同等体积并且接近室温才可使用。
离心时离心机升降速度调整到最小值。Ficoll溶液只能大致将外周血分成四层，离心后从上到下颜色依次为黄色，乳白色，透明，棕红色。根据细胞密度，单核细胞(包括白细胞和循环肿瘤细胞)位于从上往下数第二层，细胞悬液呈乳白色，其中还可能包含少量的血小板和红细胞。
1mL枪尖直接插入液面下小心吸取出第二层细胞悬液。可直接根据颜色判断是否吸取干净，即将白色部分吸取干净。残存的少量红细胞和血小板，可选择性使用裂红液去除红细胞，低速离心除去大部分残存血小板。
CD45磁珠分选后收集未吸附于磁力柱内的细胞悬液，未吸附的细胞悬液包含大部分的循环肿瘤细胞和极少数没有吸附干净的白细胞，离心后细胞沉淀用适量基质胶重悬种植于48孔板内。
实施例二
方法概述2
1)取肿瘤患者1-5mL新鲜外周血于采血管中冷冻保存备用，根据患者的具体情况，可采集1mL、2mL、3mL、4mL、5mL；一般来讲，晚期肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞比较多，因此根据患者的身体状况可适当少取一些血液样品；
2)在超净工作台内将外周血转移至15mL离心管中，加入等体积预冷到10℃以下的DPBS磷酸盐缓冲液，混合均匀；
3)取2-10mL接近室温的Ficoll溶液于另一个干净的15mL离心管中，使用1mL枪尖延离心管内壁缓慢轻柔加入血液-DPBS混合液，使其保持于Ficoll溶液层上方；
4)缓慢轻柔将配置后的Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机中，将离心机升降速度调至1，低速离心400-800g，离心10-30min。优选地，低速离心400g，离心时间30min。优选地，低速离心800g，离心时间10min。
5)离心后的混合液分为四层，从上往下数第二层为乳白色细胞悬液，即单核细胞层，包含大量白细胞，循环肿瘤细胞，少量红细胞和血小板；
6)将1mL枪尖直接置于液面下吸取乳白色细胞悬液转移至新的15mL离心管内，低速离心400-800g，5-10min。优选地，低速离心400g，离心时间10min。优选地，低速离心800g，离心时间5min。
7)沉淀中见明显红色可选择性使用裂红液裂解去除红细胞；
8)用Invitrogen Dynabeads CD45吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液收集于15mL离心管内，低速离心400-800g，1-5min。优选地，低速离心400g，离心时间5min。优选地，低速离心800g，离心时间1min。
9)去上清后置于冰上用适量基质胶重悬，种植于48孔板内，每孔30uL，种2-5个孔，一共使用60-150uL基质胶。待基质胶凝固后再加入适量的适合该类肿瘤类器官生长的培养基，一般情况下，置于37度，5％CO2的细胞孵箱内培养。
循环肿瘤细胞富集及培养流程图见图1。
实施例三
结直肠癌晚期患者循环肿瘤细胞的分离及三维培养
1)取结直肠癌患者1-5mL新鲜外周血于采血管中冷冻保存备用；
2)在超净工作台内将外周血转移至15mL离心管中，加入等体积且预冷的DPBS磷酸盐缓冲液，混合均匀；
3)取2-10mL Ficoll溶液于另一个干净的15mL离心管中，使用1mL枪尖延离心管内壁缓慢轻柔加入血液-DPBS混合液，使其保持于Ficoll溶液层上方；
4)缓慢轻柔将配置后的Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机中，将离心机升降速度调至1，低速400g，离心30min；
5)离心后的混合液分为四层，从上往下数第二层为乳白色细胞悬液，即单核细胞层，包含大量白细胞，循环肿瘤细胞，少量红细胞和血小板；
6)将1mL枪尖直接置于液面下吸取乳白色细胞悬液转移至新的15mL离心管内，低速离心400g，10min；
7)沉淀中见明显红色可选择性使用裂红液裂解去除红细胞；
8)用CD45吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液收集于15mL离心管内，低速离心400g，5min；
9)去上清后置于冰上用60uL基质胶重悬，种植于48孔板内，没孔30uL，种两孔。待基质胶凝固后即可加入150uL适合该类肿瘤类器官生长的培养基，置于细胞孵箱内培养。培养结果见图2。本发明结直肠癌细胞类器官培养条件如下表：
Figure BDA0003714472000000101
Figure BDA0003714472000000111
