CN115109867A - 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用 - Google Patents

鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115109867A
CN115109867A CN202210933313.7A CN202210933313A CN115109867A CN 115109867 A CN115109867 A CN 115109867A CN 202210933313 A CN202210933313 A CN 202210933313A CN 115109867 A CN115109867 A CN 115109867A
Authority
CN
China
Prior art keywords
poplar
ferr
sex
primer pair
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210933313.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115109867B (zh
Inventor
安新民
黄赛
陈婷婷
薛胤轩
苗得雨
吴茹茜
李影
郭斌
鲁海琳
齐婉芯
马佳琳
郑智礼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN202210933313.7A priority Critical patent/CN115109867B/zh
Publication of CN115109867A publication Critical patent/CN115109867A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115109867B publication Critical patent/CN115109867B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了鉴定杨树FERR和FERR‑R基因的特异PCR引物及其在杨树性别鉴定中的应用。本发明根据毛白杨性别决定基因FERR以及FERR‑R及其前后延长序列设计引物，从所设计的大量引物中筛选获得特异性的能够准确鉴定性别决定基因FERR特异PCR引物对以及准确鉴定性别决定基因和FERR‑R的特异PCR引物对，采用所述特异PCR引物对与待检测杨树样品DNA建立PCR扩增体系，根据PCR扩增结果就可准确的判断待测杨树样品的性别或是否含有性别决定基因FERR，具有快速、准确、特异性高等优点。

Description

鉴定杨树FERR和FERR-R基因的特异PCR引物及其在杨树性别 鉴定中的应用
技术领域
本发明涉及杨树性别的分子鉴定，尤其涉及鉴定杨树性别决定基因FERR和FERR-R的特异PCR引物对及其在杨树性别鉴定中的应用，属于杨树性别的分子鉴定领域。
背景技术
杨树在全球广泛分布，是主要的造林用材树种之一。杨树是雌雄异株植物，性别对生长性状存在影响，雌株达到性成熟后，每年开花时会产生大量飞絮，会造成严重的环境污染和安全隐患。但由于杨树的童期较长，其性别无法在早期做出判断。因此探究杨树性别早期鉴定方法，对杨树育种具有重要应用价值，也有助于对不同性别的杨树资源加以开发和利用。
杨树的性别决定有XY和ZW两套系统，在性染色体X、Y和W上均存在促雌基因FERR，但在Y染色体上除FERR基因外，还存在抑雌基因FERR-R，而Z染色体则不存在上述任何一个。
FERR-R基因是由在雌花中特异表达的基因FERR(该基因位于性别决定区外)复制形成，复制出的基因FERR-R丢失了部分序列，转录产生siRNA反过来调控FERR基因的表达，使FERR基因的启动子和第一外显子发生甲基化，并降解FERR转录本，从而抑制FERR基因在雄性植株中表达。不含FERR-R基因的杨树，FERR基因的表达不受FERR-R抑制，所以雌花发育，表现为雌株。
根据上述性别决定模型及FERR表达调控模式，待测杨树的性别可根据以下几种情况做出判断。
(1)FERR扩增阳性+FERR-R扩增阳性，属XY型、ZY型或WY型，植株性别均为雄性；
(2)仅FERR扩增阳性，属XX型、ZW型或XW型，植株性别为雌性；
(3)FERR扩增阴性+FERR-R扩增阴性，属ZZ型，植株为雄性。
FERR-R基因与FERR基因序列相似性较高，在启动子和外显子的大部分区域存在序列同源，因此，筛选获得特异性的能够准确鉴定FERR和FERR-R基因的特异PCR引物再据此建立PCR扩增体系，根据PCR扩增结果就可准确的判断杨树性别。
发明内容
本发明的目的之一是提供准确鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对；
本发明的目的之二是提供准确鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对；
