CN115105624A

CN115105624A - 一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料及其制备方法

Info

Publication number: CN115105624A
Application number: CN202211028763.8A
Authority: CN
Inventors: 胡章; 张兆宇; 张岭誉; 翁博雅; 贺怡心; 李程鹏; 李乐凡; 余佳音; 黄德坚
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2022-08-26
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2042-08-26
Also published as: CN115105624B

Abstract

本发明公开了一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料及其制备方法，属于生物医药技术领域。以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖6‑15份、马来酸酐5‑11份、2‑氯乙胺盐酸盐13‑32份、3,7‑二甲基‑6‑辛烯醛6‑16份，碘4‑8份。本发明制备得到的海洋多糖基高效抗菌膜敷料具有显著的抗菌效果，抗菌时效长，生物安全性高，在医用抗菌、创伤修复领域具有良好的应用前景。

Description

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料及其制备方法。

背景技术

侵袭性细菌感染是临床上面临的主要问题，既对公众健康产生威胁，又造成沉重的经济负担。随着耐药性细菌的出现，传统的抗菌手段已面临十分严峻的挑战，新型抗菌材料的研究和开发已迫在眉睫。在以抗菌肽和金属银离子展开的新型抗菌材料中，大多数抗菌肽通过高选择性和特异性靶向细胞质和干扰细胞代谢来发挥作用，但是抗菌肽生产成本高，体内稳定性差。金属银离子具有高效抗菌性能，但是作为外来重金属，它的远期生物安全性一直为人们所担忧。

海洋多糖如壳聚糖等，来源广泛、可降解、可再生，具有良好的生物相容性，目前作为抗菌产品的新原料备受关注。壳聚糖，甲壳素的脱乙酰化产物，是迄今为止自然界中唯一的碱性多糖，具有良好的成膜性、无毒性、生物相容性、生物降解性和广谱抗菌活性。然而，壳聚糖的水溶性差，抗菌活性较弱，且抗菌活性受诸多因素的制约，如脱乙酰度、分子量、pH等，因而应用受到限制。两亲性壳聚糖具有稳定的抗菌活性，其结构中包括亲水部分和疏水部分，这种特殊的结构使得两亲性接枝共聚物在水中能够通过自组装形成具有明显核-壳结构的共聚物胶束，在负载活性药物方面具有独特的优势，在医药领域得到广泛关注。

碘是世界公认的安全可靠的杀菌剂，广泛使用于诸多领域，如临床、卫生、日常生活、养殖业和饮用水等。但因单质碘易升华，稳定性差，在水中溶解度低，使其应用受到限制。为了提高碘的稳定性，利用载体与碘复合，使碘处于被载体络合或被包裹的状态，不仅具有与碘相同的高效、速效、广谱杀菌力，而且具有比碘杀菌作用持久、稳定性能好等优点。而如何制备得到一种性质稳定，且生物安全性较高的高效抗菌复合材料成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提出一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料及其制备方法，通过以壳聚糖、马来酸酐、2-氯乙胺盐酸盐、3,7-二甲基-6-辛烯醛（别名：香茅醛）和碘为原料制备得到一种具有显著抗菌效果的海洋多糖基复合材料，该材料稳定性及生物安全性均较高，且制备工艺简单，易于工业化生产。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料，以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖6-15份、马来酸酐5-11份、2-氯乙胺盐酸盐13-32份、3,7-二甲基-6-辛烯醛6-16份，碘4-8份。

优选的，以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖10份、马来酸酐8份、2-氯乙胺盐酸盐23份、3,7-二甲基-6-辛烯醛11份，碘6份。