实施例四
膀胱癌晚期患者循环肿瘤细胞的分离及三维培养
1)取膀胱癌晚期患者1-5mL新鲜外周血于采血管中冷冻保存备用；
2)在超净工作台内将外周血转移至15mL离心管中，加入等体积且预冷的DPBS磷酸盐缓冲液，混合均匀；
3)取2-10mL Ficoll溶液于另一个干净的15mL离心管中，使用1mL枪尖延离心管内壁缓慢轻柔加入血液-DPBS混合液，使其保持于Ficoll溶液层上方；
4)缓慢轻柔将配置后的Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机中，将离心机升降速度调至1，低速400g，离心30min；
5)离心后的混合液分为四层，从上往下数第二层为乳白色细胞悬液，即单核细胞层，包含大量白细胞，循环肿瘤细胞，少量红细胞和血小板；
6)将1mL枪尖直接置于液面下吸取乳白色细胞悬液转移至新的15mL离心管内，低速离心400g，10min；
7)沉淀中见明显红色可选择性使用裂红液裂解去除红细胞；
8)用CD45吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液收集于15mL离心管内，低速离心400g，5min；
9)去上清后置于冰上用60uL基质胶重悬，种植于48孔板内，每孔30uL，种两孔。待基质胶凝固后即可加入150uL膀胱癌肿瘤类器官培养基，置于细胞孵箱内培养。3-6天后进行肿瘤类器官的传代，利用正置显微镜拍照记录，如图3所示。本发明膀胱癌细胞类器官培养条件如下表：
Figure BDA0003714472000000121
实施例五
乳腺癌晚期患者循环肿瘤细胞的分离及三维培养
1)取乳腺癌晚期患者1-5mL新鲜外周血于采血管中冷冻保存备用；
2)在超净工作台内将外周血转移至15mL离心管中，加入等体积且预冷的DPBS磷酸盐缓冲液，混合均匀；
3)取2-10mL Ficoll溶液于另一个干净的15mL离心管中，使用1mL枪尖延离心管内壁缓慢轻柔加入血液-DPBS混合液，使其保持于Ficoll溶液层上方；
4)缓慢轻柔将配置后的Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机中，将离心机升降速度调至1，低速400g，离心30min；
5)离心后的混合液分为四层，从上往下数第二层为乳白色细胞悬液，即单核细胞层，包含大量白细胞，循环肿瘤细胞，少量红细胞和血小板；
6)将1mL枪尖直接置于液面下吸取乳白色细胞悬液转移至新的15mL离心管内，低速离心400g，10min；
7)沉淀中见明显红色可选择性使用裂红液裂解去除红细胞；
8)用CD45吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液收集于15mL离心管内，低速离心400g，5min；
9)去上清后置于冰上用60uL基质胶重悬，种植于48孔板内，没孔30uL，种两孔。待基质胶凝固后即可加入150uL适合该类肿瘤类器官生长的培养基，置于37度，5％CO2的细胞孵箱内培养。3-6天后即可传代处理，利用正置显微镜拍照记录，如图4所示。本发明乳腺癌细胞类器官培养条件如下表：
Figure BDA0003714472000000131
肿瘤类器官可以正常扩增进行后续的处理。
实施例六
利用培养的循环肿瘤类器官进行肿瘤标志基因Ki67的免疫荧光染色
1)培养后的肿瘤类器官生长到直径达30-50um时吸去培养基，加入1mL4％PFA溶液，室温固定过夜；
2)去掉4％PFA后，将细胞转移至1.5mL离心管中，进行乙醇梯度脱水，依次加入1mL的70％乙醇，80％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，各15min；
3)加入二甲苯进行透明化5min；
4)加入融化后的石蜡，浸蜡过夜；
5)包埋后切成5um厚度贴于粘附载玻片上，置于65度烘片机，15min-30min；
6)将玻片依次浸入二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，各三次，每次3min，再浸入70％乙醇，30％乙醇，超纯水，各一次，每次3min；
7)于抗原修复液中95度，30min；
8)自然冷却到室温后，转入0.3％Triton溶液中，打孔20min；
9)PBS溶液浸洗3次，每次5min，滴加能够覆盖类器官切片的3％双氧水，10min；
10)PBS溶液浸洗3次，每次5min，类器官切片上滴加30uL-50uL2％的羊血清，封闭1H；
11)去除羊血清后，切片覆盖滴加配制的一抗溶液，4度孵育过夜；