本发明的目的之三将所述的特异性PCR引物对应用于杨树的性别鉴定或是否含有性别决定基因FERR。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的第一方面是提供了准确鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对，该特异性PCR引物对的上游引物的核苷酸序列为：GCTCTTCTTCTTCCTTACCATCAA；该特异性PCR引物对的下游引物的核苷酸序列为：TAGAGTACTCTAACCTTTTGCCAC。
本发明的第二方面是提供了准确鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对，该特异性PCR引物对的上游引物的核苷酸序列为：ACCATGGATTTGCAATGTTATGAGT；该特异性PCR引物对的下游引物的核苷酸序列为：TGAATGGACATGCATGGGATGG。
本发明的第三方面是将所述的准确鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对应用于杨树是否含有FERR基因以及性染色体类型的鉴定，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对的上游引物和下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果扩增出758bp的条带，则待检测的杨树样品含有FERR基因，性染色体类型可能是X、Y或W。
本发明的第四方面是将所述的准确鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对应用于杨树性别的鉴定，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对的上游引物和下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果扩增出1355bp的条带，则待检测的杨树性别为雄性。
本发明的第五方面是将所述的准确鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对以及准确鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对同时应用于杨树性别的鉴定，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对以及鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对共同建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果同时扩增出758bp的条带和1355bp的条带，则待检测的杨树为雄性；如果均未扩增出758bp的条带以及1355bp的条带，则待检测的杨树为雄性；如果仅扩增出758bp的条带，则待检测的杨树性别为雌性。
本发明进一步提供了鉴别杨树性别的PCR试剂盒，包括：Taq酶，dNTP，Mg2+，ddH2O和PCR扩增引物对；其中，所述的PCR扩增引物对是鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对；或者所述的PCR扩增引物对是鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对；或者所述的PCR扩增引物对是由鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对和鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对共同组成。
本发明整体技术方案详述
本发明根据毛白杨FERR序列及其前后延长序列设计了6对特异性引物对，利用16种杨树材料的基因组DNA进行PCR，水为阴性对照，PCR产物经由电泳检测，根据电泳检测结果可见，引物D的PCR结果显示，1#、2#、4#、7#-9#、11#-16#均有清晰条带，证明这些杨树基因组中存在FERR基因，且条带结果与已知性染色体基因型的杨树一致，其余的5对引物(引物对A，B，C，E和F)结果均未显示清晰条带。
本发明根据毛白杨FERR-R序列及其前后延长序列了设计4对扩增引物，利用16种杨树材料的基因组DNA进行PCR，根据电泳检测的结果可见，引物对G的PCR结果显示，2#、4#、8#、12#有清晰条带，且条带结果与已知性染色体基因型的杨树一致。引物对I和引物对H的电泳结果中，雌性杨树也出现了条带，证明引物不具有特异性，不可用做性别鉴定的特异引物，引物对J仅在8#扩增出了特异性条带，但是在2#、4#和12#没有扩增出相应的特异性条带，说明其准确性不够，也不能用于杨树的性别鉴定。
综上，根据16种杨树的性别以及已知的性染色体基因型，在针对FERR所设计的6对引物中，惟有引物对D可以特异性区分出含有FERR基因的杨树，在针对FERR-R所设计的4对引物中，惟有引物对G可以特异性区分出含有FERR-R的杨树，且准确性高，可以应用于杨树性别鉴别。
附图说明
图1为杨树性别决定基因FERR PCR电泳图。
图2为杨树性别决定基因FERR-R PCR电泳图。
图3为FERR基因或FERR-R基因在白杨人工杂交群体部分子代的PCR扩增结果。