优选的，所述壳聚糖的分子量为50-500KDa，脱乙酰度为85-95%。更优选的，所述壳聚糖的分子量为300KDa，脱乙酰度为90%。

若壳聚糖分子量和脱乙酰度太低，会导致最后制备的复合膜敷料的抗菌效果不显著；若壳聚糖分子量和脱乙酰度太高，会导致工艺难度提升，成本极大增高，不利于工业化生产。

本发明还提供一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法，包括以下步骤：

1）将壳聚糖分散于水中，得到壳聚糖混悬溶液，加入马来酸酐，搅拌，然后倒入碱性溶液中，洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于水中，调节pH至5.5-6.8，加入2-氯乙胺盐酸盐，搅拌，调节pH至2.4-3.2，继续搅拌，然后倒入碱性溶液中，洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于水中，调节pH至4.2-5.8，加入3,7-二甲基-6-辛烯醛，搅拌，透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖溶于水中，加入含碘的乙醇溶液，搅拌，得到的反应液倒入模具中，避光干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

优选的，步骤1）中，所述壳聚糖混悬溶液中壳聚糖的质量分数为0.5-2.5%。更优选的，质量分数为1.5%。

优选的，所述碱性溶液为0.1M的氢氧化钠溶液。

优选的，步骤4）中，所述含碘的乙醇溶液中碘的质量分数为3-5%。更优选的，质量分数为4%。

若含碘的乙醇溶液中碘的质量分数太大，则碘浓度太大，随后添加到高分子基质材料溶液中会导致负载不均匀，缓释能力差，抗菌时长缩短，且在制备过程中碘的损失率增大；若含碘的乙醇溶液中碘的质量分数太小，则需要添加含碘的乙醇溶液体积量增多，导致高分子基质材料直接从溶液中析出，最后制备的复合材料无显著抗菌效果。

本发明还提供一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料在制备医用抗菌、创伤修复材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料具有强效抗菌效果，抗菌时效长，在医用抗菌、创伤修复领域具有良好的应用前景。

（2）本发明首先采用来源广泛的壳聚糖为起始原料，通过马来酸酐与壳聚糖的伯氨基进行反应，对壳聚糖C2的游离氨基进行保护，得到C2-氨基保护的壳聚糖；接着在C6-OH上引入亲水性的聚乙胺长链，在弱酸性条件下对C2氨基进行脱保护，得到亲水性的O-聚乙胺壳聚糖。在保留壳聚糖原氨基的结构上，在OH端引入聚乙胺亲水链，不仅改善了壳聚糖的亲水性能，而且增加了氨基含量，提高了壳聚糖的带正电能力，有利于活性碘的负载，提高抗菌活性。

（3）本发明利用香茅醛与O-聚乙胺壳聚糖C2氨基发生席夫碱反应，在C2-N上引入疏水长链，从而制得两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖。在抗菌活性方面，一方面通过香茅醛的引入，利用香茅醛本身具有较好的抗菌活性来增强壳聚糖的抗菌活性；另一方面，N-疏水链-O-亲水链壳聚糖具有两亲性结构，能有效改善与生物细胞膜中脂质结构，表现出稳定的抗菌活性，具有天然抗菌肽的抗菌机理。

（4）本发明利用两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖作为基质材料，高效负载活性碘，存在两种主要途径：（a）利用两亲性壳聚糖的自聚行为进行包裹；（b）利用改性壳聚糖增强的阳离子与碘阴离子间的静电吸附作用。通过两亲性壳聚糖与活性碘的复合，协同增强抗菌效果。

（5）本发明制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料对创面刺激性小，生物安全性高，且制备工艺简单，易于工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料的外观形貌图；

图2为原料壳聚糖及本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖的临界聚集浓度图；

图4为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖膜及其复合碘膜的亲水行为与吸水性能图；

图5为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖膜及其复合碘膜的力学性能图；

图6为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖-碘复合膜的碘释放曲线图；

图7为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖-碘复合膜的抗菌效果图；

图8为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖-碘复合膜的细胞相容性图和死/活细胞染色试验结果图；

图9为本发明实施例1制备的两亲性壳聚糖-碘复合膜的细胞凋亡试验结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。

本发明中的“室温”是指25-30℃。

在一些优选实施例中，以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖10份、马来酸酐8份、2-氯乙胺盐酸盐23份、3,7-二甲基-6-辛烯醛11份，碘6份。