12)PBS溶液浸洗3次，每次5min，滴加二抗，避光室温孵育1H；
13)PBS溶液浸洗3次，每次5min，滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片覆盖封片，四个角滴加透明指甲油固定盖玻片；
14)使用荧光显微镜拍照，如图6所示。
染色结果：Ki67是一个常见的肿瘤增殖标志物，常用于临床肿瘤的病理诊断染色。本发明培养的肿瘤类器官染色结果为大多数细胞为Ki67阳性，表明其具有增殖能力，并且可能为肿瘤细胞。由于本发明的创造性之一是可以利用此方法从外周血中获取肿瘤细胞并进行类器官的培养，而且本发明使用的培养条件只适用于上皮来源的肿瘤细胞的生长，白光图和染色实验证实可以用此发明提取出肿瘤细胞，培养为类器官，并且具备强增殖能力。
实施例七
利用培养的循环肿瘤类器官进行临床前药物筛选
1)培养后的肿瘤类器官生长到直径达30-50um时可进行传代；
2)用Tryple重悬后转移至15mL离心管中，吹打50次，置于37度水浴锅中5min，反复多次直至消化为单细胞；
3)利用传统的血细胞计数板计数，每孔为2000个的细胞密度，5uL每孔重悬细胞种植于96孔板内；
4)待基质胶凝固后加入培养基；
5)培养第二天，利用培养基配制药物浓度，每种药物终浓度为10uM，三个复孔，依次加入药物，培养48H-72H；
6)在荧光显微镜下拍照保存，利用ImageJ软件统计分析类器官大小数量，使用GraphPad软件作图，以此比较药物对肿瘤的杀伤或者抑制效果。结果如图7所示。
本实施中使用的药物包括：5-Fu、Cisplatin、Paclitaxel、PAPR、HDAC抑制剂、Ofloxacin、Ellagic acid，浓度为10μM，其中DMSO为阴性对照。
结果显示：对比图中的各数据的中位数大小。本实施例说明从外周血中提取肿瘤细胞进行3D培养后可以用于患者临床前用药的筛选，这是用多种药物去测试培养的类器官对药物的敏感性，不仅可以筛选常用的化疗药物，还可以筛选并不常规的但被FDA批准的药物，为后续患者用药做指导，具有深远的临床意义。由于肿瘤细胞具有异质性，同一个患者来源的肿瘤细胞也存在异质性，所以培养出的肿瘤类器官对药物的反应敏感度不一样，有一些类器官用药后停止生长甚至死亡，导致测量出的类器官直径小，相反，有一些类器官用药后并不受影响继续生长，直径偏大，导致了统计图中出现的拖尾现象，因此本实施例不仅可以测试培养出的类器官对不同药物的敏感性，还能证明患者来源的肿瘤细胞间存在较大的异质性，可用于进一步的临床研究。
实施例八
不同分离方法的平行对照实验
使用同一批获取的肾癌患者的外周血，各取3ml，分别进行本发明的实验提取培养和只使用Ficoll密度梯度离心或者磁珠分选的方法进行提取培养循环肿瘤细胞。图8为培养三天后的细胞生长情况。Ficoll组的细胞均一，未有生长迹象，可能是由于非肿瘤细胞过多，肿瘤细胞无法得到足够的空间与营养，导致其不能在肾肿瘤类器官的培养基中发生增殖。Ficoll+CD45 beads组为使用本发明获取的细胞培养为类器官的生长情况，图8中可以看出有3D细胞团产生。两个实验对比，可以发现同样体积的外周血使用本发明循环肿瘤细胞可以得到高效的富集。使用普遍方法包含过多非肿瘤细胞，浪费基质胶。由于有过多的非肿瘤细胞，会导致细胞间密度过大，导致肿瘤类器官生长受到抑制，成功率并不高。
不同分离方法培养的类器官结果对比
方法 最终获取细胞总数 类器官培养成功比例
梯度离心+磁珠分选 1x10<sup>6</sup> 80％
梯度离心 1x10<sup>8</sup> 10％
磁珠分选 5x10<sup>8</sup> 10％
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种外周血循环肿瘤细胞类器官培养方法，其特征在于，从新鲜外周血中分离提取循环肿瘤细胞和培养为特定类型的类器官，具体包括以下步骤：
1)采集肿瘤患者新鲜外周血然后加入等体积DPBS磷酸盐缓冲液；
2)加入Ficoll溶液配置成Ficoll-血液-DPBS混合液，然后将所述Ficoll-血液-DPBS混合液置于离心机进行低速梯度离心，经过梯度离心后的所述Ficoll-血液-DPBS混合液分为四层，吸取从上往下数第二层的乳白色细胞悬液；
3)低速离心所述乳白色细胞悬液，使用CD45磁珠吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液继续低速离心；