图4为FERR基因在毛白杨自然群体的PCR扩增结果。
图5为FERR-R基因在毛白杨自然群体的PCR扩增结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1鉴定杨树性别决定基因FERR和FERR-R的特异PCR引物的筛选及应用
1.试验材料
用于提取基因组DNA的杨树种类见表1，样品冷冻保存于-80℃超低温冰箱中。
表1.用于性别分析鉴定的杨树种类
Figure BDA0003782593860000051
Figure BDA0003782593860000061
2.试验方法
2.1 FERR基因
2.1.1 PCR引物设计
据已知美洲黑杨♀(Populus deltoides Marsh.)FERR基因序列(Xue L,Wu H,Chen Y,Li X,Hou J,Lu J,Wei S,Dai X,Olson MS,Liu J,Wang M,Charlesworth D,YinT.Evidences for a role of two Y-specific genes in sex determination inPopulus deltoides.Nat Commun.2020,11(1):5893.doi:10.1038/s41467-020-19559-2)，在已测序毛白杨GM107基因组中比对，得到毛白杨GM107中FERR基因序列，根据该序列及其前后序列设计6对PCR引物，具体的核苷酸序列见表2。
表2鉴定杨树FERR基因所设计的PCR引物
Figure BDA0003782593860000062
Figure BDA0003782593860000071
2.1.2 PCR反应程序
分别提取16种杨树材料的基因组DNA，进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板1μL(DNA浓度为50ng/μL)，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，PCR Mixture 10μL，ddH2O 8μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸1min(根据产物长度调整)，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2 FERR-R基因
2.2.1 PCR引物设计
根据已知美洲黑杨♂FERR-R基因序列(Xue L,Wu H,Chen Y,Li X,Hou J,Lu J,WeiS,Dai X,Olson MS,Liu J,Wang M,Charlesworth D,Yin T.Evidences for a role oftwo Y-specific genes in sex determination in Populus deltoides.NatCommun.2020,11(1):5893.doi:10.1038/s41467-020-19559-2)，在已测序毛白杨GM107基因组中比对，得到毛白杨GM107中FERR-R基因序列，根据该序列及其前后序列设计4对PCR引物，具体的核苷酸序列见表3。
表3鉴定杨树FERR-R基因所设计的PCR引物
Figure BDA0003782593860000072
2.2.2 PCR反应程序
分别提取16种杨树材料的基因组DNA，进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板1μL(DNA浓度为50ng/μL)，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，PCR Mixture 10μL，ddH2O 8μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸1min 30s(根据产物长度调整)，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
3试验结果
3.1 FERR基因检测
3.1.1毛白杨GM107 FERR序列
毛白杨GM107测序所得基因组中FERR基因共1959bp，其核苷酸序列如下：
ATGGCCAGCTCTTCTTCTTCCTTACCATCAATGGAGTTCGATATTGATGAGAAACCACATGTGTTAGCTGTTGATGATAGTTTGATAGACCGCAAAGTCATTGAAAGGTTACTTACCGACTCTACATGCAGAGGTATGAAAAGAACAAAAAAGTCTTGGCCTCTCTTTGTTCATAGAAACTTTGCTCATTTGGTATAATTTGTTAATCAAAGAAAAGTTTCTAGCTATAACATATTTTATCATACTTTTATCTTTGTTTTCATTGGATTTTGGTGAACATTATATCTTAATTCTCTAGTTTATATCCATGGGTTTGTATGATTAAGATTAAAGAGAAATATGATTTATGATAAAATGGTGTTCTTGTTTATACAATGTTGTCTAATTTGCAAAAGTGAAGAAACATAGAACACATGAAGGAACAAAAAAAAGTTTACCACGCTGGCTAAGCTCTCATTCCTAGGCTAGGCTAGGGCTAATTTAATGGAGAACATGATTGTCACTGCCAAAAGTTGGCTATGGCACCATGGAAGTTACCACGGTGACAAACATATGAGAACTCATAACCAAAGTGGAGATTAACAAGGAGTAGACCCCACATCTTCTGCTTTTATTTTTATCACTTTGAGGAAATTGAAAAGGAAAAGAATATCCTGTCATTTCTGGTATTGTTTTTGTTATGAATCCATTTGTTTGGATGCTAGAGGTGACAAAAGTTAGAGTACTCTAGAAAAGAACTCATAACATTGCAAATCCATGGTTTTTTAATTAATCTCAATTAATTAGCAAGGAGAGAAAGAAGTCTTGAGTTTTAGAGACTTGACTAAAGTTTTTATGATTCACAATTTGGTTCCTATGATTGCAGTGACCACAGCAGAAAACGGAAAGAGAGCATTGGAGTATTTGGGCTTAGCTGATGAACAACATCCCAATCATGGTGTAAGTAACCATACAATGAAGGTCTGATTCTTGCTTTTATGAATTCAACTCCATCATTTGTTGTTCATGGGTATTTCTCTTAGCAGGATGTGAAGGTGAATATGATCATCACTGATTATAGCATGCCAGGAATGACCGGTTATGAGCTGTTGAAAAGAATTAAGGTAAATATTACTCATCTTCAATGCTCTAGTTACGACTATCATAACTTTCCTTTGTATTTTCTAGTCTAACGGTTCGGTTTTTTAAATATCATAAACGGTGAGAACTATAAAATAAAATTTTTCGGGAGTCTCTAGAATCCTGTTAGACAGATTTAAAATTGTTTAGAAATTTATTACCTGAAAATCTAATGTTTGTTTGTTTTAAAATAATTGTTTAAGGGCTGAGTTGGTTTTAAAATAATATGTATTAGTCTTTACAACTTTAATGAATATCTAGTATTTAAGAGAGCATCGAGTAAGAACACTTCAGAAACAATACTTTGATGCAATATAAATTTCATAATTATAACAATTTTATAATTTTCTTTGTAAAATATTTTTATCCCATAGACTTTATTTTTACTCTAGATTTATTAATCTAATATTATATGAATATTAAAGATAAATTAAATTTTTAATAATAATAAATATTTATTTATGTAAATATAATAACATTATATATAATTAACAGATTAACTACATAGCATATTAAACTAACCATAACATTGTATGGTTTCTCTCAAATAGGAATCACCTACCATGAAGGAGATACCGGTGGTTGTAGTGTCATCTGAGAACATCCCTACACGAATTAATCAGTAATTACCTGCTCAGCAATTTCAGTGTTGAATAATCTTTGTTGATTTTTTGTCTTTTGTCTATTTATTTGGATAGAGGAAAAGAAATCATTGATTTGTTAAATATTTTCCACCTAAACAGGTGCATGGAGGGAGGAGCCCAAGAATTCTTGCTGAAGCCTCTTCAGCTATCAGATGCGAAAAAGCTGAGGTGCCATATAAAAAAGCTGAATAATTAA
3.1.2 FERR基因PCR结果
根据毛白杨FERR序列及其前后延长序列设计引物，利用16种杨树材料的基因组DNA进行PCR，水为阴性对照，PCR产物经由电泳检测，电泳检测结果如图1所示。根据图1的检测结果可见，引物D的PCR结果显示，1#、2#、4#、7#—9#、11#—16#均有清晰条带，证明这些杨树基因组中存在FERR基因，且条带结果与已知性染色体基因型的杨树一致。其余的5对引物(引物对A，B，C，E和F)结果均未显示清晰条带。
3.2 FERR-R基因检测
3.2.1毛白杨GM107 FERR-R序列
毛白杨GM107测序所得基因组中FERR-R基因共1446bp，其核苷酸序列如下：
AACCAAATTGTGAATCATAAAAACTTTAGTCAAGTCTCTAAAACTCAAGACTTCTTTCTCTCCTTGCTAATTAATTGAGATTAATTAAAAAACCATGGATTTGCAATGTTATGAGTTCTTTTCTAGAGTATTCTAACCTTTTGCCACCTCTAACATCCAAACAAATGGATCCATAACAAAAACAATACCAGAAATGACAAGATATTCTTTTCCTTTTCAATTTCCTCAAAGTGATAAAAATAAAAGCAGAAGATGTGGGGTCTACTCCTTGTTAATCTCCACTTTGGTCACGAGTTCCTATATGTCTGTCGACGTGGTAACTTCCATGGTGCCATAGCCAACTTATGGCAGTGACAATCATGTTCTCCATTAAATTAGCCCTAGCCTAGCCTAGGAATGAGAGCCTAAACTTTTTTTTGTTCCTTCATGTGTTTTATGTTTCTTCCCTTTTGCAAATTAGACAACATTGTATAAAGAAGAACACCATTTTATCATAAATTATATTTCTCTTTAATCTTAATCATACAAAACCATGGATATAAACTAGAGAATTAAGATATAATGTTCACCAAAACCCAATGAAAACAAAGATAAAAGTATGATAAAACATGTTATAGCTAGAAACTTTTCTTTGATTAACAAATTATACCAAATGAGCAAAGTTTCTATGAACGAAGAAAGGCCAAGACTTTTTTGTTCTTTTCATACCTCTGCATGTAGAGTTGGTAAGTAACCTTTCAATGACTTTGCGATCTATCAAACTATCATCAACATCTAACACATGTGGTTTCTCATCAATATCAAACTCCATTGATGGTAAGAAAGAAGAAGAGCTGGCCATATCTACCTTCAAAGAACACACCACAATGTCTAACCACCTCAACAAAACACGAAAAGGAAAATTCGAGGAAAAAAAAGAGAAAACTAGCTAGCAAGAAAAGAATGCCAAAAGGAGAACAAACAAGCCAAGAAGAAAAACAAGGTAGCGAGGGTAACGTAATGTAATGTGATAATCCTTGTCAAGTCAATACAAGTTATGATTGGGGATACTTATATATCGATATCCTGACTTAGCAGAAAGTGAATTTATAGTAAAATATGAAGGATAATAAGAAAAAGTAAGGAATAAAAGGGTGAGGTGAGCTCATTATTATCATTATCAGAGAAGAATAGTAAGCAAATCCTAATAAAATCATGAGTCAGAGATAATTGCTGATCTTTTCAGTCTTTGGGATTTGATTGCAGAAGCAGTAAAAGCGAAATAGATACCTTCTTGTTTTTGTTTTTCCCTTTCTTCAAGAGATCTCCATGCTCAAAACCATTGTATATTTTAACACACTTGTACGTATTTCCTATTCCATCTCCACACGGTTGTTCAAAGATTATTCCTTCATGCCTTACTTGTAGGGCTTCGGATATGCATTCCATCCCATGCATGTCCATTCA
3.2.2 FERR-R基因PCR结果
根据毛白杨FERR-R序列及其前后延长序列设计引物，利用16种杨树材料的基因组DNA进行PCR，水为阴性对照，PCR产物经由电泳检测，结果如图2所示。根据图2的结果可见，引物对G的PCR结果显示，2#、4#、8#、12#有清晰条带，且条带结果与已知性染色体基因型的杨树一致。引物对I和引物对H的电泳结果中，雌性杨树也出现了扩增条带，证明引物对I和引物对H不具有特异性，不可用做性别鉴定的特异引物，引物对J仅在8#扩增出了特异性条带，但是在2#、4#和12#没有扩增出相应的特异性条带，说明其准确性不够，若用于杨树的性别鉴定存在不确定性。
综上，根据16种杨树的性别以及已知的性染色体基因型，在针对性别决定基因FERR所设计的6对引物中，惟有引物D可以有效的区分出含有FERR基因的杨树，在针对性别决定基因FERR-R所设计的4对引物中，惟有引物G可以区分出含有FERR-R的杨树，且准确性高，可以应用于杨树性别区分。
试验例2采用鉴定FERR基因以及FERR-R基因的引物应用于白杨人工杂交群体部分子代的早期性别鉴定
1.试验材料：(1)杂交组合L9(♀)×LM50(♂)，子代25个基因型(1-1、1-2、1-4、1-8、1-10、1-11、1-12、1-28、1-32、1-43、1-47、1-51、1-52、1-53、1-58、1-60、1-61、1-67、1-72、1-75、1-80、1-87、1-90、1-91、1-92)；(2)杂交组合L9(♀)×84k(♂)，子代4个基因型(6-1、6-8、6-18、6-26)；(3)L9(♀)半同胞家系个体1个(7-7)。
2.试验方法：分别提取上述31个杨树个体的基因组DNA，进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板1μL(DNA浓度为50ng/μL)，扩增FERR基因以及FERR-R基因的引物分别为试验例1所筛选出的引物D和G，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，PCR Mixture 10μL，ddH2O 8μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸1min 30s(根据产物长度调整)，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.试验结果
电泳检测的结果见图3，依据FERR基因以及FERR-R基因的区分结果对白杨人工杂交群体部分子代的早期性别鉴定的结果见表4。
表4白杨人工杂交群体部分子代的早期性别鉴定结果
Figure BDA0003782593860000111
Figure BDA0003782593860000121
试验例3采用鉴定FERR基因以及FERR-R基因的引物应用于毛白杨自然群体的性别鉴定