壳聚糖是主要从海洋甲壳类生物如虾、蟹等外壳提取出甲壳素后脱乙酰化的产物，具有无毒性，无刺激性，无免疫原性，无热源反应，不溶血，可生物降解及良好的生物相容性，在医药领域具有广泛的应用，如人工皮肤、手术缝合线、药物载体等。具有广谱抗菌活性，但抗菌能力受诸多因素的制约，如脱乙酰度、分子量、pH等。

壳聚糖的抗菌机制比较复杂，其中壳聚糖骨架上质子化的氨基（-NH₃ ⁺）使壳聚糖分子容易与带负电荷的微生物细胞包膜相互作用，从而改变细菌细胞质膜的形态和通透性，进而导致细菌死亡。

2-氯乙胺盐酸盐是一种低毒、高亲核反应性的铵盐，广泛应用于医药领域。通过化学修饰，在壳聚糖C6-OH引入聚乙胺长链，增加了氨基含量，不仅增强了其抗菌活性，而且有利于活性碘的负载。

香茅油是一种以其天然驱虫特性而闻名的精油，在制药、香精、香料工业中应用广泛，它具有镇痛、抗惊厥、抗焦虑等多种功能，是抗真菌、抗菌、抗寄生虫和杀线虫活性的良好药剂。香茅油的抗菌活性归因于其中的香茅醛、香茅醇和香叶醇等主要成分。

在一些优选实施例中，所述壳聚糖的分子量为50-500KDa，脱乙酰度为85-95%。更优选的，所述壳聚糖的分子量为300KDa，脱乙酰度为90%。

1）将壳聚糖分散于水中，得到壳聚糖混悬溶液，加入马来酸酐，室温下搅拌反应12-24h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.5-6.8，加入2-氯乙胺盐酸盐，室温下搅拌反应8-20h，调节pH至2.4-3.2，室温下搅拌反应3-5h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至4.2-5.8，加入3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应12-24h，透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖溶于水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入含碘的乙醇溶液，避光、室温下搅拌反应5-8h，得到的反应液倒入模具中，避光干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

本发明以壳聚糖为起始原料，通过马来酸酐与伯氨基进行反应，对壳聚糖C2的游离氨基进行保护，得到C2-氨基保护的壳聚糖；接着在C6-OH上引入亲水性的聚乙胺长链，在弱酸性条件下对C2氨基进行脱保护，得到亲水性的O-聚乙胺壳聚糖；随后，利用香茅醛与C2氨基发生席夫碱反应，在C2-N上引入疏水长链，从而制得两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖。最后，利用两亲性壳聚糖作为基质材料，对活性碘进行高效负载，主要包括两种途径：（1）利用两亲性壳聚糖的自聚行为，对碘进行有效的包裹；（2）由于碘在聚电解质水溶液中易于产生碘阴离子（I₃ ^-或者IO^-），反应如下：

利用壳聚糖C2-NH₂质子化的阳离子（-NH₃ ⁺）以及C6-聚乙胺中的季铵离子（R₄N⁺）与碘阴离子（I₃ ^-或者IO^-）的静电作用，对活性碘进行负载。

本发明采用马来酸酐对C2-氨基保护和脱保护策略，可在水溶液中对壳聚糖进行化学定向修饰。另外一制备两亲性壳聚糖方法：即以甲壳素为原料，于强碱、高温条件下在C6-OH直接引入亲水性的聚乙胺长链，随后在强碱、高温条件下脱掉C2-氨基上的乙酰基，再引入香茅醛疏水长链，制得两亲性壳聚糖。与这一方法相比，本发明公开制备的两亲性壳聚糖，不仅制备工艺绿色化，而且保留了壳聚糖中氨基和N-乙酰氨基的原始序列结构，更有效的负载活性碘，获得优异的抗菌效果。