4)离心后的细胞悬液去除上清后与基质胶混合重悬，种植于孔板内，待基质胶凝固后加入适合所述特定类型的类器官生长的培养基培养到形成可传代的类器官体积。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述DPBS磷酸盐缓冲液为无菌且预冷到10℃以下。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，用接近室温的Ficoll溶液加入到血液-DPBS混合液中，加入的所述Ficoll溶液与血液-DPBS等体积。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)中的低速梯度离心速度为400-800g，离心10-30min。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中低速离心所述乳白色细胞悬液的离心速度为400-800g，离心5-10min。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中低速离心所述未吸附的细胞悬液的离心速度为400-800g，离心1-5min。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中还使用裂红液裂解去除离心沉淀中的红细胞沉淀。
8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中所述CD45磁珠的用量比例为每2×107个细胞加入250uL体积的磁珠。
9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤4)中的基质胶为Matrigel基质胶；还可以加入适合所述特定类型的类器官生长的生长因子，包括B27、重组R-Spondin-1、Noggin、Nicotinamide、SB202190、gastrin、N-acetylcysteine、A83-01、WNT3A、Y-27632和/或EGF中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述可传代的类器官体积为30-100um。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003200335B2 (en) * 1998-02-12 2004-08-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
CN106635995A (zh) * 2017-03-10 2017-05-10 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法
CN109207428A (zh) * 2018-09-12 2019-01-15 上海易对医生物医药科技有限公司 循环肿瘤细胞的分离和培养方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003200335B2 (en) * 1998-02-12 2004-08-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
CN106635995A (zh) * 2017-03-10 2017-05-10 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法
CN109207428A (zh) * 2018-09-12 2019-01-15 上海易对医生物医药科技有限公司 循环肿瘤细胞的分离和培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KALLERGI G 等: ""Evaluation of Isolation Methods for Circulating Tumor Cells (CTCs)"", vol. 40, pages 411 - 419 *
LIU 等: ""Organoid of ovarian cancer: genomic analysis and drug screening"", 《CLINICAL AND TRANSLATIONAL ONCOLOGY》, vol. 22, pages 1241 *
沈祥国: ""PD-L1在胰腺癌外周血及肿瘤组织中的表达"", no. 2, pages 072 - 539 *

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