1.材料与方法
取自山东冠县毛白杨基因库，共计268个基因型。PCR反应条件同试验例2。
2.试验结果
图4为FERR基因在毛白杨自然群体的PCR结果，图5为FERR-R基因在毛白杨自然群体的PCR结果；表5为依据FERR基因以及FERR-R基因在毛白杨自然群体中扩增结果对毛白杨自然群体作出的性别鉴定。
表5毛白杨自然群体的性别鉴定结果
Figure BDA0003782593860000122
Figure BDA0003782593860000131
Figure BDA0003782593860000141
Figure BDA0003782593860000151
Figure BDA0003782593860000161
Figure BDA0003782593860000171
Figure BDA0003782593860000181
Figure BDA0003782593860000191

Claims (9)

1.用于鉴定杨树性别决定基因FERR的特异性PCR引物对，其特征在于，所述特异性PCR引物对的上游引物的核苷酸序列为：GCTCTTCTTCTTCCTTACCATCAA；其下游引物的核苷酸序列为：TAGAGTACTCTAACCTTTTGCCAC。
2.用于鉴定杨树性别决定基因FERR-R的特异性PCR引物对，其特征在于，所述特异性PCR引物对的上游引物的核苷酸序列为：ACCATGGATTTGCAATGTTATGAGT；其下游引物的核苷酸序列为：TGAATGGACATGCATGGGATGG。
3.权利要求1所述的特异性PCR引物对在鉴别杨树是否含有FERR基因以及性染色体类型中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以权利要求1所述的特异性PCR引物对建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果扩增出758bp的条带，则待检测的杨树样品含有FERR基因，性染色体类型是X、Y或W。
5.权利要求2所述的特异性PCR引物对在鉴别杨树性别中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以权利要求2所述的特异性PCR引物对建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果扩增获得1355bp的条带，则待检测的杨树性别为雄性。
7.权利要求1所述的特异性PCR引物对和权利要求2所述的特异性PCR引物对在鉴别杨树性别中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：
(1)提取待检测的杨树样品的DNA；
(2)以提取的杨树样品的DNA为模板，以权利要求1所述的特异性PCR引物对和权利要求2所述的特异性PCR引物对组成的混合PCR引物对建立PCR扩增体系；
(3)如果同时扩增出758bp的条带和1355bp的条带，则待检测的杨树性别为雄性；如果均未扩增出758bp的条带以及1355bp的条带，则待检测的杨树性别为雄性；如果仅扩增出758bp的条带，则待检测的杨树性别为雌性。
9.一种鉴别杨树性别的PCR检测试剂盒，包括：Taq酶，dNTP，Mg2+，ddH2O和PCR扩增引物对；其特征在于，所述的PCR扩增引物对是权利要求1所述的特异性PCR引物对；或者所述的PCR扩增引物对是权利要求2所述的特异性PCR引物对；或者所述的PCR扩增引物对由权利要求1所述的特异性PCR引物对和权利要求2所述的特异性PCR引物对共同组成。
CN202210933313.7A 2022-08-04 2022-08-04 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用 Active CN115109867B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210933313.7A CN115109867B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210933313.7A CN115109867B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115109867A true CN115109867A (zh) 2022-09-27
CN115109867B CN115109867B (zh) 2023-09-26

Family

ID=83333600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210933313.7A Active CN115109867B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115109867B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007074405A2 (en) * 2005-09-16 2007-07-05 Devgen Nv Dsrna as insect control agent