在一些优选实施例中，步骤1）中，所述壳聚糖混悬溶液中壳聚糖的质量分数为0.5-2.5%。更优选的，质量分数为1.5%。

在一些优选实施例中，所述碱性溶液为0.1M的氢氧化钠溶液。

在一些优选实施例中，步骤4）中，所述含碘的乙醇溶液中碘的质量分数为3-5%。更优选的，质量分数为4%。

实施例1

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法：

1）将10g壳聚糖（分子量300KDa，脱乙酰度90%）分散于657g蒸馏水中，搅拌溶胀，得到壳聚糖混悬溶液，向其中加入8g马来酸酐，室温下搅拌反应20h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至6.0，加入23g的2-氯乙胺盐酸盐，室温下搅拌反应18h，调节pH至2.8，室温下搅拌反应4h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.0，加入11g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应18h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖（以下简称两亲性壳聚糖）；

4）将两亲性壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入150g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数4%），避光、室温搅拌反应6h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料（以下简称两亲性壳聚糖-碘复合膜）。

本实施例制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为6.25μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为25μg/mL。

图1是本实施例制备的一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料外观形貌图，图1中的（a）为数码图片；图1中的（b）为膜表面扫描电镜图；图1中的（c）为膜截面扫描电镜图；图1中的（d）为膜表面原子力显微镜图。

从图1中可以看出，两亲性壳聚糖-碘复合膜呈现浅黄褐色，半透明状，膜表面光滑，无明显褶皱和裂缝，从截面可以看出薄膜具有致密的结构。薄膜的表面粗糙程度由平均粗糙度（Ra值）和均方根粗糙度（Rq值）来衡量。两亲性壳聚糖-碘复合膜的Ra和Rq值分别为25.5nm和2.10nm。

图2是本实施例合成的两亲性壳聚糖的核磁共振氢谱图，图2中的（a）为壳聚糖；图2中的（b）为两亲性壳聚糖。

从图2中可以看出，聚乙氨基链和香茅醛链都已经成功引入到壳聚糖骨架上，表明已成功合成两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖。

图3是本实施例合成的两亲性壳聚糖的临界聚集浓度图。

从图3中可以得出，两亲性壳聚糖临界聚集浓度为1.21×10^-2mg/mL,这进一步表明，两亲性壳聚糖已成功制备，其自聚行为有利于碘的包裹。

实施例2

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法：

1）将6g壳聚糖（分子量50KDa，脱乙酰度85%）分散于1194g蒸馏水中，搅拌溶胀，得到壳聚糖混悬溶液，向其中加入5g马来酸酐，室温下搅拌反应12h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至6.8，加入13g的2-氯乙胺盐酸盐，室温下搅拌反应8h，调节pH至3.2，室温下搅拌反应3h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.8，加入6g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应12h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入133.3g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数3%），避光、室温搅拌反应5h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

本实施例制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为12.5μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为50μg/mL。

实施例3

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法：

1）将15g壳聚糖（分子量500KDa，脱乙酰度95%）分散于585g蒸馏水中，搅拌溶胀，得到壳聚糖混悬溶液，向其中加入11g马来酸酐，室温下搅拌反应24h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.5，加入32g的2-氯乙胺盐酸盐，室温下搅拌反应20h，调节pH至2.4，室温下搅拌反应5h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至4.2，加入16g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应24h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入160g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数5%），避光、室温搅拌反应8h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

本实施例制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为25μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为50μg/mL。

实施例4

一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法：

1）将12g壳聚糖（分子量200KDa，脱乙酰度88%）分散于588g蒸馏水中，搅拌溶胀，得到壳聚糖混悬溶液，向其中加入9g马来酸酐，室温下搅拌反应20h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到马来酰亚胺壳聚糖；

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.8，加入26g的2-氯乙胺盐酸盐，室温下搅拌反应16h，调节pH至3.0，室温下搅拌反应4.5h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至4.5，加入14g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应20h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入155.6g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数4.5%），避光、室温搅拌反应7h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

本实施例制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为12.25μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为25μg/mL。

试验例1

对实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料进行亲水行为与吸水性能试验，试验过程如下：

利用水接触角测量方法研究了膜的亲水行为。利用光学接触角仪器(JY-82BKruss DSA，Germany)测量水接触角；在干净的干燥膜表面添加5μL的水滴，在膜表面选取三个不同位置测量接触角值，取平均值即为复合膜亲水接触角度。

随机选取样品膜2cm×2cm，精确称重，室温下浸入30mL生理盐水中，37℃的恒温水浴浸泡30分钟后取出，用滤纸小心吸干表面水分，称重。平行操作3次，取平均值。

接触角结果见图4中的（a），两亲性壳聚糖膜水接触角为66.67°±1.14°，与大多数多糖基膜相当；与两亲性壳聚糖膜相比，两亲性壳聚糖-碘复合膜的水接触角明显降低具有显著性差异（p<0.01）。

吸收性能结果见图4中的（b），两亲性壳聚糖和两亲性壳聚糖-碘复合膜的吸水率分别为161.38%和229.55%，结果表明了这两种膜都具有良好的吸收液体性能，并能锁住水分；与两亲性壳聚糖相比，两亲性壳聚糖-碘复合膜吸水性能大大提高，具有显著性差异（p<0.01）。

试验例2

对实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料进行力学性能试验，试验过程如下：

两亲性壳聚糖及两亲性壳聚糖-碘复合膜厚度分别为0.26±0.03和0.21±0.01mm。利用万能力学试验机（INSTRON5982，USA）测定样品膜的拉伸强度(σ)、断裂伸长率（ε）和弹性模量（E）。将试样切割成长方形形状（10mm×20mm），按照GB1040-70进行测量。并以1mm/min的恒定应变速率拉伸至完全拉伸失效。每个试验重复4次，取平均值。

力学性能结果见图5。与两亲性壳聚糖膜相比，两亲性壳聚糖-碘膜的E和σ分别降低15.08%和13.79%，而ε增加了118.18%。这表明碘的引入干扰了两亲性壳聚糖分子内与分子间的氢键作用，但对聚合物薄膜赋予了增塑效应。

试验例3

对实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料进行碘的释放性能试验，试验过程如下：

利用碘量法测定实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料中的碘含量为11.13%。利用标准曲线法测定复合膜敷料中碘的释放行为：分别配制浓度为1.97×10^-4mol/L、3.94×10^-4mol/L、5.63×10^-4mol/L、7.88×10^-4mol/L和1.58×10^-3mol/L碘的水溶液，用紫外光谱仪测定其在226nm时的吸光度，以碘溶液浓度与吸光度进行线性拟合，回归方程为C=(40.5A-0.6)×10^-4mol/L，相关系数为0.9997，其中C为水溶液中碘浓度，A为碘226nm处的吸光度。将待测样品剪成规格为5×5cm的正方形，放入250mL的去离子水中，避光；室温下进行磁力搅拌，每隔5min取出2mL上清液再加入2mL去离子水，测定上清液在226nm时的吸光度，导入标准线性回归方程计算上清液每个时刻的浓度。

海洋多糖基高效抗菌膜敷料中碘的释放动态曲线见图6。碘的释放过程分别存在暴释期、快速释放期，在溶液中碘的浓度达到一恒定浓度后（约8.84×10^-4mol/L），处于缓慢释放期，海洋多糖基高效抗菌膜敷料中碘的释放先是从薄膜表面突释随后由内而外扩散，表明海洋多糖基高效抗菌膜敷料具有缓释效果，对创伤皮肤具有低刺激性。暴释和快速释放可快速达到有效浓度，产生抗菌；经过3天后检测，溶液中碘的浓度任可达到8.80×10^- ⁴mol/L，表明碘的释放与碘挥发之间处于相对的动态平衡状态，缓慢释放有利于发挥长久的抗菌效果。

试验例4

对实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料进行抗菌性能试验，试验过程如下：

采用肉汤微量稀释法测量最小抑菌浓度（MIC）。取样品（1.6mg）溶解于（1mL）蒸馏水中，制得1600μg/mL的储备液。以革兰阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 6538)和革兰阴性大肠杆菌(E.coli，ATCC 8739)为实验菌，未进行任何样品处理的菌悬液为对照组，采用二倍稀释法对样品的最小抑菌浓度进行测定。

实验结果表明，实施例1制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度浓度（MIC）为6.25μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为25μg/mL。

采用琼脂扩散法测定样品溶液对金黄色葡萄球菌(S.aureus, ATCC 6538)、大肠杆菌(E.coli, ATCC 8739)、铜绿单胞菌（P.aeruginosa, ATCC 9027）和表皮葡萄球菌（S.epidermidis, ATCC 12228）的抑菌圈，以评价材料的抗菌性能。吸取1mL接种菌悬液浓度为10⁶-10⁷CFU/mL和10mL大豆酪蛋白琼脂培养基混合均匀，缓慢倒入无菌培养皿（90mm）中静置凝固。用无菌镊子将灭过菌的牛津杯轻轻粘上琼脂平板表面，滴加入100μL样品溶液（50μg/mL）于不同的牛津杯中，置于37℃培养24h后，数码相机拍照并利用ImageJ软件测量抑菌圈大小。平行测定三次，取其平均值。

抗菌结果见图7。亲水性O-聚乙胺壳聚糖对所测试的微生物都具有一定的抑制作用；与O-聚乙胺壳聚糖相比，两亲性壳聚糖对四种受试菌的抑菌效果明显增强，表明了对O-聚乙胺壳聚糖进一步修饰，在C2-NH2引入疏水链制得的两亲性壳聚糖的抑菌效果显著提升。与两亲性壳聚糖相比，实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料对所测试金黄色葡萄球、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别达到了19.8±0.3mm、20.6±0.9mm、11.2±0.3mm和13.8±0.4mm都具有显著性差异，这表明两亲性壳聚糖复合碘后，两亲性壳聚糖与碘发挥了协同增强抗菌效果。

试验例5

对实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料进行细胞相容性试验，试验过程如下：

HaCaT细胞计数后调整细胞浓度为5×10⁴个/mL,每孔100μL接种于96孔板中，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时。加入100μL含有不同浓度样品的DMEM培养基共混孵育24h和48h。孵育结束后，每孔加入10μL CCK-8于培养箱中孵育2h。用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。细胞增殖率按如下公式计算得到。

式中，A_p为实验孔，A_C为对照孔，A_b为空白孔。

采用死/活细胞双染色法考察样品对细胞的影响：调整HaCaT细胞接种密度为1×10⁵个/mL，每孔加入200μL接种于在12孔板中培养24h。吸弃培养液待细胞贴壁后，将200μg/mL浓度的样品溶液加入孔板中，每孔加入200μL处理24h。吸弃培养液并用PBS缓冲溶液清洗2次。按Live/Dead试剂盒说明进行正确操作，每孔加入100μL Calcein-AM/PI溶液（5μLCalcein-AM和15μL PI混合在5mL 1×Assay Buffer中）在避光条件下染色20min后吸弃染色液；PBS缓冲液冲洗3遍，再加入500μL培养液，在荧光显微镜下使用490nm和545nm发射滤光片检测活死细胞情况，并拍照记录。

同时，考察了样品对细胞凋亡的影响：在6孔培养板选择浓度为200μg/mL样品处理HaCaT细胞24h和48h，未处理为空白对照组。用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，转速为850rpm、温度设置为4℃离心5min，收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，每次均用850rpm 4℃离心5min，使收集1×10⁶个/mL细胞，吸弃PBS，每孔加入100μL重悬细胞（1×10⁵个），再加入5μL AnnexinV-FITC轻轻混匀，避光，室温反应10min和5μLPI染色溶液，避光孵育5min。加入PBS至500μL，轻轻混匀置于冰上避光，样品1h内用流式细胞仪检测。

细胞相容性实验结果见图8。从细胞毒性试验结果图8中的（A）可以看出，样品随着浓度从25μg/mL增加到800μg/mL，与对照组细胞比较，培养24h和48h，细胞存活率都没有显著差异；说明实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料没有细胞毒性。

从死/活细胞染色试验结果图8中的（B）可以看出，绿色细胞代表活细胞，红细胞代表死细胞，样品组与对照组中基本都呈现活细胞，进一步表明实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料没有细胞毒性。

从细胞凋亡试验结果图9可以看出，与对照组细胞比较，培养24h和48h，实验组细胞凋亡率都没有显著差异；说明实施例1制备的海洋多糖基高效抗菌膜敷料对细胞凋亡没有显著影响。

对比例1

同实施例1，区别在于，将所有原料直接搅拌混合。

结果发现，对比例1制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为200μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为400μg/mL。

对比例2

同实施例1，区别在于，直接以壳聚糖与碘复合制备膜敷料，制备方法为：将10g壳聚糖（分子量300KDa，脱乙酰度90%）分散于657g蒸馏水中，搅拌溶胀，得到壳聚糖混悬溶液，加入150g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数4%），避光、室温搅拌反应6h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

结果发现，对比例2制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为400μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为400μg/mL。

对比例3

同实施例1，区别在于，以甲壳素为原料，采用高温、强碱条件制备亲水性O-聚乙胺壳聚糖。制备方法为：将10g甲壳素（分子量300KDa，脱乙酰度5%）分散于657g NaOH溶液(40%，w/v)中，搅拌溶胀24h，得到壳聚糖混悬溶液；将溶液升温至80℃，向其中加入23g的2-氯乙胺盐酸盐,继续搅拌18h，透析，冷冻干燥，获得O-聚乙胺甲壳素；将O-聚乙胺甲壳素溶解于氢氧化钠溶液(40%，w/v)中，65℃搅拌10h，透析，冷冻干燥，得到亲水性O-聚乙胺壳聚糖样品；将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中，调节pH至5.0，加入11g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应18h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；将两亲性壳聚糖溶于蒸馏水中，加入150g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数4%），避光、室温搅拌反应6h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

结果发现，对比例3制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为100μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为200μg/mL。

对比例4

同实施例1，区别在于，用环氧丙基三甲基氯化铵替代步骤2）中的2-氯乙胺盐酸盐，制备不同的C6-O-亲水链壳聚糖。制备方法为：

2）将马来酰亚胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至6.0，加入23g的环氧丙基三甲基氯化铵，室温下搅拌反应18h，调节pH至2.8，室温下搅拌反应4h，然后倒入0.1M氢氧化钠溶液中，收集、蒸馏水洗涤沉淀，得到亲水性C6-O-亲水链壳聚糖；

3）将亲水性O-聚乙胺壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），调节pH至5.0，加入11g的3,7-二甲基-6-辛烯醛，室温下搅拌反应18h，将反应液进行透析，真空干燥，得到两亲性的N-疏水链-O-亲水链壳聚糖；

4）将两亲性壳聚糖溶于蒸馏水中（与步骤1中壳聚糖质量分数相同），加入150g含碘的乙醇溶液（碘的质量分数4%），避光、室温搅拌反应6h，将反应液慢慢倾入模具中，避光自然干燥，得到海洋多糖基高效抗菌膜敷料。

结果发现，对比例4制备的样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为200μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为400μg/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种海洋多糖基高效抗菌膜敷料，其特征在于，以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖6-15份、马来酸酐5-11份、2-氯乙胺盐酸盐13-32份、3,7-二甲基-6-辛烯醛6-16份，碘4-8份。

2.根据权利要求1所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料，其特征在于，以质量份数计，包括以下原料：壳聚糖10份、马来酸酐8份、2-氯乙胺盐酸盐23份、3,7-二甲基-6-辛烯醛11份，碘6份。

3.根据权利要求1所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为50-500KDa，脱乙酰度为85-95%。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述壳聚糖混悬溶液中壳聚糖的质量分数为0.5-2.5%。

6.根据权利要求4所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为0.1M的氢氧化钠溶液。

7.根据权利要求4所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述含碘的乙醇溶液中碘的质量分数为3-5%。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的海洋多糖基高效抗菌膜敷料在制备医用抗菌、创伤修复材料中的应用。