CN110628934A (zh) * 2019-10-23 2019-12-31 四川大学 银白杨性别决定基因及其鉴定银白杨性别中的应用
CN111100868A (zh) * 2019-12-17 2020-05-05 南京林业大学 美洲黑杨的促雌基因ferr和抑雌基因ferr-r及其应用
CN111269974A (zh) * 2020-03-09 2020-06-12 南京林业大学 一段小叶杨雄株特异的基因组dna序列及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007074405A2 (en) * 2005-09-16 2007-07-05 Devgen Nv Dsrna as insect control agent
CN110628934A (zh) * 2019-10-23 2019-12-31 四川大学 银白杨性别决定基因及其鉴定银白杨性别中的应用
CN111100868A (zh) * 2019-12-17 2020-05-05 南京林业大学 美洲黑杨的促雌基因ferr和抑雌基因ferr-r及其应用
CN111269974A (zh) * 2020-03-09 2020-06-12 南京林业大学 一段小叶杨雄株特异的基因组dna序列及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115109867B (zh) 2023-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pakull et al. Genetic linkage mapping in aspen (Populus tremula L. and Populus tremuloides Michx.)
CN109943646B (zh) 黄牛plag1基因cnv分子标记的方法及其应用
CN110373474B (zh) 陇东绒山羊羊绒直径相关的遗传标记及其应用
WO2021097878A1 (zh) 暗纹东方鲀snp分子标记及其在遗传育种的应用
WO2023070857A1 (zh) 一种鉴别贵州黑山羊和乐至黑山羊的分子标记、检测方法及应用
CN111424119B (zh) SARS-CoV-2病毒的高通量检测引物及试剂盒
CN109371146A (zh) 绵羊多胸椎数性状的snp分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用
CN108192893B (zh) 基于转录组测序开发艾纳香ssr引物的方法
CN109280709B (zh) 一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用
Pintye et al. Improved DNA extraction and quantitative real-time PCR for genotyping Erysiphe necator and detecting the DMI fungicide resistance marker A495T, using single ascocarps
WO2017113148A1 (zh) 检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒
CN112795662A (zh) 一种光倒刺鲃的鉴定方法及其应用
CN102732514B (zh) 趋化因子受体9基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用
CN107779517A (zh) 一种影响杜洛克种猪瘦肉率性状的分子标记及其应用
CN115109867A (zh) 鉴定杨树ferr和ferr-r基因的特异pcr引物及其在杨树性别鉴定中的应用
CN106755422B (zh) 一种与黄牛生长性状相关的meg3基因snp的检测方法及其应用
CN110093425B (zh) 一种检测小尾寒羊ormdl1基因cnv标记的方法及其应用
CN113249441A (zh) 用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法
CN113789407A (zh) 一种用于油莎豆基因分型的snp分子标记组合及其应用
CN103290118B (zh) 一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒
CN108998545A (zh) 半滑舌鳎外泌体piR-mmu-31018127应用
CN116356042B (zh) 利用KASP快速检测牛环状RNA circCPNE8单核苷酸多态性的方法及其应用
CN114622020B (zh) 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用
CN113736796B (zh) 一种文冠果抗旱基因、snp及其应用
CN112695102B (zh) 山羊prnt基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant